एप्पल लुगदी में फ्लू-4/AM के साथ साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} को धुंधला करना

Summary

सेब लुगदी कोशिकाओं के अलग प्रोटोप्लास्ट को साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} एकाग्रता का पता लगाने के लिए कैल्शियम फ्लोरोसेंट रिएजेंट से भरा गया था।

Abstract

साइटोसोलिक सीए^{2 +} पौधों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। साइटोप्लाज्म में सीए^{2 +} में गतिशील परिवर्तनों का पता लगाने के लिए कैल्शियम इमेजिंग सबसे बहुमुखी विधि है। इस अध्ययन में, हमने एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस द्वारा लुगदी कोशिकाओं के व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए। अलग-थलग पड़े प्रोटोप्लास्ट को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर छोटे अणु फ्लोरोसेंट रिएजेंट (फ्लूो-4/AM) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था । फ्लोरोसेंट जांच सफलतापूर्वक साइटोसोलिक सीए^{2 +} दाग लेकिन vacuoles में जमा नहीं किया । ला^{3 +,}एक सीए^{2 +} चैनल अवरोधक, साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस तीव्रता में कमी आई। इन परिणामों से पता चलता है कि फ्लोर-4/AM का उपयोग फलों के मांस में साइटोसोलिक सीए^{2 +} में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जा सकता है । संक्षेप में, हम फल की मांस कोशिकाओं से प्रोटोप्लास्ट को प्रभावी ढंग से अलग करने और लुगदी कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म में एक छोटे-अणु कैल्शियम फ्लोरोसेंट रिएजेंट लोड करके सीए^{2 +} का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

सीए^{2 +} पौधों के सिग्नल ट्रांसडक्शन और मेटाबॉलिज्म 1^,2में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, यह^3,4फलों की गुणवत्ता को नियंत्रित करता है, जिसमें कठोरता, चीनी सामग्री और भंडारण^{5, 6}के^{दौरान}शारीरिक विकारों के प्रति संवेदनशीलता शामिल है। साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} सिग्नल ट्रांसडक्शन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और पौधों के विकास और विकास 7 को^{नियंत्रित}करता है। सेलुलर कैल्शियम होयोस्टेसिस की गड़बड़ी सेब में कड़वे गड्ढे को प्रेरित कर सकती है⁸, नाशपाती⁹में भूरे रंग की बीमारी और टमाटर में नाभि सड़ांध¹⁰, फलों की गुणवत्ता को प्रभावित कर रही है और गंभीर आर्थिक नुकसान पहुंचा सकती है^3,11 कैल्शियम इमेजिंग में पर्याप्त स्थानिक और लौकिक संकल्प होता है और यह जीवित कोशिकाओं में सीए^{2 +} गतिशीलता को देखने के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है^12,13।

वर्तमान में, जीवित कोशिकाओं में इंट्रासेलुलर कैल्शियम इमेजिंग के लिए दो मुख्य तरीके हैं: एक रासायनिक छोटे आणविक फ्लोरोसेंट जांच¹⁴को नियोजित करता है, और दूसरा जीन एन्कोडिंग सेंसर (जीईसीआई)^15,16है। फलों के पेड़ों और लंबे फलों के विकास में एक स्थिर ट्रांसजेनिक प्रणाली स्थापित करने की कठिनाई को देखते हुए, जीईसीआई_एस फल Ca^{2 +} फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त है।

फ्लोरो-4/एएम जैसे छोटे-अणु फ्लोरोसेंट जांच का एक विशेष लाभ है: उनके एएम एस्टर फॉर्म (सेल-पारगम्य एसीटॉक्सीमिथाइल एस्टर डेरिवेटिव) ट्रांसफैक्शन की आवश्यकता के बिना जीवित कोशिकाओं में आसानी से थोक-लोड किया जा सकता है, जो इसे लचीला, तेज और गैर-साइटोटॉक्सिक¹⁷बनाता है। फ्लू-4/AM सफलतापूर्वक Pyrus pyrifolia¹⁸ और Petunia,¹⁹ के पराग ट्यूब में लोड किया जा सकता है और साथ ही गार्ड कोशिकाओं में²⁰ और अरबीडोप्सिस²¹के जड़ बाल ।

