Aktivering og konjugering av løselige polysakkarider med 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate (CDAP)

Summary

Proteiner og aminholdige ligander kan kovalent knyttes til polysakkarider aktivert av cyanyleringsreagenset, 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate (CDAP), for å danne kovalent protein (ligand)-polysakkaridkonjugater. Denne artikkelen beskriver en forbedret protokoll for å utføre kontrollert CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og utføre etterfølgende konjugering av de aktiverte polysakkaridene.

Abstract

Konjugatvaksiner er bemerkelsesverdige fremskritt innen vaksinering. For fremstilling av polysakkaridkonjugatvaksiner kan polysakkaridene enkelt funksjonaliseres og knyttes til vaksinebærerproteiner ved hjelp av 1-cyano-4-dimetylaminopyridintetrafluoroborate (CDAP), et cyanylerende reagens som er lett å håndtere. CDAP aktiverer polysakkarider ved å reagere med karbohydrathydroksylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten til CDAP er svært pH-avhengig. pH-en til reaksjonen reduseres også under aktivering på grunn av hydrolysen til CDAP, noe som gjør at god pH kontrollerer nøkkelen til reproduserbar aktivering. Den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen ble utført ved romtemperatur i ubuffered pH 9-løsninger.

På grunn av den raske reaksjonen under denne tilstanden (<3 min) og det medfølgende raske pH-fallet fra den raske CDAP-hydrolysen, var det utfordrende å raskt justere og opprettholde målreaksjonen pH på kort tid. Den forbedrede protokollen som er beskrevet her, utføres ved 0 °C, noe som bremser CDAP-hydrolysen og forlenger aktiveringstiden fra 3 min til ~15 min. Dimetylaminopyridin (DMAP) ble også brukt som en buffer for å forhåndsjustere polysakkaridløsningen til målaktiverings-pH før du legger til CDAP-reagenset. Den lengre reaksjonstiden, kombinert med den langsommere CDAP-hydrolysen og bruken av DMAP-buffer, gjør det enklere å opprettholde aktiverings-pH for hele aktiveringsprosessens varighet. Den forbedrede protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, mer reproduserbar og mer egnet til å skalere opp.

Introduction

Konjugatvaksiner, som de som består av polysakkarider som er kovalent knyttet til et bærerprotein, er blant de bemerkelsesverdige fremskrittene innen vaccinologi^1,2. Polysakkarider, som T-celleuavhengige antigener, er dårlig immunogene hos spedbarn og induserer ikke minne, klasseveksling eller affinitetsmodning av antistoffer³. Disse manglene overvinnes i polysakkaridkonjugatvaksiner⁴. Siden de fleste polysakkarider ikke har et praktisk kjemisk håndtak for konjugering, må de først gjøres reaktive eller "aktiverte". Det aktiverte polysakkaridet kobles deretter enten direkte til proteinet (eller modifisert protein) eller er funksjonalisert for ytterligere avledning før konjugering⁴. De fleste lisensierte polysakkaridkonjugatvaksiner bruker enten reduktiv aminering eller cyanylering for å aktivere polysakkaridhydroksyler. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens som tidligere hadde blitt brukt til å aktivere kromatografi harpikser, ble opprinnelig brukt til polysakkaridavledning. CNBr krever imidlertid høy pH, vanligvis ~ pH 10,5 eller høyere, for delvis å deprotonere polysakkaridhydroksyler slik at de er tilstrekkelig nukleofile til å angripe cyanogruppen. Den høye pH kan være skadelig for base-labile polysakkarider, og verken CNBr eller den aktive cyano-esteren som opprinnelig ble dannet, er tilstrekkelig stabil ved så høy pH.

CDAP (1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate; Figur 1) ble introdusert av Lees et al. for bruk som et cyanylerende middel for aktivering av polysakkarider^5,6. CDAP, som er krystallinsk og lett å håndtere, ble funnet å aktivere polysakkarider ved en lavere pH enn CNBr og med færre sidereaksjoner. I motsetning til CNBr kan CDAP-aktiverte polysakkarider direkte konjugeres til proteiner, noe som forenkler synteseprosessen. CDAP-aktiverte polysakkarider kan funksjonaliseres med diamin (f.eks. heksandiamin) eller en dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for å lage amino- eller hydrazid-derivatiserte polysakkarider. En høy konsentrasjon av homobifunctional reagens brukes til å undertrykke krysskobling av polysakkarider. Aminopolysakkarider kan deretter konjugereres ved hjelp av noen av de utallige teknikkene som brukes til proteinkonjugering. Hydrazid-derivatiserte polysakkarider kobles ofte til proteiner ved hjelp av karbodiimidreagens (f.eks. 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDAC))⁷. Ytterligere optimalisering av CDAP polysakkaridaktivering er beskrevet av Lees et al.⁸ og er innlemmet i protokollen som er beskrevet her.

Oversikt over CDAP-konjugering
CDAP-protokollen kan konseptualiseres som to faser: (1) aktiveringen av polysakkaridet og (2) konjugering av det aktiverte polysakkaridet med et protein eller en ligand (figur 2). Målet med det første trinnet er å effektivt aktivere polysakkaridet, mens målet med det andre er å effektivt konjugere til det aktiverte polysakkaridet. Det aktiverte polysakkaridet binder de to trinnene sammen. Denne konseptualiseringen bidrar til å fokusere på de kritiske elementene i hvert trinn. Figur 2 utvider denne konseptualiseringen, og viser ønskede aktiverings- og koblingsreaksjoner, sammen med hydrolysereaksjonene og sidereaksjonene.

