Summary
Des protoplastes isolés de cellules de pulpe de pomme ont été chargés d’un réactif fluorescent de calcium pour détecter la concentration cytoplasmique de Ca2+.
Abstract
Le Ca2+ cytosolique joue un rôle clé dans le développement des plantes. L’imagerie calcique est la méthode la plus polyvalente pour détecter les changements dynamiques dans le Ca2+ dans le cytoplasme. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables de cellules pulpaires par hydrolyse enzymatique. Des protoplastes isolés ont été incubés avec le réactif fluorescent à petites molécules (Fluo-4/AM) pendant 30 min à 37 °C. Les sondes fluorescentes ont réussi à coloré le Ca2+ cytosolique mais ne se sont pas accumulées dans les vacuoles. La3+,un bloqueur de canaux Ca2+, a diminué l’intensité de la fluorescence cytoplasmique. Ces résultats suggèrent que Fluo-4/AM peut être utilisé pour détecter les changements dans le Ca2+ cytosolique dans la chair du fruit. En résumé, nous présentons une méthode pour isoler efficacement les protoplastes des cellules de chair du fruit et détecter le Ca2+ en chargeant un réactif fluorescent de calcium à petites molécules dans le cytoplasme des cellules pulpaires.
Introduction
Ca2+ joue un rôle important dans la transduction du signal végétal et le métabolisme1,2. En outre, il régule les caractéristiques de qualité des fruits3,4, y compris la dureté, la teneur en sucre et la susceptibilité aux troubles physiologiques pendant le stockage5,6. Le Ca2+ cytoplasmique joue un rôle important dans la transduction du signal et régule la croissance et le développement des plantes7. La perturbation de l’homéostasie cellulaire du calcium peut induire une fosse amère dans les pommes8, la maladie des taches brunes dans les poires9et la pourriture ombilicale dans les tomates10, affectant la qualité des fruits et causant de graves pertes économiques3,11. L’imagerie calcique a une résolution spatiale et temporelle suffisante et est une méthode importante pour observer la dynamique du Ca2+ dans les cellules vivantes12,13.
À l’heure actuelle, il existe deux méthodes principales pour l’imagerie calcique intracellulaire dans les cellules vivantes: l’une utilise des sondes fluorescentes chimiques à petites molécules14, et l’autre est le capteur de codage génique (GECI)15,16. Compte tenu de la difficulté d’établir un système transgénique stable dans les arbres fruitiers et du développement plus long des fruits, GECIS ne convient pas à l’imagerie par fluorescence ca2+ des fruits.
Les sondes fluorescentes à petites molécules telles que Fluo-4/AM présentent un avantage particulier : leur forme d’ester AM (dérivé d’ester acétoxyméthyléfiable aux cellules) peut être facilement chargée en vrac dans des cellules vivantes sans avoir besoin de transfection, ce qui la rend flexible, rapide et non cytotoxique17. Fluo-4 / AM pourrait être chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia18 et Petunia,19 ainsi que dans les cellules de garde20 et les poils racinaires d’Arabidopsis 21.
À l’heure actuelle, il existe peu de rapports sur la coloration par fluorescence de calcium des cellules de la pulpe22. En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que les pommes. Les pommiers sont mondialement reconnus comme une espèce économique importante, et les pommes sont considérées comme un aliment sain23. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables à partir de pulpe de fruit de pomme par hydrolyse enzymatique, puis chargé des réactifs fluorescents à petites molécules dans le cytoplasme pour détecter ca2+.
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Protocol
1. Extraction de protoplastes
- Préparer la solution de base : 20 mM deCaCl2,5 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,4 M de D-sorbitol.
REMARQUE: Le pH de la solution de base a été ajusté à 5,8 avec un tampon Tris de 0,1 M, filtré à travers des filtres solubles dans l’eau de 0,22 μm et stocké à 4 °C. - Préparer la solution enzymatique : Mélanger 0,3 % (p/v) de Macerozyme R-10 et 0,5 % (p/v) de cellulase R-10 avec la solution de base.
- Ajouter 0,5 mL de solution enzymatique dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Choisissez une pomme saine et mûre. Ensuite, coupez la pâte en 10 x 5 x 1 mm3 (Figure 1A-1C).
- Placer les morceaux de pulpe de pomme dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant une solution enzymatique, puis fermer le tube (Figure 1D).
- Incuber le tube à 28 °C pendant 1 h, en agitant à 70 tr/min dans un shaker dans l’obscurité.
- Lavez les morceaux de pulpe. Aspirer toute la solution enzymatique, puis ajouter 0,5 mL de la solution de base.
- Centrifuger à 300 x g pendant 2 min à température ambiante.
- Pour obtenir une suspension de protoplaste, aspirer la solution par le fond du tube de centrifugation (Figure 1E).
2. Coloration par fluorescence des ions calcium à petites molécules
- Préparer la solution de chargement Fluo-4/AM avec 2 mM de Fluo-4/AM, 20 % de F-127 et 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS:80 mM Na2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4et 26 mM KCI) dans un rapport de 1:1:2.
