Summary
Her presenterer vi en protokoll for den optimaliserte FlashPack kapillære kolonnepakkingsprosedyren. Bruk av en optimalisert protokoll til et vanlig 100-bar trykkbombeoppsett gir 10 ganger raskere pakking og produksjon av lange kapillære kolonner med ultrahøy ytelse.
Abstract
Kapillær ultrahøy væskekromatografi (UHPLC) er for tiden en metode for valg for prøveseparasjonstrinnet i LC-MS-basert proteomikk. Kapillære kolonner er imidlertid mye mindre robuste sammenlignet med deres høyere strømningstellertyper. På grunn av enkel forurensning og blokkering trenger de ofte utskifting. Det gjør dem til en markant dyr del av den totale LC-MS-analysekostnaden. Intern pakking av UHPLC kapillære kolonner sparer mye penger og tillater tilpasning. Standard pakkeprosedyre i 100-bar trykkbombe fungerer imidlertid bra bare for HPLC-kolonner, men er for treg for UHPLC-sorbenter. Her gir vi en beskrivelse av en optimalisert FlashPack-protokoll som brukes på det samme 100-bar trykkbombeoppsettet. Metoden er basert på pakking fra ultrahøy sorbent konsentrasjonsslam og er utviklet for intern produksjon av UHPLC kapillære kolonner med ubegrenset lengde i rimelig tid.
Introduction
Moderne proteomikk er basert på flytende kromatografi-koblet massespektrometri med ultra-høy ytelse nano-flow kromatografi (50-150 μm kolonne intern diameter (ID)) separasjon som gir den beste analysehastigheten ogfølsomheten 1. Mens mange kommersielle UHPLC kapillærkolonner er tilgjengelige, utgjør prisen en stor del av forbrukskostnadene, spesielt når flere forskjellige prosjekter kjøres i laboratoriet og prosjektspesifikk kolonneforurensning er et hyppig problem. Dessuten tillater pakking av kolonner internt bruk av tilpassede eksperimentspesifikke sorbenter (for eksempel polyCAT-A sorbent2) og kolonnekarakteristikker som ikke er tilgjengelige for kjøp som en ferdig kolonne.
For å takle det, pakker mange laboratorier kapillære kolonner internt. Imidlertid er den vanlige pakkeprosedyren med en 100 bar trykkbombe (trykkinjeksjonscelle)3 dårlig egnet til UHPLC-kolonnepakken på grunn av høyt ryggtrykk av sub-2 μm UHPLC-sorbenter, noe som resulterer i en dramatisk pakkehastighetsreduksjon i forhold til større HPLC-sorbenter. Selv om korte UHPLC-kolonner fremdeles kan pakkes veldig sakte, er produksjon av lange UHPLC-kolonner fysisk umulig4.
Standard kapillær kolonne pakking gjøres ved relativt lavt trykk opp til 100 barer, og med en svært lav sorbent slurry konsentrasjon. Derfor er to mulige retninger for å øke hastigheten på prosessen tilgjengelig. Det er mulig å øke pakketrykket5. Dette krever imidlertid spesialutstyr og praktisk talt installasjon av en ny metode i laboratoriet. En annen måte er å øke den sorbente slurrykonsentrasjonen6. Høy sorbent slamkonsentrasjonspakking er beskrevet i kombinasjon med ultrahøyt pakketrykk i en tidligere publikasjon7. Men ved 100 bar trykk, som brukes i de fleste av de eksisterende pakkebomber, høyere sorbent konsentrasjon resulterer i enten pakking rate slow-down eller direkte pakking opphør. Effekten ble nylig vist å skyldes sorbent klynger ved kolonneinngangen, og et enkelt triks av sorbent cupola destabilisering ved å hamre kolonneinngangen med en magnetstang inne i et sorbent hetteglass ble foreslått4. Den resulterende metoden, kalt FlashPack, bruker det samme 100-bar trykkbombepakkeoppsettet. Samtidig tillater mindre, men kritiske endringer i pakkeprosedyren pakking fra svært høy sorbent slurrykonsentrasjon og produksjon av svært lange UHPLC-kolonner (50 til 70 cm og lengre) på mindre enn en time, mens en kort kolonne kan produseres på få minutter med separasjonskvaliteten lik kommersielle kolonner med de samme parametrene4. FlashPack-tilnærmingen ble allerede brukt i flere proteomikkprosjekter for fremstilling av både omvendt fase (RP)8,9,10,11,12,13,14 og hydrofil interaksjon (HILIC)2 kapillære kolonner.
Her beskriver vi i detalj modifikasjonene som trengs for tilpasning av FlashPack-tilnærmingen til standard 100-bar trykkbombepakkeprosedyre.
