Summary
この研究は、マイクロプラスチックの収集とプラスチック製品の日常的な使用からの検出のための信頼性と費用対効果の高いプロトコルを詳述しました。
Abstract
マイクロプラスチック(MP)は、人間の健康に対する潜在的なリスクのために世界的な懸念事項になりつつあります。プラスチック製品(すなわち、プラスチックの使い捨てカップおよびケトル)の事例調査は、毎日の使用中のMP放出が非常に高くなることができることを示している。MP リリース レベルを正確に決定することは、露出元を特定して定量化し、この危険に起因する対応するリスクを評価/制御するための重要なステップです。海洋または淡水のMPレベルを測定するためのプロトコルはよく開発されていますが、家庭用プラスチック製品が経験する条件は大きく異なる可能性があります。多くのプラスチック製品は、頻繁な高温(100°C)に曝露され、日常使用時に室温に戻されます。したがって、各製品の実際の日常使用シナリオを模倣したサンプリング プロトコルを開発することが重要です。本研究は、多くのプラスチック製品のMPリリース研究のための費用対効果の高いプロトコルを開発するために広く使用されているポリプロピレンベースの哺乳瓶に焦点を当てた。ここで開発されたプロトコルは可能:1)サンプリングおよび検出中の潜在的な汚染の防止。2)毎日使用シナリオの現実的な実装とWHOガイドラインに基づいて哺乳瓶から解放されたMPの正確なコレクション;3)哺乳瓶から放出されるMPの費用対効果の高い化学的決定および物理的地形マッピング。このプロトコルに基づいて、標準ポリスチレンMP(直径2μm)を使用した回収率は92.4-101.2%であり、検出されたサイズは設計されたサイズの約102.2%であった。ここで詳述するプロトコルは、MPサンプルの調製および検出のための信頼性と費用対効果の高い方法を提供し、プラスチック製品からのMPリリースの将来の研究に大きな利益をもたらす可能性があります。
Introduction
ほとんどの種類のプラスチックは非生分解性ですが、酸化や機械的摩擦などの化学的および物理的プロセスのために小片に分解することができます1,2.5mm未満のプラスチック片は、マイクロプラスチック(MP)に分類されます。MPはユビキタスであり、世界中のほぼすべてのコーナーで見られます。彼らは人間と野生動物に対する潜在的なリスクのために世界的な関心事となっています3,4.現在までに、魚、鳥、昆虫5、6だけでなく哺乳類(マウス、腸内、腎臓および肝臓7、8)にMPの有意な蓄積が発見されている。研究は、MPの暴露および蓄積がマウス7、8の脂質代謝に損傷を与えることができることを発見した。魚に焦点を当てたリスク評価は、サブミクロンMPが血液対脳関門に浸透し、脳の損傷を引き起こす可能性があることを発見しました 9.人間の健康に対する特定のリスクがまだ不明である一方で、すべてのMPリスク結果は、動物研究から得られていることは、現在までに留意すべきです.
