在苹果纸浆中用 Fluo-4/AM 染色细胞质 Ca²⁺

Summary

苹果浆细胞的分离原体装有荧光钙试剂，以检测细胞质Ca²⁺ 浓度。

Abstract

细胞溶胶 Ca²⁺在植物开发中起着关键作用。钙成像是检测细胞质中 Ca²⁺动态变化的最通用方法。在这项研究中，我们通过酶水解获得了纸浆细胞的可行原体。分离的原质在37°C下用小分子荧光试剂（Fluo-4/AM）孵育30分钟。 荧光探针成功地染色了细胞溶胶Ca^2+，但没有积聚在真空中。La³⁺， Ca²⁺通道阻滞剂， 降低细胞质荧光强度.这些结果表明，Fluo-4/AM可用于检测果肉中细胞溶胶 Ca²⁺的变化。总之，我们提出了一种方法，通过在果肉细胞的细胞质中加载小分子荧光钙试剂，有效地将原质从水果的肉细胞中分离出来，并检测Ca^2+。

Introduction

Ca²⁺在植物信号转导和代谢^1、2中起着重要作用。此外，它调节水果质量特征^3，4，包括硬度，糖含量，和易感性生理障碍在存储^{过程中5，6。}细胞质Ca²⁺在信号转导中起着重要作用，调节植物生长发育^。细胞钙质平衡的干扰可诱发苹果^苦坑8个，梨⁹个棕色斑点病，西红柿脐腐烂¹⁰个，影响水果质量，造成严重经济损失^3，11。钙成像具有足够的空间和时间分辨率，是观察活细胞^12、13中Ca²⁺动力学的重要方法。

目前，活细胞细胞内钙成像主要有两种方法：一种采用化学小分子荧光探针^14，另一种采用基因编码传感器（GECI）15、16。由于在果树中难以建立稳定的转基因系统和更长的果树发育，GECI_S不适合果树Ca²⁺荧光成像。

小分子荧光探针，如Fluo-4/AM有一个特别的优势：他们的AM酯形式（细胞渗透乙酰酯衍生物）可以很容易地批量载入活细胞，而无需转染，这使得它灵活，快速，非细胞毒性^17。Fluo-4/AM可以成功地装载到皮鲁斯皮里福利亚¹⁸和佩妮^，19的花粉管，以及守卫细胞²⁰和根毛的阿拉伯^21。

目前，关于纸浆细胞钙荧光染色的报告^很少。钙作为一种重要的矿物质元素，在苹果等树果的生长和质量控制中起着关键作用。苹果树被全球公认为重要的经济物种，苹果被认为是一种^{健康食品。}在这项研究中，我们通过酶水解从苹果果浆中获得了可行的原质，然后将小分子荧光试剂装入细胞质中，以检测Ca²⁺。

Protocol

1. 前列座提取

1. 准备基本解决方案：20 mM CaCl 2，5mM 2-（N-形态）乙醇酸和0.4M D-索比托。
   注：基本溶液的 pH 值调整为 5.8，带有 0.1 M Tris 缓冲器，通过 0.22 μm 水溶性滤清器过滤，并存储在 4 °C 下。
2. 准备酶溶液：将 0.3%（w/v） 马塞罗酶 R-10 和 0.5%（w/v） 纤维酶 R-10 与基本溶液混合。
3. 将 0.5 mL 的酶溶液加入 1.5 mL 离心机管中。挑选一个健康成熟的苹果。然后将纸浆切成 10 x 5 x 1 mm³尺寸（图 1A-1C）。
4. 将苹果果浆片放入含有酶溶液的1.5mL离心机管中，然后关闭管子（图1D）。
5. 在 28 °C 下孵育管子 1 小时，在黑暗中的摇床中以 70 rpm/min 的速度摇晃。
6. 洗纸浆片。吸气所有酶溶液，然后加入 0.5 mL 的基本溶液。
7. 离心机在300 x g 在室温下2分钟。
8. 要获得前端悬架，从离心机管底部（图 1E）吸气溶液。

