Summary
흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.
Abstract
Tyr::CreER+, BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 전이성 흑색종의 생체내 모델로 널리 사용됩니다. 일단 원발성 종양이 타목시펜 처리에 의해 유도되면, 유도 후 4-6 주 이내에 전이성 부담의 증가가 관찰됩니다. 이 논문은 UHFUS(Ultra-High-Frequency UltraSound) 이미징을 활용하여 부피의 증가를 측정하여 사타구니 림프절의 전이성 관여 증가를 모니터링하는 방법을 보여줍니다.
UHFUS 시스템은 UHFUS 선형 프로브 (22-55 MHz, 축 분해능 40 μm)로 마취 된 마우스를 스캔하는 데 사용됩니다. 사타구니 림프절 (왼쪽과 오른쪽 모두)의 B 모드 이미지는 짧은 축보기로 수집되어 동물을 등쪽 난해부에 배치합니다. 초음파 기록은 전동 기계식 암에 44 μm 스텝 크기를 사용하여 수집됩니다. 그 후, 2차원(2D) B 모드 획득은 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼으로 가져오고, 획득한 횡단면 2D 이미지에서 사타구니 림프절을 반자동으로 식별하고 분할합니다. 마지막으로, 3차원(3D) 부피의 전체 재구성은 림프절 부피의 렌더링과 함께 자동으로 얻어지며, 이는 또한 절대 측정으로 표현된다.
이러한 비침습적 생체내 기술은 매우 잘 견디며, 2주에 걸쳐 동일한 실험 동물에 대한 다수의 이미징 세션의 스케줄링을 허용한다. 따라서 약리학 적 치료가 전이성 질환에 미치는 영향을 평가하는 것이 이상적입니다.
Introduction
흑색종은 종종 다른 피부 부위 (피하 전이)뿐만 아니라 림프절, 폐, 간, 뇌 및 뼈로 퍼지는 공격적인 형태의 피부암입니다1. 지난 십 년 동안 신약이 임상 실습에 도입되었으며 전이성 흑색종 환자의 기대 수명을 향상시키는 데 기여했습니다. 그러나 반응의 가변적 인 시간과 정도, 심각한 부작용 및 후천적 인 저항의 반란을 포함하여 한계가 남아 있습니다1. 따라서 초기 단계, 즉 국소 림프절에 도달 할 때 전이성 확산을 감지하는 것이 중요합니다.
국소 림프절 (센티넬 림프절)의 생검은 일반적으로 흑색종 세포의 존재를 확인하기 위해 수행됩니다. 그러나 초음파 영상은 임상 평가를 능가하고 불필요한 생검을 피하는 데 도움이 될 수 있기 때문에 전이성 개입을 탐지하는 비 침습적 방법으로 자리 잡고 있습니다2,3,4. 또한, 초음파 영상은 림프절 감시, 특히 고령 및/또는 합병증의 경우5,6에 적합한 것으로 보인다. 초음파 분석에 의해 검출되고 정상 림프절과 전이성 림프절 사이의 분화를 허용하는 특징은 크기 (부피) 증가, 타원형에서 둥글게의 모양 변화, 불규칙한 여백, 변경된 echogenic 패턴 및 변경된 (증가된) 혈관화7를 포함한다.
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 유전자 조작 마우스(Braf/Pten 마우스)는 최근 전이성 흑색종에 대한 조직 특이적이고 유도성 모델로서 과학계에 제공되었다8. 이 동물 모델에서 원발성 종양은 매우 빠르게 발달합니다 : 야생형 (wt) Braf에서 BrafV600E로의 전환 유도 후 2-3 주 이내에 볼 수 있으며 Pten의 손실은 4 주 이내에 50-100mm3의 부피에 도달합니다. 다음 2 주 동안, 원발성 종양의 성장은 다른 피부 부위, 림프절 및 폐에서 전이성 부담의 점진적 증가를 동반한다.