過去2年間で、MPへのヒト暴露レベルの確認により、人間の健康に対するMPの脅威に対する懸念が大幅に増加しました。MPの蓄積は、ヒト結腸10、妊婦11および成人便12の胎盤に見られた。MPリリースレベルの正確な決定は、暴露源を特定し、健康リスクを評価し、潜在的な制御措置の効率を評価するために重要です。ここ数年、いくつかのケーススタディは、毎日使用プラスチック(すなわち、プラスチックケトル13と使い捨てカップ14)が非常に大量のMPを放出することができることを報告しました。例えば、使い捨て紙コップ(ポリエチレンPEまたはコポリマーフィルムで積層されたインテリア付き)は、85〜90°Cの温水14への暴露後の液体の各ミリリットルに約250ミクロンサイズのMPおよび1億2000万個のサブミクロンサイズの粒子を放出した。ポリプロピレン(PP)食品容器の研究では、1回の使用時に最大7.6mgのプラスチック粒子が容器から放出されるという報告がある。さらに高いレベルは、ポリエチレンテレフタレート(PET)およびナイロンから作られたティーバッグから記録され、約116億MPと31億ナノサイズのMPを飲料16の1カップ(10mL)に放出した。これらの毎日使用プラスチック製品が食品や飲料の準備のために設計されていることを考えると、大量のMPの放出が起こりそうであり、その消費は人間の健康に対する潜在的な脅威です。
家庭用プラスチック製品(例えば、プラスチックケトル13と使い捨てカップ14)からのMPリリースに関する研究は初期段階にあるが、この話題は研究者や一般の人々から注目を集めることが期待される。これらの研究で必要とされる方法は、確立されたプロトコルが既に存在する室温海洋または淡水研究で使用されるものとは大きく異なる。対照的に、家庭用プラスチック製品の日常的な使用を含む研究は、はるかに高い温度(100°Cまで)を含み、多くの場合、室温に戻ってサイクリングを繰り返します。以前の研究では、お湯と接触しているプラスチックは、何百万ものMP16、18を放出することができると指摘しました。さらに、プラスチック製品の日常的な使用は、時間の経過とともにプラスチック自体の特性を変更する可能性があります。したがって、最も一般的な日常使用シナリオを正確に模倣するサンプリング プロトコルを開発することが重要です。マイクロサイズの粒子の検出も大きな課題です。以前の研究では、プラスチック製品からのMP放出は20 μm16、19、20より小さいと指摘した。これらのタイプのMPの検出は、小さな細孔サイズの滑らかな膜フィルターの使用を必要とする。さらに、フィルタによって捕捉される可能性のある汚染物質とMPを区別する必要があります。高感度ラマン分光法は、化学組成分析に使用され、小粒子20を容易に破壊することが知られている高いレーザーパワーの必要性を回避できるという利点がある。したがって、このプロトコルは、汚染のない処理手順と最適な膜フィルタの使用と、高速かつ正確なMP識別を可能にする特性評価方法を組み合わせる必要があります。
ここで報告された研究は、日常生活の中で最も一般的に使用されるプラスチック製品の1つであるPPベースの哺乳瓶(BFB)に焦点を当てた。式の準備18の間に多数の MP がプラスチック BFB から放出されることがわかった。毎日のプラスチックからのMP放出のさらなる研究のために、BFBのサンプル調製および検出方法は、ここで詳述されている。試料調製中に、WHO21 が推奨する標準的な式調製プロセス(洗浄、殺菌および混合)を慎重に行った。WHOガイドラインに関するプロトコルを設計することで、BBBからのMPリリースが両親が使用するベビーフォーミュラ調製プロセスを模倣することを保証しました。フィルタプロセスは、BfbsからリリースされたMPを正確に収集するように設計されています。MPの化学同定のために、ラマン分光法の作業条件は、MPのクリーンで容易に同定されたスペクトルを得るために最適化され、同時に標的粒子を燃焼させる可能性を回避した。最後に、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたMPの正確な3次元地形マッピングを可能にする最適な試験手順と適用力を開発した。ここで詳しく説明するプロトコル (図 1)は、MP サンプルの調製と検出に対して信頼性が高く、費用対効果の高い方法を提供し、プラスチック製品の将来の研究に大きな利益をもたらす可能性があります。
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Protocol
1. お湯の準備
- サンプルに接触するすべてのハードウェアに対して、ボロケイ酸3.3製のクリーンガラスを使用して、汚染の可能性を防ぎます。すべてのガラス製品を徹底的に清掃してください。
