Summary
苹果浆细胞的分离原体装有荧光钙试剂,以检测细胞质Ca2+ 浓度。
Abstract
细胞溶胶 Ca2+在植物开发中起着关键作用。钙成像是检测细胞质中 Ca2+动态变化的最通用方法。在这项研究中,我们通过酶水解获得了纸浆细胞的可行原体。分离的原质在37°C下用小分子荧光试剂(Fluo-4/AM)孵育30分钟。 荧光探针成功地染色了细胞溶胶Ca2+,但没有积聚在真空中。La3+, Ca2+通道阻滞剂, 降低细胞质荧光强度.这些结果表明,Fluo-4/AM可用于检测果肉中细胞溶胶 Ca2+的变化。总之,我们提出了一种方法,通过在果肉细胞的细胞质中加载小分子荧光钙试剂,有效地将原质从水果的肉细胞中分离出来,并检测Ca2+。
Introduction
Ca2+在植物信号转导和代谢1、2中起着重要作用。此外,它调节水果质量特征3,4,包括硬度,糖含量,和易感性生理障碍在存储过程中5,6。细胞质Ca2+在信号转导中起着重要作用,调节植物生长发育。细胞钙质平衡的干扰可诱发苹果苦坑8个,梨9个棕色斑点病,西红柿脐腐烂10个,影响水果质量,造成严重经济损失3,11。钙成像具有足够的空间和时间分辨率,是观察活细胞12、13中Ca2+动力学的重要方法。
目前,活细胞细胞内钙成像主要有两种方法:一种采用化学小分子荧光探针14,另一种采用基因编码传感器(GECI)15、16。由于在果树中难以建立稳定的转基因系统和更长的果树发育,GECIS不适合果树Ca2+荧光成像。
小分子荧光探针,如Fluo-4/AM有一个特别的优势:他们的AM酯形式(细胞渗透乙酰酯衍生物)可以很容易地批量载入活细胞,而无需转染,这使得它灵活,快速,非细胞毒性17。Fluo-4/AM可以成功地装载到皮鲁斯皮里福利亚18和佩妮,19的花粉管,以及守卫细胞20和根毛的阿拉伯21。
目前,关于纸浆细胞钙荧光染色的报告很少。钙作为一种重要的矿物质元素,在苹果等树果的生长和质量控制中起着关键作用。苹果树被全球公认为重要的经济物种,苹果被认为是一种健康食品。在这项研究中,我们通过酶水解从苹果果浆中获得了可行的原质,然后将小分子荧光试剂装入细胞质中,以检测Ca2+。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 前列座提取
- 准备基本解决方案:20 mM CaCl 2,5mM 2-(N-形态)乙醇酸和0.4M D-索比托。
注:基本溶液的 pH 值调整为 5.8,带有 0.1 M Tris 缓冲器,通过 0.22 μm 水溶性滤清器过滤,并存储在 4 °C 下。 - 准备酶溶液:将 0.3%(w/v) 马塞罗酶 R-10 和 0.5%(w/v) 纤维酶 R-10 与基本溶液混合。
- 将 0.5 mL 的酶溶液加入 1.5 mL 离心机管中。挑选一个健康成熟的苹果。然后将纸浆切成 10 x 5 x 1 mm3尺寸(图 1A-1C)。
- 将苹果果浆片放入含有酶溶液的1.5mL离心机管中,然后关闭管子(图1D)。
- 在 28 °C 下孵育管子 1 小时,在黑暗中的摇床中以 70 rpm/min 的速度摇晃。
- 洗纸浆片。吸气所有酶溶液,然后加入 0.5 mL 的基本溶液。
- 离心机在300 x g 在室温下2分钟。
- 要获得前端悬架,从离心机管底部(图 1E)吸气溶液。
2. 小分子钙离子荧光染色
- 准备 Fluo-4/AM 装载解决方案,配备 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127 和 10 倍磷酸盐缓冲盐水(PBS:80 mM Na2HPO 4、1.36 M NaCI、20 mM KH2PO4和 26 mM KCI)的比例为 1:1:2。
- 在 1.5 mL 离心机管中加入 1 μL 的 Fluo-4/AM 装载解决方案,加入 99 μL 的原顶悬架。确保荧光染料的最终浓度为 5 μM。混合溶液,然后关闭管子。
- La3+ 处理:准备 100 μM La3+ 解决方案,配备 98 μL 的前端悬架、1 μL 的 10 mM La3+和 1 μL 的 Fluo-4/AM 装载解决方案。混合溶液并关闭管子。
- 在黑暗中37°C孵育30分钟。
- 在室温下,用离心机将原质洗净 300 x g,2 分钟。吸气 70 μL 的解决方案,并添加 70 μL 的基本解决方案。
- 在 37 °C 下孵化前置悬架 30 分钟,以完全去酯化。
- 吸气 15 μL 的前列座悬架,并滴到幻灯片上。
- 在荧光显微镜下观察(补充图S1)。
注:使用具有高灵敏度的彩色摄像头,即 3.2 MP(2048 x 1536)CMOS 传感器,分辨率为 3.45 μm。 - 选择 GFP 视道进行成像(20 倍)。将亮度设置为 0.5。
注:照明是可调强度的 LED 光立方体,具有集成的硬涂层滤光片集。Fluo-4/AM 的激发波长为 490 nm。
3. 前列肌生存能力检测
- 准备氟辛二乙酸酯 (FDA) 库存溶液:用丙酮溶解 FDA,直到最终浓度为 1 毫克/毫升。
- 准备FDA工作解决方案与1微升的库存解决方案和99微升的丙酮。
- 将 1 μL 的 FDA 工作解决方案添加到 99 μL 的前列体悬架中。通过上下管道混合溶液,然后关闭管子。
