Summary
Este estudio describe un protocolo integral de resonancia magnética cardiovascular (CMR) para cuantificar los parámetros funcionales del ventrículo izquierdo del corazón de ratón. El protocolo describe la adquisición, el post-procesamiento y el análisis de las imágenes CMR, así como la evaluación de diferentes parámetros funcionales cardíacos.
Abstract
Los modelos de ratón han contribuido significativamente a comprender los factores genéticos y fisiológicos involucrados en la función cardíaca saludable, cómo las perturbaciones resultan en patología y cómo se pueden tratar las enfermedades miocárdicas. La resonancia magnética cardiovascular (CMR) se ha convertido en una herramienta indispensable para una evaluación integral in vivo de la anatomía y función cardíaca. Este protocolo muestra mediciones detalladas de la función ventricular izquierda del corazón de ratón, la distensión miocárdica y las fuerzas hemodinámicas utilizando 7-Tesla CMR. En primer lugar, se demuestra la preparación y el posicionamiento de los animales en el escáner. Los escaneos de encuestas se realizan para planificar segmentos de imágenes en varias vistas de ejes cortos y largos. Se adquieren una serie de posibles películas de eje corto (SA) activadas por ECG (o imágenes CINE) que cubren el corazón desde el ápice hasta la base, capturando las fases sistólica final y diastólica final. Posteriormente, las imágenes CINE de un solo segmento y cerradas retrospectivamente se adquieren en una vista SA del ventrículo medio y en vistas de 2, 3 y 4 cámaras, para ser reconstruidas en imágenes CINE de alta resolución temporal utilizando software personalizado y de código abierto. Las imágenes CINE se analizan posteriormente utilizando un software de análisis de imágenes CMR dedicado.
La delineación de los bordes endomiocárdicos y epicárdicos en las imágenes CINE end-sistólicas y diastólicas finales permite el cálculo de los volúmenes end-sistólicos y diastólicos finales, la fracción de eyección y el gasto cardíaco. Las imágenes DE SA CINE del ventrículo medio se delinean para todos los marcos de tiempo cardíacos para extraer una curva de volumen-tiempo detallada. Su derivada temporal permite el cálculo de la función diastólica como la relación entre las ondas de llenado temprano y contracción auricular. Finalmente, las paredes endocárdicas del ventrículo izquierdo en las vistas de 2, 3 y 4 cámaras se delinean mediante el seguimiento de características, a partir del cual se calculan los parámetros de tensión miocárdica longitudinal y las fuerzas hemodinámicas del ventrículo izquierdo. En conclusión, este protocolo proporciona una cuantificación detallada in vivo de los parámetros cardíacos del ratón, que se puede utilizar para estudiar las alteraciones temporales de la función cardíaca en varios modelos de ratón de enfermedad cardíaca.
Introduction
La resonancia magnética cardiovascular (CMR) en animales pequeños proporciona una medición precisa in vivo de la función miocárdica, lo que hace que la CMR sea una herramienta óptima para la investigación preclínica en enfermedades cardiovasculares. Debido a la alta resolución espacial y al alto contraste entre la sangre y el miocardio en las imágenes de CMR, es posible delinear los contornos endocárdicos y epicárdicos y calcular la masa miocárdica y los volúmenes ventriculares1,2. A pesar de las altas frecuencias cardíacas de hasta 600 latidos / min, el uso de electrocardiograma (ECG) y activación respiratoria permite mediciones de alta calidad de diferentes fases cardíacas (también llamadas imágenes CINE) sin artefactos de movimiento respiratorio. De esta manera, se pueden usar múltiples cortes para cubrir el corazón desde el ápice hasta la base para extraer parámetros de la función sistólica como la fracción de eyección (EF), el volumen sistólico final (ESV), el volumen diastólico final (EDV) y el gasto cardíaco (CO)3. Además de la evaluación básica de la función sistólica, recientemente se han desarrollado técnicas adicionales de CMR para evaluar la disfunción diastólica4,la cepa miocárdica5y las fuerzas hemodinámicas (HDF)6.
La ecgización permite la sincronización con el ciclo cardíaco iniciando la adquisición de la señal de RM después de la detección del pico R y registrando un número definido de fases cardíacas durante el intervalo R-R. Sin embargo, el número de fases cardíacas (frame rate) que se pueden adquirir de esta manera depende del menor tiempo de repetición posible (TR) que el sistema pueda alcanzar manteniendo una relación señal-ruido (SNR) aceptable y una resolución espacial4. Además, debido a que el uso de gradientes de campo magnético altos puede distorsionar temporalmente la señal de ECG, la adquisición generalmente se detiene antes de la fase diastólica final. Ambos factores limitan el uso de tales exploraciones a las evaluaciones de la función sistólica, ya que el cálculo de otros parámetros funcionales cardíacos requiere una mejor definición de la curva volumen-tiempo del ventrículo izquierdo (VI).
