Summary
Vi beskriver en protokoll for å merke makrofag-avledede små ekstracellulære vesikler med PKH-fargestoffer og observere deres opptak in vitro og i ryggmargen etter intratekal levering.
Abstract
Små ekstracellulære vesicles (sEVs) er 50-150 nm vesicles utskilt av alle celler og tilstede i kroppsvæsker. sEVer overfører biomolekyler som RNA, proteiner og lipider fra donor til akseptorceller, noe som gjør dem til viktige signalmeglere mellom celler. I sentralnervesystemet (CNS) kan sEVer megle intercellulær signalering, inkludert nevroimmune interaksjoner. sEV-funksjoner kan studeres ved å spore opptaket av merkede sEVer i mottakerceller både in vitro og in vivo. Dette dokumentet beskriver merking av sEVer fra det betingede mediet til RAW 264.7 makrofagceller ved hjelp av en PKH-membranfarge. Det viser opptaket av forskjellige konsentrasjoner av merkede sEVer på flere tidspunkter av Neuro-2a celler og primære astrocytter in vitro. Også vist er opptaket av sEVs levert intrathecally i musen ryggmargen nevroner, astrocytter, og mikroglia visualisert av konfekt mikroskopi. De representative resultatene viser tidsavhengig variasjon i opptaket av sEVer av forskjellige celler, noe som kan bidra til å bekrefte vellykket sEVs-levering i ryggmargen.
Introduction
Små ekstracellulære vesicles (sEVs) er nanosized, membran-avledede vesicles med et størrelsesområde på 50-150 nm. De stammer fra multi-vesikulære organer (MVB) og frigjøres fra celler ved sammensmelting av MVB-ene med plasmamembranen. sEVer inneholder miRNAer, mRNAer, proteiner og bioaktive lipider, og disse molekylene overføres mellom celler i form av celle-til-celle-kommunikasjon. sEVer kan internaliseres av mottakerceller ved hjelp av en rekke endokytiske veier, og denne fangsten av sEVer av mottakerceller formidles av anerkjennelsen av overflatemolekyler på både elbiler og målcellene1.
sEVs har fått interesse på grunn av deres evne til å utløse molekylære og fenotypiske endringer i akseptorceller, deres nytte som terapeutisk middel, og deres potensial som bærere for lastmolekyler eller farmakologiske midler. På grunn av sin lille størrelse kan avbildning og sporing av sEVer være utfordrende, spesielt for in vivo-studier og kliniske omgivelser. Derfor er mange metoder utviklet for å merke og bilde sEVs for å hjelpe deres biodistribusjon og sporing in vitro og in vivo2.
Den vanligste teknikken for å studere sEV biodistribusjon og målcelleinteraksjoner innebærer å merke dem med fluorescerende fargemolekyler3,4,5,6,7. Elbiler ble opprinnelig merket med cellemembranfarger som ofte ble brukt til å bildeceller. Disse fluorescerende fargestoffene flekker vanligvis lipidbilayeren eller proteiner av interesse på sEVer. Flere lipofile fargestoffer viser et sterkt fluorescyl når det innlemmes i cytosolen, inkludert DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine jod), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indocarbocyanine perklorat), og DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetrametyl indokarbocyanine 4-klorobenzenesulfonat salt)8,9,10,11.
Andre lipofile fargestoffer, som PKH67 og PKH26, har en svært fluorescerende polarhodegruppe og en lang alifatisk hydrokarbonhale som lett interkalerer inn i enhver lipidstruktur og fører til langsiktig fargestoffretensjon og stabil fluorescens12. PKH fargestoffer kan også merke elbiler, noe som gjør det mulig å studere EV-egenskaper i vivo13. Mange andre fargestoffer har blitt brukt til å observere eksosomer ved hjelp av fluorescensmikroskopi og strømningscytometri, inkludert lipidmerkingsfargestoffer14 og cellegjennomtrengelige fargestoffer som karboksyfluorescein diacetat succinimidyl ester (CFDA-SE)15,16 og calcein acetoxymetyl (AM) ester17.
Studier av sEV-mediert krysstale mellom forskjellige celler i CNS har gitt viktig innsikt i patogenesen av nevroinflammatoriske og nevrodegenerative sykdommer18. For eksempel kan sEVer fra nevroner spre beta-amyloidpeptider og fosforylerte tauproteiner og hjelpe til med patogenesen av Alzheimers sykdom19. I tillegg inneholder elbiler avledet fra erytrocytter store mengder alfasynuklein og kan krysse blod-hjernebarrieren og bidra til Parkinsons patologi20. SEVs evne til å krysse fysiologiske barrierer21 og overføre biomolekylene til målceller gjør dem praktiske verktøy for å levere terapeutiske legemidler til CNS22.