वर्तमान में, लुगदी कोशिकाओं के कैल्शियम फ्लोरेसेंस स्टेनिंग पर कुछ रिपोर्टें हैं²²। एक महत्वपूर्ण खनिज तत्व के रूप में, कैल्शियम सेब जैसे पेड़ फलों के विकास और गुणवत्ता नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेब के पेड़ विश्व स्तर पर एक महत्वपूर्ण आर्थिक प्रजातियों के रूप में पहचाने जाते हैं, और सेब एक स्वस्थ भोजन²³माना जाता है । इस अध्ययन में, हमने एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस के माध्यम से सेब के फल लुगदी से व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए और फिर सीए^{2 +}का पता लगाने के लिए साइटोप्लाज्म में छोटे अणु फ्लोरोसेंट रिएजेंट्स को लोड किया।

Protocol

1. प्रोटोप्लास्ट निष्कर्षण

1. मूल समाधान तैयार करें: 20 m CaCl_2,5 mm 2-(N-morpholino) एथेलसुल्फोनिक एसिड, और 0.4 एम डी-सोर्बिटोल।
   नोट: मूल समाधान के पीएच को 0.1 मीटर ट्रिस बफर के साथ 5.8 में समायोजित किया गया था, जो 0.22 माइक्रोन पानी-घुलनशील फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर किया गया था, और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।
2. एंजाइमेटिक समाधान तैयार करें: मूल समाधान के साथ 0.3% (w/v) मैकरोसाइम आर-10 और 0.5% (w/v) सेल्यूलास आर-10 मिलाएं।
3. 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एंजाइमेटिक समाधान का 0.5 एमएल जोड़ें। एक स्वस्थ और पका हुआ सेब चुनें। फिर लुगदी को 10 x 5 x 1 मिमी³ आकार(चित्रा 1A-1C)में काटलें।
4. सेब के फलों के लुगदी के टुकड़ों को 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें जिसमें एंजाइमेटिक समाधान होता है और फिर ट्यूब(चित्रा 1D)बंद कर दें।
5. 1 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब इनक्यूबेट, अंधेरे में एक शेखर में ७० आरपीएम/मिनट पर मिलाते हुए ।
6. लुगदी के टुकड़ों को धो लें। सभी एंजाइमेटिक समाधान को एस्पिरेट करें और फिर मूल समाधान के 0.5 एमएल जोड़ें।
7. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
8. प्रोटोप्लास्ट निलंबन प्राप्त करने के लिए, अपकेंद्रित्र ट्यूब(चित्रा 1E)के नीचे से समाधान को स्थगित कर दें।

2. छोटे अणु कैल्शियम आयन फ्लोरेसेंस धुंधला

1. 2 m Fluo-4/AM के साथ Fluo-4/AM लोडिंग समाधान तैयार करें, 20% एफ-127, और 10x फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस:80 mM_{Na 2}HPO_4,1.36 M NACI, 20 m M KH₂PO_4,और 26 mM KCI) एक 1:1:2 अनुपात में ।
2. 1.5 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब्स में मौजूद प्रोटोप्लास्ट सस्पेंशन के 99 माइक्रोन में 1 μL जोड़ें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट डाई की अंतिम एकाग्रता 5 माइक्रोन है। समाधान मिलाएं और फिर ट्यूब को बंद करें।
3. ला^{3 +} उपचार: प्रोटोप्लास्ट निलंबन के 98 माइक्रोन के साथ 100 माइक्रोन ला^{3 +} समाधान तैयार करें, 10 एमएम ला 3 + के^{1 माइक्रोन,}और फ्लूो-4/AM लोडिंग समाधान के 1 माइक्रोन। घोल मिलाएं और ट्यूब बंद करें।
4. अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
5. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा प्रोटोप्लास्ट धोएं। समाधान के 70 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और मूल समाधान के 70 माइक्रोन जोड़ें।
6. प्रोटोप्लास्ट निलंबन को 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से डी-एस्टेरिफ़ी करने के लिए इनक्यूबेट करें।
7. प्रोटोप्लास्ट निलंबन के 15 माइक्रोन को एस्पिरेट करें और एक स्लाइड पर ड्रिप करें।
8. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप(अनुपूरक चित्रा S1) केतहत निरीक्षण करें।
   नोट: उच्च संवेदनशीलता के साथ एक रंग कैमरा का उपयोग करें, यानी, 3.2 एमपी (2048 x 1536) 3.45 माइक्रोन पिक्सल रेजोल्यूशन के साथ सीएमओएस सेंसर।
9. इमेजिंग (20x) के लिए जीएफपी चैनल का चयन करें। चमक को 0.5 सेट करें।
   नोट: रोशनी एक एकीकृत हार्ड-लेपित फिल्टर सेट के साथ समायोज्य तीव्रता वाले एलईडी हल्के क्यूब्स हैं। फ्लूो-4/AM की उत्तेजन तरंगदैर्ध्य ४९० एनएम है ।