Las imágenes CINE de alta velocidad de fotogramas se pueden adquirir mediante una compuerta retrospectiva, mediante la cual la señal de RM se adquiere continuamente durante el escaneo, y un eco de navegador incorporado después de la excitación por radiofrecuencia (RF) detecta el movimiento cardíaco y respiratorio. Debido a que la adquisición de CMR se realiza de forma asíncrona con el movimiento cardíaco, las señales de RM adquiridas se pueden asignar a un número elegido retrospectivamente de fotogramas cardíacos. De esta manera, si se recopilan datos suficientes, se pueden reconstruir imágenes CINE de alta velocidad de fotogramas4,7. Esto permite la evaluación de la función diastólica, representada por la relación entre la tasa máxima de llenado temprano (E') y la tasa máxima de llenado tardío de la contracción auricular (A').
En la investigación clínica, las imágenes CINE se pueden analizar con el seguimiento de características CMR para evaluar la cepa miocárdica y HDF6,8. La distensión miocárdica es un parámetro de deformación cardíaca que mide la diferencia en porcentajes entre la longitud inicial (generalmente en la longitud diastólica final) y la longitud máxima (generalmente en la sístole final) de un segmento miocárdico9. Las mediciones de la tensión miocárdica pueden ser de valor incremental para evaluar la función del VI, ya que los valores de la deformación cuantifican el acortamiento y engrosamiento de la pared miocárdica. Una reducción en la función de acortamiento podría ser una indicación de daño en la fibra subendocárdica10. Las alteraciones en la cepa miocárdica pueden ocurrir independientemente de la FE y podrían ser un precursor de complicaciones subyacentes.
En concreto, se ha demostrado que la cepa longitudinal global (GLS) y la cepa circunferencial global (GCS) tienen un valor añadido en la caracterización de las cardiopatías10,11,12. Del mismo modo, se ha sugerido que la HDF es un parámetro potencialmente novedoso para indicar una función cardíaca alterada6,13. Estos HDF o gradientes de presión interventricular (IVPG) impulsan el movimiento sanguíneo durante la eyección y el llenado del corazón y se ven afectados por el intercambio de momento entre la sangre y el miocardio, incluida la válvula aórtica y mitral14,15.
En este estudio, se describe un protocolo integral para realizar mediciones robustas de CMR en animales pequeños para cuantificar la función del VI, la tensión miocárdica y la HDF de los corazones de ratón. Contiene los pasos necesarios para la preparación animal, la adquisición de datos utilizando imágenes CINE del corazón cerradas prospectiva y retrospectivamente, así como el análisis con software dedicado capaz de calcular las mediciones volumétricas, la relación E '/A', la tensión miocárdica y el HDF del corazón. Este protocolo se puede utilizar para la evaluación exhaustiva de la función del VI en varios modelos de ratón de enfermedad cardiovascular.
Protocol
Los experimentos con animales descritos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la Unión Europea para el bienestar de los animales de laboratorio (Directiva 2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del Centro Médico Académico.
1. Configuración y preparación animal
- Antes de comenzar el experimento, asegúrese de que haya suficiente anestesia con isoflurano durante al menos 2 h, y que la batería disponible para ECG y monitoreo respiratorio esté suficientemente cargada. Asegúrese de que el área del escáner esté equipada con un tubo de extracción de humos de trabajo para eliminar el exceso de isoflurano.
- Prepare la base del ratón(Figura 1A)y encienda el sistema de calefacción del animal con la temperatura establecida en 40 °C. Prepare el módulo de interfaz RESPIRATORIA/ECG y la configuración de la batería(Figura 1B),e inicie el software para el monitoreo en tiempo real del ECG y las señales respiratorias(Figura 1C).
- Retire el ratón de su jaula de alojamiento y mida el peso corporal.
- Coloque el ratón en una cámara de inducción de anestesia debajo de un brazo de extracción de campana de humos y proporcione 3-4% de isoflurano en una mezcla de 0.2 L / min O2 y 0.2 L / min de aire medicinal. Después de que el animal esté completamente anestesiado, aplique una pequeña gota de ungüento para los ojos en cada ojo y cierre los párpados del ratón.
- Coloque el ratón en posición supina sobre la base del ratón. Enganche los incisivos del ratón en la barra de mordida de la base del ratón y ajuste el cono de la nariz para que encaje correctamente (Figura 1A). Verifique visualmente si la respiración es estable por debajo de 100 respiraciones / min, y reduzca el isoflurano a ~ 2% durante la preparación animal.
- Mueva la base del ratón de tal manera que el corazón se encuentre en la parte del soporte de la cuna que terminará en el centro de la bobina de RF y el isocentro del imán.
- Use vaselina para insertar la sonda de temperatura rectal y pegue con cinta adhesiva el cable de fibra óptica de la sonda de temperatura a la base del mouse.
- Coloque el balón respiratorio en la parte inferior del abdomen del ratón y asegúrelo con cinta adhesiva. Inserte dos agujas de electrodo de ECG por vía subcutánea en el tórax a la altura de las patas delanteras y péguelas suavemente para evitar el movimiento (Figura 1A).
- Compruebe si las señales de respiración y ECG son de calidad suficiente, y si el software detecta los puntos gatillo correctos(Figura 1C).