Braf/Pten 마우스는 흑색종 발생9,10에 관여하는 신호전달 경로의 해부, 기원의 흑색종 세포의 확인11,12,13, 표적 요법과 면역요법 모두에서 새로운 치료 옵션의 시험을 포함하여 여러 목적으로 광범위하게 사용되어 왔습니다.8,14,15,16 . 특히, 우리는 Braf / Pten 마우스를 사용하여 약독화 된 리스테리아 단세포 유전자 (Lmat)가 항 흑색종 백신으로 작용한다는 것을 입증했습니다. 치료 환경에서 전신적으로 투여될 때, Lmat은 종양 부위에 선택적으로 축적되기 때문에 전반적인 독성과 관련되지 않는다. 또한, 원발성 흑색종 질량의 현저한 감소와 림프절과 폐의 전이성 부담의 감소를 일으킨다. 분자 수준에서, Lmat은 흑색종 세포의 사멸을 일으키는데, 이는 적어도 부분적으로는 비세포-자율적 활동(CD4+ 및 CD8+ T 림프구의 현장 모집)16에 기인한다.
Braf/Pten 마우스가 흑색종 모델링에 사용될 때, 원발성 종양 및 피하 전이의 성장은 캘리퍼 측정에 의해 모니터링될 수 있다. 그러나 림프절과 폐의 개입은 대체 기술을 사용하여 조사해야하며, 연구자가 시간이 지남에 따라 동일한 동물을 따라갈 수있게 해주는 비 침습적 일 수 있습니다. 이 논문은 사타구니 림프절의 크기 (부피) 증가의 종방향 모니터링을 위해 획득 된 데이터의 후속 3D 체적 분석과 결합 된 초음파 이미징 (그림 1)의 사용을 설명합니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 이탈리아 보건부 (동물 프로토콜 # 754 / 2015-PR 및 # 684 / 2018-PR)의 승인을 받았습니다.
1. 흑색종 유도
참고: 여섯 주령의 Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox 마우스 [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten)]가 본 연구에 사용되었다(자료표 참조).
- 앞서 기술한 바와 같이 등 뒤의 면도된 피부의 ∼1 cm2 상에 3 μL의 5 mM 4-HT를 적용하여 마우스를 4-하이드록시타목시펜(4-HT)으로 3일 연속으로 치료한다.
참고 : 이것은 Cre 효소를 활성화시키고 wt Braf에서 BrafV600E로 전환하고 Pten의 손실을 일으 킵니다. 이 두 안타는 흑색종 형성을 유도하기에 충분합니다. - 원발성 종양이 2-3 주 안에 피부 페인팅 부위에서 발생하고 4 주 안에 50-100mm3의 부피에 도달한다는 것을 관찰하십시오. 또한이 시점에서 다른 피부 부위, 림프절 및 폐로의 전이를 관찰하십시오 (t0).
- 캘리퍼를 사용하여 원발성 종양의 부피와 피하 전이를 측정하고 초음파 이미징을 사용하여 사타구니 림프절의 부피를 측정하십시오. 1 주 후 (t1, 스킨 페인팅 후 5 주)와 2 주 후 (t2, 스킨 페인팅 후 6 주) 이러한 측정을 반복하십시오.
- 마지막 시점에서, 기체 세보란으로 과다 투여하여 마우스를 안락사시킨다.
- 육안 검사로 원발성 종양과 림프절을 분석 한 다음 조직 학적 연구를 위해 절제하십시오.16.
2. 영상 촬영 절차
- 마우스를 가스 마취를 위한 유도 챔버에 놓고 동물이 완전히 마취될 때까지 순수한 산소에 3% 이소플루란을 공급한다. 발 꼬집음에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 확인하십시오.
- 동물을 UHFUS 이미징 스테이션의 구성 부분 인 가열 된 보드로 옮기면 동물을 수핀 위치에 고정시킵니다. 석유 젤리로 윤활 된 직장 프로브를 사용하여 체온을 측정하십시오. 보드 온도를 조정하여 마우스의 체온을 생리적 범위(36± 1°C)로 유지합니다.
- 마취 중 건조를 방지하기 위해 수의사 연고로 마우스의 눈을 적시십시오. 마우스의 코 마스크를 통해 마약 가스 (순수 산소의 1.5 % 이소플루란)를 공급하십시오. 마취의 정확한 깊이를 유지하기 위해 이소플루란의 비율을 조정하십시오.
