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Engineering

मुरीन पल्मोनरी वाल्व के सहर्पेलेटिव इमेजिंग के लिए सर्जरी और नमूना प्रसंस्करण

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/62581
Automatic Translation
1, 2, 2, 3, 3, 3, 2, 1
1Center for Electron Microscopy and Analysis, The Department of Materials Science and Engineering, Ohio State University, 2Center for Regenerative Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 3Thermo Fisher Scientific

Summary

यहां, हम सकल संरचना और स्थानीय बाह्य मैट्रिक्स संरचनाओं को निर्धारित करने के लिए मुरीन पल्मोनरी वाल्व की उत्तेजना, दबाव, निर्धारण और इमेजिंग के लिए एक सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का वर्णन करते हैं।

Abstract

हृदय वाल्व संबंधित रोग (एचवीडी) के अंतर्निहित कारण मायावी हैं। मुरीन पशु मॉडल एचवीडी का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं, हालांकि, कई लंबाई के तराजू में संरचना और संगठन को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए आवश्यक सर्जिकल और वाद्य विशेषज्ञता ने इसकी उन्नति को अवरुद्ध कर दिया है। यह काम विभिन्न लंबाई तराजू पर दिल के वाल्व को चित्रित करने के लिए मुरीन विच्छेदन, एन ब्लॉक धुंधला, नमूना प्रसंस्करण और सहसंबद्ध इमेजिंग प्रक्रियाओं का विस्तृत विवरण प्रदान करता है। हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलिवुलर दबाव का उपयोग हृदय वाल्व संरचना को रासायनिक रूप से ठीक करके लौकिक विषमता को नियंत्रित करने के लिए किया जाता था। माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (माइक्रोसीटी) का उपयोग हृदय वाल्व की ज्यामिति की पुष्टि करने और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसबीएफ-एसईएम) के लिए आवश्यक डाउनस्ट्रीम नमूना प्रसंस्करण के लिए एक संदर्भ प्रदान करने के लिए किया गया था। एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीरियल एसईएम छवियों को अपने संगठन का स्थानीय 3 डी प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए लिया गया और खंगाला गया। μCT और SBF-SEM इमेजिंग विधियों तो फेफड़े के वाल्व भर में स्थानिक भिन्नता को दूर करने के लिए सहसंबद्ध थे । हालांकि प्रस्तुत काम फेफड़े के वाल्व पर विशेष रूप से है, इस पद्धति जैविक प्रणालियों में पदानुक्रमित संगठन का वर्णन करने के लिए अपनाया जा सकता है और कई लंबाई तराजू में संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए निर्णायक है ।

Introduction

पल्मोनरी वाल्व (पीवी) सही वेंट्रिकल और पल्मोनरी धमनी के बीच एकदिशात्मक रक्त प्रवाह सुनिश्चित करने के लिए कार्य करता है। पल्मोनरी वाल्व विकृतियां जन्मजात हृदय रोग के कई रूपों से जुड़ी होती हैं। जन्मजात हृदय वाल्व रोग (एचवीडी) के लिए वर्तमान उपचार वाल्वुलर मरम्मत या वाल्व प्रतिस्थापन है, जो एक मरीज के जीवनकाल1में कई आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता कर सकता है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया गया है कि दिल के वाल्व का कार्य इसकी संरचना से प्राप्त होता है, जिसे अक्सर संरचना-कार्य सहसंबंधित के रूप में जाना जाता है। अधिक विशेष रूप से, दिल के ज्यामितीय और जैव यांत्रिक गुण इसके कार्य को निर्देशित करते हैं। यांत्रिक गुण, बदले में, ईसीएम की संरचना और संगठन द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। मुरीन हार्ट वाल्व के बायोमैकेनिकल गुणों का निर्धारण करने के लिए एक विधि विकसित करके, ट्रांसजेनिक पशु मॉडल का उपयोग हृदय वाल्व समारोह और शिथिलता2,3,4,5पर ईसीएम की भूमिका से पूछताछ करने के लिए किया जा सकता है।

मुरीन पशु मॉडल लंबे समय से आणविक अध्ययन के लिए मानक के रूप में माना जाता है क्योंकि ट्रांसजेनिक मॉडल अन्य प्रजातियों की तुलना में चूहों में अधिक आसानी से उपलब्ध हैं । मुरीन ट्रांसजेनिक मॉडल दिल वाल्व से संबंधित रोगों पर शोध के लिए एक बहुमुखी मंच प्रदान करते हैं6। हालांकि, ज्यामिति और ईसीएम संगठन दोनों की विशेषता के लिए सर्जिकल विशेषज्ञता और इंस्ट्रूमेंटेशन आवश्यकताएं एचवीडी अनुसंधान की प्रगति में एक बड़ी बाधा रही हैं। साहित्य में हस्टोलॉजिकल डेटा मुरीन हार्ट वाल्व एक्सपेरिलिएलर मैट्रिक्स सामग्री में एक तस्वीर प्रदान करता है, लेकिन केवल 2डी छवियों के रूप में, और इसकी 3 डी वास्तुकला7,8का वर्णन करने में असमर्थ हैं। इसके अतिरिक्त, दिल वाल्व दोनों स्थानिक और अस्थायी विषम है, यह मुश्किल ECM संगठन के बारे में प्रयोगों में निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए अगर नमूना और संरचना तय नहीं कर रहे हैं । पारंपरिक 3डी लक्षण वर्णन विधियां, जैसे एमआरआई या 3 डी इकोकार्डियोग्राफी, ईसीएम घटकों को हल करने के लिए आवश्यक संकल्प प्रदान नहीं करते हैं9,10।