I aktiveringsfasen er de tre største bekymringene CDAP-stabilitet, CDAP-reaksjon med polysakkaridhydroksylene og stabiliteten til det aktiverte polysakkaridet (figur 3). CDAP-hydrolyse øker med pH, det samme gjør hydrolysen til det aktiverte polysakkaridet og sidereaksjonene. CDAP-reaksjonen med polysakkaridet forenkles imidlertid ved å øke pH. Effektiv aktivering av polysakkarider med CDAP krever en balanse mellom 1) reaktivitet av polysakkarid og CDAP og 2) hydrolyse- og sidereaksjonene til både reagenset og det aktiverte polysakkaridet.

I den opprinnelige CDAP-aktiveringsprotokollen beskrevet av Lees et al.⁵ble CDAP-aktivering av polysakkarider utført ved romtemperatur i ubufferet pH 9-løsning. Aktiveringshastigheten ble funnet å være rask under denne tilstanden, og aktiveringen ville være fullført innen 3 minutter. Reaksjonen ble også ledsaget av rask hydrolyse av CDAP, noe som førte til en rask pH-dråpe av den ubufferede reaksjonsløsningen. Det var utfordrende å raskt heve og opprettholde reaksjonen pH på målverdien på så kort tid. I den beskrevne protokollen ble aktivering utført ved å legge til CDAP fra en 100 mg /ml lagerløsning til den ubuffered polysakkaridløsningen. PH ble hevet 30 s senere med "et likt volum på 0,2 M trietylamin". Protein som skal konjugereres ble deretter tilsatt etter 2,5 min til aktiveringsreaksjonen. Spesielt var pH for aktiveringstrinnet ikke godt kontrollert og sannsynligvis i utgangspunktet overskredet målet pH. Den raske reaksjonen som krever rask pH-justering gjorde aktiveringsprosessen vanskelig å kontrollere og utfordrende å skalere opp.

I motsetning til den opprinnelige protokollen har den modifiserte protokollen som er beskrevet her to store forbedringer. For det første er pH i polysakkaridløsningen forhåndsjustert til målaktivering pH, ved hjelp av DMAP som buffer, før tillegg av CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har dermed god bufferkraft rundt pH 9, og i motsetning til mange andre buffere ble det ikke funnet DMAP for å fremme CDAP hydrolyse⁸. Videre er DMAP allerede en prosess mellomliggende og legger derfor ikke til en ny komponent til reaksjonsblandingen. Forhåndsjustering av pH før du legger til CDAP eliminerer den store pH-svingen i begynnelsen av reaksjonen og gir mer effektivt vedlikehold av mål-pH under reaksjonen. Den andre forbedringen er å utføre aktiveringsreaksjonen ved 0 °C, der frekvensen av CDAP-hydrolyse er markert langsommere enn ved romtemperatur. Med lengre halveringstid for reagens ved 0 °C økes aktiveringstiden fra 3 min til 15 minutter for å kompensere for den langsommere aktiveringshastigheten ved lavere temperatur. Den lengre reaksjonstiden gjør det i sin tur lettere å opprettholde reaksjonen pH. Bruken av 0 °C reduserer også nedbrytningen av pH-sensitive polysakkarider, noe som gjør det mulig å forberede konjugater av denne typen polysakkarid. Forbedringene i protokollen gjør aktiveringsprosessen mindre frenetisk, enklere å kontrollere, mer reproduserbar og mer mottagelig for oppskalering.

Denne artikkelen beskriver den forbedrede protokollen for å utføre kontrollert CDAP-aktivering av polysakkarid ved 0 °C og ved et angitt mål-pH og utføre etterfølgende avledning av de aktiverte polysakkaridene med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfonsyre (TNBS) analyse, basert på metoden til Qi et al.⁹, for bestemmelse av hydrazidnivå på det modifiserte polysakkaridet. En modifisert analyse for heksoser basert på resorcinol og svovelsyre¹⁰ er også beskrevet, som kan brukes til å bestemme et bredere spekter av polysakkarider. Hvis du vil ha mer informasjon om CDAP-aktivering og -konjugering, refereres leseren til tidligere publikasjoner^5,6,8 av Lees et al.

Protocol

MERK: Klargjør polysakkaridløsningen, ADH-løsningen, DMAP-løsningen og CDAP-lagerløsningen på forhånd før du utfører polysakkaridaktiverings- og funksjonaliseringsprosedyrene. Plasser løsningene og utstyret på et organisert, praktisk og logisk sted. Reaksjonen som er beskrevet er for 10 mg polysakkarid og kan skaleres opp eller ned. Det anbefales å evaluere protokollen i liten skala før du skalerer opp.

