Summary
जैसा कि वर्तमान में कार्यान्वित किया गया है, गैर-मानव प्राइमेट्स में ऑप्टोजेनेटिक्स को मस्तिष्क में वायरल वैक्टर के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है। एक इष्टतम इंजेक्शन विधि विश्वसनीय होनी चाहिए और, कई अनुप्रयोगों के लिए, मनमाने ढंग से गहराई की व्यक्तिगत साइटों को लक्षित करने में सक्षम होना चाहिए जो पोस्टमॉर्टम हिस्टोलॉजी में आसानी से और स्पष्ट रूप से पहचाने जाते हैं। इन गुणों के साथ एक इंजेक्शन विधि प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
ऑप्टोजेनेटिक तकनीकों ने तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान में क्रांति ला दी है और न्यूरोलॉजिकल जीन थेरेपी के लिए भी ऐसा करने के लिए तैयार हैं। हालांकि, ऑप्टोजेनेटिक्स के नैदानिक उपयोग के लिए आवश्यक है कि जानवरों के मॉडल में सुरक्षा और प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया जाए, आदर्श रूप से गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) में, मनुष्यों के लिए उनकी न्यूरोलॉजिकल समानता के कारण। तंत्रिका विज्ञान और चिकित्सा के लिए संभावित रूप से उपयोगी उम्मीदवार वैक्टर की संख्या विशाल है, और इन वैक्टरों का परीक्षण करने के लिए कोई उच्च-थ्रूपुट साधन अभी तक मौजूद नहीं है। इस प्रकार, एनएचपी मस्तिष्क में वायरल वैक्टर के कई स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक रूप से सटीक इंजेक्शन बनाने के लिए तकनीकों की आवश्यकता है जिन्हें पोस्टमॉर्टम हिस्टोलॉजी के माध्यम से स्पष्ट रूप से पहचाना जा सकता है। यहां वर्णित एक ऐसी विधि है। इंजेक्शन प्रवेशनी युग्मित पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन और स्टेनलेस स्टील ट्यूबों से निर्मित होते हैं। ये प्रवेशनी आटोक्लेवेबल, डिस्पोजेबल हैं, और कम न्यूनतम लोडिंग वॉल्यूम हैं, जो उन्हें महंगे, अत्यधिक केंद्रित वायरल वेक्टर समाधानों के इंजेक्शन के लिए आदर्श बनाते हैं। एक निष्क्रिय, लाल रंगे खनिज तेल मृत स्थान को भरता है और वेक्टर समाधान के साथ एक दृश्यमान मेनिस्कस बनाता है, जिससे इंजेक्शन दरों और मात्राओं के तात्कालिक और सटीक माप की अनुमति मिलती है। तेल को प्रवेशनी के पीछे लोड किया जाता है, जिससे वेक्टर के साथ सह-इंजेक्शन का खतरा कम हो जाता है। कैनुला को 10 मिनट में लोड किया जा सकता है, और इंजेक्शन 20 मिनट में बनाया जा सकता है। यह प्रक्रिया जागृत या संवेदनाहारी जानवरों में इंजेक्शन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। जब उच्च गुणवत्ता वाले वायरल वैक्टर देने के लिए उपयोग किया जाता है, तो यह प्रक्रिया ऑप्टोजेनेटिक प्रोटीन की मजबूत अभिव्यक्ति का उत्पादन कर सकती है, जिससे एनएचपी में तंत्रिका गतिविधि और व्यवहार के ऑप्टिकल नियंत्रण की अनुमति मिलती है।
Introduction
गैर-मानव प्राइमेट्स (एनएचपी) में ऑप्टोजेनेटिक्स में आमतौर पर वायरल वेक्टर का इंजेक्शन सीधे मस्तिष्क में शामिल होता है। वैक्टर का एक वर्ग जो इस एप्लिकेशन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, एडेनो से जुड़े वायरस (एएवी) पर आधारित है। इन वैक्टरों में एक एकल-फंसे डीएनए जीनोम के आसपास एक प्रोटीन कैप्सिड होता है, जिसमें बदले में, एक प्रमोटर, एक ऑप्सिन जीन और वैकल्पिक रूप से, अन्य प्रोटीन-कोडिंग और जीन-नियामक तत्व होते हैं। आणविक क्लोनिंग में प्रगति ने नए वैक्टर के विकास के लिए इन घटकों के हेरफेर और संयोजन की सुविधा प्रदान की है। नतीजतन, एएवी वैक्टर का संग्रह जो एनएचपी ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए संभावित रूप से उपयोगी है, बड़ा है और तेजी से बढ़ रहा है।
वर्तमान में, एनएचपी ऑप्टोजेनेटिक्स के लिए एएवी वेक्टर की उपयोगिता के लिए विवो में परीक्षण की आवश्यकता होती है। यह तथ्य प्रगति के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा है। जानवरों को संयम से उपयोग किया जाना चाहिए, और एक ही जानवर में कई वैक्टरों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है कि इंजेक्शन साइटों को तंत्रिका वास्तुकला के सापेक्ष विवेकपूर्ण रूप से तैनात किया जाए और वायरल प्रसार के सापेक्ष अच्छी तरह से अलग किया जाए। सटीक हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन के लिए इंजेक्शन को स्थानिक और वॉल्यूमेट्रिक रूप से सटीक होने की आवश्यकता होती है। फार्माकोलॉजिकलएजेंटों 1,2,3,4 के फोकल डिलीवरी के लिए पहले इस्तेमाल की जाने वाली एक इंजेक्शन तकनीक को इस तरह के इंजेक्शन बनाने के लिए अनुकूलित और सरलीकृत किया गया था। यह इंजेक्शन तकनीक सस्ती है, डिस्पोजेबल, निष्फल घटकों का उपयोग करती है, इसका उपयोग संवेदनाहारी या जागृत व्यवहार करने वाले बंदरों में किया जा सकता है, और इसका उपयोग किसी भी गहराई के विविध मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए किया जा सकता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल डिस्पोजेबल घटकों को बनाने और एनएचपी मस्तिष्क में इंजेक्शन बनाने के लिए चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। तकनीक के फायदे और नुकसान पर चर्चा की जाती है।
