Summary
Melanom er en veldig aggressiv sykdom som raskt sprer seg til andre organer. Denne protokollen beskriver anvendelsen av ultra-høyfrekvent ultralydavbildning, kombinert med 3D-gjengivelse, for å overvåke volumet av inguinale lymfeknuter i Braf / Pten-musemodellen av metastatisk melanom.
Abstract
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genmodifiserte mus (Braf/Pten mus) er mye brukt som en in vivo modell av metastatisk melanom. Når en primærsvulst har blitt indusert ved tamoksifenbehandling, observeres en økning i metastatisk byrde innen 4-6 uker etter induksjon. Dette dokumentet viser hvordan Ultra-High-Frequency UltraSound (UHFUS) avbildning kan utnyttes for å overvåke økningen i metastatisk involvering av inguinale lymfeknuter ved å måle økningen i volumet.
UHFUS-systemet brukes til å skanne bedøvede mus med en UHFUS lineær sonde (22-55 MHz, aksial oppløsning 40 μm). B-modus bilder fra inguinale lymfeknuter (både venstre og høyre side) er anskaffet i en kortaksevisning, og plasserer dyrene i dorsal recumbency. Ultralydposter er anskaffet ved hjelp av en trinnstørrelse på 44 μm på en motorisert mekanisk arm. Etterpå importeres todimensjonale (2D) B-modus-oppkjøp til programvareplattformen for ultralydbilde etter behandling, og inguinale lymfeknuter identifiseres og segmenteres halvautomatisk i de oppkjøpte tverrsnitts 2D-bildene. Til slutt oppnås en total rekonstruksjon av det tredimensjonale (3D) volumet automatisk sammen med gjengivelsen av lymfeknutevolumet, som også uttrykkes som en absolutt måling.
Denne ikke-invasive in vivo-teknikken tolereres veldig godt og tillater planlegging av flere bildebehandlingsøkter på samme eksperimentelle dyr over 2 uker. Det er derfor ideelt å vurdere effekten av farmakologisk behandling på metastatisk sykdom.
Introduction
Melanom er en aggressiv form for hudkreft som ofte sprer seg til andre hudsteder (subkutane metastaser), samt til lymfeknuter, lunger, lever, hjerne og bein1. I løpet av det siste tiåret har nye legemidler blitt introdusert i klinisk praksis og har bidratt til å forbedre forventet levetid for metastatiske melanompasienter. Imidlertid forblir begrensninger, inkludert variabel tid til og grad av respons, alvorlige bivirkninger og opprøret av ervervet motstand1. Derfor er det avgjørende å oppdage metastatisk spredning i sine tidlige stadier, det vil si når det kommer til de lokale lymfeknuter.
En biopsi av de lokale lymfeknuter (sentinel lymfeknuter) utføres vanligvis for å sjekke om det finnes melanomceller. Imidlertid tar ultralydavbildning tak som en ikke-invasiv metode for å oppdage metastatisk involvering, da det overgår klinisk evaluering og kan bidra til å unngå en unødvendig biopsi2,3,4. Videre synes ultralydavbildning hensiktsmessig for lymfeknuteovervåking, spesielt når det gjelder avansert alder og / eller komorbiditeter5,6. Funksjonene som oppdages ved ultralydanalyse og tillater differensiering mellom normale og metastatiske lymfeknuter, består av økt størrelse (volum), endring av form fra oval til rund, uregelmessig margin, endret ekkogent mønster og endret (økt) vaskularisering7.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox genetisk konstruerte mus (Braf/Pten mus) har nylig blitt gjort tilgjengelig for det vitenskapelige samfunnet som en vevsspesifikk og indusert modell for metastatisk melanom8. I denne dyremodellen utvikler primære svulster veldig raskt: de blir synlige innen 2-3 uker etter induksjonen av bryteren fra wild-type (wt) Braf til BrafV600E og av tapet av Pten, mens de når et volum på 50-100 mm3 innen 4 uker. I de følgende 2 ukene er veksten av den primære svulsten ledsaget av en progressiv økning i metastatisk byrde i andre hudsteder, lymfeknuter og lunger.
Braf/Pten-mus har blitt mye brukt til flere formål, inkludert disseksjonen av signalveier involvert i melanomagenese9,10, identifisering av melanomceller av opprinnelse11,12,13, og testing av nye terapeutiske alternativer når det gjelder både målrettet terapi og immunterapi8,14,15,16 . Spesielt brukte vi Braf/Pten mus for å demonstrere at svekkede Listeria monocytogenes (Lmat) fungerer som en anti-melanom vaksine. Når det administreres systemisk i terapeutisk setting, er Lmat ikke forbundet med generell toksisitet, da det selektivt akkumuleres på tumorsteder. Videre forårsaker det en bemerkelsesverdig nedgang i primær melanommasse og en reduksjon i metastatisk byrde i lymfeknuter og lunger. På molekylært nivå forårsaker Lmat apoptotisk drap på melanomceller, noe som i det minste delvis skyldes ikke-celle-autonome aktiviteter (rekruttering på stedet av CD4 + og CD8 + T lymfocytter)16.