- 앞발과 뒷발을 전도성 페이스트로 코팅하고 보드에 내장 된 ECG 플레이트 전극에 테이프로 붙입니다. 생리적 파라미터(심박수, 호흡 신호 및 코어 체온)가 올바르게 수집되고 표시되는지 확인합니다.
- 탈모제를 바르면 두 사타구니 부위에서 머리카락을 제거하고 음향 결합 매체로 코팅하십시오.
- UHFUS 선형 프로브(40MHz 중심 주파수)를 UHFUS 이미징 스테이션에 내장된 특수 3D 모터에 클램핑하여 프로브를 자동으로 단계적으로 이동할 수 있습니다.
- 초음파 프로브의 위치를 적절하게 조정하고 조정하여 사타구니 림프절 (왼쪽 / 오른쪽)의 단축 이미지를 얻고 관심 영역을 초점 영역에 배치하십시오.
- 앞서 설명한 바와 같이 사타구니 림프절의 전체 부피를 2D B 모드 이미지의 시퀀스로 스캔합니다.18. 마이크로미터 스케일의 스텝 크기를 갖는 트랜스듀서의 선형 이동에 의해 림프절의 여러 레벨에서 이미지를 획득하여, 자동 호흡 및 심장 게이트 시네 루프의 관점에서 3D 데이터를 생성합니다.
- 다음 매개 변수로 이미지 녹화를 설정하십시오 : 2 ~ 5mm 사이의 스캔 거리 (림프절 크기에 따라 다름); 단계 크기 44 μm, 46-114 스텝 스텝/림프절 슬라이스의 결과와 동물 당 1-3 분의 획득 시간. 추가 오프라인 분석을 위해 획득한 이미지를 원시 형식(DICOM)으로 디지털 방식으로 저장합니다.
- 이미징 세션이 끝나면 가스 마취를 중단하고 동물이 흉골 잔해의 가열 보드에서 회복 할 수 있도록하십시오. 경향이있는 위치를 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 동물을 돌보십시오.
3. 초음파 이미지의 후처리
- 초음파 이미지 사후 처리를 위해 소프트웨어 플랫폼에서 왼쪽 / 오른쪽 사타구니 림프절의 DICOM 3D 이미지 데이터 세트를 엽니 다.
- 세분화:
- 다중 슬라이스 방법을 선택하여 3D 획득 중에 캡처된 각 이미지에 해당하는 모든 프레임의 현재 프레임과 축소판을 모두 시각화합니다.
- 첫 번째 프레임의 축소판을 선택하여 윤곽선 보기로 로드합니다. 윤곽선 보기에서 마우스를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 림프절의 경계를 따라 점을 드롭합니다. 원하는 점 수(범위 10-15)가 설정되면 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 윤곽선을 완성합니다.
- 첫 번째 윤곽선이 완료된 후 축소판 보기를 사용하여 윤곽을 그릴 다음 이미지를 선택합니다. 필요한 경우 윤곽선 사이에 여러 이미지(평균 3프레임)를 건너뜁니다. 각 3D 볼륨에 필요한 수동 트레이스 수를 줄입니다.
참고: 초음파 이미지 후처리를 위한 소프트웨어 플랫폼은 수동 추적 사이의 윤곽선을 자동으로 생성하므로 분석 시간이 단축됩니다. - 전체 볼륨이 윤곽선이 표시될 때까지 이 과정을 반복합니다. 완료되면 마침을 클릭하십시오.
- 3D 와이어프레임 및 볼륨 측정의 생성:
- 3D 모드 창 작업 영역에서 이미지 표시 영역 아래의 볼륨 측정 아이콘을 클릭하여 표면 보기를 활성화합니다.
참고: 서피스 뷰는 사용자가 생성한 볼륨을 획득한 이미지에 매핑하는 컴파일 뷰를 만듭니다. 서피스 뷰는 원하는 위치로 회전할 수 있습니다. - 큐브 보기의 왼쪽 아래 모서리에 나열된 볼륨 측정값을 기록해 둡니다.