- Asegúrese de que la frecuencia respiratoria sea de 50-80 respiraciones / min, la frecuencia cardíaca ~ 400-600 latidos / min y la temperatura corporal alrededor de 37 ° C. Ajustar la administración de isoflurano cuando la frecuencia respiratoria esté fuera de este rango, y reducir la temperatura del sistema de calentamiento animal si la temperatura corporal tiende a exceder los 37 °C.
- Coloque la bobina de RF sobre el ratón.
NOTA: Dependiendo del sistema, esto podría requerir la desconexión temporal de los electrodos de ECG y los tapones de balón respiratorio del módulo de interfaz respiratoria/ECG. - Conecte los cables de la bobina y coloque la base en el orificio del imán. Compruebe si la señal de ECG sigue siendo estable.
- Si la señal de ECG es subóptima, reposicione los electrodos de ECG para una mejor señal, ya que esto no se puede hacer en una etapa posterior sin cambiar significativamente la orientación del animal.
Figura 1:Preparación animal y configuración del equipo para imágenes CMR del corazón del ratón. (A) Ratón completamente anestesiado en posición supina, colocado en la cuna de ratón calentada con una almohada neumática respiratoria colocada en el abdomen, sensor de temperatura de fibra óptica rectal y derivaciones de ECG subcutáneas en el pecho cerca de las patas delanteras. (B) Bobina del cuerpo del ratón colocada sobre la base del ratón, con cables de ECG y almohada respiratoria reconectada al ECG y la interfaz respiratoria antes de colocar el soporte en el imán de resonancia magnética. (C)Representación del ECG y las señales respiratorias en un software dedicado a la monitorización de pequeños animales. El pico R de la señal de ECG se detecta y se utiliza como punto de partida para la adquisición de la señal de resonancia magnética. Un período de borrado entre los picos R se puede ajustar manualmente en función del período de un latido cardíaco. La activación solo puede ocurrir durante la meseta respiratoria (línea verde en el panel central) para la cual el retraso inicial y el ancho máximo se pueden ajustar manualmente. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; ECG = electrocardiograma; RM = resonancia magnética. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Calibración y activación de la resonancia magnética
- Ajuste los parámetros de ECG y de cierre respiratorio dentro del software de monitoreo de señales de modo que los puntos gatillo se generen en los picos R y solo durante la parte plana de la señal respiratoria. Para minimizar los errores de ecgáster, establezca un período de borrado que sea 10-15 ms más corto que el intervalo R-R.
NOTA: Este período de borrado debe ajustarse durante todo el experimento si se producen cambios en la frecuencia cardíaca. - Realice una calibración de frecuencia central y un escaneo SCOUT estándar (singate) con desplazamiento cero para determinar la posición del mouse en el escáner en direcciones coronal, axial y sagital. Si el corazón no está posicionado dentro de 0.5-1 cm del centro del campo de visión (FOV), ajuste la posición de la cuna en consecuencia y vuelva a hacer la exploración SCOUT.
- Realice una calibración manual de shim y RF utilizando los métodos disponibles del proveedor.
3. Planificación y adquisición de escaneos
NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer los parámetros de análisis detallados de los siguientes análisis.
- Basado en el SCOUT inicial, realice un escaneo scout de eco de gradiente de un solo marco (GRE) cerrado(Tabla 1,escaneo 1) con 5 cortes en 3 direcciones ortogonales, y coloque cada pila de cortes en la ubicación aproximada del corazón para ubicar la posición exacta del corazón(Figura 2A).
- Realice un escaneo de exploración SA de múltiples cortes de un solo fotograma cerrado(Tabla 1,escaneo 2). Con este fin, utilice el explorador GRE anterior para colocar 4-5 cortes en una posición ventricular media izquierda, perpendicular al eje largo del corazón para encontrar una estimación inicial de la vista SA del ventrículo medio, que se necesita para planificar el explorador de 2 cámaras de eje largo(Figura 2B).
- Para las siguientes exploraciones prospectivas (pasos 3.4-3.6), ajuste el número de cuadros cardíacos (Nframes) de modo que los Nframes × TR sea ~ 60-70% del intervalo R-R.
NOTA: La adquisición del 60-70% del intervalo R-R es suficiente para capturar la fase diastólica final del ciclo cardíaco, al tiempo que permite una relajación adicional de T1 durante la diástole final para mejorar el SNR y prevenir la alteración del siguiente pico R por conmutación de gradiente. - Realice un escaneo GRE de corte único cerrado para generar el explorador de 2 cámaras (2CH) de eje largo, que combinado con el escaneo SA, es necesario para planificar el escaneo de 4 cámaras (4CH)(Tabla 1,escaneo 3). Con este fin, coloque un corte perpendicular a las vistas SA anteriores que corren paralelas a los puntos de conexión entre el ventrículo izquierdo y derecho. Mueva esta rebanada a la mitad del ventrículo izquierdo y verifique la imagen coronal del explorador GRE si la rebanada está alineada con el eje largo del VI de tal manera que se coloque a través del ápice(Figura 2C).