2. 小分子钙离子荧光染色

1. 准备 Fluo-4/AM 装载解决方案，配备 2 mM Fluo-4/AM， 20% F-127 和 10 倍磷酸盐缓冲盐水（PBS：80 mM Na₂HPO 4、1.36 M NaCI、20 mM KH₂PO₄和 26 mM KCI）的比例为 1：1：2。
2. 在 1.5 mL 离心机管中加入 1 μL 的 Fluo-4/AM 装载解决方案，加入 99 μL 的原顶悬架。确保荧光染料的最终浓度为 5 μM。混合溶液，然后关闭管子。
3. La³⁺ 处理：准备 100 μM La³⁺ 解决方案，配备 98 μL 的前端悬架、1 μL 的 10 mM La³⁺和 1 μL 的 Fluo-4/AM 装载解决方案。混合溶液并关闭管子。
4. 在黑暗中37°C孵育30分钟。
5. 在室温下，用离心机将原质洗净 300 x g，2 分钟。吸气 70 μL 的解决方案，并添加 70 μL 的基本解决方案。
6. 在 37 °C 下孵化前置悬架 30 分钟，以完全去酯化。
7. 吸气 15 μL 的前列座悬架，并滴到幻灯片上。
8. 在荧光显微镜下观察（补充图S1）。
   注：使用具有高灵敏度的彩色摄像头，即 3.2 MP（2048 x 1536）CMOS 传感器，分辨率为 3.45 μm。
9. 选择 GFP 视道进行成像（20 倍）。将亮度设置为 0.5。
   注：照明是可调强度的 LED 光立方体，具有集成的硬涂层滤光片集。Fluo-4/AM 的激发波长为 490 nm。

3. 前列肌生存能力检测

1. 准备氟辛二乙酸酯 （FDA） 库存溶液：用丙酮溶解 FDA，直到最终浓度为 1 毫克/毫升。
2. 准备FDA工作解决方案与1微升的库存解决方案和99微升的丙酮。
3. 将 1 μL 的 FDA 工作解决方案添加到 99 μL 的前列体悬架中。通过上下管道混合溶液，然后关闭管子。
   注：FDA的最终浓度为100微克/升。
4. 在室温下在黑暗中污渍5分钟。
5. 准备幻灯片，并在荧光显微镜下观察。
6. 选择 GFP 视道进行成像（图 1F）。

4. 图像分析

1. 使用图像分析和电子表格软件（例如，图像专业版 Plus 和 Excel 2010）分析已获得的图像。
2. 从原质中选择两个垂直直径来计算荧光强度（补充图S2）。测量了不同治疗下所有原质的荧光强度。对于最终处理，请使用照片编辑软件。

5. 统计分析

1. 使用统计软件（补充图 S3）执行统计分析。数据以平均± SD 形式提供。学生的 t测试用于分析实验组之间的差异。

Representative Results

按照上述协议，我们使用酶方法从纸浆中获取可行的原质（图1）。有些原体有真空，而另一些没有。当Ca²⁺ 荧光指示器没有加载到原位时，原质没有荧光。当Flo-4/AM被加载到原质中时，细胞质，而不是真空，变成了荧光（图2）。这一结果表明，Fluo-4/AM成功地在细胞质中染色了Ca^2+， 并且没有观察到²⁴的隔膜化。原质被FDA染色5分钟，并显示出细胞质荧光。这表明高温（37 °C）不会影响原位生存能力。

La³⁺是 Ca^{2+ 通道 25}的阻塞剂，当 Fluo-4/AM 被加载到原质中时，它被添加。在 100 μM 下，La³⁺降低钙荧光强度（图 3）。

图1：酶水解获得的原质。 （A） 一块从成熟的苹果中切出。（B） 原质是从纸浆片中提取的。（C） 纸浆被切成10×5×1毫米³ 片。（D） 纸浆片被放置在装有0.5mL酶溶液的离心机管中。（E） 原体。箭头指向前端，箭头表示前顶的真空。（F） 原质在室温下被FDA染色5分钟。（这个数字已经从参考 ²² 修改 [园艺研究：加载钙荧光探针到原质检测钙在 马鲁斯家居的肉组织细胞]。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2：将Flo-4/AM和La³⁺ 加载到原质中。 （A） 控制：无任何加载荧光探针的原体。（B） 装有氟-4/AM的原体。（C） La³⁺ 是在原体装载氟-4/AM时添加的。La³⁺ 的最终浓度为 100 μM。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3：原体荧光强度统计分析。 表示学生 t测试（P <0.001）的显著差异。垂直条表示± SD。每个数据点表示 20 个原质的平均值。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图S1：荧光显微镜。 （A） 荧光显微镜的整体外观。（B） 设置页。选择20倍目标，GFP通道，并统一调整亮度到0.5。（C） 荧光激发区。 请点击这里下载此文件。