Protocol
सभी प्रयोगों प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया और प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान और प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा अनुशंसित न्यूनतम आवश्यकताओं से अधिक है। वाशिंगटन विश्वविद्यालय की पशु देखभाल और उपयोग समिति (यूडब्ल्यू आईएसीयूसी प्रोटोकॉल # 4167-01) द्वारा सभी प्रक्रियाओं का मूल्यांकन और अनुमोदन किया गया था। पांच स्वस्थ मकाक (2 मकाका मुलट्टा, 3 मकाका नेमेस्ट्रिना; पुरुष 4-11 वर्ष) ने इस अध्ययन में भाग लिया। सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं में बाँझ उपकरणों और तकनीक का उपयोग किया गया था।
1. एक प्रवेशनी बनाना (चित्रा 1 ए)
- प्रत्येक भाग की तैयारी
- एक डिस्क ग्राइंडर के साथ एक हाइपोडर्मिक सुई (30 ग्राम, 13 मिमी लंबाई) की नोक को कुंद करें।
- लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र की गहराई के अनुरूप लंबाई के लिए एक स्टेनलेस स्टील ट्यूब (30 जी, व्यास के अंदर = 0.16 मिमी, व्यास = 0.31 मिमी) काटें (25 मिमी सेरेब्रल कॉर्टेक्स की पृष्ठीय सतह को इंजेक्ट करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है)। डिस्क ग्राइंडर के साथ, कट ट्यूब के एक छोर को बेवल करें और दूसरे को चिकना करें। एक ब्रोच के साथ ट्यूब के अंदर डिबर करें।
- पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीएफटीई) ट्यूबिंग (व्यास के अंदर = 0.23 मिमी ± 0.02 मिमी, दीवार = 0.23 मिमी ± 0.02 मिमी, 1 मिमी 42 एनएल ± 7 एनएल तरल पदार्थ से मेल खाती है) को लोड किए जाने वाले वेक्टर समाधान की मात्रा के लिए उपयुक्त लंबाई में काटें (वेक्टर समाधान का 1 μL 24 मिमी टयूबिंग पर कब्जा कर लेता है)। कुंद हाइपोडर्मिक सुई के सम्मिलन द्वारा पीटीएफई ट्यूब के दोनों सिरों को भड़काएं।
- पीटीएफई ट्यूब के एक छोर में कुंद हाइपोडर्मिक सुई लगभग 5 मिमी डालें। स्टेनलेस स्टील ट्यूब के अप्रकाशित अंत डालें लगभग 5 मिमी दूसरे छोर में (चित्रा 1 ए)।
- प्री-इंजेक्शन परीक्षण करें। प्रवेशनी के हाइपोडर्मिक सुई हब के माध्यम से फ़िल्टर किए गए पानी को इंजेक्ट करें। पुष्टि करें कि पानी टिप से बेवल्ड स्टेनलेस स्टील ट्यूब से बाहर निकलता है और पानी किसी भी जंक्शन से रिसाव नहीं करता है।
2. संवेदनाहारी जानवरों के लिए इंजेक्शन प्रक्रिया
- सर्जरी की तैयारी
- सामग्री की तालिका में प्रक्रियाओं का उपयोग कर सर्जिकल उपकरणों और आपूर्ति बाँझ।
- यदि आवश्यक हो, तो गहरी मस्तिष्क संरचनाओं (चित्रा 2 ए) को लक्षित करने के लिए एक सिर एमआरआई लें।
- सर्जरी से ठीक पहले, जानवरों को केटामाइन (10-15 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ बेहोश करें और एंटीबायोटिक दवाओं (सेफाज़ोलिन) और एनाल्जेसिक (निरंतर-रिलीज ब्यूप्रेनोर्फिन और मेलोक्सिकैम) को इंट्रामस्क्युलर रूप से प्रशासित करें। फिर, सैफेनस या सेफेलिक नसों में अंतःशिरा (चतुर्थ) कैथेटर के माध्यम से प्रोपोफोल वितरित करें।
- जानवर को इंटुबेट करें और इसे आइसोफ्लूरेन गैस में संक्रमण करें। स्थिर हृदय गति, रक्तचाप, श्वसन दर, आराम से कंकाल की मांसपेशियों और पाल्पेब्रल या वापसी सजगता की अनुपस्थिति द्वारा उचित संवेदनाहारी की पुष्टि करें।
- जानवर का सिर मुंडवाएं। सुखाने से रोकने के लिए कॉर्निया पर कृत्रिम आंसू मरहम लागू करें।
- इंजेक्शन क्षेत्र की तैयारी
- जानवर के सिर को स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें। धुंध स्पंज के साथ मुंडा त्वचा पर सर्जिकल स्क्रब समाधान लागू करें, किसी भी मलबे को छोड़ने के लिए कोमल दबाव लागू करें, और आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ कुल्ला करें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं। जानवर को एक बाँझ फेनेस्ट्रेटेड ड्रेप के साथ कवर करें। त्वचा को चीरा लगाएं और मांसपेशियों को प्रतिबिंबित करें। स्टीरियोटैक्सिक बांह पर मैनिपुलेटर रखें, इसे लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र पर लक्षित करने के लिए स्थिति दें, और एक निष्फल कलम के साथ खोपड़ी पर क्रैनियोटॉमी स्थिति को चिह्नित करें।
- स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर निकालें और क्रानियोटॉमी करें। यदि वांछित हो तो ड्यूरा को चीरा लगाएं (उदाहरण के लिए, सल्कल स्थलों की कल्पना करने के लिए)। मैनिपुलेटर को स्टीरियोटैक्सिक बांह पर लौटाएं।
- वेक्टर समाधान लोड हो रहा है (चित्रा 1 सी)
- धीरे बुलबुले से परहेज, एक पी 20 पिपेटर के साथ एक निष्फल पीसीआर ट्यूब के लिए वेक्टर समाधान हस्तांतरण।
- एक प्रवेशनी संलग्न करें, बेवल्ड टिप के साथ, एक लंबवत उन्मुख स्टीरियोटैक्सिक धारक के लिए। प्रवेशनी के हाइपोडर्मिक सुई हब के लिए एक 1 एमएल लुअर-लॉक सिरिंज कनेक्ट करें।
- वेक्टर समाधान में प्रवेशनी के बेवल टिप को डुबोएं।
नोट: सिरिंज पहले से ही संलग्न किया जाना चाहिए; इस बिंदु पर इसे संलग्न करने से वेक्टर समाधान में बुलबुले पेश होंगे। - 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ कोमल नकारात्मक दबाव लागू करके प्रवेशनी में समाधान लोड। नेत्रहीन समाधान और हवा के बीच मेनिस्कस को ट्रैक करें।