注意: ガラス製品の既存の傷や不完全な斑点は、加熱および揺れのプロセス中に粒子を放出することができます。ガラス製品をチェックし、傷付きガラス製品の使用を避けることをお勧めします。異なるガラス(ソーダ石灰やホウケイ酸など)で作られたガラス製品を比較した結果、ホウケイ酸3.3は最も低い量のガラス粒子を放出し(ラマン分光法でスクリーニングすることができる)、すべての試験でホウケイ酸3.3ガラス製品の使用を推奨しています。 - ガラスビーカーに360mLのDI水を注ぎます。ビーカーをきれいなガラスディスクで覆います。その後、真新しい電子レンジに移動し、フルオーブンパワーで2.5分間加熱します。冷暖房による温度勾配の可能性を取り除くために穏やかに振盪した後、ビーカー内部の水の温度は70°Cであり、サンプル調製の準備が整いました。
- ガラス製品に1LのDI水を注ぎ、電子レンジで14分間加熱して、BFB滅菌用95°Cの水を調製します。
注意:お湯を準備するためにプラスチックケトルを使用しないでください。プラスチック製のケトル自体は、沸騰プロセス13の間にお湯に何百万人ものMPを放出します。
2. 式の準備中のMPリリース
注:WHO21が推奨する標準的な式調製プロセス(洗浄、殺菌および混合)に注意深く従って、式の準備中にBBFから放出されたMPは、次の3つのステップで模倣されます。
- 薬局の店からブランドの新しいBFB製品を収集し、そのパッケージから製品を削除した後、徹底的にそれらをきれいにします。各BFBを洗剤水(室温-RTで3回繰り返す)と蒸留水(3回繰り返し、RT)を使用して洗浄します。最後に、RTでDI水を使用してBFBを3回リンスします。
注意:超音波処理を使用してBFBをきれいにしないでください。超音波処理は、混合および洗浄のための実験室で広く使用されているが、BFBの超音波処理は、ボトル表面を著しく損傷し、1分以内にPP製品からのMPリリースを引き起こす可能性があります。 - BFBを95°CのDI水(セクション1.3)に浸してボトルを殺菌します。BFBの浮動を避けるために、ステンレス製のトゥイザーを使用してBFBの外側をわずかに押し、ボトル本体全体が水に浸かっていることを確認します。
- 5分後、ボトルを取り出し、きれいなガラスディスクに移動します。空気乾燥工程中に、液滴の証拠がなくなるまでガラスディスク上のボトルを反転させます。
- 180 mLの熱いDI水(WHOガイドラインに対応するセクション1.2から)を空気乾燥ボトルに注ぎます。その後、すぐにガラスペトリ皿を使用してボトルをカバーし、揺れるベッドに置きます。
- 式混合プロセスをシミュレートするには、ボトルを180 rpmの速度で60秒間振ります。振った後、ボトルをきれいなガラス板に移し、冷まします。
3. MPの識別と定量化のためのサンプル準備
- DI水を使用して、ガラスフィルター(直径25mm、ガラス漏斗、フリットガラス支持ベース、レシーバフラスコ)の全パーツを超音波処理し、徹底的に洗い流します。
- ガラスベースの中央に金でコーティングされたポリカーボネート-PC膜フィルター(0.8 μmの細孔サイズ、40 nmのAuコーティング層の厚さ)を配置します。
- ガラス漏斗とステンレススチール製クランプを組み立てて膜フィルターを固定します。最後に、組み立てられたガラスフィルターを真空ポンプに接続します(図2)。
注意: 膜がガラスベースの表面に滑らかにくっつくようにするためには、ガラスベースを濡らしておくことが重要です。必要に応じて、膜フィルターを下に置く前に、DI水の1〜2滴をガラスベースの表面に落とす必要があります。
- 冷却水サンプルをBFB(セクション2.3から)に慎重に混合し、ガラスピペットを使用して一定量の水サンプルをガラス漏斗に移します。真空ポンプのスイッチを入れ、水のサンプルが膜フィルターを通してゆっくりと濾過できるようにします。
- 濾過後、DI水を使用してガラス漏斗の内部を洗浄し、漏斗に粒子が付着していないことを確認します。
注意: 膜フィルターの表面上の粒子の重なりを避けるために、フィルターを通過する水の正しい量を慎重に選択することが重要です。BBFは大量の粒子を放出するので、水サンプルの全容をろ過するために3-5膜フィルターが必要になる。
- 濾過後、DI水を使用してガラス漏斗の内部を洗浄し、漏斗に粒子が付着していないことを確認します。
- 真空ポンプを外し、ガラスフィルターを分解します。その後、ステンレス製のトゥイザーを使用して膜フィルターを慎重に取り出し、きれいなカバーガラスに移動します。カバーガラスの膜フィルターを小さな紙テープで固定します。すぐにきれいなガラスペトリ皿にサンプルを保管してください。
4. AFMトポグラフィの特性評価のサンプル準備