Protocol
Pakkeprotokollen består av fem trinn (figur 1): 1) Klargjøring av pakkestasjon, 2) kapillærpreparat, 3) sorbent slamforberedelse, 4) kapillærpakning i trykkbomben og 5) kolonnepakning i HPLC-systemet, oppskjæring opp til størrelsen og UHPLC-tilkoblingsinstallasjonen. FlashPack-optimaliseringen krever justeringer i avsnitt 3 og 4 sammenlignet med den vanlige protokollen.
1. Montering av pakkestasjon
- Forbered en gasstank fylt med enten nitrogen, helium eller argon innredet med en entrinns gassregulator med utløpstrykket > 50 barer. Maksimalt trykk begrenses av trykkbombekompatibiliteten.
- Koble regulatoren til ventilasjonsventilen til trykkbomben.
- Hvis trykkbomben ikke er utstyrt med en integrert magnetisk rører, plasser bomben på en magnetisk rører.
- Koble en smal ID plastrør (f.eks. 0,13 mm) til lufteutløpet til trykkbomben og legg den i et kar med vann.
2. Kapillær forberedelse
- Forbered en fritted kapillær med en integrert glassfrit dannet fra Kasil og formamid15 eller en trukket emitter kapillær tilberedt av en lasertrekker16. Kapillæren er laget 10-15 cm lengre enn den tiltenkte kolonnelengden.
MERK: Se tabell 1 for drøfting av mulige problemstillinger knyttet til ulike kapillærstørrelser og frittyper. Tabell 2 inneholder et eksempel på et P2000 lasertrekkerprogram for å lage trekk-emitter kapillærer. - Beskytt en trukket emitterende med en kuttet gellastende pipettespiss.
- Klipp spissen slik at den passer tett rundt 360 μm OD kapillær (den kan flyttes langs kapillæren, men krever litt innsats for å gjøre det).
- Skyv pipettespissen på kapillæren fra den kapillære frontenden og flytt den opp til emitterenden.
- Skyv beskyttelsesspissen tilbake når kolonnen sprøytes. Skyv spissen fremover for å få senderenden inn i spissen når kolonnen ikke sprøytes (selv når kolonnen er under flyten, men fortsatt ikke sprøyter).
3. Sorbent slurry forberedelse
- Forbered et lager sorbent hetteglass: Legg ~ 50 mg tørr sorbent i et 1,5 ml sentrifugerør. Her brukes Reprosil Pur C18 som et eksempel.
- Tilsett 1 ml metanol i sorbentrøret.
- For å blande det helt, virvel røret i 10 s ved hjelp av en virvelblander.
- Soniker i et sonikeringsbad i 10 s.
- La sorbenten bli gjennomvåt grundig i 20-30 min. Deretter virvel og sonikere det igjen.
- Forbered et fungerende sorbent hetteglass. Bruk et konisk bunn hetteglass som passer inn i bomben.
MERK: Det kan enten være et annet 1,5 ml sentrifugerør eller et hvilket som helst annet hetteglass, avhengig av den spesielle trykkbombedesignen. For dette eksperimentet brukes konisk bunnskruehetterør kuttet til høyden på trykkbomben. - Resuspend sorbenten i lager sorbent hetteglasset og overfør 500 μL inn i det fungerende sorbent hetteglasset med en magnetstang på 2 x 3 mm størrelse.
- Tilsett metanol opp til ~ 1 ml til arbeids hetteglasset.
- La arbeidshette hetteglasset stå på bordet i 10 minutter for at sorbenten skal slå seg ned med tyngdekraften.
- Hvis det sorbente laget etter bosetting er under 4 mm, legg til mer av lageret sorbent slurry og vent på at sorbenten skal bosette seg i ytterligere 10 minutter.
MERK: Det forberedte arbeids hetteglasset er beregnet for tilberedning av flere kolonner over måneder. Hvis det fungerende sorbente hetteglasset forblir uten omrøring i mer enn 2 timer, må det virveliseres i 10 s, sonikeres i 10 s og avgjøres av tyngdekraften. Rutinemessig blir sorbenten resuspendert om morgenen før pakking. Deretter er det bra for pakking for hele dagen hvis det ikke er lange pauser mellom sekvensiell kolonnepakking. Hvis sorbenten i hetteglasset tørker ut, tilsett metanol, og kjør hele sorbentpreparatprosedyren som for lagersorbat hetteglasset (trinn 3.2-3.5).
4. Kapillær pakking i en trykkbombe
FORSIKTIG: Bruk alltid vernebriller når du arbeider med trykkbomben. Ikke bruk hansker. Disse reduserer sterkt følelsen av berøring som kreves for riktig håndtering av kapillærer med liten diameter og fører til feil.