- Realice otro escaneo GRE de corte único cerrado para generar el escaneo de exploración de 4 cámaras (4 CANALES), que es necesario para planificar el SA de múltiples cortes y el escaneo de 3 cámaras(Tabla 1,escaneo 4). Con este fin, coloque una rebanada perpendicular a la exploración de exploración 2CH y alinee al centro del eje largo de modo que la rebanada pase a través de la válvula mitral y el ápice. En las vistas SA, ajuste la rebanada de tal manera que se coloque paralela a la pared ventricular posterior y anterior y entre los dos músculos papilares(Figura 2D). Compruebe si la rebanada permanece en el centro del ventrículo durante todo el ciclo cardíaco.
- Realice un escaneo SA GRE secuencial cerrado de múltiples cortes(Tabla 1,escaneo 5) para mediciones de la función sistólica. Con este fin, coloque una rebanada del ventrículo medio perpendicular al eje largo del VI en las vistas 2CH y 4CH en el centro del corazón, y aumente el número de cortes (típicamente un número impar, por ejemplo, 7 o 9 cortes, sin espacio entre los cortes) para cubrir el corazón desde la base hasta el ápice(Figura 2E).
- Para las siguientes exploraciones cerradas retrospectivamente (pasos 3.8-3.9), desactive toda la funcionalidad prospectiva de las náuseas cardíacas y respiratorias. Tome nota de la frecuencia cardíaca y respiratoria antes y después de cada exploración cerrada retrospectivamente, y use estos valores para fines de reconstrucción más adelante (paso 5.2.2).
- Realizar tres exploraciones GRE secuenciales de un solo corte cerradas retrospectivamente en la vista SA del ventrículo medio (para la cuantificación de la relación E'/A'), vista 2CH y 4CH, estas dos últimas que son necesarias para la cuantificación de la tensión miocárdica y los valores de HDF(Tabla 1,exploración 6-8). Si es necesario, optimice las orientaciones finales de los segmentos de 2 CANALES y 4 CANALES en función de las vistas SA de varios cortes, así como de los escaneos exploradores de 2 CANALES y 4 CANALES disponibles.
- Realice una exploración GRE adicional de una sola rebanada cerrada retrospectivamente en una vista de 3 cámaras (3CH), que combinada con la vista de 2CH y 4CH del paso 3.8 es necesaria para la cuantificación de la tensión miocárdica y los valores de HDF(Tabla 1,exploración 9). Con este fin, coloque una rebanada perpendicular a la vista SA del ventrículo medio similar a la posición de la vista 4CH final del eje largo, y gire la rebanada 45° para pasar de la pared anterior al músculo papilar más cercano a la pared posterior. Inspeccione la rebanada BASAL SA para ver si la rebanada pasa a través de la válvula mitral y aórtica. Inspeccione en la vista final de eje largo 4CH si la división está pasando por el ápice (Figura 2F).
Figura 2: Planificación de segmentos para imágenes CMR en un ratón. (A) Planificación de GRE SCOUT a través del corazón en 3 vistas ortogonales utilizando escaneo scout inicial. (B) Planificación de scout de eje corto en las rodajas coronales y sagitales de GRE SCOUT. (C) Planificación de la vista scout 2CH utilizando el scout de eje corto y el slice coronal GRE SCOUT. (D) Planificación de la vista scout 4CH utilizando el scout de eje corto y el scout 2CH. (E) Planificación de la vista de eje corto multicorte utilizando exploradores de 2CH y 4CH. (F) (izquierda) Planificación de las vistas finales de 2CH, 3CH y 4CH utilizando las vistas de eje corto del ventrículo medio y las vistas de exploración de 2CH/4CH. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; GRE = Eco de gradiente; CH = cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número(s) de escaneo | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6-9 |
| Nombre(s) de análisis | Explorador GRE | explorador SA multi-slice | Explorador 2CH | Explorador 4CH | SA multi-slice | SA, 2CH, 4CH, 3CH |
| total de sectores | 15 (3 x 5)* | 4-5 | 1 | 1 | 7-9 | 1 |
| Espesor (mm) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| FOV (mm) | 60 | 35 | 30 | 30 | 35 | 30 |
| Relación FOV | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| Ángulo de giro | 40 | 20 | 20 | 20 | 20 | 15 |
| TE (ms)** | 3.8 | 3.4 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 3.6 |
| TR (ms) | 200 | 1 R-R | 7 | 7 | 7 | 8 |
| Nframes | 1 | 1 | 12-14 | 12-14 | 12-14 | 32 *** |
| Tamaño de la matriz | 192 x 192 | 192 x 192 | 192 x 192 | 192 x 192 | 192 x 192 | 192 x 192 |
| Desencadenamiento del ECG | No | Sí | Sí | Sí | Sí | retrospectivo |
| Desencadenante respiratorio | Sí | Sí | Sí | Sí | Sí | retrospectivo |
| Promedios | 1 | 3 | 5 | 5 | 5 | retrospectiva **** |
| Tiempo total de imágenes (estimado *****) | 2 min | 2 minutos | 3-4 min | 3-4 min | 20-25 minutos | 13 min / escaneo |
Tabla 1: Parámetros de adquisición para cada secuencia utilizada durante el protocolo CMR. * Las exploraciones se realizan en tres orientaciones ortogonales diferentes (axial, coronal, sagital). **Se utiliza el TE más corto posible, dados todos los demás parámetros, que depende de la configuración específica del escáner. Este es el número de fotogramas cardíacos después del binning retrospectivo. El promedio efectivo depende del llenado aleatorio del espacio k durante el tiempo total de adquisición. En total, se realizaron 400 repeticiones de todas las k-líneas. Incluyendo ECG/retrasos en el desencadenamiento respiratorio. Abreviaturas: CMR = resonancia magnética cardiovascular; ECG = electrocardiograma; GRE = eco de gradiente; FOV = campo de visión; TE = tiempo de eco; TR = tiempo de repetición; Nframes = número de cuadros cardíacos; SA = eje corto; CH = cámara. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
4. Finalización del experimento y almacenamiento de datos
- Retire el ratón de la base después de separar todos los demás equipos de medición y apague la anestesia. En el caso de experimentos longitudinales, coloque al ratón en una jaula de alojamiento precalentada a 37 ° C para su recuperación hasta que el animal esté despierto y activo.