यह काम पूरी तरह से सहसंबद्ध कार्यप्रवाह का विवरण देता है जहां कार्डियक चक्र के कारण अस्थायी विषमता को हाइड्रोस्टैटिक ट्रांसवैलर दबाव के साथ मुरीन पीवी की संरचना को ठीक करके संबोधित किया गया था। स्थानिक विषमता को विभिन्न लंबाई के तराजू में, विभिन्न इमेजिंग तौर-तरीकों, विशेष रूप से माइक्रोन और सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी से डेटा सेट दर्ज करके रुचि के क्षेत्रों का नमूनाकरण और डेटा सेट दर्ज करके ठीक से नियंत्रित किया गया था। डाउनस्ट्रीम नमूने के मार्गदर्शन के लिए μCT के साथ स्काउटिंग की यह विधि पहले प्रस्तावित की गई है, लेकिन क्योंकि फेफड़े के वाल्व लौकिक भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, सर्जिकल स्तर11पर नियंत्रण के एक अतिरिक्त स्तर की आवश्यकता थी।

वीवो अध्ययनों में मुरीन हार्ट वाल्व बायोमैकेनिक्स का वर्णन विरल हैं और इसके बजाय, विरूपण व्यवहार का वर्णन करते समय कम्प्यूटेशनल मॉडल पर भरोसा करते हैं। यह महत्वपूर्ण महत्व का है कि नैनोमीटर लंबाई पैमाने पर स्थानीय बाहुलर डेटा ज्यामिति और हृदय वाल्व के स्थान से संबंधित हो । यह, बदले में, यांत्रिक रूप से योगदान करने वाले ईसीएम प्रोटीन के मात्रात्मक, स्थानिक रूप से मैप किए गए वितरण प्रदान करता है, जिसका उपयोग मौजूदा बायोमैकेनिकलहार्ट वाल्व मॉडल12, 13,14को मजबूत करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन में जानवरों का उपयोग राष्ट्रव्यापी बच्चों के अस्पताल संस्थागत पशु देखभाल और प्रोटोकॉल AR13-00030 के तहत उपयोग समिति के अनुसार किया गया ।

1. पल्मोनरी वाल्व एक्ससेशन

  1. माउस विच्छेदन के लिए आवश्यक उपकरणों को ऑटोक्लेव करें। इसमें फाइन कैंची, माइक्रो फोर्स्प, माइक्रो वैस्कुलर क्लैंप, क्लैंप लगाने वाले फोर्स्प, माइक्रोनीडल होल्डर्स, स्प्रिंग कैंची और रिट्रैक्टर्स शामिल हैं ।
  2. ऑपरेशन से पहले कम से कम 2 सप्ताह के लिए सभी चूहों को स्वीकार करें। C57BL/6 चूहों, लगभग 1 वर्ष की उम्र, उनके पिंजरों और वजन से निकालें, फिर केटामाइन/जाइलाज़ीन कॉकटेल (3:1 केटामाइन: जाइलाज़ीन, 0.01 एमएल प्रति ग्राम) ओवरडोज के साथ इच्छामृत्यु करें।
  3. माउस को एक ट्रे पर पृष्ठीय अनुरिवृत्ति स्थिति में रखें और टेप के साथ उसके अंगों को सुरक्षित करें। एक बार सुरक्षित होने के बाद, थोराकोटॉमी करें।
    1. किसी भी अतिरिक्त एडीपोज ऊतक और प्रावरणी को हटाकर दिल का पर्दाफाश करें।
    2. कमरे के तापमान खारा समाधान (0.9% एनएसीएल) के साथ बाएं वेंट्रिकल के माध्यम से सही एट्रियम और छिद्रित करें। परफ्यूजन 30 एस से अधिक लगभग 20 एमएल लेना चाहिए। इसके परिणामस्वरूप माउस का विस्तार होता है।
  4. सुपीरियर वेना कावा, अवर वेना कावा, पल्मोनरी धमनी, और महाधमनी को तोड़कर पूरे दिल को हटा दें। पल्मोनरी धमनी का विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। वेंट्रिकुलो-धमनी जंक्शन के ऊपर लगभग 2 मिमी काटें, क्योंकि यह दबाव के लिए नाली के रूप में काम करेगा।
  5. वायुमंडलीय दबाव के लिए कक्षों का पर्दाफाश करने के लिए बाएं और दाएं वेंट्रिकल निकालें। सुनिश्चित करें कि फेफड़े के ट्रंक की संरचना वेंट्रिकल्स को हटाने से अप्रभावित होनी चाहिए।