1. Forbered 5 mg/ml polysakkaridoppløsning, 2 ml.

1. For lyofilisert polysakkarid
   1. La polysakkaridbeholderen komme til romtemperatur før åpning. Vei ut 10 mg polysakkarid inne i et skruehettrør ved hjelp av en analytisk balanse. Bruk en statisk eliminator for enklere prøvetaking og mer nøyaktig veiing av pulveret.
   2. Tilsett 2 ml 0,15 M natriumklorid (NaCl) i røret for å oppløse polysakkaridet. Hette og virvel røret.
      MERK: Natriumklorid påvirker ikke CDAP-reaksjonen, men det kan påvirke den sekundære polysakkaridstrukturen. Noen polysakkarider er mer oppløselige ved forskjellige saltkonsentrasjoner.
   3. Bland røret ved ende-over-end rotasjon i 12-24 timer, avhengig av polysakkaridmolekylær vekt, slik at polysakkaridet kan hydrere fullt ut. Om nødvendig, varm forsiktig røret for å fremme solubilisering.
2. For solubilisert polysakkarid i bufret oppløsning
   MERK: For effektiv CDAP-aktivering skal polysakkaridoppløsningen ikke inneholde buffer, spesielt fosfation. Følg fremgangsmåten nedenfor for å erstatte bufferen med vann eller saltløsning og for å justere polysakkaridkonsentrasjonen til 5 mg/ml.
   1. Få en 4 ml eller 15 ml sentrifugal-spinnfilterenhet med riktig molekylvektavskjæring (MWCO).
      MERK: MWCO er ideelt 5-10 ganger mindre enn molekylvekten til polysakkaridet.
   2. Tilsett et volum av den bufrede polysakkaridoppløsningen som inneholder ~20 mg polysakkarid i filterinnsatsen. Fyll på det fulle merket med vann eller en saltløsning. Hette filteret tett. Bland ved ende-over-end et par ganger.
   3. Sentrifuger filterenheten ved sentrifugalkraften som produsenten foreslo. Sørg for at sentrifugeringstiden er lang nok til å oppnå minst 5 ganger volumreduksjon etter hvert spinn. Kast gjennomstrømningen. Sett sammen filterenheten igjen.
   4. Fyll filterinnsatsen på det fulle merket med ferskvann eller saltløsning. Hette filteret tett. Bland innholdet i filteret ved ende-over-end rotasjon ~ 10 ganger eller ved skånsom virveling; gjenta spinnet.
      MERK: Polysakkarid kan akkumuleres i bunnen av filterinnsatsen på sentrifugalenheten og danner en gel. Det anbefales å blande retentanten inne i filterinnsatsen med den ferske påfyllingen før neste spinn.
   5. Gjenta påfyllings- og spinnsyklusen i minst 3 ganger.
   6. Følg øvelsen nedenfor for å gjenopprette polysakkaridets retentant fra filterinnsatsen.
      1. Tilsett ferskvann eller saltvann i filterinnsatsen slik at volumet er ~1 ml. Bland ved å pipettere opp og ned eller ved skånsom virvel.
      2. Overfør alt blandet retentant til et 5 ml rør. Tilsett 1 ml ferskvann eller saltvann i filterinnsatsen. Skyll filteret ved å pipettere opp og ned eller ved forsiktig virvel. Overfør og kombiner alle skyllingene med det gjenvunne polysakkaridet.
   7. Bestemme polysakkaridkonsentrasjonen (se polysakkaridanalysen i pkt. 7.3). Fortynn polysakkaridet med ekstra vann eller saltvann til 5 mg/ml.
3. Når polysakkaridoppløsningen er tilberedt, avkjøl røret som inneholder polysakkaridoppløsningen i en isbøtte.

2. Forbered 0,5 M adipic acid dihydrazid (ADH) løsning, 10 ml.

1. Vei 0,87 g ADH i analytisk balanse, og solubiliser i 8 ml 0,1 M HEPES (4-(2-hydroksyetyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), pH 8.
2. Juster til målet pH med 1 M natriumhydroksid (NaOH), overvåket av en pH-måler. Ta med til 10 ml med ekstra buffer og bekreft pH på nytt.

3. Forbered 2,5 M DMAP-løsning, 10 ml.

MERK: DMAP er giftig og vil trenge inn i huden. Bruk nitrilhansker når du utfører prosedyren.

1. Vei forsiktig 3 g DMAP inn i et konisk rør på 50 ml. Tilsett 5 ml vann til DMAP og bland ved virveling i 5 minutter for å få en overskyet løsning (~ 7 ml).
2. Under blanding tilsetter du 50 μL trinn på 10 N saltsyre (HCl) til DMAP-oppløsningen. Bland mellom hvert tillegg. Slutt å legge til når løsningen blir klar.
3. Tilsett 10 N NaOH i trinn på 25 μL for å bringe DMAP-løsningen til ~pH 8.
4. Ta DMAP-løsningen til 10 ml med vann for å gi en 2,5 M løsning.
5. Finjuster pH-en til 2,5 M DMAP-løsningen.
   MERK: DMAP-oppløsning pH endres med konsentrasjon og ionisk styrke. Denne øvelsen er å finjustere 2,5 M DMAP-lageret til en bestemt pH slik at når den blandes med 10 volumer polysakkarid, er den resulterende løsningen nær mål-pH for aktivering.
   1. Forbered en serie på 1,5 ml rør som inneholder 1 ml vann eller NaCl-løsningen, avhengig av hva som ble brukt til å forberede polysakkaridoppløsningen. Kjøl ned rørene på isen.
   2. Tilsett 100 μL DMAP i et kjølt rør. Virvel og mål pH med en pH-måler. Kast deretter det målte røret.
   3. Hvis den målte pH-verdien ikke er i nærheten av målverdien, justerer du pH-verdien for DMAP-lageret med 1 M NaOH eller HCl etter behov. Gjenta trinn 3.5.2 og 3.5.3 til den målte pH er nær målet pH.

4. Forbered 100 mg / ml CDAP-lagerløsning

MERK: CDAP-pulveret skal holdes tett lukket og oppbevares ved -20 °C og få romtemperatur før åpning. Bruk nitrilhansker når du utfører prosedyren.

1. Tara et 1,5 ml snap-cap mikrosenterrør på en analytisk balanse. Bruk en liten slikkepott til å veie ut 10-140 mg CDAP i røret. Legg merke til den faktiske vekten av CDAP.
2. Bestem volumet av acetonitril som trengs for å forberede 100 mg/ml CDAP. Åpne acetonitril i en avtrekkshette.
3. Bruk en passende volumpipet, tegn og slipp acetonitrile for å likevekte dampen i pipetspissen. Vent til løsningsmidlet drypper ut av pipetspissen etter noen sekunder, og vær forberedt på å overføre den direkte til CDAP-røret. Tegn det beregnede volumet av acetonitril og overfør det direkte til CDAP-røret. Trykk på hetten.
   MERK: Acetonitril kan også overføres til CDAP-røret ved hjelp av en Hamilton-sprøyte eller tilsvarende passende størrelse.
4. Vortex for å løse CDAP fullstendig. Plasser CDAP-røret i en isbøtte.
   MERK: CDAP er stabil i acetonitril i kulde. Løselige lagre kan oppbevares ved -20 °C i >1 uke. Det er imidlertid å foretrekke å tilberede ferske CDAP-løsninger.