- एक बार वेक्टर समाधान लोड हो जाने के बाद, कोमल नकारात्मक दबाव जारी रखें जब तक कि समाधान सुई हब तक न पहुंच जाए। 1 एमएल सिरिंज निकालें और हाइपोडर्मिक सुई हब में रंगीन खनिज तेल इंजेक्ट करें।
नोट: तेल को सुई हब की अंदरूनी दीवार के साथ धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाना चाहिए ताकि वेक्टर समाधान के साथ एक स्पष्ट कट मेनिस्कस बनाया जा सके और हवा के बुलबुले से बचा जा सके। - हाइपोडर्मिक सुई हब को 3-वे लुअर-लॉक स्टॉपकॉक के दो खुले बंदरगाहों में से एक में संलग्न करें।
नोट: बंद बंदरगाह के लिए हाइपोडर्मिक सुई संलग्न तेल के पीछे अवांछित हवा के दबाव का परिचय देगा। - हाइपोडर्मिक सुई हब से जुड़े बंदरगाह को बंद करें, हवा के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें, और इसे अन्य दो बंदरगाहों में से किसी एक से संलग्न करें। अंत में, सिरिंज को प्रवेशनी से जोड़ने के लिए स्टॉपकॉक के शेष बंदरगाह को बंद करें।
- धीरे-धीरे प्रवेशनी में हवा को धक्का दें। एक बार जब रंगीन तेल पीटीएफई ट्यूबिंग में कुंद सुई की नोक पर दिखाई देता है, तो समाधान और रंगीन तेल के बीच हवा की जांच करें।
- यदि हवा मौजूद है, तो सुई हब में रंगीन तेल वापस करने के लिए सिरिंज पर नकारात्मक दबाव लागू करें। बुलबुला निकालें और सकारात्मक दबाव लागू करें जब तक कि वेक्टर समाधान की एक बूंद बेवल्ड प्रवेशनी टिप पर दिखाई न दे।
- तेल के पीछे अवांछित हवा के दबाव को छोड़ने के लिए 1 एमएल सिरिंज निकालें और वेक्टर को गुरुत्वाकर्षण द्वारा प्रवेशनी से बाहर निकलने से रोकने के लिए स्टॉपकॉक को बंद करें।
- इंजेक्शन (चित्रा 1 बी, डी, एफ) के दौरान मेनिस्कस के आंदोलन को मापने के लिए पीटीएफई टयूबिंग के लिए एक प्लास्टिक शासक टेप करें।
- लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र में प्रवेशनी प्रविष्टि (चित्रा 1 बी)
- प्रवेशनी को स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर से चिपकाएं।
- मैन्युअल रूप से गैर-बाँझ सहायक से सर्जन को पंप ट्यूबिंग (जो ल्यूर-लॉक कनेक्टर में समाप्त होता है) को स्थानांतरित करें। सर्जन को बाँझ आस्तीन की दीवार के माध्यम से ल्यूर-लॉक कनेक्टर को समझना चाहिए, कनेक्टर को एक दूसरा बाँझ स्टॉपकॉक चिपकाना चाहिए, आस्तीन को इसके चारों ओर कसकर टेप करना चाहिए, और फिर आस्तीन के कॉलर को छोड़ना चाहिए, जिससे यह गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के साथ विस्तार कर सके।
- प्रवेशनी ट्यूबिंग से जुड़े स्टॉपकॉक को एयर पंप से जुड़े स्टॉपकॉक से कनेक्ट करें। वायु पंप को कम दबाव में सेट करें, इसे चालू करें, और दबाव बढ़ाएं जब तक कि तेल प्रवेशनी के माध्यम से आगे नहीं बढ़ता है और प्रवेशनी टिप पर वेक्टर समाधान की एक बूंद दिखाई देती है।
- इंजेक्शन के दौरान मेनिस्कस के आंदोलन को मापने के लिए पीटीएफई ट्यूबिंग पर प्लास्टिक शासक स्थिति को समायोजित करें।
- स्टीरियोटैक्सिक मैनिपुलेटर के साथ प्रवेशनी को नीचे चलाएं और उस गहराई को रिकॉर्ड करें जिस पर टिप सतह (ड्यूरा या पिया मेटर) तक पहुंचती है।
- ट्रैक के साथ इंजेक्शन दिया जा करने के लिए सबसे गहरी साइट के लिए प्रवेशनी ड्राइव। सतह डिंपल होगी। यदि सतह प्रांतस्था को इंजेक्ट कर रहे हैं, तो नेत्रहीन पुष्टि करें कि प्रवेशनी ने सतह में प्रवेश किया है, एक सर्जिकल माइक्रोस्कोप के साथ या यदि उपलब्ध हो तो आवर्धक लूप।
- ऊतक संपीड़न के कारण मिसटारगेटिंग को कम करने के लिए, प्रवेशनी को धीरे-धीरे (1 मिमी / मिनट), जल्दी से (0.5 मिमी / सेकंड) में नीचे 1-5 मिनट की प्रतीक्षा के साथ चलाएं, या 500 μm द्वारा सबसे गहरी इंजेक्शन साइट को ओवरशूट करें और फिर वापस ले लें।
- इंजेक्शन
- 10-30 एस से अधिक विद्युत वायु पंप के साथ वेक्टर समाधान के 0.5 μL इंजेक्ट करें। पीटीएफई ट्यूब में रंगीन तेल और वेक्टर समाधान के बीच मेनिस्कस को ट्रैक करके इंजेक्शन प्रवाह की पुष्टि करें।
- 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और ट्रैक के साथ अगले इंजेक्शन साइट पर प्रवेशनी को वापस लें।
- अंतिम इंजेक्शन के बाद, वेक्टर प्रवाह से बचने के लिए प्रवेशनी को 10 मिनट के लिए जगह में छोड़ दें।
- प्रवेशनी को वापस लें और इसे बायोहाज़र्ड शार्प कंटेनर में फेंक दें।
- वैकल्पिक रूप से, इंजेक्शन साइट पोस्टमार्टम की पहचान की सुविधा के लिए वेक्टर इंजेक्शन साइट के पास फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स की एक छोटी मात्रा (≤1 μL) इंजेक्ट करें।
- अन्य स्थानों (चित्रा 2 बी) पर अन्य वेक्टर समाधान के लिए वांछित के रूप में इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
- सर्जरी बंद
- ड्यूरा, मांसपेशियों और त्वचा को सीवन करें।
- स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम से बंदर निकालें और सभी मॉनिटर केबलों को हटा दें।
- आइसोफ्लूरेन संज्ञाहरण से बंदर को निकालें और निगलने वाले पलटा की वापसी के बाद एक्सट्यूबेट करें।