注:FDA的最终浓度为100微克/升。 - 在室温下在黑暗中污渍5分钟。
- 准备幻灯片,并在荧光显微镜下观察。
- 选择 GFP 视道进行成像(图 1F)。
4. 图像分析
- 使用图像分析和电子表格软件(例如,图像专业版 Plus 和 Excel 2010)分析已获得的图像。
- 从原质中选择两个垂直直径来计算荧光强度(补充图S2)。测量了不同治疗下所有原质的荧光强度。对于最终处理,请使用照片编辑软件。
5. 统计分析
- 使用统计软件(补充图 S3)执行统计分析。数据以平均± SD 形式提供。学生的 t测试用于分析实验组之间的差异。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
按照上述协议,我们使用酶方法从纸浆中获取可行的原质(图1)。有些原体有真空,而另一些没有。当Ca2+ 荧光指示器没有加载到原位时,原质没有荧光。当Flo-4/AM被加载到原质中时,细胞质,而不是真空,变成了荧光(图2)。这一结果表明,Fluo-4/AM成功地在细胞质中染色了Ca2+, 并且没有观察到24的隔膜化。原质被FDA染色5分钟,并显示出细胞质荧光。这表明高温(37 °C)不会影响原位生存能力。
La3+是 Ca2+ 通道 25的阻塞剂,当 Fluo-4/AM 被加载到原质中时,它被添加。在 100 μM 下,La3+降低钙荧光强度(图 3)。
图1:酶水解获得的原质。 (A) 一块从成熟的苹果中切出。(B) 原质是从纸浆片中提取的。(C) 纸浆被切成10×5×1毫米3 片。(D) 纸浆片被放置在装有0.5mL酶溶液的离心机管中。(E) 原体。箭头指向前端,箭头表示前顶的真空。(F) 原质在室温下被FDA染色5分钟。(这个数字已经从参考 22 修改 [园艺研究:加载钙荧光探针到原质检测钙在 马鲁斯家居的肉组织细胞]。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2:将Flo-4/AM和La3+ 加载到原质中。 (A) 控制:无任何加载荧光探针的原体。(B) 装有氟-4/AM的原体。(C) La3+ 是在原体装载氟-4/AM时添加的。La3+ 的最终浓度为 100 μM。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3:原体荧光强度统计分析。 表示学生 t测试(P <0.001)的显著差异。垂直条表示± SD。每个数据点表示 20 个原质的平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充图S1:荧光显微镜。 (A) 荧光显微镜的整体外观。(B) 设置页。选择20倍目标,GFP通道,并统一调整亮度到0.5。(C) 荧光激发区。 请点击这里下载此文件。
补充图 S2:用于计算果细胞前端的 Ca2+ 荧光强度的步骤。本研究中使用的荧光强度单位基于先前的报告26、27、28、29。计算过程如下:(A) 打开软件中的前列荧光图像。单击测量工具。从下拉菜单选择配置文件线。(B) 在"线配置文件"窗口中选择圆。使用此画一个椭圆形在前顶。(C) 在行配置文件窗口中,现在选择文件|出口数据(D) 通过单击数据导出,确保打开空白电子表格和导入数据。使用"平均"函数计算平均荧光强度。每次治疗重复三次,每次超过20个原质。请点击这里下载此文件。
补充图 S3:数据统计是使用统计分析软件执行的。 将数据粘贴到表中,然后单击 "分析 "进行数据分析。 请点击这里下载此文件。
补充图S4:从其他品种的苹果的纸浆中提取原质。 (A) 杜南。(B) 蜂蜜脆。 请点击这里下载此文件。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项研究中,通过酶水解获得了可行的原体。请注意,这种方法需要新鲜的苹果。本协议允许将大量原质从果浆中快速分离,用于研究。此方法的适用性不仅限于"富士":"杜南"和"蜂蜜脆"的苹果浆的原体也可以通过相同的协议提取(补充图S4)。酶溶解后的前端溶液包含细胞碎片,与以前的方法相比有所改进。作为一种必需的细胞材料,苹果浆原体可用于细胞蛋白表达技术、单细胞测序等研究。
植物细胞30中化学荧光试剂染色的方法有很多。例如,Fluo-3/AM 是在低温 (4 °C) 下加载的,因此它会进入根尖细胞31。Fluo-3/AM 也可以在高温 (37 °C) 下装载到花粉管32中。Fluo-4/AM 已成功装载到 皮鲁斯皮里福利亚 花粉管 (25 °C 15 分钟)18 和阿拉比多普西斯根毛 (4 °C 代表 30 分钟)33.然而,这些方法不适合染苹果浆原质。在这项研究中,我们成功地将荧光探针加载到高温(37°C)的原体中。此外,目前的方法简单、快速、准确,不影响前列体的活力。建议方法的关键步骤是清洗染色原质并孵育30分钟。染色后,原体应清洗。洗涤将减少观察期间的背景荧光,以便更准确地计算原质的荧光强度。孵育30分钟,让更多的探头被加载到原质。请注意,在加载过程中避免光线暴露至关重要。
La3+ 是学习 Ca2+的重要工具。它与细胞质膜 Ca2+ -ATPase 上的 Mg2+催化部位结合,从而抑制 Ca2+-ATPase的稳定状态周转,并阻断 Ca2+ 跨膜功能34。La3+ 治疗可减少细胞质 Ca2+,Fluo-4/AM 可反映这一变化,排除其他二元化剂的干扰,并验证化学荧光试剂的可行性。
尽管这种加载方法比其他方法具有更多的优势,但在数据结果的转化方面仍需进一步改进。在这里,我们通过检测原质的荧光值来估计相对细胞质Ca2+ 含量,这是定性数据,而不是定量数据。因此,在以后的研究中,将染色结果转化为特定的细胞质Ca2+ 含量尤为重要,这可以为分析水果Ca2+ 信号提供研究依据。
总之,此处描述的方法可以检测苹果浆细胞中的细胞质Ca2+, 从而为果浆细胞钙的相关研究提供技术支持。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者声明他们与本文内容没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了山东省农业品种改良项目(2019LZGC007)和山东现代农业产业技术体系果树创新团队(SDAIT-06-05)的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |
References
- Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569 (2016).
- Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
- Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
- Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
- Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
- Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
- Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
- Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
- Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
- Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
- Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
- Grienberger, C., Konnerth, A.
Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012). - Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83 (2013).
- Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320 (2016).
- Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
- Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
- Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
- Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91 (2020).
- Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5 (2004).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B.
Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999). - Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
- Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511 (2008).
- DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
- Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
- Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647 (2014).
- Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
- Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
- Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53 (2010).
- Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).