5. Polysakkaridaktivering og hydrazidfunksjonalisering

1. Forsikre deg om at alle følgende gjenstander er klare og løsninger kjølt på is før du starter aktiveringen: 2 ml av en 5 mg / ml polysakkaridoppløsning i en flatbunnet, bredmunnbeholder som inneholder en rørestang, plassert på toppen av en magnetisk rører; 100 mg /ml CDAP lagerløsning; 2,5 M DMAP lagerløsning; en pH-måler med en semimikrop pH-sonde, for eksempel sonden med 6 mm diameter, kalibrert for 0 °C i henhold til produsentens instruksjoner; en 100 μL pipet klar til bruk; en tidtaker ryddet og klar til bruk; et autotitratordispenserhode plassert eller 10 μL pipet klar til bruk; 0,5 M ADH-løsning.
2. Forhåndsjuster pH-en til polysakkaridet til mål-pH ved hjelp av DMAP.
   1. Plasser pH-sonden i polysakkaridoppløsningen og la den ligge i oppløsningen under hele aktiveringsprosedyren.
   2. Overfør 200 μL av DMAP-lagerløsningen til polysakkaridoppløsningen ved dropwise addisjon under omrøring. Juster pH for løsningen til målaktiverings-pH. Tilsett 0,1 M HCl for å senke pH og 0,1 M NaOH for å øke pH. Unngå å overskride mål-pH med mer enn 0,1 pH-enhet, og hold reaksjonen avkjølt i et isvannbad så lenge aktiveringen varer.
3. CDAP-aktivering
   1. Pipet 100 μL CDAP opp og ned for å likevekte dampen i pipetspissen. Overfør 100 μL CDAP til polysakkaridoppløsningen ved omrøring.
      MERK: Denne aktiveringen bruker 1 mg CDAP for 1 mg polysakkarid som startforhold. Forholdet kan økes eller reduseres når aktiveringen optimaliseres.
   2. Start tidtakeren og overvåk pH-endringen under hele aktiveringen. Opprettholde reaksjonen på målet pH ved å umiddelbart legge 10 μL trinn på 0,1 M NaOH til reaksjonen, ved hjelp av en autotitrator dispenser (eller pipet).
      MERK: Det kan bidra til å redusere pH-responstiden for å røre forsiktig med en pH-sonde. pH faller raskere i begynnelsen, og det kan være nødvendig å legge til 0,1 M NaOH oftere. Etter hvert som reaksjonen fortsetter, blir pH-reduksjonen langsommere, og tillegget blir sjeldnere. pH bør forbli stort sett uendret når du nærmer deg den optimale aktiveringstiden, som er 10-15 min for pH 9-aktivering.
4. ADH-funksjonalisering
   1. Når den optimale aktiveringstiden er nådd, tilsett 2 ml 0,5 M ADH samtidig til det aktiverte polysakkaridet under omrøring. Kontroller at pH er i målområdet (pH 8-9 for ADH).
      MERK: Ett tillegg med hurtigblanding minimerer sannsynligheten for at begge ender av dihydraziden reagerer med det aktiverte polysakkaridet, og forhindrer krysskobling av polysakkarid.
   2. Fortsett å røre reaksjonsblandingen i minst 1 time. Overfør reaksjonsblandingen til 4 °C, men 0-20 °C er akseptabelt.
      MERK: ADH-funksjonsevnereaksjonen er ikke sterkt avhengig av temperatur. Ettersom det store overskuddet av dihydrazid fungerer som slukkende reagens, er det ikke nødvendig å slukke det aktiverte polysakkaridet ytterligere. Men når direkte konjugaterende proteiner, bør reaksjonen slukkes, vanligvis med 1 M glycin, pH 8-9.

6. Rensing av ADH-funksjonalisert polysakkarid ved dialyse

MERK: Råproduktet fra ADH-funksjonsevnereaksjonen inneholder en høy konsentrasjon av ADH (0,5 M), som kan fjernes mest effektivt ved omfattende dialyse. Gelfiltrering, enten med en kolonne eller en spin desalting enhet, er ikke så effektiv, spesielt når det er nødvendig å fjerne gjenværende ADH forurensning.