- Limpie todo el equipo que se haya utilizado con toallitas de limpieza o alcohol al 70%.
- Genere archivos de imágenes digitales y comunicación en medicina (DICOM) para los datos de resonancia magnética con puertas prospectivas, y cópielos junto con los archivos de datos sin procesar de resonancia magnética de las exploraciones cerradas retrospectivamente a un servidor seguro para el análisis de datos posterior.
5. Reconstrucción fuera de línea de los escaneos adquiridos retrospectivamente
NOTA: Para la reconstrucción de los escaneos cerrados retrospectivamente, se utilizó un software de código abierto personalizado (Figura 3). Realice los pasos siguientes para cada uno de los datos activados retrospectivamente por separado.
- Abra el software de reconstrucción Retrospectivey cargue el archivo de datos sin procesar correspondiente a una resonancia magnética cerrada retrospectivamente.
- Inspeccione la señal del navegador Raw y observe que los picos de señal más altos representan la frecuencia respiratoria y los picos de señal más bajos representan la frecuencia cardíaca.
- Si los picos están registrados al revés, gire la señal con el interruptor hacia arriba / hacia abajo.
- Además, compruebe si la frecuencia cardíaca detectada automáticamente corresponde al 10% de los valores observados durante cada exploración. De lo contrario, ajuste manualmente estos valores porque la detección automatizada falló.
- Elija un porcentaje de ventana apropiado para la exclusión de datos durante el movimiento respiratorio, generalmente del 30%.
- Pulse Filtro para realizar el análisis del navegador y separe el navegador cardíaco del navegador respiratorio.
- Establezca el número de fotogramas CINE en 32 (valor utilizado en este estudio) y pulse sort k-space.
- Elija la configuración adecuada para la regularización de detección comprimida (CS) y pulse reconstruir. Utilice los siguientes parámetros de regularización típicos: parámetro de regularización de wavelet en las dimensiones espaciales (x, y z) (WVxyz) 0.001 o 0; restricción de variación total en la dimensión CINE (TVcine) 0,1; restricción de variación total en dimensión espacial (TVxyz) 0; y restricción de variación total en la dimensión dinámica (TVdyn) 0,05.
- Una vez finalizada la reconstrucción, obtenga una vista previa de la película CINE para evaluar la reconstrucción. Exporte imágenes DICOM para su posterior análisis con Export DCM.
Figura 3:Interfaz gráfica de usuario activativa «retrospectiva». 'Retrospectiva' es una aplicación de reconstrucción personalizada para exploraciones de resonancia magnética cardíaca activadas retrospectivamente. En la interfaz de usuario, es posible evaluar la señal del navegador, ajustar el número de fotogramas CINE a reconstruir, ajustar los parámetros de detección comprimidos para mejorar la reconstrucción, obtener una vista previa de las imágenes CINE como una película dinámica y exportar los datos reconstruidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
6. Software de análisis de imágenes
NOTA: El software de análisis de imágenes(Figura 4)requiere el uso de imágenes DICOM y tiene múltiples complementos para diferentes aplicaciones de análisis cardiovascular, como el complemento para mediciones volumétricas y el complemento para análisis de tensión y HDF.
- Para la evaluación volumétrica del VI, seleccione el escaneo SA multicorte y cárguelo en el complemento para mediciones volumétricas.
- Asigne etiquetas de sistólica final (ES) y diastólica final (DE) al cuadro cardíaco correspondiente.
- Utilice las herramientas de contorno para segmentar los bordes endomiocárdicos en los marcos ES y ED.
NOTA: El software de análisis, utilizado para este protocolo, muestra automáticamente los parámetros LV EF, EDV, ESV cuando se han realizado todas las anotaciones necesarias.
- Para mediciones diastólicas, seleccione las imágenes SA CINE del ventrículo medio y cárguelas en el complemento para mediciones volumétricas.
