Farging av Cytoplasmic Ca²⁺ med Fluo-4/AM i Apple Pulp

Summary

Isolerte protoplaster av eplemasseceller ble lastet med et kalsiumfluorescerende reagens for å oppdage cytoplasmatisk Ca^{2 +} konsentrasjon.

Abstract

Cytosolic Ca²⁺ spiller en nøkkelrolle i planteutvikling. Kalsiumavbildning er den mest allsidige metoden for å oppdage dynamiske endringer i Ca²⁺ i cytoplasma. I denne studien fikk vi levedyktige protoplaster av masseceller ved enzymatisk hydrolyse. Isolerte protoplaster ble inkubert med det lille molekylet fluorescerende reagens (Fluo-4/AM) i 30 min ved 37 °C. De fluorescerende sondene farget vellykket cytosolic Ca^{2 +,} men akkumulerte ikke i vakuoler. La³⁺, en Ca²⁺ kanalblokker, redusert cytoplasmatisk fluorescensintensitet. Disse resultatene tyder på at Fluo-4/AM kan brukes til å oppdage endringer i cytosolisk Ca²⁺ i fruktkjøttet. Oppsummert presenterer vi en metode for effektivt å isolere protoplaster fra kjøttceller av frukten og oppdage Ca^{2 +} ved å laste inn et lite molekyl kalsiumfluorescerende reagens i cytoplasma av masseceller.

Introduction

Ca²⁺ spiller en viktig rolle i plantesignaltransduksjon og metabolisme^1,2. Videre regulerer det fruktkvalitetsegenskaper^3,4, inkludert hardhet, sukkerinnhold og følsomhet for fysiologiske lidelser under lagring^5,6. Cytoplasmic Ca^{2 +} spiller en viktig rolle i signaltransduksjon og regulerer plantevekst og utvikling⁷. Forstyrrelse av cellulær kalsium homeostase kan indusere bitter grop i epler⁸, brun flekk sykdom i pærer⁹, og navlestreng rot i tomater¹⁰, påvirker fruktkvaliteten og forårsaker alvorlige økonomiske tap^3,11. Kalsiumavbildning har tilstrekkelig romlig og tidsmessig oppløsning og er en viktig metode for å observere Ca^{2 + dynamikk} i levende celler^12,13.

For tiden er det to hovedmetoder for intracellulær kalsiumavbildning i levende celler: den ene bruker kjemiske småmolekylære fluorescerende sonder¹⁴, og den andre er genkodingssensoren (GECI)^15,16. Gitt vanskeligheten med å etablere et stabilt transgent system i frukttrær og lengre fruktutvikling, er GECI_S uegnet for frukt Ca^{2 +} fluorescensavbildning.

Småmolekyl fluorescerende sonder som Fluo-4 / AM har en spesiell fordel: deres AM-esterform (cellegjennomtrengelig acetoksymetylsterderivat) kan lett bulkbelastes i levende celler uten behov for transfeksjon, noe som gjør det fleksibelt, raskt og ikke-cytotoksisk¹⁷. Fluo-4 / AM kunne med hell lastes inn i pollenrøret i Pyrus pyrifolia¹⁸ og Petunia,¹⁹ samt inn i vaktceller²⁰ og rothår av Arabidopsis²¹.

For tiden er det få rapporter om kalsiumfluorescensfarging av masseceller²². Som et viktig mineralelement spiller kalsium en nøkkelrolle i veksten og kvalitetskontroll av trefrukter som epler. Epletrær er globalt anerkjent som en viktig økonomisk art, og epler regnes som en sunn mat²³. I denne studien fikk vi levedyktige protoplaster fra eplefruktmasse gjennom enzymatisk hydrolyse og lastet deretter småmolekylet fluorescerende reagenser inn i cytoplasma for å oppdage Ca²⁺.