1. Bestem MWCO for dialysemembranen. Bruk en 3 kDa cutoff for mindre polysakkarider.
   MERK: MWCO i dialysemembranen er ideelt 5-10 ganger mindre enn MW polysakkarid.
2. Velg ønsket dialyseformat (kassetter eller slanger) og riktig enhetskapasitet. Kontroller at enhetskapasiteten er 2 ganger større enn prøvevolumet. Se produsentens instruksjoner for bruk av enheten.
3. Hydrater dialysemembranen i vann før bruk. Overfør den råavledede polysakkaridløsningen til dialyseenheten i henhold til produsentens instruksjoner.
   MERK: Bruk nitrilhansker for å unngå kontakt med DMAP.
4. Dialyze i en beholder fylt med 2-4 L 1 M NaCl og en rørestang. Plasser beholderen på en røreplate i et kaldt rom eller inne i et kjøleskap. Rør dialysen forsiktig og kontinuerlig under dialyse.
5. Etter dialyzing i minst 4 timer, bytt til frisk 1 M NaCl, og dialyze i minst 12 timer. Dialyze mot 2 endringer på 0,15 M saltvann, hver i minst 12 timer. Hvis ønskelig, dialyze mot 2 endringer av vann.
6. Kontroller om all ADH fjernes ved å teste dialysatet over natten ved hjelp av en rask TNBS-test.
   1. Få 3 borosilikatrør, merk dem som henholdsvis negativ kontroll (ctrl), positiv ctrl og prøve.
   2. Til det negative ctrlrøret legger du til 975 μL 0,1 M borat, pH 9.
   3. Til det positive ctrl-røret, tilsett 100 μL 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazid) og 875 μL 0,1 M borat, pH 9.
   4. Til prøverøret legger du til 500 μL av over natten dialysat og 475 μL 0,1 M borate, pH 9.
   5. Tilsett 25 μL 1% TNBS til alle tre rørene. Bland godt. Plasser i mørket i 1 time.
   6. Sammenlign fargeintensiteten til de 3 rørene i 1 time. Forsikre deg om at fargeintensiteten i prøverøret er mellom den positive ctrl og den negative ctrl, noe som indikerer at ADH-forurensningen er nede i 0,01 mM eller under. Ringyze en gang til.
      MERK: Det er forsvarlig å redusere nivået på ADH-forurensningen så mye som mulig, slik at ADH hydraziden står for mindre enn 1% av den totale hydraziden i renset hydrazid-polysakkarid.
   7. Gjenopprett det avledede polysakkaridet fra dialyse. Bestem konsentrasjonen av polysakkarider og hydrazid. Beregn hydrazid/polysakkaridforholdet (se pkt. 7). Hvis det dialysede polysakkaridet må konsentreres til 5-10 mg/ml, se pkt. 1.2.

7. Analyse av hydrazid-derivatiserte polysakkarider

MERK: Hensikten med analysen som er beskrevet her er å bestemme polysakkaridkonsentrasjonen, hydrazidkonsentrasjonen og nivået av hydrazidavledning når det gjelder hydrazid / polysakkaridforholdet.