3. प्रोटोप्लास्ट व्यवहार्यता परख

1. फ्लोरोसीन डायसेटेट (एफडीए) स्टॉक समाधान तैयार करें: अंतिम एकाग्रता 1 मिलीग्राम/
2. स्टॉक समाधान के 1 माइक्रोन और एसीटोन के 99 माइक्रोन के साथ एफडीए वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें।
3. प्रोटोप्लास्ट निलंबन के 99 माइक्रोन के लिए एफडीए काम समाधान के 1 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान मिलाएं और फिर ट्यूब को बंद करें।
   नोट: एफडीए के अंतिम एकाग्रता १०० μg/L है ।
4. अंधेरे में 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दाग।
5. स्लाइड्स तैयार करें और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत देखें।
6. इमेजिंग(चित्रा 1F)के लिए जीएफपी चैनल का चयन करें।

4. छवि विश्लेषण

1. इमेज एनालिसिस और स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर (जैसे, इमेज-प्रो प्लस और एक्सेल 2010) का उपयोग करके अधिग्रहीत छवियों का विश्लेषण करें।
2. फ्लोरेसेंस तीव्रता(अनुपूरक चित्रा S2)की गणना करने के लिए प्रोटोप्लास्ट से दो ऊर्ध्वाधर व्यास का चयन करें। विभिन्न उपचारों के तहत सभी प्रोटोप्लास्ट की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापा गया था। अंतिम प्रसंस्करण के लिए, फोटो संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

1. सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर(अनुपूरक चित्रा S3)का उपयोग करते हुए सांख्यिकीय विश्लेषण करें। डेटा मीन ± एसडी में प्रस्तुत कर रहे हैं। छात्र के टी-टेस्टका इस्तेमाल प्रायोगिक समूहों के बीच मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए किया गया था ।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के बाद, हमने लुगदी(चित्रा 1)से व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक विधि का उपयोग किया। कुछ प्रोटोप्लास्ट में वैक्यूल्स थे, जबकि अन्य ने ऐसा नहीं किया। जबकि प्रोटोप्लास्ट ने कोई फ्लोरेसेंस प्रदर्शित नहीं किया जब सीए^{2 +} फ्लोरोसेंट संकेतक उनमें लोड नहीं किया गया था। जब फ्लोरो-4/AM को प्रोटोप्लास्ट्स में लोड किया गया था, तो साइटोप्लाज्म, लेकिन वैक्यूल नहीं, फ्लोरोसेंट(चित्रा 2)बन गया । इस परिणाम से पता चला कि फ्लोर-4/AM ने साइटोप्लाज्म में सफलतापूर्वक सीए^{2 +} को दाग दिया और²⁴को कोई कंपार्टमेंट नहीं देखा गया । प्रोटोप्लास्ट्स को एफडीए के साथ 5 मिनट के लिए दाग दिया गया था और साइटोप्लाज्मिक फ्लोरेसेंस दिखाया गया था। इससे संकेत मिलता है कि उच्च तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) प्रोटोप्लास्ट व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है।

ला^{3 +,}Ca 2 + चैनल²⁵ के एक अवरुद्ध एजेंट, जब Fluo-4/AM प्रोटोप्लास्ट में लोड किया गया था जोड़ा गया था । 100 माइक्रोनएम में, ला^{3 +} कैल्शियम फ्लोरेसेंस तीव्रता(चित्र 3)में कमी आई।