Visualisering av sEV-opptak av utallige CNS-celler i ryggmargen vil muliggjøre både mekanistiske studier og evaluering av de terapeutiske fordelene ved eksogent administrerte sEVer fra ulike cellulære kilder. Dette dokumentet beskriver metodikken for å merke sEVer avledet fra makrofager og bilde deres opptak in vitro og in vivo i lumbale ryggmargen av nevroner, mikroglia og astrocytter for å kvalitativt bekrefte sEV levering ved visualisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle prosedyrer ble utført i samsvar med NIH-guiden for pleie og bruk av laboratoriedyr og godkjent av Institutional Animal Care &Use Committee ved Drexel University College of Medicine. Tidsdømte CD-1 mus ble brukt til astrocytisk kultur, og alle dammer ble mottatt 15 dager etter impregnering. Ti tolv uker gamle C57BL/6 mus ble brukt til in vivo opptak eksperimenter.
1. Isolering av sEVer fra RAW 264.7 makrofagceller
- Kultur RAW 264,7 celler i 75 cm2 kolber i DMEM exosome-utarmet medium som inneholder 10% exosome-utarmet foster bovint serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (penn-strep) i 24-48 h.
- Samle 300 ml kondisjonert medium og sentrifuge ved 300 × g i 10 min ved 4 °C.
- Samle supernatant og sentrifuge ved 2000 × g i 20 min ved 4 °C.
- Overfør supernatanten til sentrifugerør, sentrifuge i 35 min ved 12 000 × g ved 4 °C.
- Samle supernatanten og filtrer gjennom et 0,22 μm sprøytefilter.
- Overfør til ultracentrifuge rør og sentrifuge i 80 min ved 110,000 × g ved 4 °C.
- Oppbevar supernatanten (eksosom-utarmet medium), resuspend pellet i 2 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS), og sentrifuger i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C.
- Resuspend pellet i 100 μL AV PBS for videre karakterisering ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) eller i radioimmunoprecipitation assay (RIPA) buffer for vestlig blotting.
2. Karakterisering av sEVer
- Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA)
MERK: Størrelsesfordelingen og partikkelnummeret/konsentrasjonen av rensede sEVer fra RAW 264,7 celler ble målt av NTA.- Fortynn sEVene i filtrert PBS for å oppnå 20-60 vesicles per synsfelt for optimal sporing.
- Introduser den fortynnede prøven i en strømningscelle ved hjelp av en sprøytepumpe med konstant strømningshastighet.
- Ta 3-5 videoer på 30 s hver. Angi lukkertid og forsterkning, og fokuser kamerainnstillingene manuelt for at maksimalt antall vesikler skal være synlige og i stand til å spores og analyseres.
- Før frem prøvene mellom hver innspilling for å utføre replikeringsmålinger. Optimaliser NTA-innstillingene etter anskaffelsen og hold innstillingene konstante mellom prøvene.
- Analyser hver video ved hjelp av NTA-programvaren for å oppnå gjennomsnittlig størrelse og konsentrasjon av vesiklene.
- Utfør alle NTA-målinger med identiske systeminnstillinger for konsistens.
- Vestlig blott
- Kvantifisere de totale proteinmengdene i sEVer, cellelysater og eksosomutarmede medier ved hjelp av et proteinanalysesett i henhold til produsentens instruksjoner.
- For cellelysepreparat, kultur RAW 264,7 celler i 75 cm2 kolber til 80-90% sammenløp. Løsne cellene med 0,25% trypsin i 10-15 min, nøytraliser trypsin med kulturmedier, og pellet cellene ved å spinne på 400 × g i 5 min. Resuspend cellene i frisk vekst medium.
- Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og overfør 1 × 106 celler til et annet rør. Vask cellene med PBS to ganger ved hjelp av de samme sentrifugeringsforholdene som ovenfor og tilsett 50 μL lysisbuffer (RIPA-buffer med proteasehemmercocktail tilsatt) til cellepelleten fra det endelige spinnet.
- Virvel cellene og hold dem på is i 20 min. Utsette blandingen for sentrifugering ved 10 000 × g i 30 minutter ved 4 °C, samle supernatanten (dvs. lysatet) i friske mikrocentrifugerør, og hold den ved −80 °C til bruk.
- Konsentrer 2 ml eksosom-utarmede medier til 100 μL ved hjelp av 3 kDa-cutoff sentrifugalfiltre før du kvantifiserer mengden protein. Bland sEVene med lysisbuffer i forholdet 1:1, virvel i 30 s og inkuber på is i 15 minutter for å kvantifisere mengden protein.
- Bland like mengder protein (2 μg) av sEVene, RAW 264,7 cellelysat og eksosome-utarmede medier med redusert prøvebuffer.
- Denature prøvene ved 95 °C i 5 min, hold dem på is i 5 min, og spinn i 2 min ved 10.000 × g. Last prøvene på en 12% Tris-glycin proteingel og kjør gelen på 125 V i 45 min.
- Overfør proteinet til en polyvinylliddifluoridmembran (PVDF) ved 25 V i 2 timer.
- Etter overføringen blokkerer du PVDF-membranene med blokkeringsbuffer (se materialtabellen) i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber flekken med primære antistoffer på en shaker over natten ved 4 °C.