1. Prøvepreparering
   MERK: Polysakkarider som skal analyseiseres, må være fri for karbohydrat, amin eller hydrazid urenheter med lav molekylvekt. Lyofiliserte prøver bør være tørre og saltfrie for å sikre nøyaktig vektmåling. Vanligvis er ~1 ml av en 1-2 mg/ml oppløsning tilstrekkelig for analyser.
   1. Vei minst 10 mg av den lyofiliserte polysakkaridprøven på en analytisk balanse, ved hjelp av en ikke-statisk spatel eller en statisk eliminator. Løs opp polysakkaridet i vann eller saltvann til en konsentrasjon (f.eks. 2 mg/ml) slik at analysesignalene faller innenfor det lineære området til standardkurven.
   2. Bland ende-over-end og la det være nok tid til at prøven kan oppløses helt. Utfør hydrering over natten avhengig av polysakkaridmolekylær vekt.
2. Polysakkaridanalyse: resorcinol/svovelsyremetode
   MERK: Riktig analyse for polysakkarider vil avhenge av polymerens karbohydratsammensetning. Den opprinnelige resorcinol/svovelsyreanalysen var beregnet på heksosesukker¹⁰. Analysen ble modifisert her ved å øke temperaturen på varmetrinnet fra 90 °C til 140 °C. Ved denne høyere temperaturen mister analysen noe spesifisitet, men kan brukes til å analyse mange sukkerarter. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å bestemme analysens egnethet for et bestemt polysakkarid. Triplikater anbefales for hvert punkt, men noe overnatting kan være nødvendig på grunn av kapasiteten til varmeblokken.
   1. Forbered 75% svovelsyre
      MERK: Konsentrert svovelsyre er ekstremt etsende og kan forårsake alvorlige brannskader. Utfør denne prosedyren i en kjemisk avtrekkshette. Hell alltid konsentrert syre i vann, ikke omvendt!
      1. Tilsett 50 ml vann til en 200 ml glassflaske. Plasser flasken i et kaldtvannsbad. Tilsett sakte 150 ml svovelsyre. Cap flasken slik at den er ventilert.
      2. La løsningen likevekte til romtemperatur. Bruk løsningen innen 3 måneder.
   2. Forbered karbohydratstandarder
      1. Forbered den umodifiserte polysakkaridoppløsningen ved 1 mg/ml som skal brukes som standard. Alternativt kan du bruke en blanding av individuelle sukkerarter i forholdet som finnes i repetisjonsenheten til polysakkaridet, ved 1 mg / ml av den totale sukkerkonsentrasjonen, som standard.
         MERK: Selv om sukkerblandingen vanligvis vil gi samme resultat som karbohydratpolymeren av identisk sukkersammensetning, bør dette bekreftes eksperimentelt.
   3. Påse at varmeblokken med rørholdere for 13 x 100 borosilikatreagensrør fungerer. Bruk en beskyttelsespute under og rundt varmeblokken i tilfelle syresøl. Forvarm varmeblokken til 140 °C i minst 1 time for å oppnå stabil, jevn temperatur gjennom alle blokkene som brukes.
   4. Etikett 13 x 100 borosilikat reagensrør, triplikat for hver standard og hver prøve. Tilsett 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (eller μL) av 1 mg /ml karbohydratstandarden til de tilsvarende merkede standardrørene. Tilsett vann til hvert rør for å bringe volumet til 100 μL.
      MERK: Fargen som genereres er avhengig av spesifikke sukkerarter. Ettersom noen sukkerarter krever mer masse for å generere hele absorbansområdet, kan de faktiske mengdene som brukes til standardkurven variere.
   5. Sett opp prøveanalyser ved å legge til et volum som inneholder ~ 5 μg av det avledede polysakkaridet til tre prøverør og bringe det totale volumet til 100 μL med vann. Alternativt, hvis polysakkaridkonsentrasjonen i prøven er ukjent, utfør en serie 4 ganger fortynning. Test 100 μL av hver fortynning i triplikat.
   6. Tilbered fersk resorcinol ved 6 mg/ml i deionisert (dI) vann umiddelbart før bruk. Virvel til resorcinol er i løsning. Tilsett 100 μL 6 mg/ml resorcinol i hvert rør.
   7. Hell forsiktig den estimerte mengden 75% svovelsyre i et lite beger.
      MERK: Bruk labjakke, nitrilhansker og vernebriller. Vær forsiktig med drypp, søl og sprut. Hold våte papirhåndklær praktiske for å tørke opp eventuelle drypp. Etter hvert som aktiviteten til svovelsyren endres ved utvidet eksponering for luft, bruk en jevn blanding av svovelsyre for hele analysen.
   8. Bruk en gjentatt pipettor, tilsett jevnt 300 μL 75% svovelsyre til hvert rør. Virvel rørene kraftig for å blande godt, peke røret bort mens virveler. Plasser rørene i en varmeblokk i et jevnt tempo i sekvensiell rekkefølge. Når alle rørene er inne, stiller du inn timeren i 3 minutter umiddelbart.
   9. På 3 min, fjern rørene i et jevnt tempo i samme rekkefølge, og legg dem direkte i et stativ i et isvannbad. La rørene stå til de er iskalde. Fjern rørene og la dem likevekte til romtemperatur i ~ 5 min for å forhindre kondens på cuvette under lesing.
   10. Still inn et UV/VIS-spektrofotometer for å lese absorbansen ved 430 nm ved hjelp av en 10 mm stilengde-cuvette. Blank med et null standard rør. Les absorbansen av alle rørene ved 430 nm.
       MERK: Engangsplast-dyner er praktiske å bruke.
   11. Lag en standardkurve ved å plotte μg karbohydratstandard vs. A₄₃₀. Se figur 4 for en typisk standardkurve ved bruk av glukose som referansestandard.
   12. Bruk prøveanalyserørene med A_430-verdier som faller innenfor det lineære området til standardkurven, beregn μg-mengden av det ukjente polysakkaridet i prøveanalyserørene fra standardkurveligningen. Bestem konsentrasjonen av det ukjente polysakkaridet fra volumet av det ukjente tilsatt, som står for fortynning. Konverter konsentrasjonen til mg/ml eller μM repetisjonsenheter etter behov.
3. Hydrazide-analyse ved bruk av trinitrobenzensulfonsyre (TNBS)
   1. Forbered 0,9% NaCl som inneholder 0,02% natriumazid (prøvebuffer) ved å oppløse 9 g NaCl og 200 mg natriumazid i dI H₂O til et endelig volum på 1 L.
   2. Forbered 0,1 M natriumskjeder, pH 9 (analysebuffer), ved å blande 100 ml 0,5 M natriumskjeder, pH 9, med 400 ml dI H₂O. Bekreft at oppløsningen pH er 9 ± 0,1; justere om nødvendig.
   3. Forbered 1% TNBS ved å fortynne 200 μL av 5% 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyreoppløsning til 1 ml med dI H₂O. Merk røret som 1% TNBS og oppbevar ved 4 °C i mørket i en uke.
   4. Forbered 50 mM ADH-lager (tilsvarende 100 mM hydrazid).
      1. Vei ut 871 mg adipic dihyrazid (ADH) pulver ved hjelp av en analytisk balanse. Løs opp pulveret i en reagensflaske ved å legge prøvebufferen til 100 ml ved hjelp av en topplasterbalanse.
      2. Merk flasken som 100 mM hydrazid/50 mM ADH. Hette flasken tett og oppbevar den ved 4 °C i ett år.
   5. Forbered hydrazidstandarder (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 og 0,6 mM hydrazid).
      1. Forbered de 6 hydrazidstandardene ved å fortynne 100 mM hydrazidlageret med prøvebuffer ved hjelp av en topplasterbalanse. Forbered 100 ml av hver standard for å minimere konsentrasjonsfeil. Lukk flaskene tett og oppbevar dem ved 4 °C i ett år.
   6. Sette opp analysereaksjoner
      MERK: TNBS-analysen kjøres med et reaksjonsvolum på 1 ml. Hvert analyserør består av 100 μL av en prøve (eller en standard), 875 μL analysebuffer og 25 μL 1% TNBS-løsning. Alle analysereaksjoner (for både prøver og standarder) er satt opp i triplikat.
      1. Etikett 3 borosilikatglassrør (12 x 75 mm) for hver standard, inkludert nullstandarden. Sorter og ordne standardrørene i rørstativet for å øke konsentrasjonen. Bruk en kalibrert 100 μL eller 200 μL mikropipette for å legge nøyaktig til 100 μL av standardene til hvert tilsvarende rør. For nullstandarden bruker du 100 μL prøvebuffer.
      2. Etikett 3 borosilikatglassrør (12 x 75 mm) for hver fortynnede prøve som skal analyses. Sorter og ordne prøverørene i rørstativet deretter. Bruk en kalibrert 100 μL eller 200 μL mikropipette for å legge nøyaktig til 100 μL av prøven til hvert tilsvarende prøverør.
      3. Bruk en kalibrert mikropipette på 1000 μL for å legge til 875 μL analysebuffer nøyaktig i alle analyserør: standardene og prøvene.
   7. For å starte analysereaksjonen, bruk en kalibrert 100 μL mikropipette for å legge nøyaktig til 25 μL 1% TNBS til hvert analyserør. Start fra nullstandardrørene, flytt til standardrørene for å øke konsentrasjonen, deretter til prøverørene i henhold til den forhåndsbestemte rekkefølgen. Bytt tips når du starter en ny standard eller en ny prøve og hold tiden brukt på å legge TNBS til alle rørene i løpet av 5 minutter.
      1. Virvel alle analyserør i 2 s ved høy hastighet eller med en hastighetsinnstilling, slik at væsken inne i analyserøret kan virvle oppover for å nå en høyde på 1/2 tomme fra røråpningen.
      2. Registrer starttidspunktet for analysen og sett tidtakeren til 2 timer. Plasser analyserørstativet i mørket ved romtemperatur i 2 timer. Når tiden er over, virvel alle rørene en gang til og fortsett til datainnsamling.
   8. Datainnsamling
      1. La UV/VIS spektrofotometeret varmes opp og grunnlinjen stabilisere seg. Still inn deteksjonsbølgelengden på 500 nm for hydrazidanalysen. Bruk en 1 ml kvartscuvette med 1 cm banelengde for alle absorbansmålinger for hele analysen.
      2. Start datainnsamlingen ved å overføre en nullstandardanalyse til cuvette; instrumentet (sett absorbansen til null).
      3. Utfør en enkelt lesing på hvert rør og registrer absorbansverdiene i en datatabell. Fjern eventuell restvæske fra cuvette før du leser en ny prøve. Start fra nullstandardene, flytt til standardene for økende konsentrasjon, og deretter til prøvene. Når du har startet, utfør alle trinnene effektivt uten å stoppe og lese alle rør innen 10 minutter.
   9. Analysere eksempeldata
      1. Lag en standardkurve ved å plotte mM hydrazid-standard kontra A₅₀₀. Finn standard kurveligningen i form av y = ax + b, der y representerer mM hydrazid og x representerer A₅₀₀. Se figur 4 for en typisk standardkurve.
      2. Beregn mM hydrazid i prøvene ved hjelp av standardkurveligningen, og juster for fortynningsfaktorene. Velg bare prøveanalyserørene med A_500-verdier som faller innenfor det lineære området til standardkurven for beregningen.
      3. Beregn molarforholdet mellom hydrazid/polysakkarid ved hjelp av ligning (1).
         Hydrazid/polysakkarid = h / c × MW (1)
         Der h er mM hydrazid, c er mg / ml konsentrasjonen av polysakkaridet, og MW er polysakkaridmolekylærvekten i kDa.
      4. Beregn hydrazidmerkingstettheten per 100 kDa polysakkarid ved hjelp av ligning (2).
         Merketetthet per 100 kDa polysakkarid = h / c × 100 (2)
         Hvor h er mM hydrazid, og c er mg / ml konsentrasjonen av polysakkaridet.
         MERK: For enkelhets skyld kan polysakkaridene betraktes å ha en molekylvekt på 100.000 daltons. Dette gjør det mulig å vurdere en "merkingstetthet" i å sammenligne nivået av avledning av ulike polysakkarider.
      5. Beregn hydrazidmerkingstettheten som vektprosent ADH.
         1. Bestem den effektive mg/ml-konsentrasjonen av ADH ved hjelp av ligning (3).
            mg/ml ADH = (mM hydrazid / 1000) × 174 (3)
            der 174 er MW av ADH.
         2. Beregn vekten % ADH ved hjelp av ligning (4).
            vekt % ADH = (mg/ml ADH) / (mg/ml polysakkarid) × 100 (4)