- Plasser hetteglasset med sorbent i trykkbomben og fest alle mutterne tett.
- Start rotasjonen ved 60-100 o/min.
- Sett den frittede eller trukket emitterkapillæren inn i bomben: skyv den helt til bunnen av hetteglasset, og løft den deretter opp 2-3 mm og fest mutteren.
MERK: Påfør en minimum nødvendig kraft for å fikse kapillæren for å unngå kapillær- og ferruleskader. Det beste er håndstramming. Hvis en sekskantnøkkel brukes, må du påfør minimum tilstrekkelig innsats for stramming. - Kontroller om kapillæren er riktig festet - det må være umulig å flytte kapillæren ved å trekke den ut for hånd.
- Åpne trykkbombeventilen langsomt mens du holder den åpne enden av kapillæren vendt bort fra ansiktet ditt.
- Se de første trinnene i pakkeprosessen.
MERK: Umiddelbart ved trykksetting fyller sorbenten kapillæren og den blir ikke-gjennomsiktig for hele lengden. Så snart sorbenten begynner å pakke inne i den distale enden, øker tilbaketrykket, strømmen bremser og den jevne sorbent slurry inne i kapillærreformene i flere sorbentpakker skilt av sorbentfrie hull. Allerede pakket sorbent er synlig som en tett farget kontinuerlig voksende region. - Hold de sorbente fylte områdene til å være minst 70% av kapillærlengden med små sorbente frie hull for hele pakkeprosessens varighet.
- Det er flere vanlige problemer å se på under pakkeprosessen, som krever justering av oppsettet på flyet for å holde effektiv sorbent levering inn i kapillæren.
MERK: Flere detaljer om effektiviseringsjusteringen for sorbent-levering er beskrevet i tabell 3.- Problem 1: Når den nye sorbenten slutter å komme inn i kapillæren mens sorbenten som allerede er inne, fortsetter å bevege seg, følger du trinnene nedenfor.
MERK: Dette er det hyppigste problemet. I de fleste tilfeller blir kapillærinngangen blokkert av selvoppsamlerende sorbentklynger. Bruk følgende trinn én etter én til den sorbente flyten er gjenopprettet, og hopp deretter over resten av de problemrelaterte trinnene.- Øk rotasjonshastigheten til 500 rpm og reduser den umiddelbart tilbake til 60-100 rpm. Vanligvis gjenoppretter den den sorbente strømmen. Kontroller rotasjonshastigheten til minst 60 o/min for resten av pakkeprosessen.
- Hvis det ikke hjelper, ventiler pakkebomben kort og trykk den straks tilbake.
- Hvis det ikke hjelper eller blokkeringen skjer igjen, omplasser kapillæren inne i sorbentlaget. Fraværet av sorbenten kan skyldes at den kapillære åpne enden enten er for høyt over magnetstangen, slik at kolonneenden ikke berører den, eller kapillæren som stikker inn i hetteglassbunnen. Først luft bomben helt, løsne mutteren, skyv kapillæren til bunnen, og trekk den deretter 2 mm tilbake. Fiks mutteren.
- Hvis blokkeringen vedvarer, ventiler systemet, ta ut det sorbente hetteglasset og virvelen og soniker det igjen. Kontroller den kapillære frontenden for skader under mikroskopet og kutt ~5 mm av fronten om nødvendig.
- Utgave 2: Når sorbenten bare fyller en liten del av kapillæren med lange tomme områder, følger du trinnene nedenfor.
- Kontroller rotasjonshastigheten. Hvis rotasjonen er for langsom, er cupolabruddet ikke effektivt nok. Øk rotasjonshastigheten til ~ 150 rpm.
- Hvis rotasjonen er for rask, blir sorbenten resuspendert inn i det større hetteglassvolumet, og den lokale sorbentkonsentrasjonen rundt kolonneinngangen er lav. Senk rotasjonshastigheten ned til 60-100 RPM.
- Kontroller det sorbente nivået. Det samme problemet med lite sorbent inne i kapillæren observeres når det ikke er nok sorbent i hetteglasset. Når sorbenten blir brukt opp, fyll hetteglasset med den nye sorbenten for å holde det sorbente laget ikke mindre enn 4 mm høyt etter tyngdekraften.
- Problem 1: Når den nye sorbenten slutter å komme inn i kapillæren mens sorbenten som allerede er inne, fortsetter å bevege seg, følger du trinnene nedenfor.
- Fortsett å pakke kolonnen til målkolonnelengden pluss 5-7 cm oppnås.
- Stopp rotasjonen og trykk bomben veldig sakte.
- Åpne bombeventilen litt og vent til boblen brister inne i vannflasken for å avta. Deretter åpner du ventilen litt bredere og venter igjen på at boblen brister for å bremse ned.