补充图 S2：用于计算果细胞前端的 Ca²⁺ 荧光强度的步骤。本研究中使用的荧光强度单位基于先前的报告26、27、28、29。计算过程如下：（A） 打开软件中的前列荧光图像。单击测量工具。从下拉菜单选择配置文件线。（B） 在"线配置文件"窗口中选择圆。使用此画一个椭圆形在前顶。（C） 在行配置文件窗口中，现在选择文件|出口数据（D） 通过单击数据导出，确保打开空白电子表格和导入数据。使用"平均"函数计算平均荧光强度。每次治疗重复三次，每次超过20个原质。请点击这里下载此文件。

补充图 S3：数据统计是使用统计分析软件执行的。 将数据粘贴到表中，然后单击 "分析 "进行数据分析。 请点击这里下载此文件。

补充图S4：从其他品种的苹果的纸浆中提取原质。 （A） 杜南。（B） 蜂蜜脆。 请点击这里下载此文件。

Discussion

在这项研究中，通过酶水解获得了可行的原体。请注意，这种方法需要新鲜的苹果。本协议允许将大量原质从果浆中快速分离，用于研究。此方法的适用性不仅限于"富士"："杜南"和"蜂蜜脆"的苹果浆的原体也可以通过相同的协议提取（补充图S4）。酶溶解后的前端溶液包含细胞碎片，与以前的方法相比有所改进。作为一种必需的细胞材料，苹果浆原体可用于细胞蛋白表达技术、单细胞测序等研究。

植物细胞³⁰中化学荧光试剂染色的方法有很多。例如，Fluo-3/AM 是在低温 （4 °C） 下加载的，因此它会进入根尖细胞^31。Fluo-3/AM 也可以在高温 （37 °C） 下装载到花粉管³²中。Fluo-4/AM 已成功装载到 皮鲁斯皮里福利亚 花粉管 （25 °C 15 分钟）¹⁸ 和阿拉比多普西斯根毛 （4 °C 代表 30 分钟）³³.然而，这些方法不适合染苹果浆原质。在这项研究中，我们成功地将荧光探针加载到高温（37°C）的原体中。此外，目前的方法简单、快速、准确，不影响前列体的活力。建议方法的关键步骤是清洗染色原质并孵育30分钟。染色后，原体应清洗。洗涤将减少观察期间的背景荧光，以便更准确地计算原质的荧光强度。孵育30分钟，让更多的探头被加载到原质。请注意，在加载过程中避免光线暴露至关重要。

La³⁺ 是学习 Ca²⁺的重要工具。它与细胞质膜 Ca²⁺ -ATPase 上的 Mg²⁺催化部位结合，从而抑制 Ca^2+-ATPase的稳定状态周转，并阻断 Ca²⁺ 跨膜功能^34。La³⁺ 治疗可减少细胞质 Ca²⁺，Fluo-4/AM 可反映这一变化，排除其他二元化剂的干扰，并验证化学荧光试剂的可行性。

尽管这种加载方法比其他方法具有更多的优势，但在数据结果的转化方面仍需进一步改进。在这里，我们通过检测原质的荧光值来估计相对细胞质Ca²⁺ 含量，这是定性数据，而不是定量数据。因此，在以后的研究中，将染色结果转化为特定的细胞质Ca²⁺ 含量尤为重要，这可以为分析水果Ca²⁺ 信号提供研究依据。

总之，此处描述的方法可以检测苹果浆细胞中的细胞质Ca^2+， 从而为果浆细胞钙的相关研究提供技术支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.