Når Braf/Pten-mus brukes til melanommodellering, kan veksten av primære svulster og subkutane metastaser overvåkes av kalipermålinger. Imidlertid må involvering av lymfeknuter og lunger undersøkes ved hjelp av en alternativ teknikk, muligens en ikke-invasiv som gjør det mulig for forskere å følge samme dyr over tid. Dette dokumentet beskriver bruken av ultralydavbildning (figur 1), kombinert med en påfølgende 3D-volumetrisk analyse av de oppnådde dataene, for langsgående overvåking av økningen i størrelse (volum) av inguinale lymfeknuter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er godkjent av det italienske helsedepartementet (dyreprotokoller #754/2015-PR og #684/2018-PR).
1. Melanom induksjon
MERK: Seks uker gamle Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox mus [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] ble brukt i denne studien (se materialtabellen).
- Behandle musene med 4-hydroksytamoxifen (4-HT) ved å påføre 3 μL 5 mM 4-HT på ~ 1 cm2 barbert hud i øvre rygg, som beskrevet tidligere11,16,17, i 3 dager på rad.
MERK: Dette vil aktivere Cre enzymet og forårsake en bryter fra wt Braf til BrafV600E og tap av Pten. Disse to treffene er nok til å indusere melanomdannelse. - Vær oppmerksom på at primære svulster utvikler seg på hudmaleriets sted om 2-3 uker og når et volum på 50-100 mm3 på 4 uker. Vær også oppmerksom på metastaser til andre hudsteder, lymfeknuter og lunger på dette tidspunktet (t0).
- Bruk kalipere til å måle volumet av den primære svulsten og av subkutane metastaser, og ultralydavbildning for å måle volumet av inguinale lymfeknuter. Gjenta disse målingene etter en uke (t1, 5 uker etter hudmaling) og etter to uker (t2, 6 uker etter hudmaling).
- På siste tidspunkt euthanize musene ved å overdrive med gassformige sevorane.
- Analyser de primære svulst- og lymfeknuter ved visuell inspeksjon, og sluk dem deretter for histologiske studier, som rapportert i16.
2. Imaging prosedyre
- Plasser musen i et induksjonskammer for gassbedøvelse og tilfør 3% isofluran i rent oksygen til dyret er fullstendig bedøvet. Kontroller dybden av anestesi ved mangel på respons på poteklemme.
- Overfør dyret til et oppvarmet brett - en konstituerende del av UHFUS bildestasjon - holder dyret i en liggende stilling. Bruk en rektal sonde smurt med petroleumjell for å måle kroppstemperaturen. Juster bordtemperaturen for å opprettholde musens kroppstemperatur i det fysiologiske området (36 ± 1 °C).
- Fukt musens øyne med veterinærsalve for å forhindre tørrhet under anestesi. Tilførsel av narkotisk gass (1,5 % isofluran i rent oksygen) gjennom musens nesemaske. Juster prosentandelen isofluran for å opprettholde riktig dybde av anestesi.
- Belegge for- og bakpoten med ledende pasta og tape dem til EKG-plateelektrodene som er innebygd i brettet. Kontroller at de fysiologiske parametrene (hjertefrekvens, åndedrettssignal og kroppstemperatur) er riktig anskaffet og vist.
- Fjern hår fra begge inguinale områder ved å påføre et depilatorisk middel og belegge dem med et akustisk koblingsmedium.
- Klem uhfus lineær sonde (40 MHz senterfrekvens) inn i en spesialisert 3D-motor innebygd i UHFUS-bildestasjonen, slik at sonden kan beveges automatisk og trinnvis.
- Orienter og juster posisjonen til ultralydsonden riktig for å få kortaksebilder av den inguinale lymfeknuten (venstre / høyre), og plasser interesseområdet i fokussonen.
- Skann hele volumet av den inguinale lymfeknuten som en sekvens av bilder i 2D B-modus, som beskrevet tidligere18. Skaff bilder på flere nivåer av lymfeknuten ved lineær bevegelse av svingeren med trinnstørrelser på en mikrometerskala, for å generere 3D-data når det gjelder automatisk respirasjons- og hjerteporterte cine-løkker.