- शल्य चिकित्सा के बाद उपचार प्रदान करें (मेलोक्सिकैम के 3-5 दिन और सेफलेक्सिन के 7-10 दिन)। हर 10 मिनट में कम से कम एक बार जानवर की निगरानी करें जब तक कि यह एक स्थिर ईमानदार बैठने की स्थिति बनाए रखने में सक्षम न हो।
3. जागने वाले जानवरों के लिए सर्जरी और एएवी वेक्टर इंजेक्शन (चित्रा 1 डी)
नोट: तकनीक का एक संस्करण जागने के दिमाग में इंजेक्शन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बंदरों का व्यवहार करता है, जैसा कि नीचे वर्णित है।
- रिकॉर्डिंग के साथ एक साथ इंजेक्शन
- इंजेक्शन साइट पर विद्युत गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए, एपॉक्सी (नीचे ~ 15 मिमी) और पॉलीमाइड टयूबिंग (शेष लंबाई) के साथ प्रवेशनी के बाहर कोट करें। इससे एपॉक्सी को स्क्रैप करके टिप पर धातु को प्रकट करें (इंजेक्टरोड, चित्रा 1 एफ)2। वैकल्पिक रूप से, प्रवेशनी और एक अलग बाह्य इलेक्ट्रोड, कंधे से कंधा मिलाकर, एक डबल बैरल गाइड ट्यूब (डबल बैरल गाइड ट्यूब, चित्रा 1 ई) में डालें।
- लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र में प्रवेशनी प्रविष्टि।
- प्रयोगात्मक बूथ में बंदर रखें, सिर के आंदोलन को प्रतिबंधित करें, और मानक तकनीकों का उपयोग करके कपाल-घुड़सवार रिकॉर्डिंग कक्ष को साफ करें।
- माइक्रोड्राइव के लिए एक गाइड ट्यूब सुरक्षित करें। गाइड ट्यूब में इंजेक्शन प्रवेशनी डालें।
- प्रवेशनी अग्रिम जब तक टिप गाइड ट्यूब से बाहर निकलता है।
- स्टॉपकॉक को इलेक्ट्रिक एयर पंप से कनेक्ट करें। उचित सिस्टम फ़ंक्शन की पुष्टि करने के लिए, एयर पंप का उपयोग करके टिप से वेक्टर समाधान की एक बूंद को धक्का दें और तेल-वेक्टर समाधान मेनिस्कस के आंदोलन की पुष्टि करें।
- मस्तिष्क में ट्यूब सम्मिलन के दौरान क्षति से बचाने के लिए गाइड ट्यूब में प्रवेशनी ~ 5 मिमी वापस लें। मस्तिष्क में गाइड ट्यूब डालें।
- माइक्रोड्राइव का उपयोग करके इंजेक्शन लगाने के लिए साइट पर प्रवेशनी ड्राइव करें। या तो विद्युत रिकॉर्डिंग (चित्रा 2 सी) या उत्तेजना द्वारा लक्ष्य साइट की पहचान करें।
चित्रा 1: सर्जरी और उपकरण की स्थापना( ए) इंजेक्शन प्रवेशनी। प्रवेशनी के प्रत्येक भाग को इंगित किया गया है। नीचे-दाईं ओर इनसेट: प्रवेशनी टिप की आवर्धित तस्वीर, स्केल बार: 500 μm. (बी) संवेदनाहारी बंदरों के लिए सर्जरी सेटअप। बंदर को सर्जिकल ड्रेप के नीचे एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखा जाता है। वेंटिलेटर (वी), अंतःशिरा रेखा (चतुर्थ), रक्तचाप मॉनिटर (बीपी), और ऑक्सीजन संतृप्ति मॉनिटर (ओ2) बंदर से जुड़े हुए हैं। इंजेक्शन प्रवेशनी को स्टीरियोटैक्सिक माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके लक्ष्य क्षेत्र में डाला जाता है। वेक्टर समाधान को एक इलेक्ट्रिक एयर पंप (नीचे-बाएं इनसेट, ब्राउन) द्वारा एक एयर कंप्रेसर (नीचे-बाएं इनसेट, नीला) के साथ जोड़ा जाता है। इंजेक्शन के दौरान रंगीन तेल (शीर्ष इनसेट, लाल) और वेक्टर समाधान (शीर्ष इनसेट, स्पष्ट) के बीच मेनिस्कस के आंदोलन को मापने के लिए पीटीएफई टयूबिंग में एक प्लास्टिक शासक (शीर्ष इनसेट) टेप किया जाता है। (सी) प्रवेशनी में वेक्टर समाधान लोड करने के लिए सेटअप। (डी) एक प्रयोगात्मक बूथ में वेक्टर समाधान के इंजेक्शन के दौरान एक बंदर। जानवर के सिर को तीन स्थिरीकरण-पदों द्वारा जगह में रखा जाता है, और आंख की स्थिति एक स्क्लरल खोज कॉइल सिस्टम द्वारा दर्ज की जाती है। इंजेक्शन प्रवेशनी आयोजित किया जाता है और एक माइक्रो इलेक्ट्रोड धारक / ड्राइवर का उपयोग करके लक्ष्य गहराई तक संचालित होता है। इंजेक्शन को यूएसबी कैमरा (इनसेट पिक्चर) के माध्यम से रंगीन तेल और वेक्टर समाधान के बीच मेनिस्कस की निगरानी करके नियंत्रित किया जाता है। (ई) डबल बैरल गाइड ट्यूब इंजेक्शन। एक डबल-बैरल गाइड ट्यूब धारक /ड्राइवर एक इंजेक्शन प्रवेशनी और एक माइक्रो-इलेक्ट्रोड रखता है (इनसेट देखें)। (एफ) इंजेक्शन। प्रवेशनी की नोक पर धातु, एपॉक्सी कोट को स्क्रैप करके उजागर की जाती है, न्यूरॉन्स (इनसेट, स्केल बार: 500 μm) तक विद्युत पहुंच प्रदान करती है। (जी) लेजर उत्तेजना सेटअप। एक डबल-बैरल गाइड ट्यूब धारक / ड्राइवर एक ऑप्टिकल फाइबर और एक माइक्रो-इलेक्ट्रोड दोनों रखता है (इनसेट देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एएवी इंजेक्शन साइटों का आरेख (ए) मस्तिष्क एमआर छवि का धनु अनुभाग प्राथमिक मोटर प्रांतस्था में इंजेक्शन साइटों और मकाका नेमेस्ट्रिना के प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था दिखा रहा है। (बी) केंद्रीय सल्कस (प्राथमिक मोटर प्रांतस्था) और प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था के सापेक्ष प्रवेशनी प्लेसमेंट दिखाते हुए संबंधित एटलस प्लेट पर पृष्ठीय सतह से देखें। (सी) बेहतर कोलिकुलस में इंजेक्टरोड द्वारा यूनिट रिकॉर्डिंग। एक इकाई जिसे इंजेक्शन (दाएं शीर्ष) से पहले अलग किया गया था, इंजेक्शन (दाएं तल) के बाद गायब हो गया। (डी) इंजेक्शन ट्रैक (सफेद तीर)। स्केल बार: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
4. ऊतक विज्ञान के लिए मस्तिष्क ऊतक प्रसंस्करण