Representative Results

For å illustrere aktivering og avledning av et polysakkarid ved hjelp av CDAP-kjemi ble dextran aktivert ved 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran. For hver reaksjon ble en 10 mg/ml dekstranoppløsning i vann avkjølt på is, og 1/10^tonn av en 2,5 M DMAP-bestand (fremstilt som beskrevet i avsnitt 3) ble tilsatt. Den endelige løsningen ble brakt til pH 9 ved tilsetning av 0,1 M NaOH i 10 μL aliquots. Løsningen ble kjølt og rørt, CDAP lagt til, og pH opprettholdt ved pH 9 ved å legge til 10 μL aliquots på 0,1 M NaOH i 15 min. Bare 0,25 ml 0,5 M ADH ved pH 9 ble tilsatt (mindre enn vanlig mengde) og reaksjonen tillot å fortsette over natten ved 4 °C.

Den merkede dextranen ble deretter sekvensielt dialysert mot 1 M NaCl, 0,15 M NaCl og vann som beskrevet i avsnitt 6. ADH-dextran ble deretter analysert for dekstran ved hjelp av resorcinol/svovelsyreanalysen (pkt. 7.2). En typisk standardkurve med glukose som sukkerstandard er vist i figur 4A. Hydrazidinnholdet ble fastslått ved hjelp av TNBS-analysen beskrevet i pkt. 7.3. En typisk hydrazid standardkurve som bruker ADH som standard er gitt i figur 4B.

Representative beregninger fra aktivering av dextran på de to aktiveringsnivåene vises i figur 4A,B. Dataene presenteres som både hydrazides per 100 kDa dextran polymer og som en vektprosent av ADH til dextran, som beskrevet i pkt. 7.9.3.4 og 7.9.3.5, henholdsvis i figur 4C. Graden av avledning ble omtrent doblet da CDAP-forholdet ble doblet.