MERK: Primære antistoffer som ble brukt var anti-CD81 (1:1000), anti-alfa-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-interagerende protein X (Alix) (1:1000), anti-Calnexin (1:1,000) og anti-glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) (1:1,000). - Vask blottene 3 x 15 min med 1x Tris-bufret saltvann, 0,1% Tween 20 (TBST), og inkubere ved romtemperatur med geit antimus IgG-pepperrot peroxidase (HRP)- eller esel anti-kanin IgG-HRP-konjugerte sekundære antistoffer (1:10,000) i 1 time på shakeren.
- Vask blottene 3 x 15 min med 1x TBST, og oppdag proteinene ved hjelp av et HRP-substrat.
- Analyser blotter ved forbedret chemiluminescens ved hjelp av en vestlig blot imager.
- Transmisjonselektronmikroskopi (TEM)
- Løs sEVs ved å resuspendere dem i 2% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffer (PB); vortex for 2 x 15 s.
- Legg en dråpe på 10 μL sEV-suspensjon på ren parafilm. Flyt det karbonbelagte formvar-rutenettet på dråpen med den belagte siden vendt mot fjæringen. La membranene absorbere i 20 min i tørre omgivelser.
- Plasser gitteret (membransiden ned) på en dråpe PB for å vaske i 3 x 2 min.
- Overfør gitteret til 50 μL 1% glutaraldehyd i 5 min.
- Vask gitteret med 100 μL destillert vann i 8 x 2 min.
- Kontrast prøven ved å plassere rutenettene på en dråpe på 1% uranylacetat i 2 min.
- Bygg inn prøven med 50 μL 0,2% uranylacetat med 2% metylcelluloseoppløsning i 10 min på en parafilmdekket isfat.
- Bruk løkker i rustfritt stål til å holde gitteret og fjern overflødig væske med filterpapir.
- Lufttørk gitteret i 10 minutter mens du fortsatt er på sløyfen.
- Vær oppmerksom under et transmisjonselektronmikroskop ved 80 kV.
3. Merking av sEVer
- Fortynn 20 μg sEVer i 1 ml fortynningsbuffer eller samme volum PBS i 1 ml fortynningsbuffer for fargestoffkontroll.
- Fortynn 3 μL PKH67 eller PKH26 fargestoff i 1 ml fortynningsbuffer og bland ved pipettering.
- Tilsett fortynnet PKH-fargestoff til de fortynnede sEVene og bland ved pipettering. Inkuber i 5 min i mørket ved romtemperatur. For en fargekontroll, bland det fortynnede fargestoffet med fortynnet PBS fra trinn 3.1.
- Tilsett 2 ml 1% bovint serumalbumin (BSA) i PBS til røret med fargestoffet og sEV-blandingen og til fargestoffkontrollrøret for å absorbere overflødig fargestoff.
- Sentrifuge i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C. Kast supernatanten, resuspend pellet i 2 ml PBS, og sentrifuge i 1 time ved 110.000 × g ved 4 °C. Gjenta vasken med PBS og bruk de merkede sEVene eller fargekontrollen på nytt i like stor mengde PBS.
- Kvantifisere mengden av totalt protein ved Bradford-metoden.
4. Opptak av sEVs av Neuro-2a celler
- Legg 18 mm deksler i en 12-brønns plate og plate 10 × 104 Neuro-2a celler i hver brønn i totalt 1 ml komplett DMEM-medium som inneholder 10% FBS og 1% pennestråpe.
- Endre mediet til DMEM-eksosomet utarmet medium når cellesammenløpet er 80-90%. Tilsett 1, 5 eller 10 μg merkede sEVer i hver brønn i 1, 4 og 24 timer for dose- og tidsavhengig opptak, eller legg til et likt volum fargestoffkontroll.
5. Primære astrocytiske kulturer
- Bedøv 4 postnatale valper 4 dager etter fødselen ved å indusere hypotermi.
- Samle hjernen i en 60 mm Petri-tallerken som inneholder iskald Hanks balanserte saltløsning (HBSS) supplert med 10 mM 4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES).
- Disseker både kortikale lober og fjern meningene. Hakk vevet med et sterilisert blad.
- Overfør vevet til et 15 ml konisk rør som inneholder papain/deoxyribonuclease I dissosiasjonsbuffer og inkuber i 20 min ved 37 °C. Virvle hver femte min.
MERK: For 4 muskortikaler aktiveres 9 ml 7,5 U/ml papain i HBSS ved 37 °C i minst 30 minutter, filtreres gjennom et 0,22 μm sprøytefilter og blandes med deoksyribonuklease I til en endelig konsentrasjon på 0,1 mg/ml. - Aspirer supernatanten og tilsett 5 ml fullstendig DMEM for å inaktivere enzymaktiviteten. Trianturer forsiktig for å dissosiere vevet med en 5 ml glass serologisk pipette og en flammepolert Pasteur pipette.