चित्र 1:एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस द्वारा प्राप्त प्रोटोप्लास्ट। (A)एक टुकड़ा एक परिपक्व सेब से काटा गया था। (ख)प्रोटोप्लास्ट लुगदी के टुकड़ों से निकाले गए थे । (ग)लुगदी को 10 × 5 × 1 मिमी³ टुकड़ों में काटा गया था। (घ)लुगदी के टुकड़ों को 05 एमएल एंजाइम समाधान वाली अपकेंद्रित्र ट्यूबों में रखा गया था। (ई)प्रोटोप्लास्ट्स। एरोहेड प्रोटोप्लास्ट की ओर इशारा करते हैं, और तीर प्रोटोप्लास्ट में वैक्यूल का संकेत देते हैं। (च)प्रोटोप्लास्ट्स को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एफडीए के साथ दाग दिया गया था। (यह आंकड़ा संदर्भ ^{22 [बागवानी} अनुसंधान: मालस डोमेस्टिकाके मांस ऊतक कोशिकाओं में कैल्शियम का पता लगाने के लिए प्रोटोप्लास्ट में कैल्शियम फ्लोरोसेंट जांच लोड करता है] से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2:प्रोटोप्लास्ट में लोडिंग फ्लू-4/AM और ला^{3 +} । (A)नियंत्रण: बिना किसी लोडेड फ्लोरोसेंट जांच के बरकरार प्रोटोप्लास्ट। (ख)फ्लोरो-4/AM से भरी प्रोटोप्लास्ट्स । (ग)ला^{3 +} जोड़ा गया था जब प्रोटोप्लास्ट Fluo-4/AM के साथ भरी हुई थी । ला^{3 +} की अंतिम एकाग्रता 100 माइक्रोन था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 3:प्रोटोप्लास्ट में फ्लोरेसेंस तीव्रता का सांख्यिकीय विश्लेषण। छात्र के टी-टेस्ट(पी <0.001) के अनुसार महत्वपूर्ण अंतर इंगित करें। वर्टिकल बार एसडी ± संकेत देते हैं। प्रत्येक डेटा बिंदु 20 प्रोटोप्लास्ट के मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S1: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप। (क)फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप की समग्र उपस्थिति । (ख)सेटिंग्स पेज । 20x उद्देश्य, जीएफपी चैनल का चयन करें, और समान रूप से चमक को 0.5 में समायोजित करें। (ग)फ्लोरेसेंस उत्तेजन क्षेत्र । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S2:फल कोशिका के प्रोटोप्लास्ट में सीए^{2 +} फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कदम। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली फ्लोरेसेंस तीव्रता इकाइयां पिछली^{रिपोर्टों 26 , 27,28,29}पर आधारित हैं . गणना प्रक्रिया इस प्रकार है:(क)सॉफ्टवेयर में प्रोटोप्लास्ट फ्लोरेसेंस इमेज खोलें। उपाय उपकरण पर क्लिक करें। ड्रॉपडाउन मेनू से प्रोफाइल लाइनका चयन करें । (ख) लाइन प्रोफाइल विंडो में सर्किल का चयन करें । इसका उपयोग करके प्रोटोप्लास्ट पर एक अंडाकार आकर्षित करता है। (ग) लाइन प्रोफाइल विंडो में अब फाइल | का चयन करें निर्यात डेटा (डी)यह सुनिश्चित करें कि ब्लैंक स्प्रेडशीट खोली जाए और डेटा निर्यातपर क्लिक करके डेटा आयात किया जाए । औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता की गणना करने के लिए 'औसत' फ़ंक्शन का उपयोग करें। प्रत्येक उपचार को तीन बार दोहराया गया था जिसमें प्रत्येक 20 से अधिक प्रोटोप्लास्ट थे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S3: सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके डेटा आंकड़े किए गए थे। डेटा को तालिका में चिपकाएं और डेटा विश्लेषण के लिए विश्लेषण पर क्लिक करें। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्रा S4: सेब की अन्य किस्मों के लुगदी से प्रोटोप्लास्ट की निकासी। (A)डनन। (ख)हनी कुरकुरा । कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस अध्ययन में एंजाइमेटिक हाइड्रोलिसिस द्वारा व्यवहार्य प्रोटोप्लास्ट प्राप्त किए गए थे। ध्यान दें कि इस विधि के लिए ताजा सेब की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल अनुसंधान अध्ययन में उपयोग के लिए फल लुगदी से बड़ी संख्या में प्रोटोप्लास्ट के तेजी से अलगाव की अनुमति देता है। इस विधि की प्रयोज्यता 'फ़ूजी' तक सीमित नहीं है; 'डूनन' और 'हनी क्रिस्प' के सेब लुगदी के प्रोटोप्लास्ट भी इसी प्रोटोकॉल(अनुपूरक चित्रा S4)के माध्यम से निकाले जा सकते हैं। एंजाइमोलिसिस के बाद प्रोटोप्लास्ट समाधान में सेल मलबे होते हैं, जो पिछले तरीकों की तुलना में कुछ हद तक सुधार हुआ था। एक आवश्यक सेल सामग्री के रूप में, सेब लुगदी प्रोटोप्लास्ट का उपयोग सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रौद्योगिकी, एकल-कोशिका अनुक्रमण और अन्य शोध के लिए किया जा सकता है।

