リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質^Ca2+ を染色する

Summary

リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質^Ca2+ 濃度を検出するためにカルシウム蛍光試薬を装填した。

Abstract

サイトソリック^Ca2+は、植物開発において重要な役割を果たしています。カルシウムイメージングは、細胞質における^Ca2+の動的変化を検出する最も汎用性の高い方法です。本研究では、酵素加水分解によりパルプ細胞の生き生き可能なプロトプラストを得た。単離したプロトプラストを37°Cで30分間、低分子蛍光試薬(Fluo-4/AM)でインキュベートした。 蛍光プローブは細胞細胞系^Ca2+の染色に成功したが、液胞に蓄積しなかった。Ca^3+、Ca2+チャネルブロッカーは、細胞質蛍光強度を低下した。これらの結果は、Fluo-4/AMが果実肉における細胞質^Ca2+の変化を検出するために使用できることを示唆している。要約すると、果実の果実の果体細胞からプロトプラストを効果的に単離し、小分子カルシウム蛍光試薬をパルプ細胞の細胞質に負荷させることで^Ca2+を検出する方法を提示する。

Introduction

^Ca2+は植物のシグナル伝達と代謝^に重要な役割を^果たす1,2 .また、それは、貯蔵中の硬度、糖度、および生理障害に対する感受性を含む果物品質形質^3、4を調節する^5、6。細胞質Ca^2+は、シグナル伝達に重要な役割を果たし、植物の成長と開発^{を調節する7}.細胞カルシウム恒常性の乱れは、リンゴ^8、梨⁹の褐色スポット病、トマト¹⁰の臍帯病に苦いピットを誘発し、果実の質に影響を及ぼし、深刻な経済的損失を引き起こす^3、11。カルシウムイメージングは十分な空間的および時間的分解能を有し、生細胞^12,13における^Ca2+ダイナミクスを観察するための重要な方法である。

現在、生細胞における細胞内カルシウムイメージングには主に2つの方法がある:一方は化学小分子蛍光プローブ¹⁴を採用し、もう1つは遺伝子コードセンサ(GECI)15,16である。果樹における安定したトランスジェニックシステムの確立と長い果実の開発の難しさを考えると、GECI_Sはフルーツ^Ca2+蛍光イメージングには適していません。

Fluo-4/AMのような低分子蛍光プローブは特に利点があります:そのAMエステル形態(細胞透過性アセトキシメチルエステル誘導体)は、トランスフェクションを必要とせずに生細胞に容易にバルクロードすることができ、柔軟で迅速で非細胞毒性^の17になります。Fluo-4/AMは、ピルス・ピリフォリア¹⁸とペチュニア^、19の花粉管に正常にロードすることができ、また、アビニズナプシス²¹のガードセル²⁰と根髪に入れることができました。

現在のところ、パルプ細胞²²のカルシウム蛍光染色に関する報告はほとんどない。重要なミネラル成分として、リンゴなどの樹果の成長と品質管理においてカルシウムが重要な役割を果たします。リンゴの木は世界的に重要な経済種として認識されており、リンゴは健康的な食品²³と考えられています。本研究では、リンゴ果実パルプから酵素加水分解を介して生存可能なプロトプラストを得てから、細胞質に低分子蛍光試薬をロードして^Ca2+を検出した。

Protocol

1. プロトプラスト抽出

1. 基本溶液を調製:20 mM CaCl_2、5mM 2-(Nモルフォリノ)エタネスルホン酸、および0.4 M Dソルビトール。
   注:基本溶液のpHは、0.1 Mトリスバッファーで5.8に調整し、0.22 μmの水溶性フィルタを通して濾過し、4°Cで保存しました。
2. 酵素ソリューションを準備する:基本的なソリューションと0.3%(w/v)マセロザイムR-10と0.5%(w/v)セルラーゼR-10をミックス。
3. 0.5 mLの酵素溶液を1.5 mL遠心分離管に加えます。健康で熟したリンゴを選んでください。その後、パルプを10 x 5 x 1 mm³サイズにスライスします(図1A-1C)。
4. リンゴの果実の果肉片を酵素溶液を含む1.5mL遠心分離チューブに入れ、チューブを閉じます(図1D)。
5. 28°Cで1時間インキュベートし、暗闇の中でシェーカーで70rpm/分で揺れます。
6. パルプ部分を洗います。酵素溶液をすべて吸引し、0.5 mLの基本液を加えます。
7. 室温で2分間300×gで遠心分離機。
8. プロトプラスト懸濁液を得るために、遠心分離管の底部から溶液を吸引する(図1E)。