Protocol

1. Protoplast ekstraksjon

1. Forbered den grunnleggende løsningen: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-morpholino)etanesulfonsyre og 0,4 M D-sorbitol.
   MERK: pH i grunnløsningen ble justert til 5,8 med 0,1 M Tris buffer, filtrert gjennom 0,22 μm vannløselige filtre og lagret ved 4 °C.
2. Forbered den enzymatiske løsningen: Bland 0,3% (w / v) Macerozyme R-10 og 0,5% (w / v) cellulase R-10 med den grunnleggende løsningen.
3. Tilsett 0,5 ml enzymatisk oppløsning i et 1,5 ml sentrifugerør. Velg et sunt og modent eple. Skjær deretter massen i 10 x 5 x 1 mm³ størrelse (Figur 1A-1C).
4. Legg eplefruktmassestykkene i et sentrifugerør på 1,5 ml som inneholder enzymatisk oppløsning, og lukk deretter røret (Figur 1D).
5. Inkuber røret ved 28 °C i 1 time, rist ved 70 o/min i en shaker i mørket.
6. Vask massebitene. Aspirer all den enzymatiske løsningen og tilsett deretter 0,5 ml av den grunnleggende løsningen.
7. Sentrifuge ved 300 x g i 2 min ved romtemperatur.
8. For å oppnå en protoplastfjæring, aspirer løsningen fra bunnen av sentrifugerøret (Figur 1E).

2. Fluorescens i kalsiumion med små molekyler

1. Forbered Fluo-4/AM-lasteløsningen med 2 mM Fluo-4/AM, 20 % F-127 og 10x fosfatbufret saltvann (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1,36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄og 26 mM KCI) i forholdet 1:1:2.
2. Tilsett 1 μL Fluo-4/AM lasteløsning til 99 μL av protoplastfjæringen som finnes i 1,5 ml sentrifugerør. Forsikre deg om at den endelige konsentrasjonen av fluorescerende fargestoff er 5 μM. Bland løsningen og lukk deretter røret.
3. La³⁺ behandling: Forbered 100 μM La³⁺ oppløsning med 98 μL av protoplastfjæringen, 1 μL 10 mM La³⁺og 1 μL Fluo-4/AM lasteløsning. Bland løsningen og lukk røret.
4. Inkuber i 30 min ved 37 °C i mørket.
5. Vask protoplastene ved sentrifugering ved 300 x g i 2 minutter ved romtemperatur. Aspirer 70 μL av løsningen og tilsett 70 μL av den grunnleggende løsningen.
6. Inkuber protoplastfjæringen ved 37 °C i 30 minutter for å fullstendig avtestere.
7. Aspirer 15 μL av protoplastfjæringen og drypp på et lysbilde.
8. Vær oppmerksom på under et fluorescensmikroskop (Supplerende figur S1).
   MERK: Bruk et fargekamera med høy følsomhet, det vil si 3,2 MP (2048 x 1536) CMOS-sensor med 3,45 μm pikseloppløsning.
9. Velg GFP-kanalen for avbildning (20x). Sett lysstyrken til 0,5.
   MERK: Belysningen er LED-lysbiter med justerbar intensitet og et integrert, hardbelagt filtersett. Eksitasjonsbølgelengden til Fluo-4/AM er 490 nm.

3. Protoplast levedyktighetsanalyse

1. Forbered fluorescein diacetat (FDA) lagerløsning: Løs OPP FDA i aceton til den endelige konsentrasjonen er 1 mg / ml.
2. Forbered FDA-arbeidsløsningen med 1 μL av lagerløsningen og 99 μL aceton.
3. Tilsett 1 μL FDA arbeidsløsning til 99 μL protoplastfjæring. Bland oppløsningen ved å pipettere opp og ned og lukk deretter røret.
   MERK: Den endelige konsentrasjonen av FDA er 100 μg/L.
4. Flekk ved romtemperatur i 5 min i mørket.
5. Forbered lysbildene og observere under et fluorescensmikroskop.
6. Velg GFP-kanalen for avbildning (figur 1F).