- Still inn bildeopptaket med følgende parametere: skanneavstand som varierer mellom 2 og 5 mm (avhengig av lymfeknutestørrelse); trinnstørrelse 44 μm, med et resultat på 46-114 skannetrinn / lymfeknuteskiver og en oppkjøpstid på 1-3 min per dyr. Lagre de oppkjøpte bildene digitalt i RAW-format (DICOM) for videre offline analyser.
- På slutten av bildebehandlingsøkten, avslutt gassbedøvelsen og la dyret gjenopprette på varmebrettet i sternal recumbency. Ta vare på dyret til det har fått tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde den utsatte posisjonen.
3. Etterbehandling av ultralydbilder
- Åpne datasettet for DICOM 3D-bilder av venstre / høyre inguinal lymfeknute i programvareplattformen for ultralydbilde etter behandling.
- Segmentering:
- Velg Flersektormetode for å visualisere både gjeldende delbilder og miniatyrer for alle delbilder som tilsvarer hvert bilde som ble tatt under 3D-anskaffelsen.
- Merk miniatyrbildet av den første rammen for å laste den inn i konturvisningen. I konturvisningen, venstreklikk på musen for å slippe punkter langs kanten av lymfeknuten. Når ønsket antall poeng er angitt (område 10-15), høyreklikker du for å fullføre konturen.
- Når den første konturen er fullført, bruker du miniatyrvisningen til å merke neste bilde for konturering. Hopp om nødvendig over flere bilder (gjennomsnitt på 3 bilder) mellom konturene for å redusere antall manuelle spor som trengs for hvert 3D-volum.
MERK: Programvareplattformen for ultralydbilde etterbehandling vil automatisk generere konturer mellom manuelle spor, og dermed redusere analysetiden. - Gjenta denne prosessen til hele volumet er skissert. Når du er ferdig, klikker du på Fullfør.
- Generering av 3D-trådramme og volummåling:
- Mens du er i arbeidsområdet for 3D-modus , klikker du på Volummåling-ikonet under bildevisningsområdet for å aktivere overflatevisningen.
MERK: Overflatevisningen oppretter en kompileringsvisning som tilordner det brukergenererte volumet til det anskaffede bildet. Overflatevisningen kan roteres til ønsket posisjon. - Legg merke til volummålingen som er oppført nederst til venstre i kubevisningen.
MERK: Segmentering og generering av 3D-volum kan også fås ved hjelp av spesialutviklet programvare og/eller fritt tilgjengelig/kommersiell programvare for generell bildebehandling. Fra manuell segmentering skal programvaren gi en matematisk og / eller pikselnivåbeskrivelse av lymfeknutekonturene. Disse konturene vil bli kombinert i et 3D-rom for å gjengi den ytre overflaten av lymfeknuter. Alle trinnene som er beskrevet i avbildningsprosedyren og etterbehandlingen av ultralydbilder, er oppsummert i figur 2.
- Mens du er i arbeidsområdet for 3D-modus , klikker du på Volummåling-ikonet under bildevisningsområdet for å aktivere overflatevisningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter hudmaling av Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox mus med 4-HT, blir Cre-aktiviteten indusert, på grunn av hvilken det er en bryter på genomisk nivå fra wt Braf til BrafV600E, mens Pten går tapt (figur 3A). I løpet av 2-3 uker utvikler mus primære svulster på stedet med 100% penetrans. Etter fire uker fra 4-HT-behandling (t0) når primærsvulster et volum på 50-100 mm3, og veksten kan måles med kalipere i ytterligere 2 uker ((t1 og t2; Figur 3B, øvre paneler). Senere tidspunkter kan ikke nås fordi svulsten blir så stor at musene krever eutanasi.
Når det gjelder den metastatiske byrden, observeres en gradvis økning i pigmentering i inguinale lymfeknuter innen 4-6 uker fra 4-HT-behandling (figur 3B, nedre paneler). En slik økning i pigmentering skyldes tilstedeværelsen av melaninavsetninger, som det kan bekreftes av hematoksylin og eosinfarging utført uten å fjerne melanin. I sin tur er melaninavsetningene alltid på grunn av tilstedeværelsen av metastaserte melanomceller, som bekreftet av immunhiistokjemisk (IHC) farging av melanomantigenet MLANA og brafv600e (figur 3C).