- Slipp trykket i trinn til det ikke kommer gass ut av ventilen.
MERK: Ikke åpne ventilen helt på en gang - det vil føre til boblende inne i kapillæren og sorbenten som går tilbake i hetteglasset. Hvis det skjer, trykk bomben tilbake og vent til kolonnen blir pakket igjen.
- Når gassen slutter å komme ut av ventilasjonsventilen, ta den pakkede kapillæren ut av trykkbomben.
MERK: Ikke la søylen tørke ut. Hvis hplc-systemet ikke er koblet til umiddelbart for videre pakking, setter du den pakkede kapillæren på lager ved å senke den helt ned i 10 % EtOH-løsning. En flytende tett polypropylen matlagringsbeholder kan brukes til kapillær lagring. Frakoblede HPLC-kolonner lagres på samme måte. - Hvis det ikke planlegges ytterligere pakking, ta ut det sorbente hetteglasset fra bomben og lukk det tett. Behold den for ytterligere kolonnepakking.
5. Pakking i HPLC-kolonnen
- Koble den pakkede kapillæren til HPLC-systemet via en HPLC-tilkobling.
- Start strømmen ved 95% løsningsmiddel B (80 eller 100% acetonitril, 0,1% maursyre (FA)) rettet mot 250-300 bar trykk. For 40 cm pakket kapillær, bruk strømningshastigheten på 200-300 nL / min.
MERK: Emballasjestrømningshastigheten er 200 nL/min for 40-50 cm søyle med 100 μm ID fullpakket med 2 μm sorbent. Noen andre kolonnestørrelser er oppført i Tabell 4. Strømningshastigheter for andre kolonnelengder og IDer anslås ut fra den direkte proporsjonaliteten mellom ryggtrykket og kolonnelengden og tverrsnittet. Den nøyaktige flythastigheten justeres til den faktiske pakkede lengden, som som standard er lengre enn den angitte kolonnelengden. Vær også oppmerksom på at trykket på 300 bar er rettet mot den fysiske trykkgrensen for HPLC-tilkoblingen. For tilkoblinger med høyere trykk skal høyere strømningshastigheter opp til tilkoblingstrykkgrensen brukes til raskere pakking. - Se etter den løse sorbenten inne i kapillæren som blir pakket og blir lagt til den totale pakkede lengden.
- Uten å stoppe strømmen, dypp kolonnekroppen to ganger inn i sonikeringsbadet.
MERK: Ikke senk søyleendene og kapillære tilkoblinger bare en del av kolonneteksten. Sonikering trinn bidrar til å forbedre kolonne reproduserbarhet, spesielt for ekstremt lange kolonner >50 cm lang (upubliserte data); Det gir imidlertid en tilfeldig sjanse for å bryte den selvmontering sorbent frit inne i emitterenden av den trukket emitter kapillæren og blokkere kolonnen helt. Mens sonikering kan brukes universelt på glassfrie kolonner, foreslår vi at sonikering av trukket emitterkolonner bare for kolonnelengden > 50 cm. - Når den sorbente sengen slutter å krympe, dypp kolonnekroppen i sonikeringsbadet to ganger mer uten å stoppe strømmen.
- Kjør kolonnen i ytterligere 10 minutter på 300 barer.
- Stopp strømmen, vent til trykket faller til under tre stolper, og koble fra kolonnen.
- Undersøk kolonnen visuelt for mangel på hull og misfarginger. Hvis noen blir funnet, kan sonikering under strømmen gjentas. For kritiske eksperimenter bør du vurdere å lage en ny kolonne.
- Klipp kolonnen til ønsket lengde.
MERK: Riktig utført kutting er en forutsetning for kolonneeffektivitet. Lag et hakk i polyimidbelegg med skriveren, knekk kapillæren delvis og trekk to stykker fra hverandre. - Poler søylefronten på en keramisk wafer eller med lapping film.
- Koble kolonnen til LC-systemet på nytt ved hjelp av en UHPLC-tilkobling.
- Start arbeidsflythastigheten på 2 % B, avhengig av kolonne-IDen i henhold til tabell 4. Vent til trykket likevekter og sjekk kolonnens tilbaketrykk.
MERK: Arbeidsflythastigheten justeres i henhold til kolonneparametere. For eksempel kjøres en 30 cm lang 100 μm ID-kolonne på 500 nL / min. - Kontroller at tilbaketrykket er innenfor 5 % av forventet verdi (se tabell 5), Dette bekrefter at kolonnen er pakket riktig og klar til bruk.