4. Bildeanalyse

1. Analyser de oppkjøpte bildene ved hjelp av bildeanalyse og regnearkprogramvare (f.eks. Image-Pro Plus og Excel 2010).
2. Velg to vertikale diametre fra protoplastene for å beregne fluorescensintensiteten (Supplerende figur S2). Mål fluorescensintensiteten til alle protoplaster under ulike behandlinger ble målt. For endelig behandling, bruk fotoredigeringsprogramvare.

5. Statistisk analyse

1. Utføre statistisk analyse ved hjelp av statistisk programvare (Supplerende figur S3). Data presenteres i Mean ± SD. Studentens t-testble brukt til å analysere forskjellene mellom eksperimentelle grupper.

Representative Results

Etter protokollen beskrevet ovenfor brukte vi den enzymatiske metoden for å oppnå levedyktige protoplaster fra massen (figur 1). Noen protoplaster hadde vakuoler, mens andre ikke gjorde det. Mens protoplastene ikke viste fluorescens da Ca^{2 +} fluorescerende indikator ikke ble lastet inn i dem. Da Fluo-4/AM ble lastet inn i protoplastene, ble cytoplasma, men ikke vakuolen, fluorescerende (figur 2). Dette resultatet indikerte at Fluo-4 / AM vellykket farget Ca^{2 +} i cytoplasma og at ingen oppdeling ble observert²⁴. Protoplaster ble farget med FDA i 5 min og viste cytoplasmatisk fluorescens. Dette indikerte at høy temperatur (37 °C) ikke påvirker protoplast levedyktigheten.

La³⁺, et blokkeringsmiddel for Ca²⁺ kanal²⁵, ble lagt til da Fluo-4/AM ble lastet inn i protoplaster. Ved 100 μM reduserte La³⁺ kalsiumfluorescensintensiteten (figur 3).

Figur 1: Protoplaster oppnådd ved enzymatisk hydrolyse. (A) Et stykke ble kuttet fra et modent eple. (B) Protoplaster ble ekstrahert fra massestykker. (C) Massen ble kuttet i 10 × 5 × 1 mm³ stykker. (D) Massestykker ble plassert i sentrifugerør som inneholder 0,5 ml enzymoppløsning. (E) Protoplaster. Pilspisser peker på protoplasten, og pilene indikerer vakuolen i protoplasten. (F) Protoplaster ble farget med FDA i 5 minutter ved romtemperatur. (Denne figuren er modifisert fra referanse ²² [Hagebruksforskning: Lasting av kalsiumfluorescerende sonder i protoplaster for å oppdage kalsium i kjøttvevscellene i Malus domestica]. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Lasting av Fluo-4/AM og La³⁺ i protoplastene. (A) Kontroll: Intakt protoplast uten lastet fluorescerende sonde. (B) Protoplaster lastet med Fluo-4/AM. (C) La³⁺ ble lagt til da protoplastene ble lastet med Fluo-4/AM. Den endelige konsentrasjonen av La³⁺ var 100 μM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Statistisk analyse av fluorescensintensiteten i protoplastene. Angi signifikant forskjell i henhold til Student t-test(P <0,001). Loddrette stolper indikerer ± SD. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet av 20 protoplaster. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur S1: Fluorescensmikroskop. (A) Det generelle utseendet på fluorescensmikroskopet. (B) Innstillingsside. Velg 20x objektiv, GFP-kanal, og juster lysstyrken jevnt til 0,5. (C) Fluorescens eksitasjonsområde. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S2: Trinn som brukes til å beregne Ca^{2 +} fluorescensintensiteten ved protoplast av fruktcelle. Fluorescensintensitetsenheter som brukes i denne studien er basert på tidligere rapporter^26,27,28,29. Beregningsprosessen er som følger: (A) Åpne protoplast fluorescensbildet i programvaren. Klikk på måleverktøyet. Velg Profillinjepå rullegardinmenyen. (B) Velg Sirkel i Linjeprofil-vinduet. Bruk denne til å tegne en ellipse på protoplasten. (C) I Linjeprofil-vinduet velger du nå Fil | Eksportere data (D) Kontroller at det tomme regnearket er åpnet, og importer data ved å klikke Dataeksport. Bruk "gjennomsnitt"-funksjonen til å beregne gjennomsnittlig fluorescensintensitet. Hver behandling ble gjentatt tre ganger med mer enn 20 protoplaster hver. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S3: Datastatistikk ble utført ved hjelp av statistisk analyseprogramvare. Lim inn dataene i tabellen, og klikk Analyser for dataanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur S4: Ekstraksjon av protoplaster fra massen av andre varianter av epler. (A) Dounan. (B) Honning Skarp. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne studien ble levedyktige protoplaster oppnådd ved enzymatisk hydrolyse. Vær oppmerksom på at denne metoden krever friske epler. Den nåværende protokollen muliggjør rask isolering av et stort antall protoplaster fra fruktmasse til bruk i forskningsstudier. Anvendelsen av denne metoden er ikke begrenset til 'Fuji'; protoplastene til eplemassen til 'Dounan' og 'Honey Crisp' kan også ekstraheres gjennom samme protokoll (Supplerende figur S4). Protoplastløsningen etter enzymolyse inneholder cellerester, som ble noe forbedret sammenlignet med tidligere metoder. Som et viktig cellemateriale kan apple pulp protoplaster brukes til celleproteinuttrykksteknologi, encellet sekvensering og annen forskning.