- Asigne las etiquetas ED y ES a los cuadros cardíacos correspondientes.
- Utilice las herramientas de contorno para segmentar el borde endocárdico de todos los fotogramas. Compare la segmentación de los marcos vecinos para garantizar transiciones suaves de la segmentación a lo largo del ciclo cardíaco.
- Exportar la evolución temporal de todas las tramas cardíacas y los correspondientes volúmenes endomiocárdicos del VI (ENDO del VI). Aplique un script personalizado (consulte Material complementario)para calcular la relación E'/A'.
NOTA: El script aplica un filtro Savitzky-Golay para el cálculo robusto de las curvas dV/dt y utiliza la detección semiautomática de picos para encontrar los picos E' y A'.
- Para los cálculos de deformación y HDF, seleccione las imágenes CINE de eje largo de 2CH, 3CH y 4CH, y cárguelas en el complemento para mediciones volumétricas.
- Asigne las etiquetas ED y ES al marco cardíaco correspondiente en cada orientación de corte.
- Utilice las herramientas de contorno para segmentar el borde endocárdico de todos los fotogramas en las 3 orientaciones. Compare la segmentación de los marcos vecinos para garantizar transiciones suaves de la segmentación a lo largo del ciclo cardíaco.
- Una vez que los contornos se dibujan en el complemento para mediciones volumétricas, ejecute el complemento para el análisis de tensión y HDF.
- Asigne cada uno de los conjuntos de datos adquiridos a las etiquetas correspondientes para las vistas 2CH, 3CH y 4CH, y ejecute el análisis de deformación.
- Para el análisis HDF, dibuje el diámetro de la válvula mitral en el marco diastólico final en las 3 orientaciones y dibuje el diámetro de la aorta en la imagen de eje largo de 3 cámaras.
Figura 4: Interfaz gráfica de usuario del software de análisis de imágenes. El plugin para la medición volumétrica en el software de análisis de imágenes, que se utiliza para el contorno del borde endomiocárdico. Para cada conjunto de datos, se seleccionan las fases cardíacas diastólica final y sistólica final, y el borde endomiocárdico se segmenta para todos los fotogramas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Representative Results
Utilizando el protocolo descrito anteriormente, se escaneó un grupo de ratones sanos de tipo salvaje C57BL / 6 (n = 6, edad 14 semanas) utilizando un escáner de resonancia magnética de 7 Teslas utilizando una bobina de jaula para pájaros de 38 mm de diámetro. Durante cada sesión de escaneo, las imágenes CINE SA de múltiples cortes se adquirieron utilizando secuencias GRE cerradas prospectivamente, mientras que las imágenes CINE de sa, 2CH, 3CH y 4ch de corte medio de corte único se adquirieron mediante puerta retrospectiva. Las reconstrucciones representativas de alta velocidad de fotogramas de escaneos cerrados retrospectivamente utilizando un software de posprocesamiento personalizado se pueden ver en el Video suplementario 1. A partir de las imágenes resultantes, se determinaron las curvas volumen-tiempo durante el ciclo cardíaco(Figura 5A),así como las curvas de primera derivada correspondientes (dV/dt) para el cálculo de los parámetros de función sistólica (EF = 72,4 ± 2,8%) y diastólica (relación E'/A' = 1,5 ± 0,3) respectivamente.
Las imágenes CINE de vista 2CH, 3CH y 4CH se analizaron utilizando software de análisis de imágenes para determinar los cambios en el GLS endocárdico (endoGLS) a lo largo del ciclo cardíaco(Figura 5B)y los valores máximos correspondientes de GLS (-22.8 ± 2.4%) como medida para la tensión miocárdica. Además, el software calcula el CUADRADO medio de la raíz (RMS) HDF en direcciones longitudinales (ápice-base) (135,2 ± 31,7%) y transversales (inferolateral-anteroseptal) (12,9 ± 5,0%). Para cada animal, también es posible producir un perfil de tiempo HDF, que sigue un patrón consistente de picos positivos y negativos que representan la magnitud y la dirección del HDF durante el ciclo cardíaco(Figura 5C). Los resultados descriptivos de todos los parámetros de resultado se resumen en la Figura 5D.
Figura 5: Cuantificación de los parámetros funcionales del VI basados en el corazón del ratón. (A) Curva de volumen-tiempo representativa y curva dV/dt correspondiente. Este último representa la velocidad del flujo con un pico de llenado temprano (E') y un pico de contracción auricular (A'). (B) Curva GLS representativa que indica la deformación por deformación en la dirección longitudinal a lo largo del ciclo cardíaco. (C) Curva HDF representativa con picos de fuerza distintos en la dirección ápice-base, comenzando con la fuerza de eyección sistólica y seguida de una fuerza descendente en la transición entre sístole y diástole, fuerza de desaceleración de onda E, aceleración de onda A y fuerza de desaceleración. (D) Resultados descriptivos de todos los animales para los valores de EF, relación E'/A', GLS pico y cuadrado medio de la raíz del HDF en direcciones ápice-base e inferolateral-anteroseptal. Los valores se expresan como media ± SD. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; V = volumen; t = tiempo; GLS = deformación longitudinal global; HDF = fuerzas hemodinámicas; EF = fracción de eyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video suplementario 1: Reconstrucción representativa de imágenes CINE cerradas retrospectivamente en vistas SA, 2CH, 3CH y 4CH. Abreviaturas: SA = eje corto; CH = cámara. Haga clic aquí para descargar este video.