MERK: Tilbakeslaget for kolonnen er det totale trykket i gradientkanalen til HPLC-systemet med kolonnen tilkoblet minus kapillærenes tilbaketrykk før kolonnen. Samtidig er verdiene i tabell 5 vilkårlige (de gir en vilkårlig skala av hva du kan forvente). Den intralaboratoriets likhet med tilbaketrykket fra kolonne til kolonne er en viktigere indikator på at alt fungerer som det skal. Det faktiske absolutte tilbaketrykket avhenger av mange parametere, for eksempel sorbent størrelse og egenskaper, kapillær-ID, produsent og batch, formen på den trukket emitterenden eller tettheten og lengden på glassfriten, løsningsmiddelegenskapene og omgivelsestemperaturen i rommet, etc. Hvis tilbaketrykket er for høyt, se tabell 1 for mulige problemer.
Representative Results
FlashPack-tilnærmingen er basert på standard pakkeoppsett og følger samme emballasjerørledning. Pakking gjøres i standard fritted eller trukket emitter kapillærer. Hovedoptimaliseringen ligger i den sorbente slurrykonsentrasjonen: standardmetoden er uforenlig med en høykonsentrert sorbent suspensjon som brukes i FlashPack. Resultatet er en rask produksjonsmetode for lange UHPLC-kolonner, for eksempel en kolonne pakket for 50 cm lengde med 1,9 μm sorbent i mindre enn 1 t (figur 2).
For å demonstrere anvendelsen av FlashPack-tilnærmingen ble det utarbeidet en 30 cm 100 μm ID kapillærkolonne (tabell 6). Pakking av ReprosilPur C18 1,9 μm sorbent ble gjort på 60 barer i en 50 cm lang 100 μm ID trukket emitter kapillær, utarbeidet av en P2000 lasertrekker. Kapillæren ble pakket til ~ 40 cm på 40 min med litt mer løs sorbent igjen inne i kapillæren. Den pakkede kapillæren var koblet til et HPLC-system og kjørte i 300 nL/min med løsningsmiddel B (80 % acetonitril, 0,1 % FA). Etter to runder med 5 s sonikering var den endelige pakkede lengden 43 cm. Kolonnen ble frakoblet, kuttet til 30 cm og koblet til HPLC-systemet ved hjelp av en UHPLC-tilkobling. Vi bruker rutinemessig 360 μm ermeløs PEEK mutter-ferrule og 360 μm rustfritt stål union. Denne kombinasjonen holder minst opptil 700 barer hvis den strammes sterkt. Den produserte kolonnen har et tilbaketrykk på 520 bar ved 2% løsningsmiddel B ved 500 nL / min, som er i samsvar med forventet verdiområde (Tabell 5).
Som en demonstrasjon av kolonneeffektiviteten brukte vi den produserte 30 cm kolonnen til å skille 50 fmol av et tryptisk fordøye av cytokrom C-protein i en 15 min gradient fra 2% til 50% B. Ekstraherte ionkromatogrammer viste at toppene var svært symmetriske med minimum tailing. Gjennomsnittlig FWHM var rundt 3 s (figur 3).
Tabell 1: Feilsøking for høyt arbeidende tilbakeslag i kolonnen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 2: P2000/F lasertrekkerprogram. P2000/F lasertrekker program for fremstilling av trukket emitter kapillærer fra 360 μm OD 100 μm ID smeltet silika polyimid belagt kapillærer uten innvendig belegg ved romtemperaturer 23-25 °C. Klikk her for å laste ned dette bordet.
Tabell 3: FlashPack-spesifikke pakkeproblemer og sjekkpunkter som skal kontrolleres under pakkeprosessen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 4: Eksemplarisk pakke- og arbeidsflythastighet for ulike kolonne-IDer og lengde. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 5: Forventet tilbaketrykk for en kolonne fullpakket med 2 μm sfæriske sorbenter og kjør med arbeidsflythastighet (i henhold til kolonne-ID) i RP-løsningsmiddelsystem hos RT. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tabell 6: Eksemplarisk pakking av 30 cm UHPLC-søyle. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Figur 1: Pakkeskjema for kapillære kolonner. Trinn 1 til 3 er forberedende, etterfulgt av trykkbombepakking og ferdig med HPLC-pakking. Trinn 3 og 4 endres for den ultraeffektive FlashPack-protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Emballasjehastighet for en fritted kapillær 100 μm ID med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm ved 100 barer i metanol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Ekstraherte ionkromatogrammer av tryptiske peptider av cytokrom C. Ekstraherte ionkromatogrammer av tryptiske peptider av cytokrom C etter separasjon av 50 fmol i 30 cm lang 100 mm ID trukket emitter kapillær kolonne fullpakket med ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm i en gradient av buffer B (80% acetonitrile, 0,1 % FA) og i buffer A (2 % acetonitril, 0,1 % FA) fra 2 % til 40 % B på 15 minutter ved 500 nL/min ved RT. Deteksjon ble utført ved hjelp av et massespektrometer. Absolutte intensiteter og ekstraherte m/z-områder for hvert peptid vises til høyre for spektra. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Discussion
Innebygd kapillær kolonne pakking er svært populært i store laboratorier som jobber med flere uavhengige prosjekter. En vanlig pakkemetode fra en sorbent suspensjon med lav konsentrasjon har imidlertid store begrensninger i hastigheten og kan ikke produsere lange UHPLC-kolonner.