Figur 1: Kjemisk struktur av CDAP. CDAP = 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Prosessen med CDAP-aktivering og konjugering. Prosessen er konseptuelt delt inn i to faser, med den aktiverte polysakkariden som er vanlig for begge. Under grunnleggende forhold aktiverer CDAP hydroksyler av polysakkarid, og frigjør DMAP (reaksjon 1). CDAP-hydrolyse frigjør også DMAP (reaksjon 3). Selv om en cyano-ester vises, kan det hende at dette ikke er det faktiske mellomproduktet. Mellomproduktet kalles derfor (CDAP) "aktivert" polysakkarid. I løpet av den første aktiveringsfasen kan det aktiverte polysakkaridet hydrolysere (reaksjon 4) eller gjennomgå sidereaksjoner (reaksjon 5). I den andre konjugeringsfasen (reaksjon 2) reagerer det aktiverte polysakkaridet med et amin for å danne en stabil isoureabinding i tillegg til reaksjonene 4 og 5. Forkortelser: CDAP = 1-cyano-4-dimetylaminopyridin tetrafluoroborate; DMAP = 4-dimetylaminopyridin; R-NH₂ = Amin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: CDAP-aktivering og -konjugering. Prosessen krever balansering av CDAP-reaktivitet med polysakkaridet, stabiliteten til CDAP og aktivert polysakkarid, samt reaktivitet av det aktiverte polysakkaridet med aminets. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Representative resultater for CDAP-aktivering av dextran. Typiske standardkurver for (A) resorcinol/svovelsyre og (B) TNBS-analyser. Analyseresultatene for dekstran aktivert med 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran vises. Glukose ble brukt som standard for resorcinolanalysen. Dextran, i mg/ml, er delt på 100 kDa for å gi en molarkonsentrasjon. Hydrazidkonsentrasjonen bestemmes ved hjelp av ADH som standard og resultatene uttrykt som μM Hz. (C) Beregning av hydrazid: dekstranforhold. Nivået av avledning ble beregnet som hydrazides per 100 kDa dextran for å lette sammenligningen mellom polymerer av forskjellige gjennomsnittlige molekylvekter. Vektforholdet på g ADH/g dextran ble beregnet ved hjelp av en MW på 174 g/mol for ADH. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

CDAP er et praktisk reagens for å avlede og konjugere polysakkarider. Denne artikkelen beskriver den generelle metoden for å bruke CDAP til å avlede polysakkarider med hydrazides (PS-ADH) og inneholder nylig publiserte^{forbedringer 8}. For det første understreker teknikken viktigheten av å opprettholde mål-pH for å kontrollere aktiveringsprosessen. Vi fant ut at selv om mange vanlige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaksjonen, kan DMAP brukes som buffer for å administrere pH⁸. Videre er DMAP allerede et reaksjonsbiprodukt av CDAP-aktivering. Til slutt, bufring av polysakkaridløsningen med DMAP før du legger til CDAP, letter presis målretting og vedlikehold av reaksjonen pH. Som vi beskriver, er det nyttig å justere pH for den konsentrerte DMAP-lagerløsningen slik at den når den fortynnes når den målrettede pH. For det andre bremset prosessen i kulde reaksjonstiden, noe som gjorde aktiveringsprosessen mindre frenetisk og mer tilgivende. Lavere temperatur reduserte hastigheten på CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstiden ved pH 9 øker fra ~ 3 min til ~ 15 min. I tillegg er det nødvendig med mindre CDAP for å oppnå samme aktiveringsnivå enn ved romtemperatur.

ADH-derivatiserte polysakkarider kan konjugeres til proteiner ved hjelp av karbodiimider (f.eks. EDAC)⁷. For eksempel bruker flere lisensierte Haemophilus influensa b (Hib) vaksiner polyribosylribitolphosphate (PRP) derivatisert med ADH for å konjugere til stivkrampetoksoid ved hjelp av EDAC. CNBr ble opprinnelig ansatt, men CDAP er et mye enklere reagens å bruke til dette formålet. Etter vår erfaring er et godt målområde for ADH-avledning 10-30 hydrazides per 100 kDa polysakkarid eller ~ 1-3% ADH etter vekt.

Den samme prosessen kan brukes til å avlede polysakkarider med primære aminer ved å erstatte ADH for en diamin. Det anbefales å bruke heksandiamin for å avlede polysakkarider med aminer⁸. Det aminerte polysakkaridet (PS-NH₂) kan konjugeres ved hjelp av reagenser utviklet for proteinkonjugering¹¹. PS-NH₂ avledes vanligvis med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-karboksylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oksuccinimid ester (GMBS)), og proteinet er tiolated (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimid kjemi er svært effektiv.

Proteiner kan også kobles direkte til CDAP-aktiverte polysakkarider via ɛ-amin på lysiner. Mens aktiveringsprotokollen som brukes, generelt ligner den som er beskrevet her, er det nødvendig å optimalisere aktiveringsnivået, polysakkaridet og proteinkonsentrasjonen, samt protein: polysakkaridforholdet^5,6,8.

Dextran er en av de enkleste polysakkaridene å aktivere med CDAP på grunn av sin relativt høye tetthet av hydroksylgrupper, men noen polysakkarider, som Vi antigen, kan være utfordrende. Følgelig er det ingen enkelt "beste" protokoll for CDAP-konjugering direkte til proteiner. Vi foreslår først å utvikle en protokoll for å oppnå passende aktiveringsnivåer, som bestemt av omfanget av hydrazidavledning, og deretter fortsette å lede proteinkonjugering til CDAP-aktivert polysakkarid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma	34851
Adipic acid dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Micro stir bar	VWR	76001-878
Microfuge tube (for CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH meter
pH probe	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL	VWR	10754-696	A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip	Eppendorf	10 ml
DI water
Dialysis tubing	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips	Repligen	142150
Heating block
Nitrile gloves	VWR
Repeat pipettor	Eppendorf	M4
Resorcinol	Sigma	398047
Sugar standard		As appropriate
Sulfuric acid 75%	VWR	BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75	VWR	47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293.17