Material complementario: Haga clic aquí para descargar este archivo.
Discussion
El protocolo presentado describe el uso de imágenes CMR para experimentos longitudinales, no invasivos e in vivo para analizar la función cardíaca en ratones. Estos resultados son ejemplos de animales sanos para demostrar la viabilidad de utilizar imágenes CINE para cuantificar los parámetros cardíacos. Sin embargo, los métodos descritos se pueden utilizar para varios modelos animales. Aunque los modelos específicos de enfermedades pueden requerir pequeñas alteraciones en el protocolo, su estructura básica para evaluar los diferentes parámetros funcionales cardíacos será muy similar. Un caso particular que vale la pena mencionar es un modelo de infarto de miocardio donde parte del corazón tiene una pérdida significativa de contractilidad. Esto puede causar una baja calidad de la señal del navegador cardíaco dentro de esta rebanada. En este caso, una opción alternativa sería adquirir el navegador de una porción separada, como se describe en un estudio previo de Coolen et al.16. Las imágenes CINE en diferentes vistas se reconstruyen a partir de datos cerrados retrospectivamente utilizando algoritmos CS y se analizan utilizando un software de análisis de imágenes para calcular los valores de deformación y HDF.
La calidad de las imágenes adquiridas depende naturalmente de todos los pasos de preparación, que deben realizarse cuidadosamente antes de comenzar el protocolo de resonancia magnética cardíaca. Por ejemplo, si no se observan señales claras de ECG y respiratorias al colocar al animal dentro del escáner de resonancia magnética, esto probablemente resultará en adquisiciones subóptimas e incluso en un aumento de los tiempos de exploración debido al efecto adicional de las distorsiones magnetohidrodinámicas17. Es importante darse cuenta de que debido a la planificación secuencial de las orientaciones de las rebanadas, los animales no pueden simplemente reposicionarse entre escaneos. Por lo tanto, no es posible volver a ajustar los cables de ECG entre escaneos, ya que esto alterará la posición del mouse en el escáner. Durante el escaneo, el control de la temperatura es crucial para mantener un intervalo cardíaco y respiratorio constante, lo que beneficia especialmente la calidad de los escaneos cerrados retrospectivamente que se adquieren durante un período de tiempo más largo. Durante este escaneo de alto ciclo de trabajo, la temperatura del animal puede aumentar constantemente, haciendo que la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria aumenten. El ajuste de la temperatura del sistema de calefacción y la anestesia podría contribuir en gran medida a estabilizar la frecuencia respiratoria antes o durante la exploración.
Un paso crítico durante el análisis es la consistencia en el dibujo de contorno. Si bien la segmentación automática funciona bien para los datos clínicos, no funciona de manera robusta en el caso de los datos cardíacos de ratón (no probados para ratas). La alta frecuencia cardíaca y el alto flujo sanguíneo durante las fases cardíacas específicas, especialmente al comienzo del llenado del VI, pueden causar desfase intracoxel y vacíos de señal, comprometiendo la delineación de la pared miocárdica. Por lo tanto, no se recomienda analizar cada fotograma de forma independiente, sino inspeccionar visualmente el movimiento de la pared miocárdica entre fotogramas y tenerlo en cuenta al dibujar los contornos en todos los marcos. Se aconseja copiar y ajustar el contorno endocárdico entre dos fotogramas consecutivos para mantener un movimiento contráctil más natural en el análisis. En este protocolo, los músculos papilares se excluyen del volumen de la luz ventricular en las imágenes de SA para la evaluación de la función sistólica y diastólica, mientras que se incluyen en las vistas de 2CH, 3CH y 4CH para el análisis de tensión y HDF porque este último se basa en el conocimiento del movimiento preciso de la pared miocárdica, en lugar del volumen preciso de la luz ventricular.
Mientras que los parámetros de la función sistólica y diastólica se basan en la medición de los volúmenes del VI a lo largo del ciclo cardíaco, los parámetros de tensión y HDF también dependen de los patrones de movimiento dentro de la pared miocárdica. Para ello, se utilizan técnicas de seguimiento de características donde se puede evaluar el desplazamiento del segmento miocárdico mediante el reconocimiento de distintas características anatómicas e intensidades de señal entre las fases posteriores de CINE. El fuerte contraste entre el grupo sanguíneo y el miocardio en las imágenes de CMR facilita el uso del seguimiento de características para la posterior tensión y el análisis de HDF8. Antes del seguimiento de características de CMR, la cepa miocárdica se determinó con ecografía de seguimiento de manchas y marcado de tejido CMR. El seguimiento de características de CMR no requiere tiempo de escaneo adicional en comparación con el etiquetado de tejidos CMR. Sin embargo, a pesar del uso de la activación retrospectiva, la CMR todavía tiene una resolución temporal limitada, lo que podría dificultar la evaluación correcta de las deformaciones rápidas dentro del ciclo cardíaco.