- クリーンシリコンウエハーを準備します。シリコンウエハの表面に50μLの水サンプル(セクション2.3から)を落とし、103°C前後の温度でオーブンで乾燥させます。 水サンプルのMPレベルが低い場合は、このプロセスを繰り返します。
- 1時間の乾燥後、ウエハーをきれいなガラスペトリ皿に移し、デシケータで冷まします。
- ウエハーが冷却された後、乾燥したきれいなガラスシャーレにサンプルを保管します。
5. ラマン分光法を用いたMP同定と定量化
- ゼロオーダー補正とシリコンウェハを使用してラマン系を較正します。シリコンウエハのピーク位置が520.7cm-1であり、レーザー強度が100%の場合にはピーク強度が6000を超えるようにしてください。
- RAMの燃焼を避けながら、高い信号からノイズへのMPスペクトルを得るために、ラマンシステムのパラメータを設定します。 システムを次のように設定します:532 nm励起レーザー、宇宙線の除去、10%のレーザー強度(0.18 mWのレーザーパワー)、1.5cmのスペクトル分解能、10〜20秒の露光時間、10-40回の蓄積、200-3200cm-1のスペクトル範囲。図3は、1sから400sまでの蓄積時間を有するMPの典型的なスペクトルを示した。
注意: 急速燃焼を避けるために、直接100%レーザーを使用して粒子をテストしないでください(粒子が小さい場合は1分で焼くことができます)。低強度(10-50%)を使用まずテストを行います。 - ラマンサンプルステージの中央にフィルターサンプル(セクション3.3から)を配置します。4つの代表的なスポット(2つのスポットは中央領域にあり、他の2つのスポットは作業領域の端に近い、図3C)を選択して試験を実施する(全試験領域は1.5mm2前後)。
- 光学顕微鏡(100x)を用いてラマン分光法を用いて化学同定を行い、膜フィルター表面の粒子を観察・撮影する。
- 得られたラマンスペクトルを基準標準ポリマースペクトル(BFBおよび前の刊行物22のバルク材料から)と比較する。
- 2780-2980、1400-1640および709-850cm-1の範囲で、高分子材料に関連するCH/CH2 /CH3およびC-C基の延伸振動に対応する範囲の集中ピークを用いて、粒子の化学的性質を決定する(図3)。
- ImageJ を使用して、識別された MP のサイズと量を分析します。
- 試験領域、総作業領域(227mm2)および既知のろ過されたサンプル体積に基づいて、水サンプル中のMP濃度を取得します。
- 確認したMPをサイズ:0.8-5 μm、5-20 μm、20-50 μm、50-100 μm、>100 μmの5グループに分類します。
- 最後に、フィルターされたサンプル量、記録されたMPの数、膜フィルターのテスト領域に基づいて、水サンプルの1リットルのMP量を決定します。
6. AFMを用いたMP地形特性評価
- AFMシステム(NT-MDT)にタッピングモードプローブを装備します。ステップ高さ標準(SHS)を使用してシステムをキャリブレーションします。最適な作業条件内でシステムを設定:スキャンレートは1Hz、スキャンサイズは10〜50μm、チューニング周波数は約160kHz、スキャンラインは512ピクセルです。
- シリコンウェーハ(4.3項から)をAFMサンプルステージに固定します。シリコンウエハの表面上の標的粒子を観察し、撮影し、その後、セクション5の方法を用いて化学同定を行う。
- システムをAFMモードに切り替え(ラマン分光法とAFMは1つのシステムで組み立てられています)、識別されたMPの地形をテストします。
- Gwyddion 2.54ソフトウェアを使用して3Dデータを分析します。 3D ビューを使用して 3D 構造を取得する場合は、プロファイルオプションを使用して、パーティクルの寸法と平均高さを取得します。
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Representative Results
このプロトコルを検証するために、水サンプルは、標準的なポリスチレン微小プラスチック球(直径2.0±0.1μm)をDI水に添加して調製しました。追加された MP の量は、BB からの MP リリース レベルに類似した 4,500,000 パーティクル/L に対応しました。プロトコル・セクション 2-3 に続いて、MP は正常に収集され (図 4A)、回復率は 92.4-101.2% でした。この回復率は、MP23に関する以前の研究に匹敵します。ImageJを使用すると、標準MPの検出直径は2.04±0.08μm(±は平均値の標準誤差を表す)で、設計サイズの約102.2%(2.0±0.1μm)でした。一方、PPやPEなどの他のタイプのMPからの潜在的な干渉もテストされたが、これらの標準的なPS水サンプルには何も見つからなかった。したがって、開発されたプロトコルは汚染を回避し、BBFからのMPリリースの信頼できるテストです。