참고: 세분화 및 3D 볼륨 생성은 일반 이미지 처리를 위해 맞춤 개발된 소프트웨어 및/또는 자유롭게 사용할 수 있는/상용 소프트웨어를 사용하여 얻을 수도 있습니다. 수동 세분화부터 시작하여 소프트웨어는 림프절 윤곽선에 대한 수학적 및/또는 픽셀 수준 설명을 제공해야 합니다. 이러한 윤곽선은 림프절의 외부 표면을 렌더링하기 위해 3D 공간에서 결합됩니다. 이미징 절차 및 초음파 이미지의 사후 처리에 설명된 모든 단계는 그림 2에 요약되어 있습니다.
- 3D 모드 창 작업 영역에서 이미지 표시 영역 아래의 볼륨 측정 아이콘을 클릭하여 표면 보기를 활성화합니다.
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Representative Results
Tyr::CreER+, BrafCA/+, Ptenlox/lox 마우스의 4-HT를 사용한 피부 페인팅 후, Cre 활성이 유도되며, 이로 인해 게놈 수준에서 wt Braf에서 BrafV600E 로 전환되고 Pten은 손실됩니다(그림 3A). 2-3 주 안에 마우스는 100 % 침투력으로 현장 원발성 종양을 일으 킵니다. 4-HT 치료 (t0)로부터 4 주 후, 원발성 종양은 50-100 mm3의 부피에 도달하고, 그들의 성장은 추가 2 주 동안 캘리퍼에 의해 측정 될 수있다 ((t1 및 t2; 도 3B, 상부 패널). 종양이 너무 커져서 생쥐가 안락사를 필요로하기 때문에 나중에 시점에 도달 할 수 없습니다.
전이성 부담에 관한 한, 4-HT 치료로부터 4-6주 이내에 사타구니 림프절에서 색소침착의 점진적인 증가가 관찰된다(도 3B, 하부 패널). 이러한 색소침착의 증가는 멜라닌을 제거하지 않고 헤마톡실린 및 에오신 염색을 통해 확인할 수 있는 바와 같이 멜라닌 침착물의 존재에 기인한다. 차례로, 멜라닌 침착은 흑색종 항원 MLANA 및 BRAFV600E의 면역조직화학(IHC) 염색에 의해 확인된 바와 같이 전이된 흑색종 세포의 존재로 인해 변함없이 존재하기 때문이다(도 3C).
사타구니 림프절 내부에 색소 흑색종 세포가 축적되면 육안 검사에서 알 수 있듯이 부피가 점진적으로 증가합니다 (그림 3B, 하단 패널). 초음파 이미징은 앞서 설명한 바와 같이16 각 실험 마우스에서 종방향으로 이러한 증가를 정량화할 수 있는 독특한 기회를 제공한다. 체적 측정, 세그멘테이션 결과 및 3D 렌더링은 모두 대표적인 경우를 참조하여 그림 4에 나와 있습니다. 각 림프절의 부피는 3D 스캔 중에 획득 한 축 절편의 수동 세분화에 의해 얻어집니다.
세분화 단계가 끝나면 모든 섹션은 림프절의 외부 윤곽선의 오버레이를 보여줍니다 (그림 4A). 이러한 윤곽선은 렌더링 단계에서 프레임별로 연결되며 전체 림프절의 외부 표면은 3D 공간에 투영됩니다. 대표적인 예로서, t0, t1 및 t2 에서 분석된 우측 사타구니 림프절의 3D 렌더링은 각각 도 4B, 도 4C 및 도 4D에 도시되어 있다. 도 4E 의 그래프는 시간에 따른 동일한 동물의 좌우 사타구니 림프절에 의해 표시되는 부피의 증가를 정량화한다.