Akkumuleringen av pigmenterte melanomceller inne i inguinale lymfeknuter er ledsaget av en progressiv økning i volumet, som tydelig ved visuell inspeksjon (figur 3B, nedre paneler). Ultralydavbildning gir den unike muligheten til å kvantifisere en slik økning i lengderetningen, i hver eksperimentell mus, som beskrevet tidligere16. Volumetriske målinger, segmenteringsresultater og 3D-gjengivelse, som alle refererer til et representativt tilfelle, vises i figur 4. Volumet av hver lymfeknute oppnås ved manuell segmentering av de aksiale seksjonene som er oppnådd under en 3D-skanning.
På slutten av segmenteringsfasen viser alle seksjonene overlegget av lymfeknutens ytre kontur (figur 4A). Disse konturene er koblet ramme for ramme i gjengivelsesfasen, og den ytre overflaten av hele lymfeknuten projiseres i 3D-rommet. Som et representativt eksempel vises 3D-gjengivelsen av en høyre inguinal lymfeknute analysert ved t0, t1 og t2 i henholdsvis figur 4B, figur 4C og figur 4D. Grafen i figur 4E kvantifiserer økningen i volum som vises av venstre og høyre inguinale lymfeknuter av samme dyr over tid.
Figur 1: Ultralydavbildningssystemet som brukes til å overvåke økningen i volumet av de inguinale lymfeknuter i Braf / Pten genetisk konstruert musemodell av melanom. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Trinnvis oppsummering av bildebehandlingsprosedyren og etterbehandling av ultralydbilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Visuell inspeksjon og histologiske analyser av inguinale lymfeknuter i den vevsspesifikke og induserbare Braf/Pten metastatiske melanommodellen i musen. (A) Cre-enzymet forårsaker overgangen av wt Braf til BrafV600E og tap av Pten (eksisjon av eksoner 4 og 5). Dette systemet er melanocyttspesifikk fordi uttrykket av Cre-enzymet er under kontroll av promotoren av tyrosinase, et enzym involvert i melaninsyntese. Derfor er de to onkogene treffene begrenset til den melanocytiske avledningen. Dette systemet er også utdannet fordi Cre uttrykkes som et fusjonsprotein med østrogenreseptoren og krever at hudmaling med 4-HT translokaliseres til kjernen, hvor det kan utøve sin funksjon. (B) Utseendet til primære melanomtumorer (øvre bilder) og inguinale lymfeknuter (nedre bilder) etter henholdsvis 4, 5 og 6 uker etter 4-HT-behandling (henholdsvis t0, t1 og t2). I lymfeknuter oppdages økningen i melaninakkumulering og størrelse ved visuell inspeksjon. Skalastenger = 0,5 cm (øvre bilder); 0,2 cm (nedre bilder). (C) Histologiske analyser av inguinale lymfeknuter, 6 uker etter 4-HT-behandling. (øverst til venstre) H&E farging: melaninavsetninger fjernes ved å inkubere skiver med 1% KOH og 3% H2O2. (øverst til høyre) Melanin deteksjon utført av H &E farging uten 1% KOH og 3% H2O2 behandling. (nederst til venstre) MLANA-deteksjon ved immunoperoksidasefarging (DAB kromogensubstrat og hematoksylintellerstaining). (nederst til høyre) BRAFV600E deteksjon ved immunoperoxidase farging (DAB kromogen substrat og hematoksylin telleretaining). For alle paneler, original forstørrelse: 40x; skalastenger = 20 μm. Forkortelser: wks = uker; wt = wild-type; 4-HT = 4-hydroksytamoxifen; H&E = hematoksylin og eosin; DAB = 3,3'-diaminobenzidin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Målinger, segmentering og 3D-gjengivelse av volumet av inguinale lymfeknuter i den vevsspesifikke og uduselige Braf/Pten metastatiske melanommodellen i musen. (A) Overlegg av de eksterne konturene av høyre inguinale lymfeknute i 4 representative skannede seksjoner oppnådd ved manuell segmentering. (BD) Gjengivelse av 3D-volumet av høyre inguinal lymfeknute, målt ved henholdsvis 4, 5 og 6 uker etter 4-HT-behandling (t0, t1 og t2 tidspunkter). Den numeriske verdien av volumet rapporteres også (i mm3). (E) Volumet av venstre (svart sirkel) og høyre (hvit sirkel) inguinal lymfeknute av samme dyr ved t0, t1 og t2 tidspunkter. Forkortelser: 3D = tredimensjonal; 4-HT = 4-hydroksytamoxifen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dataene som er oppnådd i denne studien, vitner om evnen til ultralydavbildning for å overvåke metastatisk involvering av inguinale lymfeknuter i Braf / Pten-musemodellen av metastatisk melanom. Som vist tidligere16, er denne teknikken spesielt nyttig for å vurdere effekten av narkotikabehandling. Dette er fordi det tillater overvåking av endringen i lymfeknutevolumet i samme dyr over tid, ved å sammenligne målingene samlet på t1 andt2 med de som samles inn ved t0. Dette bidrar igjen til en økning i robustheten til de oppnådde resultatene, fordi variasjon mellom mus og andre faktorer som kan påvirke basal lymfeknutestørrelse, alle er gjort rede for. I tillegg tillater ultralydavbildning overholdelse av 3R-prinsippet ved å redusere antall dyr per eksperimentell gruppe.