FlashPack er en modifikasjon av standard pakkeprosedyre som gjør pakking fra en svært høy sorbent konsentrasjon mulig. Det teoretiske grunnlaget for metoden ligger i den kontinuerlige sorbente cupola destabiliseringen ved kolonneinngangen for hele pakkevarigheten. Sistnevnte oppnås teknisk ved at kolonneinngangen kontinuerlig blir truffet med en magnetstang. Metoden for cupola destabilisering er med vilje utviklet for å få pakkeoppsettet helt lik den vanlige pakkeprosessen, men trikset med FlashPack ligger i detaljene i den sorbente slurrypreparatet, kapillær posisjonering og magnetstangbruk under pakkeprosessen.
Den sorbente slurry fremstilles som et sediment sorbent lag i et stort løsningsmiddelvolum. Det er interessant at trykkbombebasert pakking ikke krever de samme pakkebetingelsene for kolonne til kolonne. I FlashPack kjenner vi aldri den eksakte sorbente slurrykonsentrasjonen rundt kolonneinngangen. Det er umulig å måle og kontrollere nøyaktig, da det også endres under pakkeprosessen. Imidlertid er de endelige kolonnene fortsatt svært reproduserbare4 uavhengig av hvordan pakkingen ble oppnådd.
Grunnlaget for rask pakking ligger i effektiv sorbent cupola destabilisering. Av denne grunn er det viktig å kontrollere sorbent inn i kapillæren og opprettholde de optimale cupola destabiliseringsforholdene gjennom hele emballasjevarigheten. Det er flere mulige problemer som kan forhindre effektiv sorbent levering. Noen eksempler på disse er sorbent lag resuspension ved rask magnetisk bar rotasjon, ineffektiv cupola destabilisering på grunn av enten feil relativ kapillær til magnet bar posisjonering eller for langsom magnet bar rotasjon. Problemstillingene selv og hvordan de skal løses diskuteres i detalj i protokolldelen.
Når kolonnen er pakket, er den viktigste kolonneparameteren som skal kontrolleres, tilbaketrykket for kolonnen. Trykkverdiene som er oppført i tabell 5 gir et referansepunkt til hva som forventes for en av de populære sub 2 μm perlestørrelse sorbent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Samtidig kan ytterligere tilbaketrykk legges til av friten eller en for smalt trukket emitter, og man bør hele tiden overvåke for det. Hvis pakking gjøres i en trukket emitter, foreslår vi fortsatt å måle forventet kolonne backpressure for den spesielle sorbent i bruk ved å pakke fritted kapillærer først, og deretter for å se om den selvmontering frit legger til for mye. For eventuelle høytrykksproblemer, bruk retningslinjene i tabell 1 for å finne problemet.
Vår erfaring er at en pakket kolonne uten misfarginger, hull og med riktig backpressure fungerer i 100% av tilfellene og gir separasjonskvaliteten nær det som kan forventes fra kolonnelengden og sorbente egenskaper. En kolonne med misfarginger er ikke garantert å fungere ordentlig, men kan fortsatt gi tilfredsstillende resultater.
Mesteparten av tiden, hvis det er noen problemer med separasjonskvaliteten, kommer de ikke fra selve kolonnen, men heller fra andre deler av separasjonssystemet, nemlig pumper, løsningsmidler eller tilkoblinger. Spesielt potensielt skadelig er eventuelle tilkoblinger etter kolonnen. Dårlig forbindelse med et dødt volum mellom emitteren og den frittede kolonnen fører til stor topp utvidelse og tailing på grunn av svært lave strømningshastigheter i kapillær kromatografi.
Et annet viktig problem som er spesifikt for FlashPack-tilnærmingen, er at den bruker mange dyre sorbenter i et fungerende sorbent slurry hetteglass. Husk at den sorbente slurryen i FlashPack er beregnet for flerbruk. Ta vare på sorbenten. Unngå unødvendig magnetstangrøring for å redusere sorbent sliping-husk å stoppe rotasjonen så snart emballasjen er ferdig. Og ikke la det åpne sorbente hetteglasset ligge i trykkbomben for å unngå sorbent tørking. Selv om sorbenten fortsatt kan brukes etter det, tar det tid å gjenskape den sorbente slurryen.