このプロトコルは、8 つの一般的な BFB 製品からの MP リリースをテストするために使用されました。 図4B は、膜フィルターの表面に集められた代表的なMPを示した。ラマン分光法を用いた化学測定(図3)の間に、2830-2970cm-1 の範囲のピークは蓄積時間の増加とともにますます有意なものとなった。これらのピークは、MPを識別するために使用できるCH / CH2/ CH3 グループの伸縮振動を反映しています。BBF の使用中に多数の MP がリリースされました。MP レベルは 1 リットル当たり 131 万から 1620 万粒子にまでです (図 5)。この結果は、飲料水24のMPの以前に報告されたレベルよりも桁違いに3〜5桁高くなります。赤ちゃんが高レベルのMP暴露を経験する可能性が高いことは明らかです。
図 6は、プロトコル セクション 1、2、4、および 6 を使用して記録された、標準的な MP の地形マップを示しています。横サイズで約8μmの大きなMP(図6のP1)の場合、平均厚さは0.82μmです。横サイズの3 μm(図6のP2)の小さいMPの場合、厚さは0.25μmに近い。一般に、BFB から放出される MP の厚さは、横サイズの約 10 分の 1 です。また、MPの表面テクスチャにはナノサイズのバンプや谷が豊富で、吸収能力を大幅に向上させることも顕著です。これまでの研究では、MPは農薬25,26などの汚染物質に対して有効なキャリアであることがわかりました。ここで見つかったMPの観察された地形は、MPの高い運搬能力に重要な貢献者である可能性が高い。
図1: サンプルの準備とテストの図をクリックして、この図の大きなバージョンを表示してください。
図2:ガラスフィルターとポンプの組み立て。 2組み立てガラスフィルター。3ガラストランスファーピペット;4真空ポンプ;5- 相互シェーカー。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:MP判定のための代表的なラマンスペクトル(A)それぞれ膜フィルター上のBFB、膜フィルター及びMPからのバルク片のラマンスペクトル。(B)異なる獲得時間(1s、10 s、100 s、400 s)を有する1つの電位MPのラマンスペクトル。(C)代表的スポットを試験した。フィルター膜の総直径は直径17mmの実作業面積で直径25mmです。4つの白い箱はラマンテストのための完全な代表の場所を示す。2つのスポットは中央の領域にあり、他の2つのスポットは作業領域の端に近い。合計で、4つのスポットのテストされた領域は1.5 mm2です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:標準PS MPとMPの標準光画像は、それぞれBFBから放出されます。(A) 標準PS MPの光学画像。赤色ボックス内部の粒子を代表的なPSMPとして確認した。 (B) BBBからのMPリリースの光学画像。赤色の箱の中の粒子は、典型的なMPとして確認された。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:プラスチックBFB製品から発売されたMPの数量。 エラー バーは、平均値の標準誤差を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:BFBからのMPリリースの典型的な3D画像。(A) BFB からリリースされる一般的な MP の AFM イメージ。(B) MP の断面プロファイルを抽出しました。
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Discussion
海洋および淡水のMPの研究は広く報告されており、関連する標準プロトコルは17に開発されていますが、日用品プラスチック製品の研究は重要な新興研究分野です。家庭用プラスチック製品が経験する環境条件の違いは、信頼性の高い結果を得るためには、特別な注意と努力が必要であることを意味します。研究プロトコルは、実際の日常使用シナリオと一致している必要があります。例えば、超音波処理は、サンプルをきれいにするためにラボテストで広く使用されています。しかし、1分間の超音波処理は、BFBの表面に深刻な損傷を与え、MPのレベルが桁違いに高いレベルを解放することが判明しました。超音波処理による同様のポリマー破損も以前に報告されました27, 超音波処理は、MP研究でプラスチックサンプル調製のための適切な洗浄方法ではないことを示しています.