I Braf / Pten mus er ikke bare inguinal, men også brachial og aksillære lymfeknuter steder for metastatisk spredning. Det er imidlertid tilrådelig å fokusere på inguinale lymfeknuter fordi de andre er for nær det primære tumorstedet, som vanligvis endrer lokalisering og morfologi under utviklingen av selve primærsvulsten. Alternativt kan brachial og aksillære lymfeknuter bli egnet for ultralydavbildning hvis et annet sted for tumorinduksjon er valgt, for eksempel ører eller poter8. Når det gjelder andre metastatiske steder, kan lungene ikke studeres ved hjelp av ultralydavbildning, på grunn av tilstedeværelsen av luft i vevet. Teoretisk sett kan bare overfladiske lungemetastaser som når pleuralgrensesnittet visualiseres med denne teknikken. Selv om mikroberegnet tomografi/positronutslippstomografi (CT/PET) kan brukes i stedet, har denne tilnærmingen flere ulemper, inkludert høye kostnader og begrenset tilgjengelighet. Videre, basert på ioniserende strålinger, er mikro CT / PET neppe kompatibel med langsgående målinger på flere tidspunkter. Omvendt kan ultralydavbildning lett påføres studiet av subkutane metastaser og tillater måling av både volum og vaskularisering16.
Hvis en 2-ukers tidsramme er for kort til å sette pris på effekten av stoffet som studeres, kan et mer perifert induksjonssted (f.eks. spissen av tail9,11) eller en mindre tumorutsatt genotype (Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/+ mus i stedet for Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox mus) velges. . I begge tilfeller forventes veksten av den primære svulsten å være mye langsommere, slik at metastaseovervåking i langt mer enn 6 uker etter induksjon med 4-HT.
Fra et mer teknisk synspunkt er det viktig å merke seg at 2D-segmentering av ultralydbilder er det mest kritiske trinnet i denne protokollen, fordi det kan påvirke målingen av 3D-volum. Heldigvis, i Braf / Pten dyremodellen, er kontrasten mellom lymfeknuter og omkringliggende vev ganske merket, slik at disposisjonen av lymfeknutegrensene ved manuell segmentering er relativt enkel. Segmenteringsprosessen bør imidlertid forenkles av den høye kvaliteten på ultralydbildene som er anskaffet av sonografen, som igjen skal være svært erfaren og fokusert på å skaffe seg samme ultralydprojeksjon av lymfeknuten, selv i skanneøkter utført på forskjellige tidspunkter.
B-modus ultralydavbildning kan ikke markere kreftceller direkte; I stedet tillater det slutningen av deres tilstedeværelse fra økningen i volumet av inguinale lymfeknuter. I lys av denne informasjonen anbefales det at ultralydavbildning kombineres med passende IHC-farging av lymfeknuter, slik at tilstedeværelsen av kreftceller kan bekreftes på molekylært nivå. Imidlertid kan en lymfeknuteforstørrelse observert i en indusert Braf / Pten-mus vanligvis tilskrives kreftspredning og ikke til en annen årsak , for eksempel en pågående infeksjon. Dette skyldes sannsynligvis at eksperimentelle mus som brukes til ultralydavbildning, blir avlet under kontrollerte forhold og rutinemessig blir utsatt for sanitær screening, slik at sykdom raskt oppdages og behandles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke S. Burchielli (FTGM, Pisa) for hennes hjelp med dyreprosedyrer. Dette arbeidet ble støttet av ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica institusjonell finansiering til LP; MFAG #17095 tildelt av AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro til LP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
References
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663 (2019).
- Blum, A., et al. Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients. Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).
- Olmedo, D., et al. Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis. Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).
- Voit, C., et al. Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma. Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).
- Hayes, A. J., et al. Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma. British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).
- Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients. Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).
- Jayapal, N., et al. Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).
- Dankort, D., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Damsky, W. E., et al. β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas. Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).
- Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma. Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).
- Kohler, C., et al. Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes. Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).
- Yuan, P., et al. Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).
- Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma. Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).
- Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma. American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).
- Steinberg, S. M., et al. BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma. Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).
- Vitiello, M., et al. Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma. Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).
- Moon, H., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma. Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).