Metoden fungerer like bra for både fritted kapillærer og pulled-emitter kapillærer. FlashPack-prinsippet øker emballasjehastigheten for kapillære IDer fra 20 til 250 μm (mindre og større ble ikke testet). Det gjelder også alle sorbentene, både fullt og overfladisk porøse, vi kunne teste (reflekterer at den sorbente cupolaformasjonen i høy sorbent slurry konsentrasjon ikke er begrenset spesielt til RP-sorbenter). Dessuten påvirker løsningsmiddelparametere tydelig pakkingen i henhold til deres fysiske og kjemiske egenskaper. For eksempel gir mindre viskøs aceton enda høyere emballasjehastighet enn metanol ved samme pakketrykk. Imidlertid er det også mindre polart enn metanol og reduserer sorbente partikler som holder seg til hverandre. Effekten i seg selv forhindrer sorbent cupoladannelse i begynnelsen av pakningen når strømningshastigheten fortsatt er høy. Reduksjon i sorbent partikkelinteraksjon fører imidlertid også til mindre pålitelig selvmontering av fritformasjon og hyppigere trukket-end blokkering under pakkingen. Så, mens aceton er bedre for pakking av fritted kapillærer, er den mindre egnet for pulled-emitter kapillærer, med metanol som et slurry løsningsmiddel som er langsommere, men egnet for begge typer slutt. Pakking fra heksan eller dichloromethane (DCM) er ekstreme tilfeller av å bytte til aceton fra metanol: de er enda mindre polare, så de forhindrer sorbent cupoladannelse helt, men de er ikke egnet for trukket emitterpakking i det hele tatt. Dessuten ble det bemerket at ekstremt lav DCM-polaritet fører til at sorbente partikler stikker til den indre kapillærveggen og lager et tykt lag på den. Lagtykkelsen vokser gradvis og tilfeldige lokale blokker dannes, noe som resulterer i kolonnen pakket i flere deler atskilt av regioner uten sorbent. Slik effekt ble observert for C18 PeptidE Aeris sorbent.
Et annet observert problem var YMC Triart C18 sorbent ikke blir suspendert i metanol riktig, men å danne en slags flak. Det forhindrer imidlertid ikke at den blir fullpakket med FlashPack og gir veldig anstendig separasjonseffektivitet (upubliserte data). Således, selv om det ikke var optimalt for noen tilfeller, var metanol det mest universelle løsningsmidlet som fungerte for alle testede sorbenter og kolonner. Det er nødvendig å nevne at vi ennå ikke analyserte hvordan forskjellige slurry løsemidler påvirker kolonneseparasjonseffektiviteten. Samtidig er effektiviteten til kolonner pakket fra metanol allerede helt lik kommersielle kolonner for samme sorbents4.
FlashPack er ikke den eneste eksisterende tilnærmingen for å forbedre emballasjehastigheten til UHPLC-kolonner. Rask pakking fra høy sorbent slurry konsentrasjon er også mulig ved bruk av ultra-høytrykk pakking7. Fordelen med FlashPack er at den er mye enklere, da den ikke krever spesielle ultrahøytrykkspumper og trykkbomber for sorbent levering og kapillære tilkoblinger. Samtidig ble det demonstrert at kolonnene pakket ved ekstreme trykk kan ha separasjonseffektivitet høyere enn lavere trykkpakkede kolonner17. Og mens FlashPack produserer kolonner som er identiske med kommersielle som brukes i sammenligningen4, som vi ikke kjenner pakkemetoden for, ble den ennå ikke testet hvordan FlashPack-kolonner står mot ultrahøytrykkspakkede kolonner.