- Ajouter 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM à 99 μL de la suspension de protoplaste présente dans les tubes centrifuges de 1,5 mL. Assurez-vous que la concentration finale du colorant fluorescent est de 5 μM. Mélangez la solution, puis fermez le tube.
- Traitement La3+ : Préparer une solution de La3+ de 100 μM avec 98 μL de suspension de protoplaste, 1 μL de 10 mM De La3+et 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM. Mélanger la solution et fermer le tube.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité.
- Laver les protoplastes par centrifugation à 300 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer 70 μL de la solution et ajouter 70 μL de la solution de base.
- Incuber la suspension de protoplaste à 37 °C pendant 30 min pour se désestérifier complètement.
- Aspirer 15 μL de la suspension de protoplaste et égoutter sur une lame.
- Observer au microscope à fluorescence(figure supplémentaire S1).
REMARQUE: Utilisez un appareil photo couleur avec une sensibilité élevée, c’est-à-dire un capteur CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) avec une résolution de pixels de 3,45 μm. - Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (20x). Réglez la luminosité sur 0,5.
REMARQUE: L’éclairage est des cubes de lumière LED à intensité réglable avec un ensemble de filtres à revêtement dur intégré. La longueur d’onde d’excitation de Fluo-4/AM est de 490 nm.
3. Test de viabilité du protoplaste
- Préparer la solution diacétate de fluorescéine (FDA) : Dissoudre la FDA dans l’acétone jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 mg/mL.
- Préparer la solution de travail FDA avec 1 μL de la solution stock et 99 μL d’acétone.
- Ajouter 1 μL de solution de travail FDA à 99 μL de suspension de protoplaste. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas, puis fermer le tube.
REMARQUE: La concentration finale de la FDA est de 100 μg / L. - Tache à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité.
- Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence.
- Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (Figure 1F).
4. Analyse d’images
- Analysez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et de tableur (p. ex., Image-Pro Plus et Excel 2010).
- Sélectionnez deux diamètres verticaux parmi les protoplastes pour calculer l’intensité de fluorescence (Figure supplémentaire S2). Mesurer l’intensité de fluorescence de tous les protoplastes sous différents traitements a été mesurée. Pour le traitement final, utilisez un logiciel de retouche photo.
5. Analyse statistique
- Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique (Figure supplémentaire S3). Les données sont présentées dans moyenne ± SD. Le test tde l’étudiant a été utilisé pour analyser les différences entre les groupes expérimentaux.
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Representative Results
Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons utilisé la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes viables à partir de la pulpe (Figure 1). Certains protoplastes avaient des vacuoles, tandis que d’autres n’en avaient pas. Alors que les protoplastes ne présentaient aucune fluorescence lorsque l’indicateur fluorescent Ca2+ n’y était pas chargé. Lorsque Fluo-4/AM a été chargé dans les protoplastes, le cytoplasme, mais pas la vacuole, est devenu fluorescent (Figure 2). Ce résultat indique que Fluo-4/AM a réussi à coloré le Ca2+ dans le cytoplasme et qu’aucune compartimentation n’a été observée24. Les protoplastes ont été colorés avec la FDA pendant 5 minutes et ont montré une fluorescence cytoplasmique. Cela indique qu’une température élevée (37 °C) n’affecte pas la viabilité des protoplastes.
La3+,un agent bloquant du canalCa 2+ 25,a été ajouté lorsque Fluo-4/AM a été chargé dans des protoplastes. À 100 μM, La3+ a diminué l’intensité de la fluorescence du calcium(Figure 3).
Figure 1: Protoplastes obtenus par hydrolyse enzymatique. (A) Un morceau a été découpé dans une pomme mûre. (B) Les protoplastes ont été extraits de morceaux de pâte. (C) La pâte a été coupée en 10 × 5 × 1 mm3 morceaux. (D)Les morceaux de pâte ont été placés dans des tubes centrifuges contenant une solution enzymatique de 0,5 mL. (E) Protoplastes. Les pointes de flèches pointent vers le protoplaste et les flèches indiquent la vacuole dans le protoplaste. (F) Les protoplastes ont été colorés avec la FDA pendant 5 minutes à température ambiante. (Cette figure a été modifiée à partir de la référence 22 [Recherche horticole : Chargement de sondes fluorescentes calciques dans des protoplastes pour détecter le calcium dans les cellules du tissu charnu de Malus domestica]. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Chargement de Fluo-4/AM et La3+ dans les protoplastes. (A) Contrôle: Protoplast intact sans sonde fluorescente chargée. (B) Protoplastes chargés de Fluo-4/AM. (C) La3+ a été ajouté lorsque les protoplastes ont été chargés de Fluo-4/AM. La concentration finale de La3+ était de 100 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Analyse statistique de l’intensité de fluorescence dans les protoplastes. Indiquez une différence significative selon le test tde l’élève (P <0.001). Les barres verticales indiquent ± SD. Chaque point de données représente la moyenne de 20 protoplastes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure supplémentaire S1 : Microscope à fluorescence. (A) L’aspect général du microscope à fluorescence. (B) Page Paramètres. Sélectionnez objectif 20x, canal GFP et réglez uniformément la luminosité à 0,5. ( C )Régiond’excitation de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Étapes utilisées pour calculer