2. 低分子カルシウムイオン蛍光染色

1. Fluo-4/AM負荷溶液を2 mM Fluo-4/AM、20%F-127、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS:80 mM Na₂HPO 4、1.36 M NaCI、20 mM KH₂PO_4、26mM KCI)で1:1:2の比率で調製します。
2. 1.5 mL遠心分離管に存在するプロトプラスト懸濁液の99 μLに、Fluo-4/AM負荷溶液を1 μL加えます。蛍光色素の最終濃度が5μMであることを確認し、溶液を混合し、チューブを閉じます。
3. ラ³⁺処理:プロトプラスト懸濁液98 μL、1μLのラ^3+、1μLのFluo-4/AMローディング溶液を1μL用意します。溶液を混ぜてチューブを閉じます。
4. 暗闇の中で37°Cで30分間インキュベートします。
5. プロトプラストを300xgで室温で2分間遠心して洗浄します。70 μLの溶液を吸引し、70 μLの基本溶液を追加します。
6. プロトプラスト懸濁液を37°Cで30分間インキュベートし、完全に脱エステル化します。
7. プロトプラスト懸濁液の15μLを吸引し、スライドに滴下します。
8. 蛍光顕微鏡下で観察する(補助図S1)。
   注:3.45 μmピクセル解像度の3.2 MP(2048 x 1536)CMOSセンサーなど、高感度のカラーカメラを使用してください。
9. イメージング用の GFP チャネルを選択します(20x)。明るさを 0.5 に設定します。
   メモ:照明は、統合されたハードコーティングされたフィルタセットを備えた調整可能な強度LEDライトキューブです。Fluo-4/AMの励起波長は490nmです。

3. プロトプラスト生存アッセイ

1. フルオレセインジアセテート(FDA)ストック溶液を調製する:最終濃度が1mg/mLになるまでFDAをアセトンに溶解する。
2. 1 μLのストック溶液と99 μLのアセトンでFDAの作業ソリューションを準備します。
3. 99 μLのプロトプラスト懸濁液に1 μLのFDA作業溶液を加えます。上下にピペットして溶液を混ぜ、チューブを閉じます。
   注:FDAの最終濃度は100 μg/Lです。
4. 暗闇の中で5分間室温で汚す。
5. スライドを準備し、蛍光顕微鏡で観察します。
6. イメージング用の GFP チャネルを選択します (図 1F)。

4. 画像解析

1. 取得した画像を画像解析およびスプレッドシートソフトウェア(例えば、Image-Pro PlusおよびExcel 2010)を使用して分析します。
2. プロトプラストから2つの垂直直径を選択して蛍光強度を計算する(補助図S2)。異なる治療の下ですべてのプロトプラストの蛍光強度を測定し測定した。最終処理には、写真編集ソフトを使用してください。

5. 統計分析

1. 統計ソフトウェアを使用して統計解析を実行する (補助図 S3)。データは平均±SDで提示されます。実験グループ間の違いを分析するために、学生の t-testを使用しました。

Representative Results

上述したプロトコルに従って、酵素法を用いて、パルプから生き生き可能なプロトプラストを得た(図1)。一部のプロトプラストは空胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストは^、Ca2+ 蛍光指標がそれらにロードされなかったときに蛍光を示さなかった。Fluo-4/AMがプロトプラストに積み込まれると、細胞質は蛍光を発するが、液胞は含まれなかった(図2)。この結果は、Fluo-4/AMが細胞質に^Ca2+ を染色し、区画化が²⁴を観察されなくなったことを示した。プロトプラストをFDAで5分間染色し、細胞質蛍光を示した。これは、高温(37°C)がプロトプラストの生存率に影響を与えないことを示した。

La³⁺は、Fluo-4/AM がプロトプラストにロードされたときに、Ca²⁺チャネル²⁵のブロッキング剤として追加されました。100 μMで^、La3+は蛍光カルシウム強度を減少した(図3)。

図1:酵素加水分解により得られたプロトプラスト(A)成熟したリンゴから切り取られた個体。(B)プロトプラストをパルプ片から抽出した。(C)パルプを10×5×1mm3個に切った。(D)パルプ片を0.5mL酵素溶液を含む遠心管に入れた。(E) プロトプラスト。矢印はプロトプラストを指し、矢印はプロトプラストの空胞を示します。(F)プロトプラストを室温で5分間FDAで染色した。(この図は参考文献²²から改変された[園芸研究:カルシウム蛍光プローブをプロトプラストにロードして、マルス・ドメトナの肉組織細胞中のカルシウムを検出する]。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2: プロトプラストにFluo-4/AMおよびLa³⁺をロードする(A)コントロール:蛍光プローブをロードせずにそのままプロトプラスト。(B) Fluo-4/AM を搭載したプロトプラスト(C)ラ³⁺は、プロトプラストがFluo-4/AMでロードされたときに追加されました。ラ³⁺の最終濃度は100 μMでした。