그림 1: 흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피 증가를 모니터링하는 데 사용되는 초음파 이미징 시스템. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이미징 절차와 초음파 이미지의 후처리에 대한 단계별 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스의 조직 특이적이고 유도성 Braf/Pten 전이성 흑색종 모델에서 사타구니 림프절의 육안 검사 및 조직학적 분석. (A) Cre 효소는 wt Braf를 BrafV600E로 전환하고 Pten을 손실(엑손 4와 5를 절제)합니다. 이 시스템은 멜라닌 세포-특이적 Cre 효소의 발현이 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 티로시나제의 프로모터의 제어 하에 있기 때문이다. 따라서 두 개의 발암 유발 히트는 멜라노시스 계통으로 제한됩니다. 이 시스템은 또한 Cre가 에스트로겐 수용체와의 융합 단백질로 발현되고 그 기능을 발휘할 수있는 핵으로 이식되기 위해 4-HT로 피부 페인팅을 필요로하기 때문에 유도 가능합니다. (B) 4-HT 치료 후 4, 5 및 6주 후에 원발성 흑색종 종양(위 사진) 및 사타구니 림프절(아래 사진)의 출현(각각 t0, t1 및 t2). 림프절에서 멜라닌 축적과 크기의 증가는 육안 검사에 의해 감지됩니다. 스케일 바 = 0.5 cm (상단 사진); 0.2 cm (아래 사진). (C) 사타구니 림프절의 조직학적 분석, 4-HT 치료 후 6주. (왼쪽 위) H&E 염색: 멜라닌 침착물은 1% KOH 및 3% H2O2로 조각을 배양하여 제거한다. (오른쪽 위) 멜라닌 검출은 1% KOH 및 3% H2O2 처리 없이 H&E 염색에 의해 수행되었다. (왼쪽 아래) 면역퍼옥시다제 염색에 의한 MLANA 검출 (DAB 염색체 기질 및 헤마톡실린 역염색). (오른쪽 아래) 면역퍼옥시다제 염색(DAB 염색체 기질 및 헤마톡실린 역염색)에 의한 BRAFV600E 검출. 모든 패널의 경우 원래 배율 : 40x; 스케일 바 = 20 μm. 약어: wks = 주; wt = 야생형; 4-HT = 4-하이드록시타목시펜; H&E = 헤마톡실린 및 에오신; DAB = 3,3'-디아미노벤지딘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 마우스의 조직 특이적이고 유도성 Braf/Pten 전이성 흑색종 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 측정, 세분화 및 3D 렌더링합니다. (A) 수동 분할을 통해 얻은 4개의 대표적인 스캔 절편에서 오른쪽 사타구니 림프절의 외부 윤곽을 오버레이합니다. (B-D) 우사타구니 림프절의 3D 부피의 렌더링은, 4-HT 치료 후 4, 5, 및 6주째에 측정된 바와 같다(각각 t0, t1, 및 t2 시점). 볼륨의 숫자 값도 보고됩니다(mm3). (e) t0, t1 및 t2 시점에서의 동일한 동물의 좌측(검은색 원) 및 오른쪽(백색 원) 사타구니 림프절의 부피. 약어: 3D = 3차원; 4-HT = 4-하이드록시타목시펜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 연구에서 얻은 데이터는 전이성 흑색종의 Braf / Pten 마우스 모델의 사타구니 림프절의 전이성 관여를 모니터링하는 초음파 이미징의 능력을 증명합니다. 앞서 보여진 바와 같이16, 이 기술은 약물 치료의 효능을 평가하는데 특히 유용하다. 이는 t1 andt2 에서 수집된 측정치와 t0에서 수집된 측정값을 비교함으로써 시간에 따른 동일한 동물에서 림프절 부피의 변화를 모니터링할 수 있기 때문이다. 이것은 차례로 획득 된 결과의 견고성 증가에 기여하는데, 이는 마우스 간 가변성 및 기저 림프절 크기에 영향을 줄 수있는 다른 요인이 모두 설명되기 때문입니다. 또한 초음파 이미징은 실험군 당 동물 수를 줄임으로써 3R 원칙을 준수 할 수 있습니다.
Braf / Pten 마우스에서 사타구니 일뿐만 아니라 상완 및 겨드랑이 림프절도 전이성 확산 부위입니다. 그러나 다른 것들은 원발성 종양 부위에 너무 가깝기 때문에 사타구니 림프절에 집중하는 것이 좋습니다.이 림프절은 일반적으로 원발성 종양 자체의 발달 중에 국소화 및 형태를 변경합니다. 대안적으로, 상완 및 겨드랑이 림프절은 귀 또는 발과 같은 종양 유도의 다른 부위가 선택되는 경우 초음파 영상화에 적합해질 수 있다8. 다른 전이성 부위에 관한 한, 폐는 조직에 공기가 존재하기 때문에 초음파 이미징을 사용하여 연구 할 수 없습니다. 이론적으로, 흉막 계면에 도달하는 피상적 인 폐 전이 만이이 기술로 시각화 될 수 있습니다. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 / 양전자 방출 단층 촬영 (CT / PET)을 대신 사용할 수 있지만이 접근법에는 높은 비용과 제한된 가용성을 포함하여 몇 가지 단점이 있습니다. 또한 이온화 방사선을 기반으로 하는 마이크로 CT/PET는 여러 시점에서 종방향 측정과 거의 호환되지 않습니다. 반대로, 초음파 영상은 피하 전이 연구에 쉽게 적용될 수 있으며 부피와 혈관화의 측정을 모두 허용합니다16.
2 주간의 기간이 너무 짧아서 연구중인 약물의 효과를 이해할 수 없다면, 더 많은 말초 유도 부위 (예 : 꼬리 9,11의 끝) 또는 종양이 발생하기 쉬운 유전자형 (Tyr : : CreER +, BrafCA / +, Ptenlox / + 마우스 대신 Tyr : : CreER +, BrafCA / +, Ptenlox / lox 마우스)을 선택할 수 있습니다9 . 두 경우 모두에서, 원발성 종양의 성장은 훨씬 느려질 것으로 예상되며, 4-HT로 유도 후 6주 이상 전이 모니터링을 가능하게 한다.
보다 기술적 인 관점에서 볼 때, 초음파 이미지의 2D 세분화는 3D 볼륨의 측정에 영향을 줄 수 있기 때문에이 프로토콜에서 가장 중요한 단계라는 점에 유의해야합니다. 운 좋게도 Braf / Pten 동물 모델에서는 림프절과 주변 조직 간의 대비가 상당히 두드러 지므로 수동 세분화에 의한 림프절 경계의 윤곽이 비교적 간단합니다. 그러나 세분화 과정은 초음파 학자가 획득 한 초음파 이미지의 높은 품질에 의해 촉진되어야하며, 소노 그래퍼는 고도로 숙련되고 다른 시점에서 수행되는 스캔 세션에서도 림프절의 동일한 초음파 투영을 획득하는 데 집중해야합니다.
B 모드 초음파 영상은 암세포를 직접 강조 표시 할 수 없습니다. 대신, 그것은 사타구니 림프절의 부피의 증가로부터 그들의 존재를 추론 할 수있게합니다. 이 정보에 비추어 볼 때, 초음파 이미징을 림프절의 적절한 IHC 염색과 결합하여 암세포의 존재를 분자 수준에서 확인할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 그러나, 유도된 Braf/Pten 마우스에서 관찰된 림프절 확대는 전형적으로 암 확산에 기인하며, 예를 들어, 진행중인 감염과 같은 다른 원인에 기인하지 않는다. 이것은 초음파 영상에 사용 된 실험 마우스가 통제 된 조건에서 자란 후 일상적으로 위생 검사를 받으므로 질병이 즉시 발견되고 치료되기 때문일 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 동물 절차에 대한 그녀의 도움에 대해 S. Burchielli (FTGM, Pisa)에게 감사하고 싶습니다. 이 작업은 ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica 기관 자금 조달에 의해 LP에 지원되었습니다. MFAG #17095는 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro가 LP에 수여했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-hydroxytamoxifen | Merck | H6278 | drug used for tumor induction |
| B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) mice | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | ophthalmic solution gel | |
| BRAFV600E antibody | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorane) | Zoetis | liquid for gaseous anaesthesia | |
| MLANA antibody | Thermo Fisher Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma gel | Parker | electrode gel | |
| Transonic gel clear | Telic SAU | ultrasound gel | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | depilatory cream | |
| Compact Dual Anesthesia System | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Isoflurane-based anesthesia system equipped with nose cone and induction chamber | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS linear probe | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS system | |
| Vevo Imaging Station | Fujifilm, Visualsonics Inc. | UHFUS imaging station and Advancing Physiological Monitoring Unit endowed with heated board | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | software platform for ultrasound image post-processing |
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