Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Окрашивание цитоплазматического Ca2+ с fluo-4/AM в яблочной мякоти

Published: November 6, 2021 doi: 10.3791/62526
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

Summary

Изолированные протопласты клеток яблочной мякоти нагружали флуоресцентным реагентом кальция для обнаружения цитоплазматической концентрации Ca2+.

Abstract

Цитозольный Ca2+ играет ключевую роль в развитии растений. Кальциевая визуализация является наиболее универсальным методом обнаружения динамических изменений Ca2+ в цитоплазме. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты клеток пульпы путем ферментативного гидролиза. Изолированные протопласты инкубировали с маломолекулярным флуоресцентным реагентом (Fluo-4/AM) в течение 30 мин при 37 °C. Флуоресцентные зонды успешно окрашивали цитозольный Ca2+, но не накапливались в вакуолях. La3+,блокатор каналов Ca2+, снижение интенсивности цитоплазматической флуоресценции. Эти результаты свидетельствуют о том, что Fluo-4/AM может быть использован для обнаружения изменений цитозольного Ca2+ в мякоти плода. Таким образом, мы представляем метод эффективного выделения протопластов из клеток мякоти плода и обнаружения Ca2+ путем загрузки маломолекулярного флуоресцентного реагента кальция в цитоплазму клеток пульпы.

Introduction

Ca2+ играет важную роль в трансдукции сигналов растений иметаболизме 1,2. Кроме того, он регулирует признаки качества плодов3,4,включая твердость, содержание сахара и восприимчивость к физиологическим нарушениям при хранении5,6. Цитоплазматический Ca2+ играет важную роль в сигнальной трансдукции и регулирует рост и развитие растений7. Нарушение клеточного гомеостаза кальция может вызвать горькую косточку в яблоках8,заболевание коричневых пятн у груш9и пуповинную гниль у томатов10,влияющих на качество плодов и вызывающих серьезные экономические потери3,11. Кальциевая визуализация имеет достаточное пространственное и временное разрешение и является важным методом наблюдения динамики Ca2+ в живых клетках12,13.

В настоящее время существует два основных метода внутриклеточной визуализации кальция в живых клетках: один использует химические маломолекулярные флуоресцентные зонды14,а другой - датчик кодирования генов (GECI)15,16. Учитывая сложность создания стабильной трансгенной системы у фруктовых деревьев и более длительное развитие плодов, GECIS не подходит для флуоресцентной визуализации фруктов Ca2+.

Маломолекулярные флуоресцентные зонды, такие как Fluo-4/ AM, имеют особое преимущество: их форма эфира AM (проницаемое в клетки производное ацетоксиметилового эфира) может быть легко загружена массой в живые клетки без необходимости трансфекции, что делает его гибким, быстрым и нецитотоксичным17. Fluo-4/AM может быть успешно загружен в пыльцевую трубку Pyrus pyrifolia18 и Petunia,19, а также в защитные клетки20 и корневые волосы Arabidopsis21.

В настоящее время имеется мало сообщений о окрашивание кальциевой флуоресценцией клетокпульпы 22. Как важный минеральный элемент, кальций играет ключевую роль в росте и контроле качества плодов деревьев, таких как яблоки. Яблони признаны во всем мире важным экономическим видом, а яблоки считаются здоровой пищей23. В этом исследовании мы получили жизнеспособные протопласты из мякоти плодов яблок путем ферментативного гидролиза, а затем загрузили маломолекулярные флуоресцентные реагенты в цитоплазму для обнаружения Ca2+.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Экстракция протопластов

  1. Готовят основной раствор: 20 мМ CaCl2,5 мМ2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты и 0,4 М D-сорбита.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РН основного раствора доводили до 5,8 с буфером 0,1 М Триса, фильтроввали через водорастворимые фильтры 0,22 мкм и хранили при 4°С.
  2. Приготовить ферментативный раствор: смешать 0,3% (мас./об.) мацероцима R-10 и 0,5% (мас./об.) целлюлазы R-10 с основным раствором.
  3. Добавьте 0,5 мл ферментативного раствора в пробирку центрифуги 1,5 мл. Соберите здоровое и спелое яблоко. Затем нарежьте мякоть на размер 10 х 5х 1 мм 3(рисунок 1А-1С).
  4. Поместите кусочки мякоти плодов яблока в центрифужную трубку размером 1,5 мл, содержащую ферментативный раствор, а затем закройте трубку(рисунок 1D).
  5. Инкубируют трубку при 28 °C в течение 1 ч, встряхивая со скоростью 70 об/мин в шейкере в темноте.
  6. Кусочки мякоти вымойте. Аспирировать весь ферментативный раствор и затем добавить 0,5 мл основного раствора.
  7. Центрифуга при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
  8. Для получения суспензии протопласта аспирируют раствор со дна трубки центрифуги(рисунок 1Е).

2. Флуоресцентное окрашивание ионами кальция маломолекулярных

  1. Приготовьте загрузочный раствор Fluo-4/AM с 2 мМ Fluo-4/AM, 20% F-127 и 10x фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS: 80 мМ Na2HPO4,1,36 М NaCI, 20 мМ KH2PO4и 26 мМ KCI) в соотношении 1:1:2.
  2. Добавьте 1 мкл загрузочного раствора Fluo-4/AM к 99 мкл суспензии протопласта, присутствующей в трубках центрифуги объемом 1,5 мл. Убедитесь, что конечная концентрация флуоресцентного красителя составляет 5 мкМ. Смешайте раствор и закройте трубку.
  3. Обработка La3+: Приготовьте 100 мкМ раствора La3+ с 98 мкл суспензии протопласта, 1 мкл 10 мМ La3+и 1 мкл раствора Fluo-4/AM с нагрузкой. Перемешайте раствор и закройте трубку.
  4. Инкубировать в течение 30 мин при 37 °C в темноте.
  5. Промыть протопласты центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Аспират 70 мкл раствора и добавляют 70 мкл основного раствора.
  6. Инкубируют суспензию протопласта при 37 °C в течение 30 мин до полной деэтерификации.
  7. Аспирировать 15 мкл суспензии протопласта и капать на горку.
  8. Наблюдение под флуоресцентным микроскопом(Дополнительный рисунок S1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цветную камеру с высокой чувствительностью, т.е. CMOS-сенсор 3,2 Мп (2048 x 1536) с разрешением 3,45 мкм пикселей.
  9. Выберите канал GFP для создания изображений (20x). Установите яркость на 0,5.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Освещение - это светодиодные кубы с регулируемой интенсивностью и встроенным набором фильтров с твердым покрытием. Длина волны возбуждения Fluo-4/AM составляет 490 нм.

3. Анализ жизнеспособности протопласта

  1. Приготовьте раствор флуоресцеина диацетата (FDA): растворите FDA в ацетоне до тех пор, пока конечная концентрация не сойдёт 1 мг/мл.
  2. Готовят в FDA рабочий раствор с 1 мкл запасного раствора и 99 мкл ацетона.
  3. Добавьте 1 мкл рабочего раствора FDA к 99 мкл суспензии протопласта. Перемешайте раствор, пипетируя вверх и вниз, а затем закройте трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация FDA составляет 100 мкг/л.
  4. Окрашивать при комнатной температуре в течение 5 мин в темноте.
  5. Подготовьте слайды и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.
  6. Выберите канал GFP для визуализации(рисунок 1F).

4. Анализ изображений

  1. Анализируйте полученные изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений и электронных таблиц (например, Image-Pro Plus и Excel 2010).
  2. Выберите два вертикальных диаметра из протопластов для расчета интенсивности флуоресценции(дополнительный рисунок S2). Измеряли интенсивность флуоресценции всех протопластов при различных методах лечения. Для окончательной обработки используйте программное обеспечение для редактирования фотографий.

5. Статистический анализ

  1. Выполнение статистического анализа с помощью статистического программного обеспечения(дополнительный рисунок S3). Данные представлены в средней ± УР. Тест студента t-testиспользовался для анализа различий между экспериментальными группами.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Следуя описанному выше протоколу, мы использовали ферментативный метод для получения жизнеспособных протопластов из пульпы(рисунок 1). Некоторые протопласты имели вакуоли, в то время как другие этого не делали. В то время как протопласты не проявляли флуоресценции, когда флуоресцентный индикатор Ca2+ не был загружен в них. Когда Fluo-4/AM был загружен в протопласты, цитоплазма, но не вакуоль, стала флуоресцентной(рисунок 2). Этот результат показал, что Fluo-4/ AM успешно окрашивал Ca2+ в цитоплазме и что не наблюдалось компартментализации24. Протопласты окрашивали FDA в течение 5 мин и показывали цитоплазматическую флуоресценцию. Это указывало на то, что высокая температура (37 °C) не влияет на жизнеспособность протопласта.

La3+,блокирующий агент канала Ca2+ 25,был добавлен при загрузке Fluo-4/AM в протопласты. При 100 мкМ La3+ снижала интенсивность флуоресценции кальция(рисунок 3).

Figure 1
Рисунок 1:Протопласты, полученные ферментативным гидролизом. (А)Кусок вырезали из зрелого яблока. (B) Протопласты были извлечены из кусков целлюлозы. (C) Мякоть разрезали на 10 × 5 × 1 мм3 куска. (D)Куски целлюлозы помещали в центрифужные трубки, содержащие 0,5 мл раствора фермента. (E) Протопласты. Наконечники стрел указывают на протопласт, а стрелки указывают на вакуоль в протопласте. (F)Протопласты окрашивали FDA в течение 5 мин при комнатной температуре. (Этот рисунок был изменен из ссылки 22 [Исследования в области садоводства: загрузка флуоресцентных зондов кальция в протопласты для обнаружения кальция в клетках плотской ткани Malus domestica]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Загрузка Fluo-4/AM и La3+ в протопласты. (A) Контроль: Интактный протопласт без какого-либо загруженного флуоресцентного зонда. (B) Протопласты, загруженные Fluo-4/AM. (C) La3+ был добавлен, когда протопласты были загружены Fluo-4 / AM. Окончательная концентрация La3+ составила 100 мкМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Статистический анализ интенсивности флуоресценции в протопластах. Укажите существенную разницу в соответствии с t-тестом стьюдента (P <0,001). Вертикальные полосы указывают ± SD. Каждая точка данных представляет собой среднее значение 20 протопластов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Флуоресцентный микроскоп. (A) Общий внешний вид флуоресцентного микроскопа. (B) Страница настроек. Выберите объектив 20x, канал GFP и равномерно отрегулируйте яркость до 0,5. (C)Область возбуждения флуоресценции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Этапы, используемые для расчета интенсивности флуоресценции Ca 2+ в протопласте фруктовой клетки. Единицы интенсивности флуоресценции, используемые в этомисследовании,основаны на предыдущих отчетах26,27,28,29. Процесс расчета выглядит следующим образом: (A) Открыть флуоресцентное изображение протопласта в программном обеспечении. Нажмите на инструмент «Измерение». В раскрывающемся меню выберите Строка профиля. (B) Выберите «Круг» в окне «Профиль линии». С помощью этого рисуйте эллипс на протопласте. (C) В окне Профиль строки выберите Файл | Экспорт данных (D)Убедитесь, что пустая электронная таблица открыта, и импортируйте данные, щелкнув Экспорт данных. Используйте функцию «средний» для расчета средней интенсивности флуоресценции. Каждое лечение повторялось три раза с более чем 20 протопластами каждый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Статистика данных проводилась с использованием программного обеспечения для статистического анализа. Вставьте данные в таблицу и нажмите кнопку Анализ для анализа данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Извлечение протопластов из мякоти других сортов яблок. (А) Дунан. (B) Мед хрустящий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом исследовании жизнеспособные протопласты были получены ферментативным гидролизом. Отметим, что для этого способа требуются свежие яблоки. Настоящий протокол позволяет быстро изолировать большое количество протопластов из мякоти плодов для использования в научных исследованиях. Применимость этого метода не ограничивается «Fuji»; протопласты яблочной мякоти 'Dounan' и 'Honey Crisp' также могут быть извлечены по тому же протоколу(Дополнительный рисунок S4). Раствор протопласта после ферментализа содержит клеточный мусор, который был несколько улучшен по сравнению с предыдущими методами. В качестве важного клеточного материала протопласты яблочной целлюлозы могут быть использованы для технологии экспрессии клеточного белка, секвенирования одиночных клеток и других исследований.