Det finnes mange metoder for kjemisk fluorescerende reagensfarging i planteceller³⁰. For eksempel ble Fluo-3 / AM lastet ved lav temperatur (4 °C), slik at den ville komme inn i rotspisscellene³¹. Fluo-3/AM kan også lastes ved høy temperatur (37 °C) inn i pollenrøret³². Fluo-4/AM har lykkes lastet inn i pollenrøret i Pyrus pyrifolia (25 °C i 15 min)¹⁸ og rothåret til Arabidopsis (4 °C i 30 min)³³. Disse metodene er imidlertid ikke egnet for farging av eplemasseprotoplaster. I denne studien lastet vi fluorescerende sonder i protoplaster ved høy temperatur (37 °C). I tillegg er den nåværende metoden enkel, rask, nøyaktig og påvirker ikke protoplast vitalitet. Et kritisk skritt i den foreslåtte metoden er å vaske de fargede protoplastene og inkubere dem i 30 minutter. Etter farging skal protoplastene vaskes. Vaskingen vil redusere bakgrunnsfluorescensen under observasjon slik at fluorescensintensiteten til protoplastene kan telles mer nøyaktig. Inkuber i 30 min for å la flere sonder lastes inn i protoplastene. Vær oppmerksom på at det er viktig å unngå lyseksponering under lastingen.

La³⁺ er et viktig verktøy for å studere Ca²⁺. Den binder seg til mg^{2 +} katalytisk sted på den cytoplasmatiske membranen Ca^{2 +}-ATPase, og hemmer dermed steady-state-omsetningen til Ca^{2 +}-ATPase og blokkerer Ca^{2 +} transmembrane som fungerer³⁴. La^{3 +} behandling redusert cytoplasmic Ca^{2 +}, og Fluo-4 / AM kan gjenspeile denne endringen, unntatt forstyrrelser av andre divalente kasjoner og verifisere muligheten for kjemiske fluorescens reagenser.

Selv om denne innlastingsmetoden gir flere fordeler enn andre metoder, må den fortsatt forbedres ytterligere for å transformere dataresultater. Her estimerte vi det relative cytoplasmatiske Ca^{2 +} -innholdet ved å oppdage fluorescensverdien til protoplaster, som er kvalitative data i stedet for kvantitative. Derfor er det spesielt viktig å oversette fargingsresultatene til spesifikt cytoplasmisk Ca^{2 +} -innhold i fremtidige studier, noe som kan gi et forskningsgrunnlag for å analysere frukt Ca^{2 +} signalering.

Oppsummert kan metoden beskrevet heri oppdage cytoplasmatisk Ca^{2 +} i eplemasseceller, og dermed gi teknisk støtte til relaterte studier av fruktmassecellekalsium.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.