³⁰पौधों की कोशिकाओं में रासायनिक फ्लोरोसेंट रिएजेंट धुंधला होने के संबंध में कई तरीके हैं । उदाहरण के लिए, फ्लू-3/AM को कम तापमान (4 डिग्री सेल्सियस) पर लोड किया गया था, ताकि यह रूट टिप कोशिकाओं में प्रवेश कर जाए³¹। फ्लूो-3/AM को पराग ट्यूब^३२में उच्च तापमान (३७ डिग्री सेल्सियस) पर भी लोड किया जा सकता है । फ्लूो-4/AM ने पायरस पायरिफोलिया (15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस)¹⁸ और अरबीडोप्सिस (30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस)^३३के पराग ट्यूब में सफलतापूर्वक लोड किया है । हालांकि, ये विधियां सेब लुगदी प्रोटोप्लास्ट को धुंधला करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इस अध्ययन में, हमने सफलतापूर्वक उच्च तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) पर प्रोटोप्लास्ट में फ्लोरोसेंट जांच भरी। इसके अलावा, वर्तमान विधि सरल, तेज, सटीक है, और प्रोटोप्लास्ट जीवन शक्ति को प्रभावित नहीं करती है। प्रस्तावित विधि में एक महत्वपूर्ण कदम दाग प्रोटोप्लास्ट को धोना और उन्हें 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करना है। धुंधला होने के बाद, प्रोटोप्लास्ट को धोया जाना चाहिए। धोने से अवलोकन के दौरान पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस कम हो जाएगी ताकि प्रोटोप्लास्ट की फ्लोरेसेंस तीव्रता को अधिक सटीक रूप से गिना जा सके। 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट अधिक जांच प्रोटोप्लास्ट में लोड करने की अनुमति देने के लिए । ध्यान दें कि लोडिंग के दौरान लाइट एक्सपोजर से बचना जरूरी है।

ला^{3 +} Ca²⁺का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । यह साइटोप्लाज्मिक झिल्ली सीए^{2 +} -ATPase पर एमजी^{2 +}उत्प्रेरक साइट से बांधता है, जिससे सीए^{2 +}-ATPase के स्थिर-राज्य कारोबार को बाधित किया जाता है और सीए^{2 +} ट्रांसमेम्ब्रान कार्य³⁴को अवरुद्ध करता है। ला^{3 +} उपचार कम साइटोप्लाज्मिक Ca^{2 + ,}और Fluo-4/AM इस परिवर्तन को प्रतिबिंबित कर सकता है, अंय divalent cations के हस्तक्षेप को छोड़कर और रासायनिक फ्लोरेसेंस reagents की व्यवहार्यता की पुष्टि ।

हालांकि यह लोडिंग विधि अन्य तरीकों की तुलना में अधिक लाभ प्रदान करती है, फिर भी डेटा परिणामों को बदलने में इसे और बेहतर बनाने की आवश्यकता है। यहां, हमने प्रोटोप्लास्ट के फ्लोरेसेंस मूल्य का पता लगाकर सापेक्ष साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} सामग्री का अनुमान लगाया, जो मात्रात्मक के बजाय गुणात्मक डेटा है। इसलिए, भविष्य के अध्ययनों में धुंधला परिणामों को विशिष्ट साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} सामग्री में अनुवाद करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो फल सीए^{2 +} सिग्नलिंग का विश्लेषण करने के लिए एक शोध आधार प्रदान कर सकता है।

संक्षेप में, यहां वर्णित विधि सेब लुगदी कोशिकाओं में साइटोप्लाज्मिक सीए^{2 +} का पता लगा सकती है, जिससे फल लुगदी-सेल कैल्शियम के संबंधित अध्ययनों के लिए तकनीकी सहायता प्रदान की जा सकती है।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.