Oppsummert kan den beskrevne FlashPack-metoden enkelt tilpasses den eksisterende pakkeprotokollen i laboratoriet med noen justeringer i protokollen, mens oppsettet forblir helt det samme. Den fremskynder HPLC kapillærkolonnepakking til minutter og tillater produksjon av lange UHP kapillærkolonner, noe som er helt klart umulig med standard pakkeprosedyre. Den samlede økonomien i tid og penger for laboratoriet ved bruk av FlashPack-tilnærmingen kan telles i titusenvis av euro per år. I tillegg åpner muligheten til å produsere UHP kapillære kolonner lokalt mulighetene for eksperimenttilpasning umulig med de tilgjengelige kommersielle produktene.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Arbeidet ble støttet av RSF grant 20-14-00121. Forfatterne takker P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) for fruktbare diskusjoner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59002 | |
| centrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | ||
| Ceramic Scoring Wafer | Restek | 20116 | any ceramic wafer is suitable for capillary polishing |
| Diamond-chip bladed scribe | NewObjective | Diamond-chip bladed scribe | recommended for capillary cutting |
| fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD | CM Scientific | TSP100375 | |
| GELoader tips | Eppendorf | 30001222 | |
| HPLC system | ThermoScientific | Ultimate3000 RSLCnano | |
| laser puller | Sutter | P2000/F | |
| magnet bar 2x5 mm | Merck | Z283819 | |
| MeOH | Merck | 1.06018 | |
| microspatula | Merck | Z193216 | |
| PEEK ferrule 360 mm | VICI | JR-C360NFPK | use to connect the column to UPLC union |
| pipette tip, 1000 uL | Merck | Z740095 | |
| pipette, 1000 uL | Gilson | Pipetman L P1000L | |
| pressure bomb | NextAdvance | PC-77 MAG | |
| regulator | GCE | Jetcontrol 600 200/103 | |
| Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm | Dr. Maisch | r13.aq.0001 | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL | Merck | AXYST050SS | |
| Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL | Merck | AXYST150SS | |
| Screw caps with O-rings | Merck | AXYSCOC | |
| sonication bath | Elma | Elmasonic S30 H | |
| union HPLC | VICI | JR-C360RU1PK6 | HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| union UPLC | VICI | JR-C360RU1FS6 | UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column |
| vortex | BioSan | V-1plus | |
| Water with 0.1% (v/v) Formic acid | Merck | 1.59013 |
References
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Now Coon, J. J. Now, more than ever, proteomics needs better chromatography. Cell Systems. 3 (4), 321-324 (2016).
- Shliaha, P. V., et al. Middle-down proteomic analyses with ion mobility separations of endogenous isomeric proteoforms. Analytical Chemistry. 92 (3), 2364-2368 (2020).
- Pressure injection cells - next advance - laboratory instruments. , Available from: https://www.nextadvance.com/pressure-injection-cells-lc-ms-capillary-column-packing-loader/?target=Overview (2021).
- Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. FlashPack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (2), 383-390 (2019).
- MacNair, J. E., Lewis, K. C., Jorgenson, J. W. Ultrahigh-pressure reversed-phase liquid chromatography in packed capillary columns. Analytical Chemistry. 69 (6), 983-989 (1997).
- Bruns, S., et al. Slurry concentration effects on the bed morphology and separation efficiency of capillaries packed with sub-2 µm particles. Journal of Chromatography. A. 1318, 189-197 (2013).
- Godinho, J. M., Reising, A. E., Tallarek, U., Jorgenson, J. W. Implementation of high slurry concentration and sonication to pack high-efficiency, meter-long capillary ultrahigh pressure liquid chromatography columns. Journal of Chromatography. A. 1462, 165-169 (2016).
- Andrzejczak, O. A. The effect of phytoglobin overexpression on the plant proteome during nonhost response of barley (Hordeum vulgare) to wheat powdery mildew (Blumeria graminis f. sp. tritici). Scientific Reports. 10 (1), 9192 (2020).
- Elchaninov, A., et al. Comparative analysis of the transcriptome, proteome, and miRNA profile of kupffer cells and monocytes. Biomedicines. 8 (12), 627 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Draft genome sequences of Hirudo medicinalis and salivary transcriptome of three closely related medicinal leeches. BMC Genomics. 21 (1), 331 (2020).
- Babenko, V. V., et al. Identification of unusual peptides with new Cys frameworks in the venom of the cold-water sea anemone Cnidopus japonicus. Scientific Reports. 7 (1), 14534 (2017).
- Loughran, G., et al. Unusually efficient CUG initiation of an overlapping reading frame in POLG mRNA yields novel protein POLGARF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (40), 24936-24946 (2020).
- Radzisheuskaya, A., et al. PRMT5 methylome profiling uncovers a direct link to splicing regulation in acute myeloid leukemia. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (11), 999-1012 (2019).
- Rubtsova, M., et al. Protein encoded in human telomerase RNA is involved in cell protective pathways. Nucleic Acids Research. 46 (17), 8966-8977 (2018).
- Maiolica, A., Borsotti, D., Rappsilber, J. Self-made frits for nanoscale columns in proteomics. PROTEOMICS. 5 (15), 3847-3850 (2005).
- Ishihama, Y., Rappsilber, J., Andersen, J. S., Mann, M. Microcolumns with self-assembled particle frits for proteomics. Journal of Chromatography. A. 979 (1-2), 233-239 (2002).
- Shishkova, E., Hebert, A. S., Westphall, M. S., Coon, J. J. Ultra-high pressure (>30,000 psi) packing of capillary columns enhancing depth of shotgun proteomic analyses. Analytical Chemistry. 90 (19), 11503-11508 (2018).