図3: プロトプラストにおける蛍光強度の統計解析 学生の t検定 (P <0.001) ごとに有意差を示します。縦棒は、SD±示します。各データポイントは、20個のプロトプラストの平均を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補助図S1:蛍光顕微鏡(A)蛍光顕微鏡の全体的な外観。(B)設定ページ20xの目標、GFPチャンネルを選択し、輝度を0.5に均一に調整します。(C)蛍光励起領域。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補助図S2:果実細胞のプロトプラストにおける^Ca2+蛍光強度の算出に用いられるステップ。この研究で使用される蛍光強度単位は、以前の報告^{26、27、28、29}に基づいています。計算プロセスは次の通りです: (A) プロトプラスト蛍光画像をソフトウェアで開きます。測定ツールをクリックします。ドロップダウン メニューから [プロファイル ライン] を選択します。(B) [ラインプロファイル]ウィンドウで[円]を選択します。これを使用して、プロトプラストで楕円を描きます。(C) [ライン プロファイル] ウィンドウで [ファイル] |データのエクスポート(D) 空のスプレッドシートが開かれていることを確認し、[データエクスポート] をクリックしてデータをインポートします。平均蛍光強度を計算するには、'average' 関数を使用します。各処置をそれぞれ20個以上のプロトプラストで3回繰り返した。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図S3:統計解析ソフトウェアを用いてデータ統計を行った。 テーブルにデータを貼り付け、[データ 分析のために分析 ]をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補助図S4:リンゴの他の品種のパルプからのプロトプラストの抽出。 (A) ドゥーナン。(B)ハニークリスプ。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

Discussion

本研究では、生き生きとしたプロトプラストを酵素加水分解により得た。この方法には新鮮なリンゴが必要であることに注意してください。本プロトコルは、研究研究で使用するために、果肉から多数のプロトプラストを迅速に分離することを可能にする。この方法の適用可能性は「富士」に限定されません。「ドゥーナン」と「ハニークリスプ」のリンゴパルプのプロトプラストも同じプロトコルを介して抽出することができます(補助図S4)。酵素溶解後のプロトプラスト溶液には細胞デブリが含まれており、これは以前の方法に比べて幾分改善された。必須の細胞材料として、リンゴパルププロトプラストは、細胞タンパク質発現技術、単細胞シーケンシング、およびその他の研究に使用することができます。

植物細胞³⁰における化学蛍光試薬染色に関する多くの方法がある。例えば、Fluo-3/AMは、低温度(4°C)でロードされ、ルート先端セル³¹に入る。Fluo-3/AMは、花粉管³²に高温(37°C)でロードすることもできる。Fluo-4/AMはピラスピリフォリア(25°C15分間⁾¹⁸とシロイヌナズナの根髪(30分間4°C)33の花粉管に正常にロードされました。しかし、これらの方法はリンゴパルププロトプラストの染色には適していない。本研究では、蛍光プローブを高温(37°C)でプロトプラストに積み込むことに成功しました。また、本方法は、簡単で、速く、正確であり、プロトプラストの活力に影響を与えません。提案された方法の重要なステップは、染色されたプロトプラストを洗浄し、30分間インキュベートすることです。染色後、プロトプラストを洗浄する必要があります。この洗浄は観察中のバックグラウンド蛍光を減少させ、プロトプラストの蛍光強度をより正確にカウントできるようにします。30分間インキュベートして、より多くのプローブをプロトプラストに積み込むことができます。負荷時の光の露出を避けるために重要であることに注意してください。

La^{3 +}は Ca²⁺を研究するための重要なツールです。それは、細胞質膜Ca2+-ATPase上の^Mg2+触媒部位に結合し、それによって^Ca2+-ATPaseの定常回転を阻害し^、Ca2+膜貫通機能³⁴を遮断する。^La3+治療は細胞質^Ca2+を減少させ、Fluo-4/AMはこの変化を反映し、他の二価カチオンの干渉を除き、化学蛍光試薬の実現可能性を検証する可能性がある。

この読み込み方法は他の方法よりも多くの利点を提供しますが、データ結果の変換でさらに改善する必要があります。ここでは、定量的ではなく定性的データであるプロトプラストの蛍光値を検出することにより、相対的な細胞質^Ca2+ 含有量を推定した。したがって、染色結果を将来の研究で特定の細胞質^Ca2+ 含有量に変換することが特に重要であり、果実^Ca2+ シグナル伝達を分析するための研究基盤を提供する可能性があります。

要約すると、本明細書に記載の方法は、リンゴ果乳球細胞における細胞質^Ca2+ を検出することができ、それにより果実果肉細胞カルシウムの関連研究に対する技術支援を提供することができる。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.