- Før cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil og sentrifuger cellene ved 250 × g i 5 min ved 4 °C. Aspirer mediet og frø cellene i 10 ml fullstendig DMEM i en 75 cm2 kolbe. Bytt ut det supernatante mediet med 15 ml friskt DMEM-medium 4 timer etter plating.
- Etter 14 dager in vitro, overfør kolben til en orbital shaker for å løsne mikroglia og oligodendrocytter ved 320 rpm i 6 timer.
- Prøv de resterende astrocyttene ved hjelp av 5 ml av celledissosiasjonsenzymet (Materialtabellen) i 10 min ved 37 °C. Tilsett 5 ml fullstendig DMEM for å inaktivere den enzymatiske virkningen og pellet cellene ved 250 × g i 5 min ved 4 °C.
- Resuspend cellene i fullstendig DMEM. Frø 5 × 104 celler på 12 mm #1,5 deksler i en 24-brønns plate.
6. Opptak av sEVs av astrocytter
- Når astrocytter når 80-90% samløp, endre medium til DMEM exosome-utarmet medium.
- Tilsett 1 μg umerkede, merkede sEVer, et likt volum fargekontroll eller PBS i cellene. Bruk cellene til farging 1 t og 24 timer etter sEV-behandling.
7. Immunfluorescens
- Skyll cellene med PBS 3x og fest dem med 4% PFA i PB i 10 minutter ved romtemperatur.
- Vask de faste cellene 3 x 5 min med PB og permeabiliser dem med 0,1% Triton X-100 i PB i 10-15 min og vask med PB 3 x 5 min.
- Blokker cellene med 5% normalt geitserum (NGS) i PB i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber cellene med primære antistoffer: mikrotubule-assosiert protein 2 (MAP2A, 1:500) for Neuro-2a celler eller glial fibrillært surt protein (GFAP, 1:500) for primære astrocytter i friske 5% NGS / PB over natten ved 4 °C med skånsom risting.
- Vask 3 x 10 min med PB og tilsett fluoroforkonjugede sekundære antistoffer (Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594; eller Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488) i 5% NGS og inkuber i 2 timer ved romtemperatur på en rocker.
- Vask 3 x 10 min med PB og inkuber med 1 μg/ml kjernefysisk flekk 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 10 min ved romtemperatur. Vask cellene igjen 3x med PB.
- Monter dekslene på #1 lysbilder ved hjelp av et antifade monteringsmedium. La dem tørke over natten i mørket, og oppbevar det forberedte glasset glir ved 4 °C til de ser på et konfokalt mikroskop.
8. In vivo opptak av sEVs
- Utfør intrathecal injeksjon av 5 μg umerket eller merket sEVs resuspendert i 10 μL PBS, eller lik volum (10 μL) fargekontroll (som utarbeidet i avsnitt 3) i C57BL/6 mus.
- Etter 6 og 18 timer etter injeksjon av sEVs, dypt bedøvet mus ved intraperitoneal injeksjon av 100 mg / kg kroppsvekt av ketamin og 10 mg / kg kroppsvekt av xylazine.
- Utfør intrakardial perfusjon av mus med 0,9% saltvann for å skylle ut blod, etterfulgt av nylaget iskald 4% PFA / PB.
- Disseker ryggmargen og fest i 4% PFA / PB ved 4 °C i 24 timer. Kryoprekt vevet i 30% sukrose i PB ved 4 °C i 24 timer eller til vevet synker. Oppbevar vevet ved 4 °C til immunhiistokjemi.
9. Immunohistokjemi
- Bygg inn L4-L5 ryggmargen i O.C.T-forbindelsen. Frys på tørris til den er helt størknet.
- Seksjon vevet på 30 μm (tverrsnitt for ryggmargen) ved hjelp av en kryostat, og samle seksjonene i en 24-brønns plate som inneholder PB. Vask seksjonene 3 x 5 min med 0,3% Triton i PB.
- Blokker ikke-spesifikke bindingssteder med 5% NGS i 0,3% Triton / PB i 2 timer ved romtemperatur.
- Fortynn primære antistoffer: Anti-MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 for mikroglia (1:2,000) med 5% NGS i 0,3% Triton / PB, og inkubere seksjonene over natten ved 4 ° C på en shaker.
- Vask seksjonene 3 x 5 min med 0,3% Triton / PB, og legg til sekundære antistoffer (Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488, 1:500 eller Goat Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488, 1:500) i 5% NGS / PB i 2 timer ved romtemperatur.
- Vask 3 x 5 min med PB, og inkuber seksjonene i 1 μg/ml DAPI i 10 minutter ved romtemperatur. Vask seksjonene 3 x 5 min med PB.
- Monter seksjonene på et rent selvklebende lysbilde (Materialbord) med en fin pensel under et lett mikroskop.
- Fukt dekslene med monteringsmedium. Herd over natten i mørket ved romtemperatur.