- ट्रांसजीन अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के लिए इंजेक्शन के बाद 6-8 सप्ताह प्रतीक्षा करें।
नोट: इष्टतम अवधि प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सटीक वायरल वेक्टर पर निर्भर है। - पारगमन दक्षता और चयनात्मकता 5,6,7 का आकलन करने के लिए पारंपरिक हिस्टोलॉजिकल तकनीकों का उपयोग करके मस्तिष्क को संसाधित करें।
Representative Results
यहां वर्णित सर्जिकल इंजेक्शन विधि का उपयोग करके एनएचपी मस्तिष्क में विवो स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन द्वारा ट्रांसजीन अभिव्यक्ति का प्रदर्शन करने के लिए, दो वैक्टर का चयन किया गया था जिसमें अलग-अलग न्यूरोनल प्रकार 8,9 में सुपर पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन -2 (एसवाईएफपी 2) की अभिव्यक्ति को बढ़ाने वाले एन्हांसर शामिल थे। वायरल वैक्टर को पीएचपी.ईबी कैप्सिड10 में पैक किया गया था, जिसे आयोडिक्सानोल सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा शुद्ध किया गया था, और फिर क्यूपीसीआर द्वारा मापा गया उच्च टिटर (>1ई13 वायरल जीनोम / ट्रैक की कुल इंजेक्शन मात्रा के लिए प्रांतस्था के माध्यम से दस पटरियों के साथ दस गहराई में से प्रत्येक पर 0.5 μL की मात्रा इंजेक्ट की गई थी। चित्रा 3 ए-सी एक वयस्क पुरुष मकाका नेमेस्ट्रिना के प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था में पीवीएएलबी उपवर्ग-विशिष्ट एएवी वेक्टर, सीएन 2045 के 113 दिनों के बाद इंजेक्शन के माध्यम से एंटी-जीएफपी इम्यूनोस्टेनिंग के माध्यम से एसवाईएफपी 2 अभिव्यक्ति दिखाता है। एसवाईएफपी 2 ट्रांसजीन कॉर्टिकल गहराई में बिखरे हुए कई गैर-पिरामिड न्यूरॉन्स में मजबूती से पता चला है, और अधिकांश एसवाईएफपी 2 व्यक्त न्यूरॉन्स पीवीएएलबी7 के लिए भी प्रतिरक्षात्मक थे। चित्रा 3 डी एल 5 न्यूरॉन उपवर्ग-विशिष्ट एएवी वेक्टर, सीएन 2251 के इंजेक्शन के 64 दिनों के बाद प्राथमिक मोटर प्रांतस्था में देशी एसवाईएफपी 2 अभिव्यक्ति दिखाता है। एसवाईएफपी 2-लेबल वाले न्यूरॉन्स में सभी में स्पष्ट पिरामिड आकृति विज्ञान होता है जिसमें सोमाटा परत 5 और विशेषता मोटी एपिकल डेंड्राइट्स तक सीमित होता है। ये डेटा स्पष्ट रूप से एएवी वैक्टर को लक्षित करने वाले सेल-प्रकार के स्टीरियोटैक्सिक इंजेक्शन द्वारा एनएचपी मस्तिष्क में नियोकोर्टिकल न्यूरॉन्स की चुनिंदा आबादी में ट्रांसजीन अभिव्यक्ति के सटीक नियंत्रण का प्रदर्शन करते हैं।
चित्रा 3: एनएचपी मस्तिष्क में इंजेक्ट किए गए एएवी वैक्टर द्वारा मध्यस्थता सेल प्रकार-विशिष्ट एसवाईएफपी 2 अभिव्यक्ति का उदाहरण (ए) मकाक प्राथमिक दृश्य प्रांतस्था से एक निश्चित अनुभाग का एपिफ्लोरेसेंस फोटोमाइक्रोग्राफ 113 दिनों के बाद पीवीएएलबी उपवर्ग-विशिष्ट एएवी वेक्टर का इंजेक्शन। स्केल बार: 1 मिमी। (बी, सी) ए में दिखाए गए बॉक्सिंग क्षेत्र की उच्च आवर्धन छवि। (बी) एंटी-जीएफपी सिग्नल। (सी) एंटी-पीवीएएलबी सिग्नल। स्केल बार: 250 μm. (डी) मकाक प्राथमिक मोटर प्रांतस्था से एक निश्चित खंड में देशी एसवाईएफपी 2 प्रतिदीप्ति के एपिफ्लोरेसेंस फोटोमाइक्रोग्राफ 64 दिनों के बाद एक परत 5 एक्स्ट्राटेलेंसेफेलिक उपवर्ग-विशिष्ट एएवी वेक्टर के इंजेक्शन के बाद। स्केल बार: 500 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
न्यूरोफिजियोलॉजिकल और व्यवहारिक ऑप्टोजेनेटिक जोड़तोड़ के लिए इस इंजेक्शन तकनीक की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए, तीन प्रयोग किए गए थे, प्रत्येक एक अलग बंदर (मकाका मुलत्ता) पर। पहले प्रयोग (चित्रा 4 ए-डी) में, एएवी वैक्टर चैनलरोडोप्सिन -2 ट्रांसजीन (एएवी 1-एचएसवाईएन 1-सीएचआर 2-एमचेरी) को बाएं बेहतर कोलिकुलस (एससी) में इंजेक्ट किया गया था। वेक्टर को कुल 12 μL के लिए 19 गहराई पर हर 250 μm इंजेक्ट किया गया था। दूसरे प्रयोग (चित्रा 4 ई-जी) में, एएवी 1-एचएसआईएन-आर्कटी-ईवाईएफपी समाधान के 3 μL को नाभिक जालीदार टेगमेंटी पोंटिस (एनआरटीपी) में इंजेक्ट किया गया था। तीसरे प्रयोग (चित्रा 4 एच-के) में, एएवी 9-एल 7-सीएचआर 2-एमचेरी समाधान के 24 μL अनुमस्तिष्क प्रांतस्था6 में इंजेक्ट किया गया था। प्रत्येक इंजेक्शन के छह से आठ सप्ताह बाद, एक ऑप्टिकल फाइबर और एक टंगस्टन इलेक्ट्रोड को डबल-बैरल गाइड ट्यूब (चित्रा 1 जी) के माध्यम से मस्तिष्क में डाला गया था।
चित्रा 4 बी नीली रोशनी (450 एनएम) के लिए एक एससी न्यूरॉन की प्रतिक्रिया को दर्शाता है। 40 मेगावाट पर निरंतर प्रकाश (1.2 एस) ने लगातार एक्शन पोटेंशिअल (चित्रा 4 बी, शीर्ष) की एक श्रृंखला का उत्पादन किया। 1-एमएस अवधि के हल्के दालों ने 40 मेगावाट (चित्रा 4 बी, मध्य) पर एक्शन पोटेंशिअल पैदा करने में विफल रहे, लेकिन 160 मेगावाट पर मज़बूती से एक्शन पोटेंशिअल पैदा किया, एकमात्र अन्य शक्ति स्तर का परीक्षण किया गया, जिसमें 2.7 ± 0.6 एमएस (चित्रा 4 बी, नीचे) की विलंबता थी। एक पल्स ट्रेन (160 मेगावाट, आवृत्ति: 300 हर्ट्ज, कर्तव्य चक्र: 15%, अवधि: 300-एमएस) ने 97 ± 32 एमएस की औसत विलंबता, 10.4 ° का औसत आयाम और 47 ° (ऊपर और दाईं ओर) के औसत कोण के साथ लगातार थैली पैदा की; चित्रा 4 सी)।
एससी11,12 के सबथ्रेशोल्ड विद्युत उत्तेजना का उपयोग करके संशोधित सैकेड लाभ वाले अध्ययनों के अनुरूप, 15 °, 18 °, और 20 ° बाएं और नीचे (225 °) सैकेड के बाद एससी की ऑप्टिकल उत्तेजना धीरे-धीरे सैकेड लाभ (चित्रा 4 डी) को कम करती है। लाभ में इस कमी के लिए ~ 250 परीक्षणों (हरे हलकों) को पूर्व-अनुकूलन लाभ (ब्लैक सर्कल) पर लौटने की आवश्यकता होती है, जो दीर्घकालिक प्लास्टिसिटी में इसके आधार की पुष्टि करता है।
दूसरे प्रयोग (चित्रा 4 ई) में, एनआरटीपी से अनुमस्तिष्क प्रांतस्था (लोब्यूल्स वीआईसी और सातवीं) के ओकुलोमोटर वर्मिस (ओएमवी) तक काई फाइबर प्रक्षेपण को ऑप्टिकल रूप से दबा दिया गया था। चित्रा 4 एफ ओएमवी (इनसेट) में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले काई फाइबर और रोसेट दिखाता है। पीले लेजर प्रकाश (589 एनएम) को ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से ओएमवी को दिया गया था, और पास के टंगस्टन इलेक्ट्रोड का उपयोग पुर्किनजे सेल गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए किया गया था। चित्रा 4 जी एनआरटीपी अनुमानों (चित्रा 4 जी, शीर्ष) के पहले (ग्रे) और बाद में (नारंगी) ऑप्टोजेनेटिक निष्क्रियता से पहले सरल स्पाइक गतिविधि दिखाता है। निष्क्रियता से पहले, पुर्किनजे सेल ने 12 ° दाईं ओर थैली (चित्रा 4 जी, मध्य, ग्रे) के लिए एक डबल फट पैटर्न का प्रदर्शन किया। निष्क्रियता के दौरान, फायरिंग दर कम हो गई और फट-विराम पैटर्न (चित्रा 4 जी, मध्य, नारंगी) में बदल गई। इन दो प्रतिक्रिया पैटर्न की तुलना करने से पता चलता है कि पुर्किनजे कोशिकाओं के लिए काई फाइबर इनपुट दूसरे फट (चित्रा 4 जी, मध्य, हरे) को चलाकर सैकेड मंदी चरण को प्रभावित करता है। ऑप्टोजेनेटिक निष्क्रियता के दौरान दाएं थैलियों की परिवर्तनशीलता कम हो गई थी, इस विचार के अनुरूप कि सैकेड मैट्रिक्स में कुछ परीक्षण-से-परीक्षण परिवर्तनशीलता काई फाइबर (चित्रा 4 जी, नीचे, नारंगी) द्वारा किए गए संकेतों में परिवर्तनशीलता के कारण है।
तीसरे प्रयोग (चित्रा 4 एच) में, ओएमवी की पुर्किनजे कोशिकाओं को ऑप्टोजेनेटिक रूप से उत्तेजित किया गया था (चित्रा 4 आई)। लघु प्रकाश दालों (1.5-एमएस दालों, 65 मेगावाट, 50 हर्ट्ज) की एक ट्रेन ने एक पृथक पुर्किनजे सेल (चित्रा 4 जे, शीर्ष) की सरल स्पाइक गतिविधि में वृद्धि की। व्यक्तिगत 1.5-एमएस प्रकाश दालों ने अक्सर >1 सरल स्पाइक (चित्रा 4 जे, नीचे) पैदा किया। ऑप्टोजेनेटिक सरल स्पाइक सक्रियण, एक सैकेड (10-एमएस प्रकाश नाड़ी, 60 मेगावाट) के दौरान होने का समय, सैकेड आयाम (चित्रा 4 के) में वृद्धि हुई, जो ओकुलोमोटर फट जनरेटर पर पुर्किनजे कोशिकाओं की विघटनकारी भूमिका की पुष्टि करता है।
चित्रा 4: जागृत बंदरों में किए गए तीन ऑप्टोजेनेटिक प्रयोगों का सारांश (ए-डी) प्रयोग 1, पैन-न्यूरोनल उत्तेजना: वायरल इंजेक्शन, लेजर उत्तेजना और यूनिट रिकॉर्डिंग बेहतर कोलिकुलस (ए) में आयोजित की गई थी। (बी) लेजर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न प्रतिनिधि इकाई गतिविधि। (सी), आंखों के आंदोलनों के क्षैतिज (शीर्ष) और ऊर्ध्वाधर (मध्य) घटक और लेजर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न इकाई गतिविधि (नीचे) के रेखापुंज भूखंड। (डी) लेजर उत्तेजना द्वारा प्रेरित सैकेड अनुकूलन का एक प्रतिनिधि सत्र। उत्तेजना (100 0.5-एमएस लेजर दालों) को प्रत्येक सैकेड (इनसेट) के बाद 80-एमएस वितरित किया गया था। परीक्षणों में सैकेड लाभ (सैकेड आयाम / लक्ष्य आयाम) धीरे-धीरे कम हो गया। (ई-जी) प्रयोग 2, मार्ग-विशिष्ट निषेध: एक वायरल वेक्टर को नाभिक जालीदार टेगमेंटी पोंटिस में इंजेक्ट किया गया था, और लेजर उत्तेजना और यूनिट रिकॉर्डिंग ओकुलोमोटर वर्मिस (ई) में आयोजित की गई थी। (एफ) ओकुलोमोटर वर्मिस का हिस्टोलॉजिकल सेक्शन लेबल वाले काई फाइबर (स्केल बार: 1 मिमी) और उनके रोसेट (इनसेट, स्केल बार: 100 μm) दिखा रहा है। (जी) पुर्किनजे सेल गतिविधि (शीर्ष: रेखापुंज, मध्य: औसत फायरिंग दर) और लेजर उत्तेजना के साथ और बिना नेत्रहीन निर्देशित थैली (नीचे) के प्रक्षेपवक्र। ग्रे: परीक्षणों से लेजर, नारंगी: परीक्षणों पर लेजर, हरा: ग्रे और नारंगी के बीच अंतर। (एच-के) प्रयोग 3, सेल प्रकार-विशिष्ट सक्रियण: वायरल इंजेक्शन, लेजर उत्तेजना, और यूनिट रिकॉर्डिंग ओकुलोमोटर वर्मिस (एच) में आयोजित की गई थी। (I) ओकुलोमोटर वर्मिस का हिस्टोलॉजिकल सेक्शन लेबल पुर्किनजे कोशिकाओं को दर्शाता है। स्केल बार: 100 μm. (जे) लेजर उत्तेजना द्वारा उत्पन्न एक पुर्किनजे सेल की सरल स्पाइक गतिविधि। शीर्ष: 14 परीक्षणों से रेखापुंज साजिश। नीचे: एक एकल प्रतिनिधि परीक्षण से वोल्टेज ट्रेस। (के) लेजर उत्तेजना के साथ और बिना नेत्रहीन निर्देशित थैलियों के प्रक्षेपवक्र। थैली के दौरान एक 10-एमएस प्रकाश नाड़ी ने थैली आयाम में वृद्धि की। लेजर-ऑन परीक्षणों पर व्यक्तिगत सैकेड प्रक्षेपवक्र (सियान) और उनका औसत (नीला)। लेजर-ऑफ परीक्षणों पर व्यक्तिगत सैकेड प्रक्षेपवक्र (हल्के भूरे रंग) और उनके औसत (गहरे भूरे रंग के)। प्रकाश तरंग दैर्ध्य प्रयोग 1 और 3 में 450 एनएम था और प्रयोग 2 में 589 एनएम था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
एनएचपी ऑप्टोजेनेटिक्स में प्रगति ने सटीक, विश्वसनीय इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन विधियों की आवश्यकता पैदा की है। इस रिपोर्ट में वर्णित विधि के फायदे यह हैं कि यह सस्ती है, निष्फल और डिस्पोजेबल घटकों का उपयोग करता है, और किसी भी गहराई के विविध मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने की क्षमता रखता है। यह उस गति के आधार पर इंजेक्शन की गति और मात्रा के नियंत्रण की भी अनुमति देता है जिसके साथ वायु वाल्व को नियंत्रित किया जा सकता है। एक क्लॉग को हटाने के लिए हवा के दबाव को क्षणिक रूप से बढ़ाया जा सकता है और फिर बाद के ओवर-इंजेक्शन से बचने के लिए जल्दी से कम किया जा सकता है जो निरंतर दबाव द्वारा उत्पादित किया जाएगा। डिस्पोजेबल घटक इंजेक्शन साइटों के बीच क्रॉस-संदूषण के जोखिम को कम करते हैं।
इस इंजेक्शन प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों में उच्च गुणवत्ता वाले प्रवेशनी का निर्माण करना, बुलबुले पेश किए बिना उन्हें लोड करना और इंजेक्शन साइटों का चयन करना शामिल है जो एक साथ बहुत करीब नहीं हैं। ≥1 सेमी अलग इंजेक्शन आमतौर पर गैर-अतिव्यापी क्षेत्रों को स्थानांतरित करते हैं, लेकिन यह अनुमानी वायरल सीरोटाइप, टिटर, प्रमोटर, वॉल्यूम, लक्ष्य और पता लगाने की विधि पर निर्भर है। इंजेक्शन साइटों का चयन करना जो सीधे जुड़े नहीं हैं, अक्षतंतु के साथ ऑप्सिन तस्करी द्वारा उत्पादित संभावित भ्रम और प्रतिगामी पारगमन के लिए कुछ एएवी सीरोटाइप की प्रवृत्ति से बचते हैं।
विधि का उपयोग एनएचपी को इंजेक्ट करने के लिए किया जा सकता है जबकि एनेस्थेटाइज्ड और स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम (चित्रा 3) या अलर्ट और हेड-फिक्स्ड (चित्रा 4) में। पूर्व में इंजेक्शन को स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक में लक्षित करने की अनुमति देने का लाभ है, और यह एक तीव्र ड्यूरोटॉमी के माध्यम से प्रवेशनी प्रवेश की दृश्य पुष्टि की अनुमति देता है (एक जागृत बंदर में ड्यूरा को चीरा, एक पुरानी क्रैनियोटॉमी के माध्यम से, संक्रमण के जोखिम को बढ़ाता है)। उत्तरार्द्ध दृष्टिकोण में उत्तरजीविता सर्जरी की संख्या को कम करने के फायदे हैं और इसलिए जानवर के लिए तनाव, व्यवहार के दौरान इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के साथ संगत है, और पोस्ट-इंजेक्शन प्रयोगों के लिए ऑप्टिकल फाइबर डालने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान समन्वय फ्रेम और इंस्ट्रूमेंटेशन का उपयोग करना है। कृत्रिम ड्यूरा13,14,15 के माध्यम से इंजेक्शन बनाकर जागृत बंदरों में इंजेक्शन तकनीक को और बेहतर बनाया जा सकता है। यह इंजेक्शन साइटों और ऊतक प्रतिदीप्ति के प्रत्यक्ष दृश्य के अतिरिक्त फायदे प्रदान करेगा जो सफल पारगमन को इंगित करता है।
एनएचपी में कई अन्य एएवी इंजेक्शन तकनीकों का उपयोग किया गया है। हाल ही में, एएवी वैक्टर को समान रूप से बड़े एनएचपी कॉर्टिकल क्षेत्रों में वितरित करने के लिए एक मल्टी-चैनल इंजेक्शन डिवाइस विकसितकिया गया था। इसी तरह के परिणाम संवहन-वर्धित वितरण17,18 का उपयोग करके प्राप्त किए जा सकते हैं। इन विधियों का उद्देश्य पारगमन प्रसार को अधिकतम करना है, जो एक महत्वपूर्ण लक्ष्य है, लेकिन एक जो स्थानिक परिशुद्धता से अलग है जिसे हमारी विधि प्राप्त करना है।
एक अन्य वैकल्पिक विधि बोरोसिलिकेट ट्यूबिंग के माध्यम से एएवी वैक्टर को इंजेक्ट करना है जो एक छोर पर एक तेज टिप से जुड़ा हुआ है और दूसरे 5,6 पर हैमिल्टन सिरिंज से जुड़ा हुआ है। इस पत्र में वर्णित विधि के साथ इस विधि में बहुत समानता है। वायरल वेक्टर को ट्यूबिंग की लंबाई में रखा जाता है, वायरस के पीछे ट्यूबिंग में जगह रंगे हुए तेल से भरी होती है, और वेक्टर के प्रवाह की निगरानी तेल-वेक्टर मेनिस्कस के आंदोलन के माध्यम से की जाती है। इस वैकल्पिक तकनीक को कम उपकरण और तैयारी की आवश्यकता होती है, लेकिन इसके लिए नकारात्मक दबाव से बेवल्ड टिप के माध्यम से बोरोसिलिकेट ट्यूबिंग में तेल खींचने और बाद में उसी मार्ग के माध्यम से वेक्टर लोड करने की आवश्यकता होती है। यह अनिवार्य रूप से मस्तिष्क को वितरित तेल के निशान में परिणाम देता है। इसके अतिरिक्त, हमारे अनुभव में, बोरोसिलिकेट ट्यूबिंग में ड्यूरा में प्रवेश करने के लिए ~ 350 μm का व्यास होना चाहिए, भले ही बेवल किया गया हो और इसलिए इस पेपर (चित्रा 2 डी) में वर्णित पतली धातु प्रवेशनी की तुलना में अधिक यांत्रिक क्षति का कारण बनता है। 30 जी ट्यूबिंग का उपयोग किया गया था क्योंकि इसका महत्वपूर्ण बकलिंग लोड 1-10 सेमी लंबाई के बावजूद ड्यूरा प्रवेश की मध्यस्थता करने के लिए काफी अधिक है, क्योंकि यह पीटीएफई ट्यूबिंग को कसकर फिट बैठता है, और क्योंकि यह शायद ही कभी बाधित हो जाता है। 33 जी टयूबिंग क्लॉग और अधिक आसानी से झुकता है और पीटीएफई ट्यूबिंग के साथ संभोग करना अधिक कठिन है। 36 जी ट्यूबिंग एनएचपी ड्यूरा मेटर में प्रवेश करने के लिए अपर्याप्त रूप से कठोर है।
एक अन्य वैकल्पिक इंजेक्शन तकनीक वेक्टर-लोडेड, खींचे गए ग्लास पिपेट19 के पीछे एयर पंप के आउटपुट को संभोग करना है। वेक्टर को पंप से प्रत्यक्ष, आंतरायिक हवा के दबाव से पिपेट टिप से मजबूर किया जाता है, जिससे तेल की आवश्यकता समाप्त हो जाती है। ऊपर वर्णित एकल-ट्यूब विधि के समान, मेनिस्कस और प्रवेशनी टिप के बीच किसी भी सामग्री जंक्शनों की कमी लीक के जोखिम को कम करती है। हालांकि, ग्लास पिपेट के तेज टेपर और नाजुक सुझाव उन्हें एनएचपी ड्यूरा में प्रवेश करने या गहरी संरचनाओं को लक्षित करने से रोकते हैं।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को डब्ल्यूएएनपीआरसी / आईटीएचएस पी 51ओडी010425 (जेटीटी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) अनुदान ईवाई 023277 (वाईके के लिए आर 01), ईवाई 030441 (जीएच के लिए आर 01), एमएच 114126 (जेटीटी के लिए आरएफ 1, बोअज लेवी, एड लीन), एमएच 120095 (जेटीटी और जीएच के लिए यूजी 3), ईवाई028902 (आर) द्वारा समर्थित किया गया था। लेखक हिस्टोलॉजी के लिए यास्मीन एल-शामायलेह और विक्टोरिया ओमस्टेड, वायरल वेक्टर क्लोनिंग के लिए रेफ्यूजियो मार्टिनेज और एनएचपी मस्तिष्क ऊतक प्रसंस्करण के साथ सहायता के लिए जॉन मिच को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: Stereotaxic set | |||
| Item | |||
| Allen keys | BONDHUS | 10936 | STERRAD |
| Cannula holder | KOPF | 1770 | STERRAD |
| Carrier (manipulator) | KOPF | 1404 | STERRAD |
| Carrier platform | KOPF | 1430 | NA |
| Carrier stand | KOPF | 1449 | STERRAD |
| Eye, ear, mouth bars | KOPF | 1430 | NA |
| Stereotaxic base | KOPF | 1210 | NA |
| Equipment: Cannula | |||
| Item | |||
| 1 mL Luer-lock syringes | BD | 309628 | NA (sterilized package) |
| Cannulas* | (homemade - see below) | NA | steam (autoclave) |
| Colored oil** | (homemade - see below) | NA | NA |
| Elevator (for tube rack) | Cole-Parmer | UX-08057-10 | STERRAD |
| Filter tip | Genesee Scientific | 23-404 | NA (sterilized package) |
| Fluorescent microbeads | Lumafluor | R170 | NA |
| P20 pipetman | Gilson | FA10003M | NA |
| PCR tubes | Olympus Plastics | 22-161 | STERRAD |
| Stopcock | Cole-Parmer | 3060004 | STERRAD |
| Tube rack | homemade | NA | STERRAD |
| Vector solution | (homemade) | NA | NA |
| Equipment: Electric air pump set | |||
| Item | |||
| Electric air pump | World Precision Instruments | PV830 | NA |
| Foot pedal | World Precision Instruments | 3260 | NA |
| Tube cover | EZ Drape | A400-1000 | NA (sterilized package) |
| Equipment: General surgery tools | |||
| Item | |||
| Beaker | MEDLINE | azlon | STERRAD |
| Burrs | STRYKER | 277-10-235 | STERRAD |
| Double pronged tissue pick | Fine Science Tools | 18067-11 | STERRAD |
| Drapes | MEDLINE | DYNJP3004 | NA (sterilized package) |
| Dressing forceps | Miltex | 6-118 | STERRAD |
| Drill | STRYKER | Q9R-5400 | NA |
| Drill bits | STRYKER | 277-82-87 | STERRAD |
| Gauze | MEDLINE | NON26334 | NA (sterilized package) |
| Hemostatic mosquito forceps | Miltex | 7-2, 7-4 | STERRAD |
| Light handles | SKYTRON | Stellar XL | STERRAD |
| Needle hodler | Miltex | 8-2 | STERRAD |
| Periosteal elevator | Miltex | 18-1968 | STERRAD |
| Rongeurs | Miltex | 17-4800 | STERRAD |
| Saline | BAXTER | 2F7122 | STERRAD |
| Scalpel | Bard-Parker | 372610 | STERRAD |
| Scissors | Miltex | 5-12, 5-114 | STERRAD |
| Senn retractors | Miltex | 28065 | STERRAD |
| Sterile gloves | MEDLINE | Triumph Micro | NA (sterilized package) |
| Suction | medela | 200-4869 | NA |
| Suction tip | MEDLINE | DYNDFR12S | NA (sterilized package) |
| Suction tube | COVIDEN | 8888301614 | NA (sterilized package) |
| Surgical gowns | MEDLINE | DYNJP2002S | NA (sterilized package) |
| Surgical pens & ruler | MEDLINE | DYNJSM03 | NA (sterilized package) |
| Suture | COVIDEN | SL-635 | NA (sterilized package) |
| Tissue forceps | Miltex | 6-114 | STERRAD |
| Towel clamps | Miltex | 7-504 | STERRAD |
| Wood swabs | MEDLINE | MDS202095 | NA (sterilized package) |
| Equipment: *cannulas | |||
| Item | |||
| Hypodermic needle | EXELINT INTERNATIONAL | 26437 | NA (sterilized package) |
| Stainless steel tube | K-TUBE | K30R | NA |
| PTFE tube | ZEUS | 216200 | NA |
| Equipment: **colored oil | |||
| Item | |||
| Liquid Candle Dye Concentrate | PremiumCraft | Red/Pink | NA |
| Mineral oil | Vi-Jon | S0883 | NA |
| STERRAD: low-temperature hydrogen peroxide gas plasma |
References
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