さらに、潜在的な汚染源を特定し、除去する必要があります。ポットは、BFB試験に必要なお湯を調製するために広く使用されています。しかし、1つの沸騰は、プラスチックケトル13でリットル当たり最大3000万個の粒子を生成することができる。電子レンジは、局所加熱を除去するために注意を払った後、お湯を準備するための非接触方法です。ろ過のために、プラスチック製(通常PP製)ではなく、ガラス転写ピペットをお勧めします。新しいPP製品については、製造工程 15 により表面に大量のMPが取り付けられていることが報告されており、試験開始前にすべての製品を適切に洗浄するよう注意が必要です。要約すると、研究者は、BBからのMP放出の測定レベルに悪影響を及ぼす可能性のある手順を避けるために警戒する必要があります。
プロトコルは、MP リリースのすべてのタイプを説明できないことに注意してください。0.8 μmの孔径のフィルターを使用しているため、0.8μm未満のナノ粒子はこの方法の範囲を超えています。さらに、個々の親は、実際の生活の中で準備された式のMPレベルがここで報告されたものと大きく異なる可能性があるため、プロトコルの基礎となるWHOガイドラインに従わない可能性があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。本書の資料の提示は、特定の企業または特定の製造業者の製品に関するトリニティ・カレッジ・ダブリン側の意見の表現を意味するものではなく、トリニティ・カレッジ・ダブリンが同様の性質を持つ他の企業よりも優先して承認、推奨、批判、その他の方法で承認されていることを意味するものではありません。エラーと省略を除く。この文書に含まれる情報を検証するために、すべての合理的な予防措置が講じられています。ただし、公開された資料は、明示または黙示にかかわらず、いかなる種類の保証もなく配布されています。資料の解釈と使用に対する責任は、読者にあります。トリニティ・カレッジ・ダブリンは、その使用に起因する損害に対して責任を負いません。
Acknowledgments
著者らは、エンタープライズアイルランド(助成金番号CF20180870)と科学財団アイルランド(助成金番号:20/FIP/PL/8733、12/RC/2278_P2、16/IA/4462)の財政支援を高く評価している。また、トリニティ・カレッジ・ダブリンの工学部奨学金と中国奨学金協議会(201506210089・201608300005)からの資金援助も認めます。さらに、トリニティ・シビル・構造環境部とAMBER研究センターのサラ・マク・コーマック教授と技術者チーム(デビッド・A・マコーレー、メアリー・オシェイ、パトリック・L・K・ビール、ロバート・フィッツパトリック、マーク・ギリガンなど)の専門的な支援に感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM cantilever | NANOSENSORS | PPP-NCSTAuD-10 | To obtain three-dimensional topography of PP MPs |
| Atomic force microscope | Nova | NT-MDT | To obtain three-dimensional topography of PP MPs |
| Detergent | Fairy Original | 1015054 | To clean the brand-new product |
| Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um | APC, Germany | 0.8um25mmGold | To collect microplastics in water and benefit for Raman test |
| Gwyddion software | Gwyddion | Gwyddion2.54 | To determine MPs topography |
| ImageJ software | US National Institutes of Health | No, free for use | To determine MPs size |
| Microwave oven | De'longhi, Italy | 815/1195 | Hot water preparation |
| Optical microscope, x100 | Mitutoyo, Japan | 46-147 | To find and observe the small MPs |
| Raman spectroscopy | Renishaw | InVia confocal Raman system | To checmically determine the PP-MPs |
| Shaking bed-SSL2 | Stuart, UK | 51900-64 | To mimic the mixing process during sample preparaton |
| Standard polystyrene microplastic spheres | Polysciences, Europe | 64050-15 | To validate the robusty of current protocol |
| Tansfer pipette with glass tip | Macro, Brand | 26200 | To transfer water sample to glass filter |
| Ultrasonic cleaner | Witeg, Germany | DH.WUC.D06H | To clean the glassware |
| Vacuum pump | ILMVAC GmbH | 105697 | To filter the water sample |
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