- Bilde under et konfokalt mikroskop med de respektive laserne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter isolering av sEVer fra RAW 264,7 betingede medier via sentrifugering ble NTA brukt til å bestemme konsentrasjonen og størrelsesfordelingen til de rensede sEVene. Gjennomsnittlig gjennomsnittsstørrelse på RAW 264,7-avledede sEVer var 140 nm, og topppartikkelstørrelsen var 121,8 nm, noe som bekrefter at de fleste påvisbare partikler i lysspredningsmålingen falt innenfor størrelsesområdet for eksosomer eller sEVer ved 50-150 nm (Figur 1A). Som foreslått i minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesicles 2018 (MISEV2018)23, analyserte vi et sett med proteiner som skulle være til stede eller utelukket fra forskjellige EV-populasjoner. Vestlig blotting av sEVer, cellelys og ekso-utarmede medier viste at sEV-avledede proteinprøver inneholdt sEV-markørproteinene Alix, CD81 og GAPDH. Cellelysefraksjonen ble beriket med det endoplasmatiske retikulumboerproteinet, calnexin, som var fraværende i sEVene. Dermed fungerte calnexin som en negativ markør for cellulær forurensning (Figur 1B).
Vi utførte deretter doserespons og tidskurseksperimenter for sEV-opptak in vitro. Neuro-2a celler ble inkubert med en enkelt 1 μg dose PKH67-merkede sEVs i 1, 4 og 24 h, hvoretter opptaket av forskjellige konsentrasjoner av sEVs (1, 5 og 10 μg) ble undersøkt ved 1 t. Resultatene av NTA indikerte at 1 μg protein i gjennomsnitt var lik ~ 1 x 109 partikler. Parallelt ble også PBS, umerkede sEVer og fargestoff-alene-kontroller testet. Vi observerte at opptak av sEVer forekom ved 1 t (figur 2A) og for 1, 5 og 10 μg sEVer (figur 2B). Fluorescens kan påvises ved 4 timer for 5 og 10 μg av sEVs (Figur 2C) etter inkubasjon. Deretter ble opptak av PKH26-merkede sEVer av primære astrocytter undersøkt (figur 3). Maksimal fluorescens fra sEV-opptak i primære kortikale astrocytter skjedde ved 24 timer. Unlabeled sEVs viste ikke fluorescens, noe som viser at sEV autofluorescence ikke bidrar vesentlig til falske positiver (Supplerende figur S1A).
Deretter ble merkede sEVer intrathecally injisert i mus for å vurdere levering og opptak av sEVs av forskjellige celler i ryggmargen ved hjelp av immunhiistokjemi og konfikal mikroskopi. Vi farget for MAP2 som en nevronmarkør, GFAP som en astrocytisk markør og IBA1 som en mikroglial markør. Nevroner (figur 4), astrocytter (figur 5) og mikrogliale celler (figur 6) tok alle opp PKH26-merkede sEVer, og maksimal sEV-fluorescens ble observert ved 6 timers postinjeksjon. Mens sEVene ikke alltid colokaliserte med cellulære markører, observerte vi ikke noe differensialopptak av CNS-celler. Intrathecal injeksjon med 5 μg umerket RAW 264.7 sEVs eller fargestoffkontroll viste ikke signifikant fluorescens (Supplerende figur S1B). Fluorescerende signaler ble observert i meningene, både 6 timer og 18 timer etter injeksjon av sEVs (Supplemental Figure S1C).
Figur 1: Karakterisering av renset RAW 264.7 sEVs. (A) Størrelse og konsentrasjon av sEVs ble bestemt ved hjelp av NanoSight NS300. Partiklene ble sporet og dimensjonert basert på brownsk bevegelse og diffusjonskoeffisient. Størrelsesfordelingen for sEVer vises i nm. Konsentrasjonen av sEVer ble uttrykt som partikler/ml. (B) Vestlig flekk av proteiner avledet fra rensede sEVer, cellelys og exosome-utarmede medier ved hjelp av sEV-markørene ALIX, GAPDH og CD81. Den endoplasmatiske retikulumproteinmarkøren, calnexin, tjener som en kontroll for å overvåke cellulær forurensning i sEV-preparater. (C) Transmisjonselektronmikroskopi demonstrerte størrelsen og morfologien til sEVer. Skalastang = 100 nm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; ALIX = Alfa-1,3/1,6-Mannosyltransferase (ALG-2)-interagerende protein X; GAPDH = glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase; CD81 = differensieringsklynge 81. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Opptak av merkede RAW 264,7 sEVer av Neuro-2a-celler. (A) PKH67-merkede sEVer (1 μg) ble lagt til de dyrkede Neuro-2a-cellene i 1, 4 eller 24 h. sEV-opptak ble observert til enhver tid med konfokal mikroskopi. (B) PKH67-merkede sEVer (1, 5 eller 10 μg) ble lagt til Neuro-2a celler i 1 t. (C) PKH67-merkede sEVer (5 eller 10 μg) ble lagt til Neuro-2a celler i 4 t. SEV opptak ble observert i alle doseringsgrupper med konfektmikroskopi. Negative kontrollgrupper behandlet med PKH-fargestoff alene viste ikke sEV-farging (Supplerende figur S1). Neuro-2a celler ble immunostained med MAP2A (probed med Alexa Fluor 594, vist i rødt), mens cellekjerner ble farget med DAPI (vist i blått) og sEVs med PKH67 (vist i grønt). Skalastang = 50 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; MAP2A = mikrotubule-assosiert protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Opptak av PKH26-merkede RAW 264,7 sEVer av primærmus kortikale astrocytter. En μg av sEVs ble merket med PKH26 fargestoff og lagt til det primære astrocyttkulturmediet. Opptak av sEVer ble observert ved 1 og 24 timers etter tillegg ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Astrocytter ble farget med GFAP (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt), mens cellekjerner ble motarbeidet med DAPI (vist i blått), og sEVer ble tidligere farget med PKH26 (vist i grønt). Skala bar = 20 μm. PKH26 fargestoff alene tjente som en negativ kontroll for sEV farging. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Opptak av RAW 264,7 sEVsin-nevroner. PKH26-merkede sEVer ble injisert intrathecally hos mus; 6 og 18 timer senere ble musene perfundert med 4% PFA, og ryggmargen ble isolert og seksjonert på 30 μm. Ryggmargsseksjoner ble immunostert med en cellemarkør (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt) og DAPI kjernefysiske tellere (vist i blått), mens sEVs tidligere var merket med PKH26 (vist i grønt). Ryggmargsseksjoner ble immunostert for MAP2A for å visualisere nevronene (rød). Konfektmikroskopi viser sEVer i MAP2A-positive nevroner på forskjellige tidspunkter. Den negative kontrollen, PKH26 fargestoff-alene gruppe, viste ikke sEV farging. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; PFA = paraformaldehyd; MAP2A = mikrotubule-assosiert protein 2A; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Opptak av RAW 264,7 sEVer i astrocytter. PKH26-merkede sEVer ble injisert intrathecally hos mus; 6 og 18 timer senere ble musene perfundert med 4% PFA, og ryggmargen ble isolert og seksjonert på 30 μm. Ryggmargsseksjoner ble immunostert med en cellemarkør (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt) og DAPI kjernefysiske tellere (vist i blått), mens sEVs tidligere var merket med PKH26 (vist i grønt). Ryggmargsseksjoner ble immunostert for GFAP for å visualisere astrocyttene (rød). Konfektmikroskopi viser sEVer i GFAP-positive astrocytter på forskjellige tidspunkter. Den negative kontrollen, PKH26 fargestoff-alene gruppe, viste ikke sEV farging. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; PFA = paraformaldehyd; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Opptak av RAW 264,7 sEVer i mikroglia. PKH26-merkede sEVer ble injisert intrathecally hos mus; 6 og 18 timer senere ble musene perfundert med 4% PFA, og ryggmargen ble isolert og seksjonert på 30 μm. Ryggmargsseksjoner ble immunostert med en cellemarkør (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt) og DAPI kjernefysiske tellere (vist i blått), mens sEVs tidligere var merket med PKH26 (vist i grønt). Ryggmargsseksjonene ble immunostert for IBA1 for å visualisere mikroglia (rød). Konfektmikroskopi viser sEVer i IBA1-positiv mikroglia på forskjellige tidspunkter. Den negative kontrollen, PKH26 fargestoff-alene gruppe, viste ikke sEV farging. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; PFA = paraformaldehyd; IBA1 = ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Opptak av merkede RAW 264,7 sEVer med primærmus kortikale astrocytter og i ryggmargen. (A) Kontroller for opptak av PKH26-merkede RAW 264.7 sEVs av primære mus kortikale astrocytter. En μg av umerkede sEVer resuspendert i PBS eller et likt volum av PBS ble lagt parallelt med kulturmediet av astrocytter. Ingen fluorescens ble observert ved 1 time for PBS og den umerkede kontrollen ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Astrocytter ble farget med GFAP (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt), mens kjernene ble motarbeidet med DAPI (blå), og umerkede sEVer ble visualisert under samme Alexa Fluor 546-kanal som PKH26-merkede sEVer. Skalastang = 50 μm. (B) Kontroller for opptak av PKH26-merket RAW 264.7 sEVs av musens ryggmarg in vivo. Fem μg umerkede sEVer eller fargestoffkontroll ble injisert intrathecally hos mus. Igjen ble fluorescerende signaler ikke observert for umerkede sEVer eller fargestoff-alene kontroll ved hjelp av et konfokalt laserskanningsmikroskop. Astrocytter ble farget med GFAP (probed med Alexa Fluor 488, vist i rødt), mens kjerner ble motsnakket med DAPI (blå), og umerkede sEVer ble visualisert under samme Alexa Fluor 546-kanal som PKH26-merkede sEVer. Skalastang = 50 μm. (C)Representative bilder avslører tilstedeværelsen av RAW 264.7 sEVs i musen spinal meninges 6 h og 18 h etter intrathecal levering. Fem μg av sEVs ble merket med PKH26 fargestoff (vist i grønt), og kjernene ble motarbeidet med DAPI (vist i blått). Stjerner indikerer den fremre ryggradsarterien. Skalastang = 50 μm. Forkortelser: sEVs = små ekstracellulære vesicles; PBS = fosfatbufret saltvann; GFAP = glial fibrillært surt protein; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen viste vi merking av sEVer med PKH-fargestoffer og visualisering av opptaket i ryggmargen. PKH lipofile fluorescerende fargestoffer er mye brukt til merking av celler ved strømning cytometri og fluorescerende mikroskopi3,5,6,12,24,25. På grunn av deres relativt lange halveringstid og lav cytotoksisitet, kan PKH-fargestoffer brukes til et bredt spekter av in vivo- og in vitro-cellesporingsstudier26,27. Selv om utmerket membranretensjon og biokjemisk stabilitet er fordelaktig, kan interkalering av fluorescerende sonder med lipoproteinkontaminanter renset med sEVer kompromittere tolkningen av sEV-internalisering og funksjonelle studier. Dermed er rensing og merking av sEVs kritiske trinn i protokollen fordi utholdenheten til fargestoffene med forurensninger kan føre til feiltolkning av in vivo-fordelingen 28. Inkludering av kontroller er avgjørende for å unngå falske positive fluorescenssignaler på grunn av ikke-spesifikk merking av partikler og den lange halveringstiden til disse fargestoffene.
Aggregering og micelledannelse av lipofile fargestoffer kan også gi falske signaler. Vi løste problemet med fri eller ubundet fargestoff ved å inkludere en fargestoff-alene kontroll og visualisere EV-opptaket på tidligere tidspunkter. En viktig begrensning rapportert for PKH-merking er at mange PKH26 nanopartikler dannes under PKH26 fargemerking av sEVs. Selv om det ikke er inkludert i denne protokollen, rapporteres det at PKH26 nanopartikler kan fjernes av en sukrose gradient29. En annen studie evaluerte effekten av PKH-merking på størrelse med sEVs av NTA og rapporterte en økning i størrelse etter PKH-merking30. Likevel fungerer PKH-fargestoffer som en pragmatisk og verdifull tracer for å vise hvor sEVene har krysset. En annen begrensning i denne studien er at vi ikke kvantifiserer sEVs da denne protokollen fokuserer på bekreftelse av cellulært opptak etter intratekal levering. Nye cyaninbaserte membranprober har nylig blitt utviklet for svært sensitiv fluorescensavbildning av sEVer uten å endre størrelsen eller generere artefakter, for eksempel dannelsen av PKH nanopartikler31, og vil utvilsomt forbedre fremtidige merkingsstudier.
Selv om makrofager spiller viktige roller i nevroinflammasjon, utøver de også nevrobeskyttende funksjoner ved å levere lasten via eksosomer32. Våre studier viser at merkede makrofagavledede sEVer tas opp av Neuro-2a-celler, primære astrocytter, og i lumbale ryggmargen etter intratekal administrering. Resultatene indikerer at en lengre inkubasjonstid kan føre til lavere sEV-signalintensitet, noe som kan tilskrives nedbrytning av sEVer eller celledeling av Neuro-2a-celler i kultur33,34. Selv om denne protokollen er lav gjennomstrømning, kan denne protokollen for visualisering av merkede SEVer i ryggmargen brukes til innledende valideringsstudier som bekrefter SEV-opptak før du undersøker den funksjonelle effekten av sEVer levert intrathecally. Som vi observerte generelt lignende sEV-opptak i flere CNS-celletyper, ser opptaksprosessen ut til å være ikke-selektiv. Hvis autofluorescens er et problem i avbildning, kan umerkede sEVer brukes som en ekstra kontroll for å sEV autofluorescence under avbildning av vev og kulturer. Selv om dosen og administrasjonsveien for sEVer kan påvirke mønsteret av biodistribusjon11, er denne protokollen ikke optimalisert for kvantitativ analyse av sEV-opptak. Flere forskjellige tilnærminger og ulike bildestrategier brukes til å undersøke sEVer, og disse blir kontinuerlig raffinert og optimalisert for in vivo-sporing av sEVs2.
Denne protokollen er ment å være bare en tilnærming for å bekrefte sEV-opptak. Som med alle protokoller, kan kryssvalidering ved hjelp av multimodale tilnærminger være gunstig. Spesielt kan opptaket av sEVer bekreftes ved å undersøke biomolekylær lastoverføring til mottakerceller og vev. Hvis undersøkeren kjenner miRNA-sammensetningen av leverte sEVer, vil en alternativ tilnærming for å bekrefte sEV-overføring være å se etter miRNA-endringer i mottakercellene eller bestemme endringene i uttrykksnivåer av målgener for miRNAene som overføres. PBS-behandlede prøver kan brukes som en kontroll for denne tilnærmingen. Samlet sett støtter disse resultatene konseptet om at makrofag-avledede sEVer tas opp av CNS-celler in vitro og in vivo. Denne protokollen kan brukes til å undersøke SEVs rolle i ryggsykdommer, smerte og betennelse og for å avgjøre om sEVs kan utvikles som cellulære kjøretøy for levering av terapeutiske små molekyler, RNA og proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra NIH NINDS R01NS102836 og Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) tildelt Seena K. Ajit. Vi takker Dr. Bradley Nash for kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | MilliporeSigma | Z677094 | |
| Anti-Alix Antibody | Abcam | ab186429 | 1:1000 |
| Anti-Calnexin Antibody | Abcam | Ab10286 | 1:1000 |
| Anti-CD81 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-166029 | 1:1000 |
| Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10) | Cell Signaling Technology | 2118 | 1:1000 |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Sigma-Aldrich | MAB360 | 1:500 for IF; 1:1000 for IHC |
| Anti-Iba1 Antibody | Wako | 019-19741 | 1:2000 |
| Anti-MAP2A Antibody | Sigma-Aldrich | MAB378 | 1:500 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 0332 | |
| Cell Strainer, 40 μm | VWR | 15-1040-1 | |
| Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 3118-0050 | 12,000 x g |
| Coverslip, 12-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| Coverslip, 18-mm, #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | 1 µg/mL |
| DC Protein Assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse I) | MilliporeSigma | D4513-1VL | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) | Abcam | ab16284 | 1:10000 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | 1:500 |
| Double Frosted Microscope Slides, #1 | Thermo Scientific | 12-552-5 | |
| DPBS without Calcium and Magnesium | Corning | 21-031-CV | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum | Gibco | A27208-01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| FluorChem M imaging system | ProteinSimple | ||
| FV3000 Confocal Microscope | Olympus | ||
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | ab6789 | 1:10000 |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11001 | 1:500 |
| Goat Anti-Mouse IgG1, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-21125 | 1:500 |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | VWR | 02-0121 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| HRP Substrate | Thermo Scientific | 34094 | |
| Intercept blocking buffer, TBS | LI-COR Biosciences | 927-60001 | |
| Laemmli SDS Sample Buffer | Alfa Aesar | AAJ61337AC | |
| Micro Cover Glass, #1 | VWR | 48404-454 | |
| Microm HM550 | Thermo Scientific | ||
| NanoSight NS300 system | Malvern Panalytical | ||
| NanoSight NTA 3.2 software | Malvern Panalytical | ||
| Neuro-2a Cell Line | ATCC | CCL-131 | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| O.C.T Compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | NC9597281 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| PKH26 | Sigma-Aldrich | MINI26-1KT | |
| PKH67 | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 1862209 | |
| PVDF Transfer Membrane | MDI | SVFX8302XXXX101 | |
| RAW 267.4 Cell Line | ATCC | TIB-71 | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Sodium Chloride | AMRESCO | 0241-2.5KG | |
| Superfrost Plus Gold Slides | Thermo Scientific | 15-188-48 | adhesive slides |
| T-75 Flasks | Corning | 431464U | |
| Tecnai 12 Digital Transmission Electron Microscope | FEI Company | ||
| TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FSF300-cu | |
| Tris-Glycine Protein Gel, 12% | Invitrogen | XP00120BOX | |
| Tris-Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC26755 | |
| Tris-Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| TrypLE Express | Gibco | 12605028 | cell dissociation enzyme |
| Triton X-100 | Acros Organics | 327371000 | |
| Trypsin, 0.25% | Corning | 25-053-CL | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman | 344058 | 110,000 x g |
References
- Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641 (2014).
- Betzer, O., et al. Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594 (2020).
- Dehghani, M., Gaborski, T. R.
- González, M. I., et al. Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications. Biomedicines. 9 (1), 81 (2021).
- Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91 (2018).
- vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Heinrich, L., et al. Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Grange, C., et al. Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging. International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).
- Wiklander, O. P., et al. Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316 (2015).
- Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6 (1), 7029 (2015).
- Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
- Montecalvo, A., et al. Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes. Blood. 119 (3), 756-766 (2012).
- Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC Cancer. 11, 108 (2011).
- Cho, E., et al. Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics. Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).
- Mantel, P. Y., et al. Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system. Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).
- Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator. Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).
- De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications. Frontiers in Immunology. 6, 203 (2015).
- Matsumoto, J., et al. Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71 (2017).
- Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier. Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).
- Shaimardanova, A., et al. Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases. Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Hoen, E. N. M. N. -t, et al. Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).
- Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles. Frontiers in Pharmacology. 9, 169 (2018).
- Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes. Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).
- Kuffler, D. P. Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs. Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).
- Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
- Pužar Dominkuš, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
- Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 9533 (2020).
- Shimomura, T., et al. New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake. Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).
- Yuan, D., et al. Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain. Biomaterials. 142, 1-12 (2017).
- Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10 (2018).
- Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry. Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170 (2020).