l’intensitéde fluorescence Ca2+ au protoplaste de la cellule du fruit. Les unités d’intensité de fluorescence utilisées dans cette étude sont basées sur les rapports précédents26,27,28,29. Le processus de calcul est le suivant: (A) Ouvrez l’image de fluorescence du protoplaste dans le logiciel. Cliquez sur l’outil Mesure. Dans le menu déroulant, sélectionnez Ligne de profil. (B) Sélectionnez Cercle dans la fenêtre Profil de ligne. En utilisant cela, dessinez une ellipse au niveau du protoplaste. (C) Dans la fenêtre Profil de ligne, sélectionnez maintenant Fichier | Exporter les données (D) Assurez-vous que la feuille de calcul vierge est ouverte et importez les données en cliquant sur Exportation des données. Utilisez la fonction « moyenne » pour calculer l’intensité moyenne de fluorescence. Chaque traitement a été répété trois fois avec plus de 20 protoplastes chacun. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Les statistiques de données ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. Collez les données dans la table et cliquez sur Analyser pour l’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S4: Extraction de protoplastes de la pulpe d’autres variétés de pommes. (A) Dounan. (B) Croustillant au miel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans cette étude, des protoplastes viables ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Notez que cette méthode nécessite des pommes fraîches. Le présent protocole permet l’isolement rapide d’un grand nombre de protoplastes de la pulpe de fruit pour une utilisation dans des études de recherche. L’applicabilité de cette méthode ne se limite pas à « Fuji »; les protoplastes de la pulpe de pomme de 'Dounan' et 'Honey Crisp' peuvent également être extraits par le même protocole(Figure supplémentaire S4). La solution de protoplaste après enzymolyse contient des débris cellulaires, qui ont été quelque peu améliorés par rapport aux méthodes précédentes. En tant que matériau cellulaire essentiel, les protoplastes de la pulpe de pomme peuvent être utilisés pour la technologie d’expression des protéines cellulaires, le séquençage unicellulaire et d’autres recherches.
Il existe de nombreuses méthodes concernant la coloration chimique des réactifs fluorescents dans les cellules végétales30. Par exemple, Fluo-3/AM a été chargé à basse température (4 °C), de sorte qu’il pénètre dans les cellules de la pointe de la racine31. Fluo-3/AM peut également être chargé à haute température (37 °C) dans le tube à pollen32. Fluo-4/AM a chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia (25 °C pendant 15 min)18 et les poils racinaires d’Arabidopsis (4 °C pendant 30 min)33. Cependant, ces méthodes ne conviennent pas à la coloration des protoplastes de pulpe de pomme. Dans cette étude, nous avons réussi à charger des sondes fluorescentes dans des protoplastes à haute température (37 °C). De plus, la présente méthode est simple, rapide, précise et n’affecte pas la vitalité des protoplastes. Une étape critique de la méthode proposée consiste à laver les protoplastes colorés et à les incuber pendant 30 minutes. Après la coloration, les protoplastes doivent être lavés. Le lavage réduira la fluorescence de fond pendant l’observation afin que l’intensité de fluorescence des protoplastes puisse être comptée plus précisément. Incuber pendant 30 min pour permettre à plus de sondes d’être chargées dans les protoplastes. Notez qu’il est essentiel d’éviter l’exposition à la lumière pendant le chargement.
La3+ est un outil important pour étudier le Ca2+. Il se lie au site catalytique Mg2+ sur la membrane cytoplasmique Ca2+-ATPase, inhibant ainsi le renouvellement à l’état d’équilibre de ca2+-ATPase et bloquant le fonctionnement transmembranaire Ca2+ 34. Le traitement La3+ a réduit le Ca2+cytoplasmique, et Fluo-4/AM pourrait refléter ce changement, en excluant l’interférence d’autres cations divalents et en vérifiant la faisabilité des réactifs de fluorescence chimique.
Bien que cette méthode de chargement offre plus d’avantages que les autres méthodes, elle doit encore être améliorée dans la transformation des résultats des données. Ici, nous avons estimé la teneur relative en Ca2+ cytoplasmique en détectant la valeur de fluorescence des protoplastes, qui est une donnée qualitative plutôt que quantitative. Par conséquent, il est particulièrement important de traduire les résultats de coloration en teneur cytoplasmique spécifique en Ca2+ dans de futures études, ce qui pourrait fournir une base de recherche pour l’analyse de la signalisation Ca2+ des fruits.
En résumé, la méthode décrite ici peut détecter le Ca2+ cytoplasmique dans les cellules de la pulpe de pomme, fournissant ainsi un soutien technique pour les études connexes du calcium des cellules de la pulpe de fruit.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le projet d’amélioration des variétés agricoles de la province du Shandong (2019LZGC007) et l’équipe d’innovation des arbres fruitiers du système technologique moderne de l’industrie agricole du Shandong (SDAIT-06-05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
| CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
| Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
| D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
| F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
| FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
| Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
| Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
| Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
| Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |
References
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