La evaluación de la HDF a lo largo del ciclo cardíaco requiere mediciones de los diámetros de las válvulas mitral y aórtica para calcular la HDF en direcciones ápice-base e inferolateral-anteroseptal utilizando ecuaciones previamente descritas18. Este método ha mostrado estimaciones consistentes de la HDF en comparación con la resonancia magnética de flujo 4D estándar de referencia, que tiene una disponibilidad limitada en el uso clínico debido a su complejidad6. Es importante saber que la estimación robusta de los diámetros de las válvulas es difícil y, por lo tanto, los diámetros de las válvulas deben mantenerse constantes para un grupo de animales y a través de mediciones repetidas en un estudio longitudinal, ya que las variaciones en este parámetro por estimaciones incorrectas podrían eclipsar fácilmente los cambios sutiles en los parámetros de HDF. Es posible que el software específico utilizado para calcular los parámetros GLS y HDF no esté disponible para todos los usuarios. Por lo tanto, uno puede referirse a Voigt et al.19 (GLS), así como Pedrizzetti et al.6,20 (HDF), que contienen todas las descripciones matemáticas que forman la base de los cálculos respectivos realizados por el software de análisis.
Para el propósito de este estudio, el protocolo fue evaluado en animales sanos (N = 6). En la Figura 5A-Cse muestra un conjunto representativo de curvas de tiempo para volumen LV, dV/dt, endoGLS y HDF. Los valores medios de múltiples parámetros funcionales cardíacos (EF, relación E'/A', GLS pico y HDF) se muestran en la Figura 5D. Estos concuerdan bien con protocolos comparables utilizados en la literatura21. La literatura sobre datos de GLS y HDF en ratones es escasa. Se midió un valor medio de GLS de -22,8%, que está en el mismo rango que los datos clínicos8,lo que indica que las mediciones de GLS obtenidas con el método descrito son factibles en ratones. Las curvas HDF obtenidas en ratones también muestran las mismas fases distintas que se ven en los datos humanos, lo que muestra la traducción exitosa de esta técnica a la investigación preclínica. Si bien se plantea la hipótesis de que los parámetros de HDF sirven como biomarcadores tempranos de disfunción cardíaca, se justifican más estudios para investigar el valor diagnóstico y predictivo de este nuevo parámetro. Los resultados de este protocolo muestran que se espera que los resultados de HDF y GLS sean más variables entre los animales, lo que debe tenerse en cuenta cuando se esperan diferencias sutiles en los modelos animales o los efectos del tratamiento.
Disclosures
Ruslan Garipov es empleado de MR Solutions Ltd., Guildford, Reino Unido. David Hautemann es empleado de Medis medical imaging systems B.V., Leiden, Países Bajos.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Dorita Dekkers y Fatimah Al Darwish por su ayuda con las mediciones del ratón y el análisis de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| AccuSens single and multi-channel signal conditioner | Opsens solutions inc., Canada | ACS-P4-N-62SC | Used with fiber optic temperature sensor to monitor body temperature |
| Duratears eye ointment | Alcon Nederland B.V., Netherlands | ||
| Mouse cell | Équipment Vétérinaire Minerve, France | referred to as mouse cradle | |
| MR-compatible Monitoring & Gating System for Small animals | SA Intuments, Inc., United States | Model 1030 | ERT Module (ECG/respiratory interface module) , ERT Control/Gating Module, battery pack and subdermal ECG Electrode Set |
| MRI scanner | MR Solutions Ltd., United Kingdom | Model: MRS-7024 | Preclinical MRI System 7.0T/24 cm |
| Multistation temperature control unit and High Flow PCA | Équipment Vétérinaire Minerve, France | Model: URT Multipostes | animal heating system |
| Respiration Sensor | Graseby Medical Limited, United Kingdom | Ref 2005100 | |
| RF coil | MR Solutions Ltd., United Kingdom | MRS-MVC | 38mm mouse volume RF coil for mouse body studies |
| SF flowmeter | flow-meter, Italy | SF 3 | |
| Vaporizer sigma delta Intermed | Penlon Ltd., United Kingdom | ||
| Materials | |||
| Isoflurane | AST farma, Netherlands | ||
| Vaseline petroleum jelly | Unilever, United Kingdom | ||
| Software | |||
| BART toolbox | https://mrirecon.github.io/bart/ | ||
| Mathematica 12.0 | Wolfram Research, Inc., United States | ||
| MATLAB 2019a | The MathWorks,Inc., United States | ||
| MEDIS Suite MR | Medis Medical Imaging Systems B.V. ,Netherlands | Image analysis software | |
| PC-SAM | SA Intuments, Inc., United States | ||
| Preclinical Scan | MR Solutions Ltd., United Kingdom | Scanning software | |
| Retrospective version 7.0 | Amsterdam UMC, the Netherlands | Reconstuction software: https://github.com/Moby1971?tab=repositories |
References
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