2. फेफड़े के वाल्व का दबाव निर्धारण

  1. पल्मोनरी धमनी के साथ एनास्टोमोज़ दबाव टयूबिंग, चीन-ट्यूबलर जंक्शन के बीच लगभग 1 मिमी की दूरी और टयूबिंग के अंत को पत्रक और फेफड़े के ट्रंक के बड़े आंदोलनों के लिए समायोजित करने के लिए छोड़ दिया जाता है।
  2. जलाशय को एक अनुरूप शारीरिक दबाव में ऊंचा करें और इसे खारे समाधान से भरें। यह सुनिश्चित करने के लिए फ्लो-थ्रिक सिस्टम का परीक्षण करें कि कोई रुकावट या हवा के बुलबुले नहीं हैं।
  3. एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी वाल्व के लिए एक स्टॉपकॉक संलग्न करें और बहिर्वाह पथ को स्विच करके ट्यूबिंग (यानी, कोई हवा के बुलबुले) के माध्यम से पर्याप्त प्रवाह सुनिश्चित करें। एक बार प्रवाह पर्याप्त होने के बाद, बहिर्वाह को एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी वाल्व में स्विच करें और फेफड़े के ट्रंक का दबाव सुनिश्चित करें। इसकी पहचान पल्मोनरी ट्रंक डिटेंशन से होती है।
  4. एक बार पल्मोनरी ट्रंक के दबाव की पुष्टि होने के बाद, धीरे-धीरे प्राथमिक सुधारात्मक समाधान (1.25% ग्लूटाराल्डिहाइड, 0.15 एम कैकोडिलेट में 1.0% पैराफॉर्मल्डिहाइड) को शामिल करें जब तक कि खारा समाधान शुद्ध न हो जाए। यह एक हिस्से को हटाकर किया जाता है, जलाशय क्षमता का लगभग 25%, खारा समाधान का और इसे प्राथमिक फिक्सेटिव के साथ बदल दिया जाता है।
    सावधानी: सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले फिक्सेटिव (पैराफॉर्मलडिहाइड और ग्लूटारल्डिहाइड) अत्यधिक जहरीले हैं और उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहने जाने चाहिए।
  5. सुखाने को रोकने के लिए ऊतक के नमूने पर एक फिक्स्ड-लथपथ धुंध रखें।
  6. 3 घंटे के लिए फिक्स्ड को पर्फ्यूज करें, लगातार दबाव बनाए रखने के लिए जलाशय को फिर से भरें। निर्धारण के दौरान, रासायनिक निर्धारण के कारण फेफड़े के वाल्व को सिकुड़ना असामान्य नहीं है। यदि ऐसा है, तो शारीरिक दबाव बनाए रखने के लिए जलाशय को प्राथमिक सुधारात्मक के साथ लगातार भरपाई करें।
  7. उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फिक्सिव सॉल्यूशन में हार्ट वॉल्व स्टोर करें। नमूनों को बिना किसी समझदार अंतर के 1 सप्ताह तक संग्रहीत किया गया था।

3. एन ब्लॉक नमूना धुंधला और एम्बेड15,16

सावधानी: इस खंड में उपयोग किए जाने वाले धुंधला अभिकर्मक (पोटेशियम फेरोसायनाइड, ऑस्मियम टेट्रोक्साइड, थिओकार्बोहाइड्रेजाइड, सीसा एस्पार्टेट और यूरेनिल एसीटेट) अत्यधिक जहरीले होते हैं और इसे अत्यधिक देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। धूम हुड और उचित पीपीई का उपयोग करने की सलाह दी जाती है।

  1. धुंधला
    1. ठंड 0.15 मीटर कैकोडिलेट बफर के साथ 5 मिनट के लिए फिक्स्ड हार्ट वाल्व नमूना धोएं। दो बार और धोएं।
    2. 1.5% पोटेशियम फेरोसाइनाइड, 0.15 एम कैकोडिलेट, 2 एमएम कैल्शियम क्लोराइड, और 2% ऑमियम टेट्रोक्साइड के समाधान में दिल के वाल्व को पूरी तरह से जलमग्न कर दें, 1 घंटे के लिए बर्फ पर।
    3. जबकि नमूना इनक्यूबेटिंग है, डीएच2ओ के 10 एमएल में 0.1 ग्राम टीसी को भंग करके थिओकार्बोहाइड्रेजाइड (सीआईएच) समाधान तैयार करें। 1 घंटे के लिए समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए समय-समय पर धीरे-धीरे आंदोलन करें कि टीसी पूरी तरह से भंग हो जाए। उपयोग से तुरंत पहले 0.22 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
    4. नमूनों को कमरे के तापमान के साथ धोएं डीडीएच2ओ को 5 मिनट के लिए डीडीएच2ओ की एक ट्यूब में रखकर और कंटेनर को हिलाकर थोड़ा उत्तेजित करें। इस प्रक्रिया को तीन बार दोहराएं।
    5. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए फ़िल्टर किए गए TCH समाधान में रखें। चरण 3.1.4 में वर्णित कमरे के तापमान डीडीएच2ओ के साथ तीन बार (5 मिनट प्रत्येक) धोने का चरण करें।
    6. एक बार किया, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 2% ऑस्मियम टेट्रोक्साइड में नमूना जगह है । फिर इसे कमरे के तापमान डीडीएच2ओ के साथ 5 मिनट प्रत्येक के लिए कुल तीन बार फिर से धोएं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 1% यूरेसिल एसीटेट में नमूना इनक्यूबेट करें।
    8. इस समय के दौरान, एस्पार्टिक एसिड स्टॉक समाधान के 10 एमएल में 0.066 ग्राम लीड नाइट्रेट का समाधान करें। पीएच को 1 एन कोह के साथ 5.5 पर समायोजित करें। सीसा नाइट्रेट को भंग करने के लिए समाधान को 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    9. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, चरण 3.1.4 में वर्णित धोने के चरण को करें। तीन बार दोहराएं। फिर, 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में चरण 3.1.8 से सीसा एस्पार्टेट समाधान में हृदय वाल्व ऊतक को इनक्यूबेट करें।
  2. निर्जलीकरण
    1. डीडीएच 2 ओ के साथ कमरे के तापमान पर5मिनट के लिए ऊतकों को धोएं। तीन बार दोहराएं।
    2. डीडीएच 2 ओ में 20%, 50%, 70%, 90%, और100% इथेनॉल के नए समाधान करें।
    3. हृदय वाल्व ऊतक को निर्जलित करना। प्रत्येक 5 मिनट के लिए बर्फ पर 20%, 50%, 70%, और 90% इथेनॉल के बाद के उपचार करें। फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर 100% इथेनॉल के दो बाद के उपचार करें।
    4. ऊतक को 10 मिनट के लिए बर्फ-ठंडे एसीटोन में ले जाएं। फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ताजा एसीटोन में रखें।
  3. एम्बेडिंग
    1. निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार राल मिश्रण (सामग्री की तालिकादेखें) बनाएं: घटक ए का 11.4 ग्राम, घटक बी का 10 ग्राम, घटक सी का 0.3 ग्राम, और 0.05-0.1 ग्राम घटक डी। प्रारंभ में घटकों को सी और डी जोड़ने से पहले प्रत्येक घटक को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करके घटक ए और बी मिलाएं। मिश्रण घटकों सी और डी जोड़ने पर एक एंबर रंग में बदल जाएगा । ठीक से मिलाने पर यह एक समान हो जाएगा।
    2. 25:75, 50:50, और 75:25 राल: एसीटोन के वॉल्यूम अनुपात के साथ मिश्रण बनाएं। अच्छी तरह मिला लें।
    3. 25:75, 50:50, और 75:25 राल के बाद के उपचार में ऊतकों रखें: कमरे के तापमान पर 2 घंटे प्रत्येक के लिए एसीटोन मिश्रण।
    4. कमरे के तापमान पर रात भर 100% राल में ऊतकों रखें।
    5. अगले दिन, कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ताजा 100% राल में ऊतकों रखें।
    6. दिल के वाल्व ऊतकों को एक एम्बेडिंग कैप्सूल में स्थानांतरित करें, ताजा 100% राल के साथ विकल्प, और इलाज के लिए 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
  4. नीचे दिखाए गए सहसंबद्ध इमेजिंग करें।

4. माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी इमेजिंग

  1. एक चिपकने वाला (गोंद या दो तरफा टेप अच्छी तरह से काम करता है) के साथ एक μCT नमूना धारक पर राल नमूना ब्लॉक माउंट।
  2. धारक को μCT कक्ष में रखें और कोलेट को पंगा लेकर इसे चरण पर ठीक करें ताकि धारक की कोई गति न हो। स्कैन के दौरान नमूना आंदोलन छवि की गुणवत्ता को कम करेगा।
  3. आइकन पर डबल क्लिक करके μCT यूजर इंटरफेस खोलें। परियोजनाओं के बगल में + साइन का चयन करके और आवश्यक क्षेत्रों में भरें।
  4. एक बार यह बन जाने के बाद, बनाई गई परियोजना को ढूंढें, और उस पर क्लिक करके इसे चुनें। इससे दूसरा कॉलम अधिग्रहणखुल जाएगा । अधिग्रहण के बगल में + का चयन करें और आवश्यक क्षेत्रों को भरें।
  5. चैंबर के दरवाजे बंद करें और फ्रंट पैनल या μCT पर आर्मिंग बटन को मार कर सिस्टम को आर्म करें । वार्मअप का संकेत बटन का चयन करके यूजर इंटरफेस से वार्मअपएक्स-रे ।
    नोट: सिस्टम एक सफल वार्म-अप प्रक्रिया के बाद एक्स-रे को स्वचालित रूप से बंद कर देगा। बटन का चयन कर एक्स-रे चालू करें।
  6. चरण रोटेशन को समायोजित करें ताकि नमूने के रोटेशन का केंद्र मॉनिटर के केंद्र से विचलित न हो (यानी, नमूना पूरे स्कैन के लिए देखने के क्षेत्र के भीतर है)। इस प्रयोग के लिए उपयोग की जाने वाली प्रणाली के लिए, इसमें नीचे दिए गए विस्तृत रूप में ड्रॉप-डाउन टैब के तहत ब्याज के क्षेत्र (आरओआई) चरण को समायोजित करना शामिल है।
    1. रोटेशन कोण को 0 डिग्री पर सेट करके और नमूने के किनारे को चिह्नित करके आरओआई चरण समायोजन निर्धारित करें। इसके बाद नमूने को 180 डिग्री तक घुमाया जाता है और नमूने के किनारे को फिर से चिह्नित किया जाता है।
    2. आरओआई स्टेज एक्स-एक्सिस स्थिति को समायोजित करें ताकि नमूने का किनारा इन दो चरम सीमाओं के बीच हो। वाई-पोजीशन के लिए 90 डिग्री और 270 डिग्री के रोटेशन कोणों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    3. मामले में जहां नमूने के रोटेशन किनारों को देखने के क्षेत्र से बाहर जाने का कारण बनता है, μCT जरूरतों के आवर्धन को कम करें जब तक कि नमूने के किनारे उपरोक्त सेट कोणों पर दिखाई न दें और एक मोटे आरओआई चरण समायोजन किया जा सकता है।
    4. एक बार कम आवर्धन पर समायोजित होने के बाद, आवर्धन बढ़ाने के लिए नमूना या डिटेक्टर को स्थानांतरित करें और आरओआई पदों को ठीक समायोजित किया जा सकता है।
      नोट: संरेखण सुनिश्चित करने के लिए इस प्रक्रिया को दोहराया जा सकता है। उचित संरेखण के परिणामस्वरूप एक नमूना होता है जो सभी नमूना रोटेशन कोणों के माध्यम से कोई क्षैतिज आंदोलन नहीं दिखाता है।
  7. निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग करके वांछित स्कैनिंग मापदंडों के लिए μCT समायोजित करें। इन मापदंडों में ट्यूब क्षमता, ट्यूब वर्तमान, डिटेक्टर दूरी, नमूना दूरी, एक्सपोजर समय, प्रक्षेपवक्र और अनुमानों की संख्या शामिल है (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले μCT अधिग्रहण मापदंडों के लिए टेबल S1 देखें)।
    नोट: कैलिब्रेशन पैरामीटर, जैसे स्पष्ट क्षेत्र और अंधेरे क्षेत्र स्कैन, निर्माता के विनिर्देशों पर रखा जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा कहा न जाए। उदाहरण के लिए, यदि कोई नमूना बहुत बड़ा है और सिस्टम नमूना को फ़ील्ड व्यू से बाहर नहीं ले जा सकता है, तो स्पष्ट फ़ील्ड कैलिब्रेशन स्कैन करने के लिए नमूने को हटाने की आवश्यकता है।
  8. एक बार पैरामीटर सेट होने के बाद, स्कैन की अवधि का एक अनुमान समय अनुमान बटन से टकराकर देखा जा सकता है। स्कैन शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन का चयन करें।
  9. स्कैन पूरा होने के बाद, सुनिश्चित करें कि एक्स-रे बंद कर रहे हैं, कोलेट को अनस्क्रू करें, और ध्यान से μCT कक्ष से नमूना हटा दें।

5. नमूना प्रसंस्करण और छवि सहसंबंध

  1. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर (सामग्रीकी तालिका देखें) के साथ फ़िल्टर किए गए बैक प्रोजेक्शन एल्गोरिदम का उपयोग करके μCT अनुमानों का पुनर्निर्माण करें।
    1. स्क्रीन के शीर्ष पर टोह टैब का चयन करें। परियोजना और अधिग्रहण टैब का चयन करें।
    2. फ़िल्टर किए गए बैक प्रोजेक्शन के साथ टोह टेम्पलेट एसोसिएट का चयन करें। स्टार्ट टोह बटन मारो।
  2. इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पल्मोनरी वाल्व को पहचानें और सेगमेंट करें। इसके लिए पल्मोनरी वाल्व17के शरीर रचना विज्ञान के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है । ऊंचा धमनी दबाव पर, पत्रक फेफड़े के वाल्व के लुमेन को को कूटते और ब्लॉक करते हैं।
  3. स्कैनिंग दिशा और नमूने के संबंध में टुकड़ा करने की क्रिया अभिविन्यास की पहचान करें। नमूने को इस तरह से फिर से रीओरिएंट करें कि स्लाइसिंग दिशा वांछित धुरी के साथ गठबंधन हो।
  4. उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए ब्याज के क्षेत्रों की पहचान करें। इस प्रयोग में पर्चा और आर्टेरियो-वाल्वुलर जंक्शन के पेट (मध्य) को चुना गया।
  5. अतिरिक्त राल और नमूना या तो रेजर ब्लेड या सामग्री के बड़े टुकड़ों के लिए सैंडिंग, या महीन टुकड़ों के लिए माइक्रोटॉम द्वारा निकालें ।
  6. एक बार ब्याज के स्थान पर, स्थान की पुष्टि करने के लिए आभासी μCT स्लाइस के साथ भौतिक नमूने की तुलना करें। यह क्रॉस सेक्शन में शारीरिक सुविधाओं की तुलना करके किया गया था।

6. सीरियल ब्लॉक चेहरा स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी18

  1. एसबीएफ-एसईएम को समायोजित करने के लिए नमूने के क्रॉस-सेक्शन को कम करें, लगभग 2.0 x 1.5 x 1.8 मिमी।
  2. एपॉक्सी का उपयोग कर एसबीएफ-एसईएम एल्यूमीनियम स्टब पर छंटनी किए गए नमूने को माउंट करें।
  3. 35 एनएम सोने के साथ नमूना ब्लॉक कोट। कोटिंग की एक भी परत लागू करने के लिए मंच पर नमूना स्पिन।
  4. एसबीएफ-एसईएम चैंबर को वेंट करें और चाकू ब्लेड की ऊंचाई को माइक्रोस्कोप यूसेंट्रिक ऊंचाई में समायोजित करें।
  5. नमूना डालें और नमूना स्टब को स्तर करें।
  6. चार्जिंग को रोकने के लिए कम वैक्यूम स्थितियों के तहत छवि और बैकस्कैटर डिटेक्टर के साथ (एसबीएफ-एसईएम अधिग्रहण मापदंडों के लिए टेबल S2 देखें)।
  7. छवि और स्वचालित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विभिन्न आवर्धन पर ब्याज के कई क्षेत्रों सिलाई (सामग्री की तालिकादेखें) ।

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Representative Results

दबाव टयूबिंग के लिए पल्मोनरी धमनी का एनास्टोमोसिस चित्रा 1 एमें दिखाया गया है । हाइड्रोस्टैटिक दबाव के आवेदन के बाद, फेफड़े के ट्रंक मूल रूप से(चित्रा 1B)को डिस्टर्ब करता है जो यह दर्शाता है कि पल्मोनरी वाल्व पत्रक एक बंद विन्यास में हैं। पल्मोनरी वाल्व संरचना μCT द्वारा पुष्टि की गई थी। इस मामले में, पत्रक को कोआप्ट (बंद) किया गया था और एन्युन्यूस परिपत्र(चित्रा 2 ए)था। चित्रा 2B,सी या तो निर्धारण(चित्रा 2B)या धमनी पतन(चित्रा 2C)द्वारा अपर्याप्त फेफड़े वाल्व दबाव की डिग्री बदलती दिखाता है ।

नमूना ब्लॉक ट्रिमिंग μCT मात्रा प्रतिपादन द्वारा निर्देशित किया गया था। इस मामले में, चीन-ट्यूबलर जंक्शन के समानांतर विमान को टुकड़ा करने की दिशा के रूप में चुना गया था। शारीरिक स्थलों का उपयोग करना, μCT मात्रा प्रतिपादन आभासी पार वर्गों ऑप्टिकल छवियों के साथ सहसंबद्ध किया गया था(चित्रा 3) टुकड़ाकरने की क्रिया दिशा और स्थान की पुष्टि करने के लिए ।

एक बार नमूना ब्लॉक वांछित स्थान और अभिविन्यास पर था, उच्च संकल्प SBF-SEM छवियों को एक पत्रक के भीतर एक स्थानीय क्षेत्र में लिया गया । छवि सहसंबंध μCT मात्रा प्रतिपादन आभासीटुकड़ा (चित्रा 4A),कम संकल्प SBF-SEM छवियों(चित्रा 4B),और उच्च संकल्प SBF-SEM छवियों(चित्रा 4C)के बीच किया गया था । मैनुअल नमूना बढ़ते के कारण, एसबीएफ-एसईएम में छवियों को प्राप्त करने से पहले एक सपाट सतह बनाने के लिए नमूना ब्लॉक के अपेक्षित स्लाइस की आवश्यकता थी; इसलिए, चित्रा 3 और चित्रा 4 के बीच विभिन्न स्थानों.

वीडियो 1में μCT और SBF-SEM डेटा सेट के बीच एक पूर्ण छवि सहसंबंध देखा जा सकता है । μCT मात्रा प्रतिपादन में फेफड़े वाल्व नमूना आसानी से भारी धातु परमाणुओं के धुंधला होने की वजह से आसपास के एम्बेडिंग राल से समझा जा सकता है । टुकड़ा करने की क्रिया का मार्गदर्शन करने के लिए छवि में लंबाई और कोण मापा जाता है। इस उदाहरण में, चीन-ट्यूबलर जंक्शन के समानांतर विमान का उपयोग किया गया था। एक आभासी टुकड़ा सामग्री को हटाने का अनुकरण करता है जब तक कि ब्याज की गहराई तक नहीं पहुंच जाता है। एसबीएफ-एसईएम द्वारा ली गई उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को इस क्रॉस सेक्शन में लिया गया था और μCT डेटा सेट पर पंजीकृत किया गया था।

एक बार अधिग्रहीत होने के बाद, एसबीएफ-एसईएम द्वारा ली गई उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को एक छवि प्रोसेसर में आयात किया जा सकता है और 3 डी प्रतिनिधित्व(चित्रा 5)में संकलित किया जा सकता है जहां बाहुलर घटकों की पहचान की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:एनास्टोमोस्ड पल्मोनरी ट्रंक की प्रतिनिधि छवियां। हाइड्रोस्टैटिक दबाव के बाद उत्पादित पल्मोनरी ट्रंक(ए)से पहले और(बी)। बिंदीदार रेखा वेंट्रिकुलो-धमनी जंक्शन को इंगित करती है जहां फेफड़े के ट्रंक का एन्युलस रहता है। दबाव पर पल्मोनरी ट्रंक डिटेशन पर ध्यान दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:पल्मोनरी वाल्व प्रदान करने वाले प्रतिनिधि μCT मात्रा। (A)पल्मोनरी वाल्व पर्याप्त रूप से फैला हुआ और कोएप्ट (सर्कल) के साथ एक बंद स्थिति में है। (B,C) पल्मोनरी वाल्व का अपर्याप्त दबाव। ध्यान दें कि पत्रक ठीक से coapt(B)नहीं हैं और यह कि एन्युलस परिपत्र(सी)नहीं है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:पल्मोनरी वाल्व नमूना ब्लॉक की छवि सहसंबंध। (A)ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा ली गई ट्रिमिंग के बाद वर्चुअल स्लाइस और(बी)भौतिक नमूना ब्लॉक प्रतिपादन करने वाला μCT वॉल्यूम। पल्मोनरी वाल्व पत्रक के वर्गों लाल रंग में परिक्रमा कर रहे हैं और दो अलग इमेजिंग तरीकों को सहसंबंधित करने के लिए स्थलों के रूप में इस्तेमाल किया गया। स्केल बार 500 माइक्रोन से मेल खाता है. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4:इमेज्ड पल्मोनरी वाल्व क्रॉस सेक्शन का छवि सहसंबंध। (A)μCT वॉल्यूम रेंडरिंग द्वारा उत्पन्न वर्चुअल क्रॉस सेक्शन। लाल बॉक्स उस क्षेत्र को इंगित करता है जिसे एसबीएफ-एसईएम(बी)में SBF-SEM का उपयोग करके चित्रित किया गया था। (ख)माइक्रोसीटी क्रॉस सेक्शन के साथ सहसंबंधित करने के लिए कम-रिज़ॉल्यूशन अवलोकन छवियों का अवलोकन। ब्लू बॉक्स(सी)उच्च संकल्प SBF-SEM इमेजिंग के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है । स्केल बार(B)100 माइक्रोन और(सी)10 माइक्रोन के अनुरूप हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5:एसबीएफ-एसईएम द्वारा लिए गए पल्मोनरी वाल्व का खंडित क्षेत्र। क्रॉस-सेक्शनल छवियों को स्थानीय फेफड़े के वाल्व क्षेत्र के 3 डी प्रतिनिधित्व बनाने के लिए खड़ी और संकलित किया गया था। लेबल एंडोथेलियल कोशिकाओं (हरे), वाल्वुलर इंटरस्टिशियल कोशिकाओं (नीले), और बाह्य कोशिकीय फाइबर (पीला) को सौंपा गया था। इमेज्ड क्षेत्र के अनुमानित आयाम 30 माइक्रोन x 20 माइक्रोन x 100 माइक्रोन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ट्यूब क्षमता 70 केवी
ट्यूब वर्तमान 75 माइक्रोना
फोकस मोड M
प्रक्षेप-पथ वृत्तीय
अनुमान/क्रांति 2880
मोड 3040 x 3040 पिक्सल
औसत 1
एक्सपोजर समय 1.0 एस
नमूना-से-बंदूक की दूरी 15 मिमी
डिटेक्टर-टू-गन दूरी 725 मिमी
वोक्सल आकार 2.9 माइक्रोन
देखने का क्षेत्र 8.4 x 8.4 x 6.3 मिमी

तालिका S1: μCT के लिए इमेजिंग पैरामीटर।

लैंडिंग ऊर्जा 2 - 2.5 केवी
बीम वर्तमान 100 - 400 पीए
काम करने की दूरी 6.5 - 7 मिमी
संसूचक वीएस-डीबीएस
बस समय 1 - 2 माइक्रोन

तालिका S2: एसबीएफ-एसईएम के लिए इमेजिंग पैरामीटर।

वीडियो 1: μCT और SBF-SEM डेटा सेट की छवि सुधार। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

वेंट्रिकल्स को हटाने के दो प्रयोजनों में कार्य करता है। सबसे पहले, वायुमंडलीय दबाव के लिए वेंट्रिकल पक्ष को उजागर करना, जिससे केवल फेफड़े के वाल्व के धमनी पक्ष से एक ट्रांसवैलर दबाव को बंद करने की आवश्यकता होती है, और दूसरा, फेफड़े के ट्रंक को घुमाने से रोकने के लिए एक स्थिर आधार प्रदान करता है। दबाव के दौरान, फेफड़े का ट्रंक मूल रूप से और अवर रूप से डिस्टर्ब हो जाता है, जिससे यह घुमाने का खतरा हो जाता है, जिससे फेफड़े के ट्रंक का पतन हो जाता है। खारा समाधान के साथ फेफड़े के वाल्व को प्रीलोड करना यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त गुणवत्ता की जांच प्रदान करता है कि दबाव पर्याप्त है और यदि सिस्टम में कोई लीक है। प्राथमिक फिक्सेटिव की कार्रवाई कुछ सेकंड के क्रम में त्वरित होती है, और नमकीन समाधान के साथ हाइड्रोस्टैटिक प्रीलोडिंग के बिना, फेफड़े के वाल्व को यादृच्छिक संरचना में तय किया जाता है। प्रीलोडिंग के बिना, बंद पल्मोनरी वाल्व के लिए सफलता दर लगभग 10%-20% थी। प्रीलोडिंग स्टेप के साथ, सफलता दर 90% से ऊपर थी।

इस आवेदन के लिए μCT और SBF-SEM इमेजिंग शर्तों को देखते थे। पल्मोनरी वाल्व, जब पूरी तरह से फैला हुआ है, तो 10 माइक्रोन मोटी से कम हो सकता है। अंगूठे के नियम के रूप में, एक सुविधा को हल करने में सक्षम होने के लिए 3 स्वरों की एक सीमा की आवश्यकता होती है; इसलिए μCT वॉल्यूम रेंडरिंग को 8.4 x 8.4 x 6.3 मिमी के दृश्य के क्षेत्र के साथ 2.9 माइक्रोन के स्वर आकार के साथ स्कैन किया गया था। छोटे स्वर आकार μCT में प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन यह या तो नमूना ट्रिमिंग और/ एक छोटा नमूना इसे एक्स-रे स्रोत के करीब रखकर उच्च संकल्प की अनुमति देगा। छोटे स्वर भी एक्स-रे डिटेक्टर को नमूने से आगे वापस रखकर प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, यह डिटेक्टर पर कुल प्रवाह को कम करेगा और सिग्नल-टू-शोर अनुपात से समझौता करेगा। एक संदर्भ के रूप में, हमारे μCT स्कैन अवधि में लगभग 5-6 घंटे थे । इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली विशिष्ट इमेजिंग स्थितियां अनुपूरक तालिका एस1 और अनुपूरक तालिका एस 2में हैं।

इस विधि की सीमाएं हैं। इस प्रक्रिया के शल्य चिकित्सा भाग को संभालने के दौरान फेफड़े के वाल्व संरचना से समझौता नहीं करने के लिए पशु हैंडलिंग में विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, इमेजिंग समय-प्रधान है और कई इमेजिंग उपकरणों की आवश्यकता होती है। एक संदर्भ के रूप में, उच्च-रिज़ॉल्यूशन एसबीएफ-एसईएम इमेजिंग लगभग 100 माइक्रोन की गहराई के लिए निरंतर इमेजिंग का लगभग 1 सप्ताह था। यह उपकरण के लिए एक मांग कार्य के लिए स्थिर और लंबे इमेजिंग सत्र के लिए लगातार रहना है । एक अधिक व्यावहारिक दृष्टिकोण के लिए एक नमूना रणनीति तैयार करने के लिए ठीक समय निवेश के बिना फेफड़े वाल्व की विषमता चित्रित किया जाएगा । यह अभी निर्धारित किया जाना है । आज तक, पूरे सहसंबद्ध कार्यप्रवाह एक माउस पर किया गया है, लेकिन लंबाई तराजू में फेफड़े के वाल्व की जांच में सहसंबद्ध कार्यप्रवाह की व्यवहार्यता और क्षमता को दिखाया गया है।

इस सहसंबद्ध दृष्टिकोण के भविष्य के पुनरूकवरों में सीटू माइक्रोसीटी प्रयोगों में शामिल हो सकता है, जैसे कि नमूना-से-नमूना भिन्नता को हटाने के लिए एक ही नमूना को विभिन्न ट्रांसवैलर दबाव से अवगत कराया जा सकता है। यह वर्तमान में विस्तारित स्कैन समय के लिए नमूना और साधन स्थिरता द्वारा सीमित है, इमेजिंग सिस्टम में एकीकृत एक दबाव तंत्र, और पानी और ऊतक के समान क्षीणन गुणांक के कारण विपरीत। इसके अतिरिक्त, हालांकि ट्रांसवैलर दबाव शारीरिक स्थितियों के चिंतनशील थे, यह स्पंदन प्रवाह का प्रतिनिधि नहीं है जो हृदय संकुचन की विशेषता है। हालांकि, यह दिखाया गया है कि तनाव दर पत्रक के अनुरूप पर थोड़ा प्रभाव पड़ता है । भविष्य पुनरावृत्तियों में, यह पल्सटाइल प्रवाह9का प्रशासन करने में सक्षम डिवाइस को इंजीनियर करने के लिए अधिक प्रासंगिक साबित हो सकता है। इसके अतिरिक्त, अधिकांश कार्य के लिए नमूने की मैन्युअल पूछताछ की आवश्यकता होती है, क्योंकि वर्तमान में कोई स्वचालित कार्यप्रवाह नहीं है। फेफड़े के वाल्व का पता लगाना, ब्याज, छवि सहसंबंध और पंजीकरण के क्षेत्र की ओर नमूना प्रसंस्करण मैन्युअल रूप से किया गया था, लेकिन प्रसंस्करण को कारगर बनाने और व्यक्तिपरकता को कम करने के लिए भविष्य में उपयोगी साबित होगा।

प्रस्तुत किया गया कार्य फेफड़े के वाल्व की संरचना को ठीक करने और μCT और SBF-SEM में इमेजिंग दर्ज करने के लिए एक सहसंबद्ध कार्यप्रवाह है। इस विधि का उपयोग करके प्राप्त जानकारी का उपयोग अंततः मुरीन पशु मॉडल में फेफड़े के वाल्व के अंतर्निहित बायोमैकेनिक्स को निर्धारित करने के लिए किया जाएगा, जिसे अभी तक स्पष्ट नहीं किया गया है। वाल्वुलर बायोमैकेनिक्स को पूरी तरह से इसकी ज्यामिति और बाह्यशता मैट्रिक्स द्वारा वर्णित किया जा सकता है, लेकिन ये दो अलग-अलग लंबाई के तराजू पर हैं। ऐसा करने के लिए, वाल्व की विषमता का सटीक नियंत्रण और फेफड़े के वाल्व के भीतर अपने स्थान के संबंध में बाह्य-रिज़ॉल्यूशन मैट्रिक्स के उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों की सटीक मानचित्रण की आवश्यकता है। इस सहसंबद्ध कार्यप्रवाह को पहले से ही अन्य प्रयोगों में लागू किया जा रहा है ताकि फाइब्रिलर एक्सपेरिअलर मैट्रिक्स मतभेदों की तुलना करने के लिए जंगली प्रकार और ट्रांसजेनिक ऑस्टियोजेनेसिस इम्परफेक्टा चूहों के बीच तुलना की जा सके और इसे आसानी से अन्य जन्मजात दोषों जैसे बाइसपिड वाल्वगठन 19,20से बाहर निकाला जा सके। यह जानकारी संभावित प्रोटेओमिक्स के साथ मिलकर दो मुरीन पशु मॉडलों के बीच बायोमैकेनिक्स कैसे अलग होगी, इसकी पूरी तस्वीर प्रदान करेगी।

इस काम के बावजूद केवल फेफड़े के वाल्व को चित्रित करते हुए, यह कार्यप्रवाह अन्य विषम, पदानुक्रमित जैविक प्रणालियों के लिए आसानी से संशोधित है। हमने ईसीएम के वास्तुशिल्प संगठन को पकड़ने के लिए 3 डी इमेजिंग तकनीकों का उपयोग किया, लेकिन ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या स्कैनिंग ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी जैसी उच्च संकल्प तकनीकों को वांछित जानकारी के आधार पर संलग्न किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम का समर्थन किया है, भाग में, R01HL139796 और R01HL128847 CKB और RO1DE028297 और CBET1608058 DWM के लिए अनुदान ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% glutaraldehyde (aq) EMS 16210 Primary fixative component
0.9% sodium chloride injection Hospira Inc. NDC 0409-4888-10
1 mL syringe BD 309659
10 mL syringe BD 309604
200 proof ethanol EMS 15055
22G needle BD 305156
3 mL syringe BD 309657
3-way stopcock Smiths Medical ASD, Inc. MX5311L
4% osmium tetroxide EMS 19150 Staining component
4% paraformaldehyde (aq) EMS 157-4-100 Primary fixative component
Absorbable hemostat Ethicon 1961
Acetone EMS 10012
Black polyamide monofilament suture, 10-0 AROSurgical instruments Corporation TI38402
Black polyamide monofilament suture, 6-0 AROSurgical instruments Corporation SN-1956
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664 Approximately 1 yo
Calcium chloride Sigma-Aldrich 10043-52-4
Clamp applying forcep FST 00072-14
Cotton tip applicators Fisher Scientific 23-400-118
DPBS Gibco 14190-144
Dumont #5 forcep FST 11251-20
Dumont #5/45 forceps FST 11251-35
Dumont #7 fine forcep FST 11274-20
Durcupan ACM resin EMS 14040 For embedding
Fine scissor FST 14028-10
Heliscan microCT Thermo Fisher Scientific Micro-CT
Ketamine hydrochloride injection Hospira Inc. NDC 0409-2053
L-aspartic acid Sigma-Aldrich 56-84-8 Staining component
Lead nitrate EMS 17900 Staining component
low-vacuum backscatter detector Thermo Fisher Scientific VSDBS SEM backscatter detector
Micro-adson forcep FST 11018-12
Millex-GP filter, 0.22 um, PES 33mm, non-sterile EMD Millipore SLGP033NS
Non-woven songes McKesson Corp. 94442000
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate Sigma-Aldrich 14459-95-1 Staining component
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich 1310-58-3
Pressure monitor line Smiths Medical ASD, Inc. MX562
Saline solution (sterile 0.9% sodium chloride) Hospira Inc. NDC 0409-0138-22
Size 3 BEEM capsule EMS 69910-01 Embedding container
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich 6131-99-3 Buffer
Solibri retractors FST 17000-04
Sputter, carbon and e-beam coater Leica EM ACE600 Gold coater
Surgical microscope Leica M80
Thiocarbohydrazide (TCH) EMS 21900 Staining component
Tish needle holder/forcep Micrins MI1540
Trimmer Wahl 9854-500
Uranyl acetate EMS 22400 Staining component
Volumescope scanning electron microscope Thermo Fisher Scientific VOLUMESCOPESEM Serial Block Face Scanning Electron Microscope
Xylazine sterile solution Akorn Inc. NADA# 139-236

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References

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इंजीनियरिंग अंक 174 मुरीन पल्मोनरी वाल्व हार्ट वाल्व कोलेजन एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स सहरक्षक इमेजिंग सीरियल ब्लॉक फेस स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी हार्ट वाल्व रोग
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