Существует множество методов, касающихся окрашивания химических флуоресцентных реагентов в растительных клетках30. Например, Fluo-3/AM загружали при низкой температуре (4 °C), так что он входил бы в клетки кончика корня31. Fluo-3/AM также может быть загружен при высокой температуре (37 °C) в пыльцевую трубку32. Fluo-4/AM успешно загрузил в пыльцевую трубку Pyrus pyrifolia (25 °C в течение 15 мин)18 и корневые волосы Arabidopsis (4 °C в течение 30 мин)33. Однако эти методы не подходят для окрашивания протопластов яблочной мякоти. В этом исследовании мы успешно загрузили флуоресцентные зонды в протопласты при высокой температуре (37 °C). Кроме того, данный метод прост, быстр, точен и не влияет на жизнеспособность протопластов. Критическим этапом в предлагаемом способе является промывка окрашенных протопластов и инкубирование их в течение 30 мин. После окрашивания протопласты следует промыть. Промывка уменьшит фоновую флуоресценцию во время наблюдения, так что интенсивность флуоресценции протопластов может быть подсчитан более точно. Инкубировать в течение 30 минут, чтобы позволить загрузить больше зондов в протопласты. Обратите внимание, что важно избегать воздействия света во время загрузки.

La3+ является важным инструментом для изучения Ca2+. Он связывается с каталитическим сайтом Mg2+ на цитоплазматической мембране Ca2+-АТФазы, тем самым ингибируя стационарный оборот Ca2+-АТФазы и блокируя функционирующий трансмембранный Ca2+ 34. Лечение La3+ снижает цитоплазматическую Ca2+и Fluo-4/AM может отражать это изменение, исключая интерференцию других двухвалентных катионов и проверяя осуществимость химических флуоресцентных реагентов.

Хотя этот метод загрузки предлагает больше преимуществ, чем другие методы, он все еще нуждается в дальнейшем улучшении при преобразовании результатов данных. Здесь мы оценили относительное содержание цитоплазматического Ca2+, обнаружив значение флуоресценции протопластов, которое является качественными данными, а не количественными. Поэтому особенно важно перевести результаты окрашивания в специфическое цитоплазматическое содержание Ca2+ в будущих исследованиях, что может обеспечить исследовательскую основу для анализа сигналов плодов Ca2+.

Таким образом, способ, описанный в настоящем описании, может обнаруживать цитоплазматическийCa2+ в клетках мякоти яблока, тем самым обеспечивая техническую поддержку для соответствующих исследований кальция из целлюлозы плодовой целлюлозы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов с содержанием данной статьи.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Проектом по улучшению сельскохозяйственных сортов провинции Шаньдун (2019LZGC007) и инновационной командой по выращиванию фруктовых деревьев современной технологической системы сельскохозяйственной промышленности Шаньдуна (SDAIT-06-05).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× phosphate-buffered saline Solarbio P1022 PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. 
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid Solarbio M8010 Biological buffer
CaCl2·2H2O Solarbio C8370 Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10 Yakult Honsha MX7352 Degrade plant cell walls.
D-sorbitol Solarbio S8090 It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127 Thermo Fisher Scientific P6867 Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. 
FDA Thermo Fisher Scientific F1303 FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. 
Fluo-4/AM Thermo Fisher Scientific F14201 The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope Thermo Fisher EVOS Auto 2 Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10 Yakult Honsha MX7351 Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris Solarbio T8060 It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569 (2016).
  2. Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
  3. Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
  4. Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
  5. Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness--a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
  6. Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
  7. Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
  8. Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
  9. Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
  10. Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
  11. Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
  12. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  13. Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83 (2013).
  14. Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
  15. Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
  16. Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
  17. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  18. Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320 (2016).
  19. Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
  20. Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
  21. Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
  22. Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91 (2020).
  23. Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5 (2004).
  24. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  25. Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
  26. Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511 (2008).
  27. DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
  28. Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
  29. Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
  30. Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647 (2014).
  31. Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
  32. Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
  33. Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53 (2010).
  34. Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).

Tags

Биология выпуск 177
Окрашивание цитоплазматического Ca<sup>2+</sup> с fluo-4/AM в яблочной мякоти
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qiu, L., Huang, D., Wang, Y., Qu, H. … More

Qiu, L., Huang, D., Wang, Y., Qu, H. Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp. J. Vis. Exp. (177), e62526, doi:10.3791/62526 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter