Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen

Published: February 12, 2022 doi: 10.3791/62589
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Helmholtz Institute for RNA-based Infection Research (HIRI), Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung (Helmholtz Centre for Infection Research), 2Medical Faculty, Julius-Maximilians University Würzburg

Summary

Dit protocol presenteert een complete experimentele workflow voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties met behulp van optische pincetten. Verschillende mogelijke experimentele opstellingen worden geschetst, waaronder de combinatie van een optisch pincet met confocale microscopie.

Abstract

RNA neemt verschillende structurele plooien aan, die essentieel zijn voor zijn functies en daardoor verschillende processen in de cel kunnen beïnvloeden. Bovendien kan de structuur en functie van een RNA worden gemoduleerd door verschillende trans-acterende factoren, zoals eiwitten, metabolieten of andere RNA's. Frameshifting RNA-moleculen zijn bijvoorbeeld regulerende RNA's in coderende regio's, die het vertalen van ribosomen naar een alternatief open leeskader sturen en daardoor fungeren als genschakelaars. Ze kunnen ook verschillende plooien aannemen na binding aan eiwitten of andere transfactoren. Om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om het samenspel en de mechanische kenmerken van deze RNA-eiwitcomplexen tegelijkertijd te bestuderen. Dit werk illustreert hoe single-molecule-fluorescentie-gekoppelde optische pincetten kunnen worden gebruikt om het conformationele en thermodynamische landschap van RNA-eiwitcomplexen met een hoge resolutie te verkennen. Als voorbeeld wordt de interactie van het SARS-CoV-2 geprogrammeerde ribosomale frameshifting element met de trans-acterende factor korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit uitgewerkt. Bovendien werden fluorescentie-gelabelde ribosomen gecontroleerd met behulp van de confocale eenheid, die uiteindelijk de studie van translatie-elongatie mogelijk zou maken. De fluorescentie gekoppelde OT-test kan op grote schaal worden toegepast om diverse RNA-eiwitcomplexen of trans-acterende factoren die de translatie reguleren te onderzoeken en zou studies van op RNA gebaseerde genregulatie kunnen vergemakkelijken.

Introduction

Overdracht van genetische informatie van DNA naar eiwitten via mRNA's is een complex biochemisch proces, dat op alle niveaus nauwkeurig wordt gereguleerd door macromoleculaire interacties in cellen. Voor translationele regulatie spelen RNA-eiwitinteracties een cruciale rol om snel te reageren op verschillende stimuli en signalen1,2. Sommige RNA-eiwitinteracties beïnvloeden de mRNA-stabiliteit en veranderen daardoor de tijd dat een RNA translatief actief is. Andere RNA-eiwitinteracties zijn geassocieerd met hercoderingsmechanismen zoals stop-codon readthrough, bypassing of geprogrammeerde ribosomale frameshifting (PRF)3,4,5,6,7. Onlangs is aangetoond dat een aantal RNA-bindende eiwitten (RBP's) interageren met stimulerende mRNA-elementen en de translatiemachinerie om te bepalen wanneer en hoeveel hercodering in de cel zal plaatsvinden7,8,9,10,11. Dus, om de rol van RNA-bindende eiwitten in translatie te ontleden en hoe ze de RNA-structuur en stabiliteit moduleren, is het cruciaal om de interactieprincipes en mechanische eigenschappen van deze RNA-eiwitcomplexen in detail te bestuderen.

Tientallen jaren werk hebben de basis gelegd voor het bestuderen van het meerstaps- en meercomponentenproces van vertaling, dat afhankelijk is van ingewikkelde communicatie tussen het RNA en eiwitcomponenten van de vertaalmachinerie om snelheid en nauwkeurigheid te bereiken12,13,14. Een cruciale volgende stap in het begrijpen van complexe regulerende gebeurtenissen is het bepalen van de krachten, tijdschalen en structurele determinanten tijdens translatie met hoge precisie12,15,16,17. De studie van RNA-conformatiedynamica en vooral hoe trans-acterende hulpfactoren tijdens translatie op de RNA-structuur inwerken, is verder verlicht door de opkomst van hulpmiddelen met één molecuul, waaronder optische pincetten of nulmodusgolfgeleiders16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.

Optische pincetten (OT) vertegenwoordigen een zeer nauwkeurige single-molecule techniek, die is toegepast om vele soorten RNA-afhankelijke dynamische processen te bestuderen, waaronder transcriptie, en translatie26,27,28,29,30,31,32. Het gebruik van een optisch pincet heeft het mogelijk gemaakt om moleculaire interacties, nucleïnezuurstructuren en thermodynamische eigenschappen, kinetiek en energetica van deze processen in detail te onderzoeken16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . Optische pincet assay is gebaseerd op de beknelling van microscopische objecten met een gerichte laserstraal. In een typisch OT-experiment wordt het betreffende molecuul vastgebonden tussen twee transparante (meestal polystyreen) kralen (figuur 1A)27. Deze kralen worden vervolgens gevangen door optische vallen, die zich gedragen als veren. De kracht die op het molecuul wordt uitgeoefend, kan dus worden berekend op basis van de verplaatsing van de kraal uit het midden van de gerichte laserstraal (valcentrum). Onlangs is een optisch pincet gecombineerd met confocale microscopie (figuur 1B), waardoor fluorescentie- of Förster resonantie-energieoverdracht (FRET)-metingen40,41,42 mogelijk zijn. Dit opent een heel nieuw veld van mogelijke experimenten die gelijktijdige meting en dus nauwkeurige correlatie van krachtspectroscopie en fluorescentiegegevens mogelijk maken.

Hier demonstreren we experimenten met behulp van het optische pincet in combinatie met confocale microscopie om eiwit-RNA-interacties te bestuderen die translationele frameshifting reguleren. Tussen het objectief en de condensor maakt een stroomcel met vijf kanalen een continue monstertoepassing met laminaire stroming mogelijk. Via de microfluïdische kanalen kunnen verschillende componenten direct worden geïnjecteerd, wat de hands-on tijd vermindert en zeer weinig monsterverbruik tijdens het experiment mogelijk maakt.

Eerst wordt een basisrichtlijn voorgesteld om het ontwerp van OT-experimenten te ondersteunen en worden voordelen en valkuilen van verschillende opstellingen besproken. Vervolgens wordt de voorbereiding van monsters en experimentele workflows beschreven en wordt een protocol voor de data-analyse verstrekt. Om een voorbeeld te geven, schetsen we de resultaten verkregen van RNA-stretching-experimenten om het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element (figuur 2A) te bestuderen met de trans-acterende factor de korte isovorm van zink-vinger antiviraal eiwit (ZAP), dat de vertaling van het virale RNA van een alternatief leesframe verandert43. Bovendien is aangetoond dat fluorescentie-gelabelde ribosomen kunnen worden gebruikt in deze OT confocale assay, wat nuttig zou zijn om de processiviteit en snelheid van de vertaalmachinerie te controleren. De hier gepresenteerde methode kan worden gebruikt om snel het effect van verschillende buffers, liganden of andere cellulaire componenten te testen om verschillende aspecten van translatie te bestuderen. Tot slot worden veelvoorkomende experimentele valkuilen besproken en hoe deze op te lossen. Hieronder worden enkele cruciale punten in experimenteel ontwerp geschetst.

Ontwerp construeren
In principe zijn er twee gangbare benaderingen om een OT-compatibel RNA-construct te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een lang RNA-molecuul dat is gehybridiseerd met complementaire DNA-handvatten, waardoor een construct ontstaat dat bestaat uit twee RNA / DNA-hybride regio's die een enkelstrengs RNA-sequentie in het midden flankeren (figuur 2B). Deze aanpak wordt gebruikt in de meeste OT RNA-experimenten33,44,45.

De tweede benadering maakt gebruik van dsDNA-handgrepen met korte (ongeveer 20 nt) overhangen15,17. Deze overhangen worden vervolgens gehybridiseerd met het RNA-molecuul. Hoewel ingewikkelder in ontwerp, overwint het gebruik van dsDNA-handles enkele beperkingen van het DNA / RNA-hybride systeem. In principe kunnen zelfs zeer lange handgrepen (>10kb) worden geïmplementeerd, wat handiger is voor confocale metingen. Bovendien kan het RNA-molecuul worden geligeerd aan DNA-handvatten om de stabiliteit van de tether te vergroten.

End-labeling strategie
Het construct moet via een sterke moleculaire interactie aan kralen worden vastgemaakt. Hoewel er benaderingen beschikbaar zijn voor covalente binding van handvatten aan kralen46, worden sterke maar niet-covalente interacties zoals streptavidin-biotine en digoxigenine-antilichaam vaak gebruikt in OT-experimenten15,33,35,45. In het beschreven protocol wordt het construct gelabeld met biotine of digoxigenine en zijn de kralen gecoat met respectievelijk streptavidin of antilichamen tegen digoxigenine (figuur 1A). Deze aanpak zou geschikt zijn voor het toepassen van krachten tot ongeveer 60 pN (per tether)47. Bovendien maakt het gebruik van verschillende 5'- en 3'-etiketteringsstrategieën het mogelijk om de oriëntatie van de tussen de kralen gevormde ketting te bepalen17.

Eiwitetikettering voor fluorescentiemetingen
Voor de confocale beeldvorming zijn er verschillende veelgebruikte benaderingen voor fluorescentie-etikettering. Fluoroforen kunnen bijvoorbeeld covalent worden gehecht aan aminozuurresiduen die inheems in eiwitten worden aangetroffen of door plaatsgerichte mutagenese via een reactieve organische groep worden geïntroduceerd. Thiol of amine-reactieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het etiketteren van respectievelijk cysteïne- en lysineresiduen. Er zijn verschillende omkeerbare beschermingsmethoden om de specificiteit van etikettering te vergroten48,49, maar inheemse eiwitten worden meestal gelabeld op meerdere residuen. Hoewel de kleine omvang van de fluorofoor een voordeel kan bieden, kan niet-specifieke etikettering de eiwitactiviteit verstoren en dus de signaalintensiteit variëren49. Afhankelijk van de etikettering kan de intensiteit van het efficiëntiesignaal ook verschillen tussen verschillende experimenten. Daarom moet voorafgaand aan het experiment een activiteitencontrole worden uitgevoerd.

In het geval dat het eiwit van belang een N- of C-terminale tag bevat, zoals een His-tag of streptokokkentag, vertegenwoordigt specifieke etikettering van deze tags een andere populaire benadering. Bovendien vermindert tag-gerichte etikettering de kans dat de fluorofoor de eiwitactiviteit verstoort en kan de oplosbaarheid verbeteren49. Tag-specifieke etikettering levert echter meestal mono-fluorofoor gelabelde eiwitten op, die een uitdaging kunnen zijn om te detecteren. Een andere manier van specifieke etikettering kan worden bereikt door antilichamen te gebruiken.

Microfluïdica-installatie
De combinatie van OT met een microfluïdicasysteem maakt een snelle overgang tussen verschillende experimentele omstandigheden mogelijk. Bovendien maken de huidige systemen gebruik van het behoud van de laminaire stroming in de stroomcel, waardoor het mengen van vloeistoffen uit andere kanalen in de loodrechte richting ten opzichte van de stroomrichting wordt uitgesloten. Daarom is laminaire stroming bijzonder voordelig voor het experimentele ontwerp. Momenteel worden vaak flowcellen met maximaal 5 kanalen gebruikt (figuur 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

  1. Kloon de interessante sequentie in de vector met de Lambda DNA-fragmenten, die dienen als de handvatsequenties (figuur 2)43,50.
  2. Genereer eerst een DNA-sjabloon voor daaropvolgende in vitro transcriptie via PCR (figuur 2B; reactie 1). Bij deze PCR-stap wordt de T7-promotor toegevoegd aan het 5'-uiteinde van het zintuig DNA-molecuul32,33,43,50. Stel de PCR-reactie in volgens tabel 1. Voer de PCR uit in aliquots van 50 μL met de juiste cycli in de thermocycler.
  3. Bereid de handgrepen voor door twee afzonderlijke PCR-reacties (tabel 1, figuur 2B; reactie 2 en 3). Genereer eerst de 5'-handgreep met PCR. Genereer vervolgens het 3'-handvat en label het tegelijkertijd met digoxigenine met behulp van een 5'-digoxigenine-gelabelde primer32,33,43,50.
  4. Zuiver na de PCR het DNA met behulp van silica spin kolommen.
  5. Voer de in vitro transcriptiereactie uit met behulp van T7 RNA polymerase (Tabel 2)32,33,43,50. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 2-4 uur, afhankelijk van de lengte van het RNA. Voeg vervolgens DNase I toe aan de reactie en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten om het DNA-sjabloon te verteren. Zuiver het RNA met behulp van silica spin kolommen.
  6. Voeg tijdens de etiketteringsreactie van de 5'-handgreep (tabel 3) biotine-16-dUTP toe aan het 3'-uiteinde van het handvat door T4 DNA-polymerase38,50. Voer de reactie uit bij kamertemperatuur gedurende 1-2 uur. Zuiver daarna het DNA met behulp van silica spin kolommen.
    OPMERKING: Aangezien de 5'-handgreep aan het uiteinde van 3' moet worden gelabeld (figuur 2B), kan de etikettering niet worden uitgevoerd tijdens de PCR.
  7. Meng de bovengenoemde componenten - 5'-handvat (3'gelabeld met biotine), 3' handvat (5' gelabeld met digoxigenine) en RNA - in een molaire verhouding van 1:1:1 in gloeibuffer (80% formamide, 400 mM NaCl, 40 mM HEPES, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, pH 8), om de gewenste RNA/DNA-hybride te verkrijgen (tabel 4). Verwarm het gloeimengsel gedurende 10 minuten tot 85 °C en koel vervolgens langzaam af tot 4 °C.
  8. Meng het gegloeide monster met 1/10 volume van 3 M natriumacetaat (pH 5), 3 volumes ijskoude ethanol en incubeer bij -80 °C gedurende ten minste 1 uur of bij -20 °C gedurende één nacht.
  9. Centrifugeer de monsters bij 15.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Gooi het bovennatuurlijke middel weg en droog de pellet (meestal niet zichtbaar) onder vacuüm.
  10. Tot slot resuspend, de pellet in 50 μL RNase-vrij water en maak aliquots. Bewaar de aliquots bij -80 °C tot ze gebruikt zijn. Voor opslag op korte termijn kunnen de monsters ook bij -20 °C worden bewaard.

2. Instrument instellen

OPMERKING: Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het commerciële optische pincetinstrument C-Trap van LUMICKS company. Daarom kunnen aanpassingen aan de gepresenteerde stappen nodig zijn tijdens het gebruik van andere optische pincetten. Indien niet gebruikt, wordt het microfluïdicasysteem van de machine bewaard in bleekmiddel (natriumhypochlorietoplossing) en moet het vóór gebruik worden gewassen.

  1. Gooi het bleekmiddel weg en vul de spuiten met 1 ml RNase-vrij water.
  2. Voeg 50 μL 0,5 M natriumthiosulfaat toe aan ten minste 1 ml RNase-vrij water en was het systeem grondig (1 bar, ten minste 0,5 ml) om het resterende bleekmiddel in het systeem te verwijderen.
  3. Gooi de natriumthiosulfaatoplossing uit de spuiten weg. Vervang spuiten door nieuwe en was het systeem met ten minste 0,5 ml RNase-vrij water.
    OPMERKING: Wees voorzichtig dat het microfluïdicasysteem nooit droogvalt om luchtbellen in het systeem te voorkomen.
  4. Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,33) of ongeveer 70 μL water bovenop het objectief.
  5. Plaats de stroomcel in het houderframe op zijn plaats.
  6. Leg 2 druppels dompelolie (brekingsindex van 1,51) op de stroomcel.
  7. Schakel het laserapparaat in het pincet in. Zodra het actief is, schakelt u de overvullaser in de software-interface op 100% in.
  8. Stel met behulp van diagnosecamera's (Z-finder) de Z-as in het midden van de kamer tussen de tweede en de derde reflecties (interfaces) waar de brekingsringen het grootst zijn, door aan de microschroef te draaien.
    OPMERKING: Telkens wanneer het objectief dichter bij de meetkamer wordt geplaatst en het brandpuntsvlak van het objectief het raakvlak tussen twee fasen kruist, kan een reflectie worden herkend in de Z-finder-modus. Er zijn 4 interfaces mogelijk: (i) water/dompelolie en bodemglas (ii) bodemglas en buffer in de kamer (iii) buffer in de kamer en bovenglas (iv) bovenglas en dompelolie voor condensor.
  9. Stel de condensorpositie in (stel de vanglaser in op ongeveer 50%), zodat de condensor de dompelolie bovenop de meetkamer raakt.
  10. Pas de scherpstelling aan door langzaam naar beneden/omhoog te bewegen met de condensor, zodat er in de maanmodus ca. 10 lichtbanden worden getoond (diagnosecamera's).

3. Monstermeting

  1. Incubeer anti-digoxigenine-gecoate kralen (AD) met de monsterconstructies (3 μL van 0,1% (w/v) AD-kralsuspensie + 4 μL monster) en met 1 μL RNase-remmers en 8 μL van de testbuffer (300 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7,6, 0,05% Tween 20, 5 mM DTT) bij RT gedurende 10-20 min. Verdun het monster na de incubatie in 500 μL testbuffer.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om zuurstofvangers, met name tijdens fluorescentiemetingen, aan de buffer toe te voegen om oxidatieve schade te voorkomen. Hier werd een zuurstofafvoersysteem gebruikt dat glucose (8,3 mg / ml), glucoseoxidase (40 E / ml) en catalase (185 U / ml) bevatte.
  2. Meng 0,8 μL van 1% (w/v) streptavidin-gecoate (SA) kralen met 1 ml assaybuffer.
  3. Gooi water uit de spuiten weg en vul de spuiten met de respectievelijke suspensies/oplossingen. Was minstens 2 minuten op ongeveer 1 bar en begin dan met het vangen van kralen.
    OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele opstelling kunnen verschillende kanaalopstellingen worden gebruikt (figuur 3). Meestal is één stroomkanaal gevuld met anti-digoxigenineparels die het RNA-molecuul dragen. Een tweede kanaal is gevuld met de streptavidin-gecoate kralen. Bufferkanaal wordt gebruikt om de tethers te vormen. Een vierde kanaal kan worden gebruikt om het RNA-bindende eiwit te laden (figuur 3C), of als alternatief kan RBP direct in het bufferkanaal worden toegevoegd (figuur 3B).
  4. Om de kralen vast te leggen, verplaatst u de optische vallen uit elkaar. Ga eerst naar het AD-kanaal en vang een AD-kraal in val 1. Verplaats vervolgens het werkgebied naar het SA-kanaal en vang een enkele SA-kraal met val 2.
    OPMERKING: Probeer op de interface van de buffer- en kralenkanalen te blijven om te voorkomen dat u de reeds gevangen kraal verliest of om te voorkomen dat u meerdere kralen vangt door dezelfde val.
  5. Zodra de kralen van de juiste grootte zijn opgevangen, gaat u naar het bufferkanaal en stopt u de laminaire stroom. Voer vervolgens krachtkalibratie uit om de stijfheid van de val te controleren. De respectieve stijfheidswaarden mogen in de x/y-as niet meer dan 10-15% verschillen.
    OPMERKING: Pas het laservermogen of de lasersplitsing tussen de vallen aan op basis van de grootte van de kraal. Krachtkalibratie hoeft niet voor elk kralenpaar te worden uitgevoerd zolang de kraalsjablonen overeenkomen (gelijkenisscore > 0,9). Het moet echter regelmatig worden uitgevoerd, of op zijn minst elke keer dat de testomstandigheden worden gewijzigd.
  6. Begin met vissen naar een tether door de kralen dicht bij elkaar te bewegen, een paar seconden te wachten en ze vervolgens weer uit elkaar te bewegen, herhaal totdat er een tether is gevormd. Een tetherformatie resulteert in een toename van de gemeten kracht bij het van elkaar wegtrekken van de twee kralen.
    OPMERKING: Om de vorming van meerdere tethers te voorkomen, mogen de kralen niet te dicht worden verplaatst. Bij het vangen van een tether tussen de twee kralen, kan de tetherkwaliteit worden gecontroleerd door het overstretching plateau te vinden. Het plateau moet tussen de 50 en 60 pN zijn voor een enkele tether.
  7. Na het verkrijgen van een tether, start u de meting. Afhankelijk van het bestudeerde fenomeen moeten verschillende meetopstellingen worden gekozen (figuur 1B-D).
    OPMERKING: Meestal wordt aan het begin van het experiment een force-ramp-experiment uitgevoerd om de tetherkwaliteit te controleren en het gedrag te onderzoeken. Daarna kan men ook beginnen met de experimenten met constante kracht of constante positie om de toestandsovergangen verder te bestuderen. Zodra er voldoende metingen zijn uitgevoerd op een RNA-monster om het gedrag ervan te bepalen, kunnen gelabelde factoren aan het systeem worden toegevoegd om confocale metingen uit te voeren.
  8. Om fluorescentiemetingen uit te voeren, schakelt u de confocale lasers en fotonentellereenheid in het optische pincet in.
  9. Schakel de excitatielaser van de gewenste golflengte in de software-interface in en stel het vermogen van de laser in op 5% of hoger, afhankelijk van de fluorofoor.
    OPMERKING: Verlaag, terwijl u niet meet, verlaagt u de vermogensinstelling van de excitatielaser tot 0% om overmatige fotoschade aan het monster te voorkomen.
  10. Begin met het in beeld brengen van het monster met behulp van de beeldfuncties van de software.
    OPMERKING: Om goed gefocuste beelden te krijgen, moeten het brandpuntsvlak van de confocale microscoop en optische vallen worden uitgelijnd. Hiervoor kan autofluorescentie van de polystyreenparels in het blauwe laserkanaal worden gebruikt. Het brandpuntsvlak van optische vallen wordt omhoog of omlaag bewogen in de z-as totdat het beeld van kralen zijn hoogste diameter bereikt. Op deze positie kan het fluorescentiesignaal van het molecuul dat tussen de kralen is vastgebonden, worden gemeten.
  11. Als u de kymograaffunctie wilt gebruiken, geeft u de x-y-positie van de kymograafas op, zodat de tether tussen de kralen kan worden gedetecteerd.
  12. Gedurende de meting kan de buffersamenstelling eenvoudig worden gewijzigd door de kralen naar verschillende kanalen te verplaatsen of door de buffer in het microfluïdicasysteem te veranderen.

4. Data-analyse

  1. Voorbewerking van onbewerkte gegevens
    1. Door een eenvoudig script te gebruiken, kunt u de onbewerkte gegevens voldoende downsamplen om (i) een snellere daaropvolgende gegevensverwerking mogelijk te maken, maar (ii) nog steeds alle kritieke informatie te bevatten (figuur 4A). Meestal is 100-5000 Hz geschikt voor dit doel.
      OPMERKING: De frequentie voor het verzamelen van gegevens in experimenten met optische pincetten is vaak hoger dan nodig is voor de analyse - in de gepresenteerde experimenten is de frequentie voor het verzamelen van gegevens standaard ingesteld op 78 125 Hz. Omdat de opslagruimte beperkt is, is het handig en tijdbesparend om de bemonsteringsfrequentie van de gegevens te verminderen. Hier werden de ruwe gegevens met een factor 30 gedownsampled.
    2. Gebruik vervolgens een signaalfilter om de hoogfrequente meetruis van het signaal te verminderen (figuur 4A). Pas de parameters van de filtergraad en de afkapfrequentie dienovereenkomstig aan om de gegevensuitvoer van verschillende experimenten te optimaliseren (figuur 5).
      OPMERKING: Onder de signaalfilters is Butterworth filter51 een van de meest gebruikte. Een op maat geschreven python-script dat de voorverwerking van onbewerkte gegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Downsampling- en signaalfilterparameters (afkapfrequentie, filtergraad) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.
  2. Voer de volgende stappen uit voor de analyse van force-rampgegevens.
    1. Markeer de stappen handmatig door overeenkomstige punten op de krachttrajectplot te vinden of door aangepaste scripts te gebruiken. Ontvouwende stappen worden gekenmerkt door een plotselinge daling van de kracht in combinatie met een toename van de afstand in de kracht-afstand (FD) curve.
    2. Zodra ontvouwende gebeurtenissen zijn gemarkeerd, past u verschillende gebieden van de FD-curve aan met behulp van geschikte modellen (figuur 4D).
      OPMERKING: Voor het gebied vóór de eerste ontvouwende stap kan de tether als "dubbelstrengs" worden beschouwd en wordt deze gewoonlijk geschikt met behulp van een uitbreidbaar Worm-like-chain-model (WLC) 47,52,53. De delen na de eerste ontvouwende gebeurtenis worden beschouwd als een combinatie van dubbelstrengs nucleotiden (handvatten) en enkelstrengs nucleotiden (ongevouwen RNA-molecuul). Daarom is datafitting complexer - meestal wordt een combinatie van 2 WLC-modellen of WLC- en Free-jointed chain (FJC) -modellen gebruikt36,39,52. Het uitbreidbare WLC-model heeft twee belangrijke pasvormparameters: contourlengte (LC) en de persistentielengte (LP). Contourlengte komt overeen met de lengte van het volledig uitgerekte molecuul en persistentielengte definieert de buigeigenschappen van het betreffende molecuul. Het model kan worden beschreven met de volgende vergelijking (1). WLC kan worden gebruikt om het gedrag van zowel gevouwen als uitgevouwen gebieden te modelleren, hoewel voor elk van deze een afzonderlijk model met verschillende parameters moet worden gebruikt.
      (1) Equation 1
      waarbij x extensie is, LC contourlengte, F kracht, LP persistentielengte, kB Boltzmannconstante, T thermodynamische temperatuur en S rekmodulus.
      Het tweede model genaamd Freely-jointed chain (FJC) wordt vaak gebruikt om het gedrag van ongevouwen enkelstrengsregio's te beschrijven. Het gebruikt vergelijkbare parameters van de polymeren, maar behandelt elke eenheid van de "keten" als een stijve staaf, hier overeenkomend met de nucleotiden van het ontvouwde enkelstrengsgebied. De volgende vergelijking (2) beschrijft dit model:
      (2) Equation 2
      OPMERKING: Ons lab heeft onlangs een algoritme ontwikkeld dat batchverwerking van de ruwe force-ramp-gegevens mogelijk maakt, genaamd "Practical Optical Tweezers Analysis TOol (POTATO)54." Het algoritme downsamples en filtert de gegevens, identificeert vervolgens mogelijke ontvouwende stappen en voert ten slotte gegevensaanpassing uit. De POTATO is gebouwd in een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) (https://github.com/REMI-HIRI/POTATO).
  3. Verwerk gegevens met constante kracht als volgt:
    OPMERKING: De volgende instructies kunnen analoog worden toegepast op gegevens met een constante positie.
    1. Voor de gegevens over de constante kracht plot u de afstand in de tijd (figuur 5). Een histogram dat de frequentie (tellingen) van verschillende conformaties over de relatieve positieverandering weergeeft, is een nuttige manier om verschillende dominante en secundaire toestanden te karakteriseren (figuur 7).
    2. Monteer het histogram met behulp van (meerdere) Gaussische functies om het totale percentage individuele conformers bij een bepaalde kracht te schatten (figuur 7C). De Gaussische pasvorm, gemiddelde positie en de standaarddeviatie schetst de krachtgerelateerde relatie tussen verschillende populaties.
      OPMERKING: Een op maat geschreven python-script dat voorbewerking en basis bimodale Gaussiaanse aanpassing van constante krachtgegevens mogelijk maakt, wordt verstrekt in de aanvullende gegevens. Parameters (afkapfrequentie, filtergraad, verwachte gemiddelden, standaarddeviatiewaarden en amplitudes) moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende experimenten.
    3. Gebruik vervolgens het Hidden Markov-model om de toestanden verder te analyseren, wat extra vouwtussenproducten (conformers) kan blootleggen55. Voor meer informatie over het constante kracht en Hidden Markov model kan men verwijzen naar 55,56,57,58.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In deze sectie wordt voornamelijk aandacht besteed aan metingen van RNA-eiwit/ligand interacties door het fluorescentie optische pincet. Voor een beschrijving van algemene RNA optische pincet experimenten en bijbehorende representatieve resultaten, zie32. Voor meer gedetailleerde bespreking van de RNA/DNA-eiwit interacties, zie ook1,2,26,59,60.

In principe stabiliseert, destabiliseert of kan binding van een RBP of een andere trans-acterende factor van belang op het RNA de conformatie van het molecuul stabiliseren, destabiliseren of veranderen. Hieronder wordt een afbeelding van de mechanische waarneembare voor elk effect getoond. Het werkelijke effect dat wordt waargenomen voor een bepaald RNA-eiwitcomplex is echter niet beperkt tot deze onderstaande scenario's.

Stabilisatie
De RNA-structuur kan specifiek worden herkend en gebonden door het eiwit of andere liganden45,61,62,63,64. De vorming van de bindingen gaat gepaard met een afgifte van energie. Daarom moet een extra energetische barrière worden overwonnen om de gegeven RNA-structuur te ontvouwen. Als gevolg hiervan kan een toename van de gemiddelde ontvouwende kracht worden waargenomen50,65. De stabilisatie van de RNA-structuur door binding van een extern agens (eiwit, klein molecuul, andere trans-acterende factoren) kan ook resulteren in een verandering van de vouwkinetiek van de structuur45. Daarvoor kunnen verdere metingen worden uitgevoerd in de constante-krachtmodus, waarbij minder frequente overgangen tussen de vouwtussenproducten en krachtverschuiving in het evenwicht kunnen worden waargenomen.

Destabilisatie
Sommige eiwitten herkennen bepaalde sequentiemotieven in plaats van specifieke RNA-structuren. De bindingsplaatsen kunnen variëren van een zeer specifiek motief tot een meer algemeen patroon zoals GC- of AU-rijke stretches60,66. Niettemin, als het eiwit zich bij voorkeur bindt aan de ongevouwen enkelstrengs RNA-conformatie, kan het evenwicht tussen de gevouwen en ontvouwde toestand worden verschoven naar de ongevouwen toestand36,43,67. In figuur 6 en figuur 7 zijn voorbeelden van dergelijk gedrag weergegeven.

Structuurwijziging
In sommige gevallen kunnen RFP's (of andere liganden) beide hierboven genoemde mechanismen zodanig combineren dat de RBP de voorheen dominante conformatie destabiliseert en het evenwicht verschuift naar een alternatieve RNA-structuur44,68,69. De overgang naar een alternatieve toestand kan leiden tot een verandering in de waargenomen conformatiepopulatiefrequenties en het optreden of verdwijnen van individuele vouwtoestanden. Deze veranderingen kunnen voor het eerst worden waargenomen in force-ramp experimenten en kunnen verder worden onderzocht door de constant-force (of constant-positie) experimenten.

Effect van de trans-acterende factor op RNA vouwing/ontvouwen
Hier werd een RNA-sequentie bestudeerd die overeenkomt met het -1 geprogrammeerde ribosomale frameshifting-element van SARS-CoV-2. Dit RNA-element zal naar verwachting een H-type pseudoknot70,71 vormen. In het voorbeeld van kracht-afstandstrajecten ontvouwt en hervouwt het RNA zich in twee opeenvolgende stappen (figuur 6A). Deze twee stappen komen waarschijnlijk overeen met de twee stengellussen die de voorwaarde zijn voor de pseudoknotvorming. In dit geval werd de pseudoknot ook niet waargenomen omdat het RNA niet volledig vouwde of een alternatieve structuur vormde die concurreerde met de pseudoknot. Na toevoeging van de trans-acterende factor ZAP werd een plotselinge verdwijning van de hervouwgebeurtenissen en een enorme hysterese waargenomen (figuur 6B)43. Dit suggereert dat het eiwit zich bindt aan de enkelstrengstoestand van het RNA, waardoor de vorming van secundaire structuren wordt belemmerd. Bovendien bevestigen experimenten met constante kracht de resultaten van force-ramp experimenten. Dienovereenkomstig, terwijl het RNA volledig is gevouwen bij ongeveer 10 pN (figuur 7A), verschuift de aanwezigheid van het eiwit de hervouwing naar lagere krachten, en bij 10 pN bezet het RNA nog steeds grotendeels de uitgevouwen toestand (figuur 7B).

OT-metingen gekoppeld aan confocale microscopie
Vervolgens worden voorbeeldige resultaten getoond voor de niet-specifieke en specifieke binding van verschillende fluoroforen en gelabelde ribosomen (figuur 8). In het eerste voorbeeld werd SYTOX Green dye gebruikt om de tethered DNA / RNA-hybride te labelen. Bij toenemende kracht is de kleurstofbinding overvloediger, wat resulteert in een hoger fluorescentiesignaal. Zodra de kracht te hoog is, breekt de tether en gaat het fluorescentiesignaal verloren (figuur 8A). Voor de experimenten met bacteriële ribosomen (figuur 8B) werd niet-specifieke etikettering van de lysineresiduen gebruikt met behulp van N-hydroxysuccinimide (NHS) geconjugeerd tot een rode fluorescerende kleurstof. Hoewel er een risico is op het verminderen van de activiteit van gelabeld eiwit / complex, is het grote voordeel dat een sterker signaal wordt bereikt omdat elk ribosoom (gemiddeld) wordt gelabeld door meerdere fluoroforen. Het RNA-construct bevatte een ribosoombindingsplaats (RBS) herkend door bacteriële ribosomen, die in de 5'-nabijheid van de bestudeerde RNA-sequentie werd geplaatst. Bij binding van de ribosomen wordt het fluorescentiesignaal waargenomen op de tether. Fluorescentiegegevens kunnen verder worden geanalyseerd met behulp van beeldanalysetools72 en de resultaten kunnen worden gecombineerd met de krachtgegevens, waardoor vouwovergangen kunnen worden bestudeerd.

Figure 1
Figuur 1: Schematiek van het OT-experiment en mogelijke meetbenaderingen. (A) Schema ter illustratie van de optische pincet experimenten met het SARS-CoV-2 frameshifting RNA in het midden. RNA wordt gehybridiseerd naar ssDNA-handvatten en geïmmobiliseerd op kralen. Deze worden gebruikt om trekkracht uit te oefenen op het RNA met een gerichte laserstraal. De kracht wordt geleidelijk opgevoerd totdat het RNA zich ontvouwt (bodem). (B) Schema van confocale microscopie in combinatie met een optisch pincet om de binding van gelabelde factor aan RNA te controleren. (C) Voorbeeldgegevens over constante kracht kunnen worden verkregen door de kracht in de loop van de tijd op een constante waarde te fixeren, waardoor de verblijftijd van de conformers nauwkeurig kan worden gemeten. (D) Voorbeeld van een krachtafstandscurve (FD), verkregen uit een force-rampmeting. De ontvouwende stap wordt waargenomen als een plotselinge breuk in het FD-profiel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Een algemeen schema van OT-monstersynthese. (A) Voorbeeldsequentie en voorspelde secundaire structuur van het bestudeerde SARS-CoV-2 frameshifting RNA dat in de studie werd gebruikt. (B) Een vector die de sequence of interest (SoI) bevat, geflankeerd door twee handvatgebieden, dient als sjabloon voor het genereren van het DNA/RNA-construct in 3 PCR-reacties. Primers worden afgebeeld en genummerd in het schema volgens hun bindingsplaatsen in de overeenkomstige PCR. PCR 1 levert de in vitro transcriptiesjabloon op, die vervolgens wordt gebruikt voor de in vitro transcriptie (IVT) reactie om het lange RNA-molecuul (lichtblauw) te genereren. PCR 2 levert het 5' handvat op, dat later 3' wordt gelabeld met biotine. PCR 3 met behulp van de voorwaartse primer geconjugeerd aan digoxigenine produceert de 3 'digoxigenine-gelabelde handgreep. Ten slotte worden de twee handvatten en het RNA gegloeid om een DNA / RNA hybride construct te geven dat geschikt is voor optische pincetmetingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Illustratie van verschillende microfluïdische kanaalopstellingen. (A) Een schema van de stroomcel met 5 microfluïdische kanalen. (B) en (C) zijn de zoom-ins van het rood-onderbroken gebied van (A). (B) Een eenvoudige 3-kanaals opstelling met AD-kralen en SA-kralen in respectievelijk kanaal 1 en 3. Factor is te vinden in kanaal 2. Deze opstelling is geschikt voor stabiele eiwitten met een hoge affiniteit, dus een lage concentratie heeft de voorkeur om een lage fluorescerende achtergrond te garanderen. De kraalkanalen aan de zijkant maken een vaste tetheroriëntatie en snelle rekrutering van nieuwe kralen mogelijk indien nodig. (C) 4-kanaals setup met Factor in kanaal 4. Een dergelijke regeling is met name voordelig voor een minimaal monsterverbruik. De meting kan direct in kanaal 4 worden uitgevoerd. Als alternatief, om achtergrondfluorescentiesignaal te voorkomen, kan het complex worden gevormd in kanaal 4 en vervolgens kan de meting worden uitgevoerd in kanaal 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Data-analyseworkflow voor force-ramp experimenten. (A) Stroomdiagram van de gegevensanalyseworkflow. De onbewerkte gegevensbestanden worden eerst gedownsampled en gefilterd, vervolgens worden stappen gemarkeerd en worden de afzonderlijke statussen aangepast aan het bijbehorende model. (B) De ruwe gegevens bevatten een aanzienlijke hoeveelheid ruis, die de identificatie van ontvouwende/hervouwgebeurtenissen belemmert. Ook is in de meeste experimenten de frequentie van gegevensverzameling hoger dan nodig. (C) Daarom worden downsampling en signaalfiltratie gebruikt om het gegevensprofiel glad te strijken. (D) De verwerkte curven worden uiteindelijk aangebracht met behulp van het WLC-model wanneer het molecuul zich nog in de gevouwen toestand bevindt (vóór de zich ontvouwende gebeurtenis), een combinatie van de WLC met FJC-modellen of een tweede WLC-model wanneer het molecuul zich in een uitgevouwen toestand bevindt (na de zich ontvouwende gebeurtenis). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Het effect van cut-off-frequentie op data output. Hoewel de ruwe gegevensuitvoer kan worden belast met signaalruis (boven), is het cruciaal om de juiste signaalfiltratieparameters voor gegevensanalyse te kiezen. Hoewel een goede filtratie zou helpen bij de identificatie van vouwtussenproducten (afkapfrequentie 0,1, midden), kan overfiltratie (afkapfrequentie <0,001, bodem) leiden tot verlies van resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Voorbeeld FD trajecten bij afwezigheid en aanwezigheid van ZAP. (A) Ontvouwen (roze) en hervouwen (blauw) sporen van het SARS-CoV-2 RNA in afwezigheid van ZAP. Het monster toont gemakkelijk hervouwen met slechts kleine hysterese. (B) Ontvouwen (roze) en hervouwen (blauw) sporen van het RNA in aanwezigheid van transfactor ZAP (400 nM). Het monster vertoont een enorme hysterese, wat suggereert dat het eiwit zich bindt aan het enkelstrengs RNA en voorkomt dat het opnieuw wordt gevouwen. (C) Een staafdiagram met het aantal stappen die zich ontvouwen (roze) en opnieuw vouwen (blauw) bij afwezigheid of aanwezigheid van ZAP. Hoewel de verdeling van de zich ontvouwende stappen bijna onaangetast blijft door de aanwezigheid van ZAP, is er een duidelijke daling van het aantal hervouwstappen met ZAP. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Voorbeeld van gegevens over constante kracht bij afwezigheid en aanwezigheid van ZAP. (A) Gegevens over constante kracht verkregen bij krachten variërend van 10 (tot) tot 13 (onderste) pN die de verschuiving laten zien van volledig gevouwen toestand naar volledig uitgevouwen toestand van het SARS-CoV-2 frameshifting RNA-element. Elke grafiek bevat de positie versus tijd (links) en een histogramplot (rechts). (B) Gegevens over constante kracht verkregen in aanwezigheid van ZAP (400 nM). Bij eiwitbinding is de herplooiing verminderd. Bij 10 pN, in tegenstelling tot RNA alleen, bestaat in de aanwezigheid van ZAP RNA meestal in de ongevouwen toestand. Daarom is een verschuiving in de evenwichtskracht naar lagere krachten aangegeven. (C) Het histogram van positiegegevens kan worden geanalyseerd door de gegevens aan te passen aan Gaussische functies om de relatieve abundantie van elke toestand op te leveren (afgeleid van het gebied onder de curve voor elke toestand). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: OT gecombineerd met confocale microscopie. (A) Een voorbeeld kymograaf van de SYTOX Green gelabelde tether (links). Let op de toename van de signaalintensiteit bij toenemende krachten. De zwarte pijl markeert de tetherbreukgebeurtenis, wat leidt tot signaalverlies. Afbeelding van de tether met kleurstof eraan gebonden (Binding) en na breuk zonder kleurstof (Geen signaal) (rechts). (B) Voorbeeld kymograaf van specifieke binding van het ribosoom op het mRNA (links). De bindingsgebeurtenis kan worden waargenomen als een fluorescentiesignaal op het vastgebonden RNA tussen de twee kralen. Afbeelding van tether zonder (Geen signaal) en met fluorescentie-gelabelde ribosomen gebonden (Binding) (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Voorraad concentratie Eindconcentratie Volume
Reactie volume - - 500 μL
10× buffer 10× 1× 50 μL
dNTP-mix 10 meter 0,2 mM 10 μl
High fidelity DNA polymerase 1,25 U/μL 0,025 u/μl 10 μl
Primer 1 Zoekertjes 10 μM 0,4 μM 20 μL
Primer 2 Zoekertjes 10 μM 0,4 μM 20 μL
Sjabloon 100 ng/μL 1 ng/μl 5 μl
Water - - 385 μL

Tabel 1: Pipetteerschema voor de PCR om de optische pincetconstructies te genereren.

Voorraad concentratie Eindconcentratie Volume
Reactie volume - - 300 μL
5× buffer 5× 1× 60 μl
rNTP-mix 25 meter 5 meter 60 μl
RNase-remmer 40 u/μl 0,7 U/μL 5 μl
Pyrofosfatase 100 U/ml 1,7 mU/μL 4 μl
DTT 100m 3,3 mM 10 μl
T7 RNA polymerase 50 u/μl 3,3 U/μL 20 μL
Sjabloon 120 ng/μl 2 ng/μL 5 μl
Water - - 136 μL

Tabel 2: Pipetteerschema voor in vitro transcriptie.

Voorraad concentratie Eindconcentratie Volume
Reactie volume - - 100 μL
10× buffer (NEB 2.1) 10× 1× 10 μl
BSA 1 μg/ml 100 ng/μL 1 μl
Biotine-16-dUTP 1mm 50 μM 5 μl
T4 DNA polymerase 30 u/μl 1,5 u/μl 5 μl
DNA 5' handvat (20-60 μg) 300 ng/μl 237 ng/μl 79 μL

Tabel 3: Pipetteerschema voor 3' eindbiotine-etikettering.

Voorraad concentratie Eindconcentratie Eindbedrag Volume
Reactie volume - - - 300 μL
Gloeibuffer 1.25× 1× - 240 μl
RNase-remmers 40 u/μl 0,5 U/μL - 5 μl
5 'gebiotinyleerd DNA handvat 300 ng/μl 10 ng/μl 3 μg 10 μl
3' DNA handvat 300 ng/μl 10 ng/μl 3 μg 10 μl
RNA 150 ng/μl 10 ng/μl 3 μg 20 μL
Water - - - 5 μl

Tabel 4: Pipetteerschema voor het gloeien van de optische pincetconstructie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier demonstreren we het gebruik van fluorescentie-gekoppelde optische pincetten om interacties en dynamisch gedrag van RNA-moleculen met verschillende liganden te bestuderen. Hieronder worden kritische stappen en beperkingen van de huidige techniek besproken.

Kritieke stappen in het protocol
Zoals voor veel andere methoden is de kwaliteit van het monster van cruciaal belang om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom, om monsters van de hoogst mogelijke kwaliteit te verkrijgen, is het de moeite waard om tijd te besteden aan het optimaliseren van de procedure voor monstervoorbereiding. De optimalisatiestappen omvatten een goed primerontwerp, gloeitemperaturen, RNA en eiwitzuiveringsstappen.

Gedurende het hele experiment is het gebruik van gefilterde tips en oplossingen cruciaal om RNase-vrije omstandigheden te behouden. Bovendien wordt het microfluïdicasysteem in bleekmiddel gehouden wanneer het niet in gebruik is. Voordat u met metingen begint, is het belangrijk om het systeem goed te wassen met natriumthiosulfaat en RNase-vrij water om het bleekmiddel uit het systeem te verwijderen.

In het geval dat tijdens het hele experiment kralen van dezelfde grootte worden gebruikt, is het niet nodig om elke keer krachtkalibratie uit te voeren. Niettemin moeten regelmatig krachtkalibratiecontroles worden uitgevoerd op de reproduceerbaarheid van experimenten.

Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Fluorofoorstabiliteit en fotobleaching
Een complicatie bij fluorescentiemetingen is fotobleaching. Aangezien het tijdsbestek om de translatie te controleren afhankelijk van het systeem kan worden verlengd van seconden tot minuten, moet ook fotobleaching tijdens de metingen worden overwogen en zoveel mogelijk worden geminimaliseerd73. Een optie is om stabielere fluoroforen te gebruiken, die minder vatbaar zijn voor fotobleaching, zoals onlangs geïntroduceerde quantum dots49,74,75. Verdere stabiliteit wordt ook bereikt door zuurstofmoleculen te verwijderen met behulp van een "zuurstofaase" -systeem, zoals glucoseoxidase in combinatie met catalase. Glucoseoxidase verwijdert zuurstof uit de omgeving door het om te zetten in waterstofperoxide, dat vervolgens wordt afgebroken door catalase. Alternatieve zuurstofafvoersystemen kunnen ook worden gebruikt76,77.

Microfluïdica
Het handhaven van een continue laminaire stroming is essentieel voor een goede meting. Het belangrijkste is dat het systeem nooit droog mag lopen. Helaas zijn RFP's of andere trans-acterende factoren van belang vaak alleen in kleine volumes beschikbaar voor de experimenten, daarom kan het handhaven van een continue stroom een uitdaging en kostenintensief zijn. Als er tijdens het aanbrengen van het monster luchtbellen in het systeem worden gebracht, is handmatige druk of ethanolwas meestal voldoende om ze te verwijderen.

Beperkingen van de methode
Combinatie van OT met confocale microscopie brengt ook enkele beperkingen met zich mee. Ten eerste moet het brandpuntsvlak van de confocale eenheid goed worden uitgelijnd met valcentra om een goede registratie van het fluorescentiesignaal mogelijk te maken. Bovendien zijn voor confocale metingen meestal handvatten van ten minste 2 kb op elke locatie nodig17. Hoewel in principe het gebruik van langere handgrepen mogelijk is, moet men rekening houden met de energiebijdrage van de handgrepen en de verandering in de persistentielengte voor de nauwkeurigheid van gegevensanalyse78. Een ander cruciaal punt is dat de zuurstofvangers, die worden gebruikt om de halfwaardetijd van de fluoroforen te verlengen, ook leiden tot relatief snelle veranderingen in de pH van de oplossingen76. Deze veranderingen kunnen gedeeltelijk worden gecompenseerd door de concentratie van de bufferverbinding te verhogen; tijdens de metingen moeten de monsters echter regelmatig worden aangevuld (elke 30-60 minuten) om consistente omstandigheden tijdens het experiment te garanderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

We bedanken Anuja Kibe en Jun. Prof. Redmond Smyth voor het kritisch beoordelen van het manuscript. Wij danken Tatyana Koch voor de deskundige technische bijstand. We bedanken Kristyna Pekarkova voor de hulp bij het opnemen van experimentele video's. Het werk in ons laboratorium wordt ondersteund door de Helmholtz Association en financiering van de European Research Council (ERC) Grant Nr. 948636 (to NC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial Strains
E. coli HB101 lab collection N/A cloning of the vectors
Chemicals and enzymes
Sodium chloride Sigma-Aldrich 31424 Buffers
Biotin-16-dUTP Roche 11093070910 Biotinylation
BSA Sigma-Aldrich A4737 Buffers
Catalase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
Dithiothreitol (DTT) Melford Labs D11000 Buffers
DNAse I from bovine pancreas Sigma-Aldrich D4527 in vitro transcription
dNTPs Th.Geyer 11786181 PCR
EDTA Sigma-Aldrich E9884 Buffers
Formamide Sigma-Aldrich 11814320001 Buffers
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG Oxygen scavanger system
Glucose-oxidase Lumicks N/A Oxygen scavanger system
HEPES Carl Roth HN78.3 Buffers
Magnesium chloride Carl Roth 2189.1 Buffers
Phusion DNA polymerase NEB M0530L Gibson assembly, cloning
Potassium chloride Merck 529552-1KG Buffers
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase Takara Bio Clontech R050A PCR
Pyrophosphotase, thermostabile, inorganic NEB M0296L in vitro transcription
RNase Inhibitor Molox 1000379515 Buffers
rNTPS life technologies R0481 in vitro transcription
Sodium thiosulophate Sigma-Aldrich S6672-500G Bleach deactivation
Sytox Green Lumicks N/A confocal measurements
T4 DNA Polymerase NEB M0203S Biotinylation
T5 exonuclease NEB M0363S Gibson assembly, cloning
T7 RNA polymerase Produced in-house N/A in vitro transcription
Taq DNA polymerase NEB M0267S PCR
Taq ligase Biozym L6060L Gibson assembly, cloning
TWEEN 20 BioXtra Sigma-Aldrich P7949 Buffers
Kits
Monolith Protein Labeling Kit RED-NHS 2nd Generation (Amine Reactive) Nanotemper MO-L011 Used for ribosome labeling
Purefrex 2.0 GeneFrontier PF201-0.25-EX Ribosomes used for the labeling
Oligonucleotides
5' handle T7 forward Microsynth custom order 5’ - CTTAATACGACTCACTATAGGTC
CTTTCTGTGGACGCC - 3’, used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
3’ handle reverse Microsynth custom order 5' -  GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate OT in vitro transcription template in PCR 1
5' handle forward Microsynth custom order 5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , used to generate 5' handle in PCR 2
5’ handle reverse Microsynth custom order 5’ - CATAAATACCTCTTTACTAATATA
TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3’, used to generate 5' handle in PCR 2
3’ handle forward Microsynth custom order 5' - ATCCTGCAACCTGCTCTTCGCC
AG - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
3’ handle reverse 5’labeled with digoxigenin Microsynth custom order 5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', used to generate 3' handle in PCR 3
DNA vectors
pMZ_OT produced in-house N/A further description in "Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control"
Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley
bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035
Software and Algorithms
Atom https://atom.io/packages/ide-python N/A
Bluelake Lumicks N/A
Graphpad https://www.graphpad.com/ N/A
InkScape 0.92.3 https://inkscape.org/ N/A
Matlab https://www.mathworks.com/products/matlab.html N/A
POTATO https://github.com/lpekarek/POTATO.git N/A
RNAstructure https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html N/A
Spyder https://www.spyder-ide.org/ N/A
Other
Streptavidin Coated Polystyrene Particles, 1.5-1.9 µm, 5 ml, 1.0% w/v Spherotech SVP-15-5
Anti-digoxigenin Coated Polystyrene Particles, 2.0-2.4 µm, 2 ml, 0.1% w/v Spherotech DIGP-20-2
Syringes VWR TERUMO SS+03L1
Devices
C-trap Lumicks N/A  optical tweezers coupled with confocal microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balcerak, A., Trebinska-Stryjewska, A., Konopinski, R., Wakula, M., Grzybowska, E. A. RNA-protein interactions: disorder, moonlighting and junk contribute to eukaryotic complexity. Open Biology. 9 (6), 190096 (2019).
  2. Armaos, A., Zacco, E., Sanchez de Groot, N., Tartaglia, G. G. RNA-protein interactions: Central players in coordination of regulatory networks. BioEssays. 43 (2), 2000118 (2021).
  3. Firth, A. E., Brierley, I. Non-canonical translation in RNA viruses. Journal of General Virology. 93, Pt 7 1385-1409 (2012).
  4. Caliskan, N., Peske, F., Rodnina, M. V. Changed in translation: mRNA recoding by −1 programmed ribosomal frameshifting. Trends in Biochemical Sciences. 40 (5), 265-274 (2015).
  5. Jaafar, Z. A., Kieft, J. S. Viral RNA structure-based strategies to manipulate translation. Nature Reviews Microbiology. 17 (2), 110-123 (2019).
  6. Eswarappa, S. M., et al. Programmed translational readthrough generates antiangiogenic VEGF-Ax. Cell. 157 (7), 1605-1618 (2014).
  7. Rodnina, M. V., et al. Translational recoding: canonical translation mechanisms reinterpreted. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1056-1067 (2020).
  8. Li, Y., et al. Transactivation of programmed ribosomal frameshifting by a viral protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 2172 (2014).
  9. Napthine, S., et al. Protein-directed ribosomal frameshifting temporally regulates gene expression. Nature Communications. 8 (1), 15582 (2017).
  10. Patel, A., et al. Molecular characterization of the RNA-protein complex directing -2/-1 programmed ribosomal frameshifting during arterivirus replicase expression. Journal of Biological Chemistry. 295 (52), 17904-17921 (2020).
  11. Napthine, S., Bell, S., Hill, C. H., Brierley, I., Firth, A. E. Characterization of the stimulators of protein-directed ribosomal frameshifting in Theiler's murine encephalomyelitis virus. Nucleic Acids Research. 47 (15), 8207-8223 (2019).
  12. Marshall, R. A., Aitken, C. E., Dorywalska, M., Puglisi, J. D. Translation at the Single-Molecule Level. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 177-203 (2008).
  13. Rodnina, M. V. The ribosome in action: Tuning of translational efficiency and protein folding. Protein science : A publication of the Protein Society. 25 (8), 1390-1406 (2016).
  14. Rodnina, M. V., Fischer, N., Maracci, C., Stark, H. Ribosome dynamics during decoding. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 372 (1716), (2017).
  15. Yan, S., Wen, J. D., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosome excursions during mRNA translocation mediate broad branching of frameshift pathways. Cell. 160 (5), 870-881 (2015).
  16. Liu, T., et al. Direct measurement of the mechanical work during translocation by the ribosome. eLife. 3, 03406 (2014).
  17. Desai, V. P., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).
  18. Choi, J., O'Loughlin, S., Atkins, J. F., Puglisi, J. D. The energy landscape of -1 ribosomal frameshifting. Science Advances. 6 (1), (2020).
  19. Prabhakar, A., Puglisi, E. V., Puglisi, J. D. Single-molecule fluorescence applied to translation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (1), 032714 (2019).
  20. Bao, C., et al. mRNA stem-loops can pause the ribosome by hindering A-site tRNA binding. Elife. 9, 55799 (2020).
  21. Chen, J., Tsai, A., O'Leary, S. E., Petrov, A., Puglisi, J. D. Unraveling the dynamics of ribosome translocation. Current Opinion in Structural Biology. 22 (6), 804-814 (2012).
  22. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475 (7354), 118-121 (2011).
  23. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1044-1056 (2014).
  24. Blanchard, S. C. Single-molecule observations of ribosome function. Current Opinion in Structural Biology. 19 (1), 103-109 (2009).
  25. Juette, M. F., et al. The bright future of single-molecule fluorescence imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 20, 103-111 (2014).
  26. McCauley, M. J., Williams, M. C. Mechanisms of DNA binding determined in optical tweezers experiments. Biopolymers. 85 (2), 154-168 (2007).
  27. Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles. Optics Letters. 11 (5), 288-290 (1986).
  28. Bustamante, C., Smith, S. B., Liphardt, J., Smith, D. Single-molecule studies of DNA mechanics. Current Opinion in Structural Biology. 10 (3), 279-285 (2000).
  29. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23 (2019).
  30. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annual Reviews of Biochemistry. 77, 205-228 (2008).
  31. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA Unfolds and Refolds. Annual Review of Biochemistry. 77 (1), 77-100 (2008).
  32. Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. Nanomanipulation of single RNA molecules by optical tweezers. Journal of Visualized Experiments. (90), e51542 (2014).
  33. Halma, M. T. J., Ritchie, D. B., Cappellano, T. R., Neupane, K., Woodside, M. T. Complex dynamics under tension in a high-efficiency frameshift stimulatory structure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (39), 19500 (2019).
  34. Hansen, T. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B., Sørensen, M. A. Correlation between mechanical strength of messenger RNA pseudoknots and ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (14), 5830-5835 (2007).
  35. Zhong, Z., et al. Mechanical unfolding kinetics of the SRV-1 gag-pro mRNA pseudoknot: possible implications for -1 ribosomal frameshifting stimulation. Science Reports. 6, 39549 (2016).
  36. McCauley, M. J., Rouzina, I., Li, J., Núñez, M. E., Williams, M. C. Significant differences in RNA structure destabilization by HIV-1 GagDp6 and NCp7 proteins. Viruses. 12 (5), 484 (2020).
  37. de Messieres, M., et al. Single-molecule measurements of the CCR5 mRNA unfolding pathways. Biophysics Journal. 106 (1), 244-252 (2014).
  38. Yang, L., et al. Single-molecule mechanical folding and unfolding of RNA hairpins: Effects of single A-U to A·C pair substitutions and single proton binding and implications for mRNA structure-induced -1 ribosomal frameshifting. Journal of American Chemical Society. 140 (26), 8172-8184 (2018).
  39. McCauley, M. J., et al. Targeted binding of nucleocapsid protein transforms the folding landscape of HIV-1 TAR RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13555-13560 (2015).
  40. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. High-resolution "Fleezers": Dual-trap optical tweezers combined with single-molecule fluorescence detection. Methods in Molecular Biology. 1486, Clifton, N.J. 183-256 (2017).
  41. Yerramilli, V. S., Kim, K. H. Labeling RNAs in live cells using malachite green aptamer scaffolds as fluorescent probes. ACS Synthetic Biology. 7 (3), 758-766 (2018).
  42. Gross, P., Farge, G., Peterman, E. J., Wuite, G. J. Combining optical tweezers, single-molecule fluorescence microscopy, and microfluidics for studies of DNA-protein interactions. Methods in Enzymology. 475, 427-453 (2010).
  43. Zimmer, M. M., et al. The short isoform of the host antiviral protein ZAP acts as an inhibitor of SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting. Nature Communications. 12 (1), 7193 (2021).
  44. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A. N., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39 (17), 7677-7687 (2011).
  45. Ritchie, D. B., Soong, J., Sikkema, W. K., Woodside, M. T. Anti-frameshifting ligand reduces the conformational plasticity of the SARS virus pseudoknot. Journal of the American Chemical Society. 136 (6), 2196-2199 (2014).
  46. Janissen, R., et al. Invincible DNA tethers: covalent DNA anchoring for enhanced temporal and force stability in magnetic tweezers experiments. Nucleic Acids Research. 42 (18), 137 (2014).
  47. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. Science. 271 (5250), 795 (1996).
  48. Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Labeling of specific cysteines in proteins using reversible metal protection. Biophysical Journal. 100 (10), 2513-2521 (2011).
  49. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  50. Hill, C. H., et al. Structural and molecular basis for Cardiovirus 2A protein as a viral gene expression switch. Nature Communications. 12 (1), 7166 (2021).
  51. Butterworth, S. On the theory of filter amplifiers. Experimental Wireless and the Wireless Engineer. 7, 536-541 (1930).
  52. Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophysics Journal. 72 (3), 1335-1346 (1997).
  53. Mukhortava, A., et al. Structural heterogeneity of attC integron recombination sites revealed by optical tweezers. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1861-1870 (2019).
  54. Buck, S., Pekarek, L., Caliskan, N. POTATO: An automated pipeline for batch analysis of optical tweezers data. bioRxiv. , (2021).
  55. Zhang, Y., Jiao, J., Rebane, A. A. Hidden Markov modeling with detailed balance and its application to single protein folding. Biophysical Journal. 111 (10), 2110-2124 (2016).
  56. Sgouralis, I., Pressé, S. An introduction to infinite HMMs for single-molecule data analysis. Biophysics Journal. 112 (10), 2021-2029 (2017).
  57. Müllner, F. E., Syed, S., Selvin, P. R., Sigworth, F. J. Improved hidden Markov models for molecular motors, part 1: basic theory. Biophysical Journal. 99 (11), 3684-3695 (2010).
  58. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical Journal. 103 (7), 1490-1499 (2012).
  59. Re, A., Joshi, T., Kulberkyte, E., Morris, Q., Workman, C. T. RNA-protein interactions: an overview. Methods Molecular Biology. 1097, 491-521 (2014).
  60. Jankowsky, E., Harris, M. E. Specificity and nonspecificity in RNA-protein interactions. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 16 (9), 533-544 (2015).
  61. Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
  62. Sunbul, M., Jäschke, A. SRB-2: a promiscuous rainbow aptamer for live-cell RNA imaging. Nucleic Acids Research. 46 (18), 110 (2018).
  63. Sanchez de Groot, N., et al. RNA structure drives interaction with proteins. Nature Communications. 10 (1), 3246 (2019).
  64. Zeffman, A., Hassard, S., Varani, G., Lever, A. The major HIV-1 packaging signal is an extended bulged stem loop whose structure is altered on interaction with the Gag polyprotein. Journal of Molecular Biology. 297 (4), 877-893 (2000).
  65. Mangeol, P., et al. Probing ribosomal protein-RNA interactions with an external force. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (45), 18272 (2011).
  66. Luo, X., et al. Molecular mechanism of RNA recognition by Zinc-Finger antiviral protein. Cell Reports. 30 (1), 46-52 (2020).
  67. Qu, X., Lancaster, L., Noller, H. F., Bustamante, C., Tinoco, I. Ribosomal protein S1 unwinds double-stranded RNA in multiple steps. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (36), 14458-14463 (2012).
  68. Chandra, V., Hannan, Z., Xu, H., Mandal, M. Single-molecule analysis reveals multi-state folding of a guanine riboswitch. Nature Chemical Biology. 13 (2), 194-201 (2017).
  69. Savinov, A., Perez, C. F., Block, S. M. Single-molecule studies of riboswitch folding. Biochimica et Biophysica Acta. 1839 (10), 1030-1045 (2014).
  70. Kelly, J. A., et al. Structural and functional conservation of the programmed ribosomal frameshift signal of SARS coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Journal of Biological Chemistry. 295 (31), 10741-10748 (2020).
  71. Neupane, K., et al. Structural dynamics of single SARS-CoV-2 pseudoknot molecules reveal topologically distinct conformers. Nature Communications. 12 (1), 4749 (2021).
  72. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  73. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  74. Deerinck, T. J. The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton, and electron microscopic imaging. Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).
  75. Rill, N., Mukhortava, A., Lorenz, S., Tessmer, I. Alkyltransferase-like protein clusters scan DNA rapidly over long distances and recruit NER to alkyl-DNA lesions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 117 (17), 9318-9328 (2020).
  76. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  77. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  78. Wen, J. -D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophysical journal. 92 (9), 2996-3009 (2007).

Tags

Biochemie Nummer 180
Optisch pincet om RNA-eiwitinteracties in vertaalregelgeving te bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N.… More

Pekarek, L., Buck, S., Caliskan, N. Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation. J. Vis. Exp. (180), e62589, doi:10.3791/62589 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter