Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Published: August 3, 2021 doi: 10.3791/62599
Automatic Translation
1, 2, 2
1Department of Chemical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Center for Biomedical Engineering, School of Engineering, Brown University

Summary

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Abstract

Modelcelmembranen zijn een nuttig screeningsinstrument met toepassingen variërend van vroege ontdekking van geneesmiddelen tot toxiciteitsstudies. Het celmembraan is een cruciale beschermende barrière voor alle celtypen, die de interne cellulaire componenten scheidt van de extracellulaire omgeving. Deze membranen bestaan grotendeels uit een lipide bilayer, die buitenste hydrofiele kopgroepen en binnenste hydrofobe staartgroepen bevat, samen met verschillende eiwitten en cholesterol. De samenstelling en structuur van de lipiden zelf spelen een cruciale rol bij het reguleren van de biologische functie, inclusief interacties tussen cellen en de cellulaire micro-omgeving, die geneesmiddelen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen bevatten. In deze studie worden methoden beschreven om uni-lipide en multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde cel nabootsende lipide bilayers te formuleren. Eerder werden uni-lipide fosfatidylcholine (PC) lipide bilayers en multi-lipid placentale trophoblast-geïnspireerde lipide bilayers ontwikkeld voor gebruik bij het begrijpen van moleculaire interacties. Hier zullen methoden voor het bereiken van beide soorten tweelaagse modellen worden gepresenteerd. Voor celimitoren met meerdere lipiden wordt de gewenste lipidesamenstelling eerst bepaald via lipide-extractie uit primaire cellen of cellijnen, gevolgd door vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Met behulp van deze samenstelling worden lipideblaasjes vervaardigd met behulp van een dunne film hydratatie- en extrusiemethode en hun hydrodynamische diameter en zeta-potentieel worden gekarakteriseerd. Ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers kunnen vervolgens worden gevormd met behulp van kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D) en op een poreus membraan voor gebruik in een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA), respectievelijk. De representatieve resultaten benadrukken de reproduceerbaarheid en veelzijdigheid van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen. De gepresenteerde methoden kunnen helpen bij een snelle, gemakkelijke beoordeling van de interactiemechanismen, zoals permeatie, adsorptie en inbedding, van verschillende moleculen en macromoleculen met een celmembraan, wat helpt bij de screening van kandidaat-geneesmiddelen en voorspelling van potentiële cellulaire toxiciteit.

Introduction

Het celmembraan, voornamelijk samengesteld uit fosfolipiden, cholesterol en eiwitten, is een cruciaal onderdeel van alle levende cellen1. Met organisatie gedreven door lipide amfififilie, functioneert het celmembraan als een beschermende barrière en reguleert het hoe de cel interageert met zijn omgeving2. Verschillende cellulaire processen zijn afhankelijk van de lipide- en eiwitsamenstelling van hetmembraan 1,2. Celmembraaninteracties zijn bijvoorbeeld belangrijk voor effectieve medicijnafgifte3. Farmaceutische producten, biologische geneesmiddelen, nanomaterialen, biologische toxines en milieutoxische stoffen kunnen de integriteit van een celmembraan beïnvloeden, waardoor de cellulaire functie wordt beïnvloed4. De constructie van in vitro cel nabootsende membraanmodellen op basis van de lipidesamenstelling van celmembranen heeft het potentieel om gemakkelijke hulpmiddelen te bieden om de studie van de potentiële impact van deze materialen op cellen aanzienlijk te verbeteren.

Model lipide bilayers omvatten lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers, en gesuspendeerde lipide bilayers. Ondersteunde lipide bilayers zijn een model van het fosfolipide celmembraan dat vaak wordt gebruikt in biotechnologische toepassingen waarbij lipideblaasjes worden gescheurd op een ondersteund substraatmateriaal5,6,7,8,9. Een veelgebruikte techniek om de vorming van twee lagen te monitoren is kwartskristal microbalans met dissipatiemonitoring (QCM-D), die de adsorptie van blaasjes onderzoekt in vergelijking met de bulkvloeistofeigenschappen in situ8,10,11,12,13,14 . Eerder is QCM-D gebruikt om aan te tonen dat onder stroomomstandigheden, zodra een kritische blaasjesdekking van fosfatidylcholine (PC) lipideblaasjes op het oppervlak wordt bereikt, ze spontaan scheuren in stijve lipide bilayers15. Eerder werk heeft ook de vorming van ondersteunde lipide bilayer onderzocht met verschillende lipidesamenstellingen16, opname van lipide-eiwitten17,18,19en het gebruik van polymeerkussens20, wat ondersteunde lipide bilayers oplevert die in staat zijn om verschillende aspecten van de celmembraanfunctie na te bootsen.

Lipide bilayers zijn gebruikt om verschillende biologische barrières na te bootsen van subcellulaire tot orgaanniveaus, waaronder mitochondrion, rode bloedcel en levercelmembranen door de fosfolipide-, cholesterol- en glycolipidecomponenten te veranderen21. Deze complexere multi-lipide blaasjes kunnen aanvullende methoden vereisen om vesikelruptuur te bereiken, afhankelijk van de lipidesamenstelling. Eerdere studies hebben bijvoorbeeld een α-spiraalvormig (AH) peptide gebruikt dat is afgeleid van het niet-structurele eiwit 5A van het hepatitis C-virus om dubbellaagse vorming te induceren door de geadsorbeerde lipidenblaasjes te destabiliseren22,23. Met behulp van dit AH-peptide zijn eerder ondersteunde lipide bilayers gevormd die placentacellen nabootsen24. Het grote potentieel van ondersteunde lipide bilayers voor biomedische toepassingen is aangetoond met onderzoeken die moleculair en nanodeeltjestransportomvatten 25,26,omgevingstoxische interacties27,eiwitassemblage en -functie17,18,19,peptide-arrangement en insertie28,29,medicijnscreening30en microfluïdische platforms31.

Gesuspendeerde lipide bilayers zijn gebruikt voor farmaceutische screeningstudies via een parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA) waarbij een lipide bilayer wordt gesuspendeerd over een poreuze hydrofobe insert32,33,34,35. PAMPA lipide modellen zijn ontwikkeld voor verschillende biologische interfaces, waaronder de bloed-hersenen, buccale, intestinale en transdermale interfaces36. Door zowel de ondersteunde lipide bilayer als PAMPA technieken te combineren, kunnen adsorptie, permeabiliteit en inbedding van verbindingen in lipidecomponenten van een gewenst weefsel- of celtype grondig worden bestudeerd.

Dit protocol beschrijft de fabricage en toepassing van in vitro celmembraan lipide bilayer modellen om verschillende moleculaire interacties te onderzoeken. Voorbereiding van zowel uni-lipide als multi-lipide ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers is gedetailleerd. Om een ondersteunde lipide bilayer te vormen, worden lipideblaasjes eerst ontwikkeld met behulp van dunne-film hydratatie- en extrusiemethoden gevolgd door fysisch-chemische karakterisering. Vorming van een ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D monitoring en fabricage van gesuspendeerde lipidembranen voor gebruik in PAMPA wordt besproken. Ten slotte worden multi-lipide blaasjes voor de ontwikkeling van complexere celnabootsende membranen onderzocht. Met behulp van beide soorten gefabriceerde lipidemembranen laat dit protocol zien hoe deze tool kan worden gebruikt om moleculaire interacties te bestuderen. Over het algemeen construeert deze techniek cel nabootsende lipide bilayers met een hoge reproduceerbaarheid en veelzijdigheid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Het ontwikkelen van uni-lipide blaasjes

  1. Dunnefilmhydratatiemethode
    1. Bereiding en opslag van lipidenbestandsoplossingen
      OPMERKING: Alle stappen met chloroform moeten worden uitgevoerd in een chemische zuurkast. Chloroform moet altijd worden gepipetteerd met behulp van oplosmiddelveilige koolstofvezelpipetpunten. Oplossingen die chloroform bevatten, moeten altijd in glazen injectieflacons worden bewaard.
      1. Bereid een lipidenbouillonoplossing van 10 mg/ml door het juiste volume chloroform toe te voegen aan de injectieflacon met het lipidepoeder en meng goed. Voeg bijvoorbeeld 20 ml chloroform toe aan 200 mg L-α-fosfatidylcholine (ei, kip) (eggPC). De stamoplossing kan indien nodig in een andere concentratie worden gemaakt.
        OPMERKING: Als het poederlipide werd opgeslagen in een ampul, na toevoeging van chloroformtransfer aan een glazen injectieflacon met een met polytetrafluorethyleen (PTFE) beklede dop.
      2. Sluit de dop van de injectieflacon af met Parafilm en bewaar tot 6 maanden bij -20 °C.
    2. Vorming van een droge lipidefilm
      1. Voeg het juiste volume lipidenbouillonoplossing toe aan een injectieflacon met schoon glas die nodig is voor een uiteindelijke blaasjesconcentratie van 2,5 mg/ml. Om bijvoorbeeld 1 ml ei-pc-blaasjes te vormen bij 2,5 mg / ml, pipetteer 250 μl ei-pc-bouillonoplossing in de injectieflacon.
        OPMERKING: Het voorbereide volume kan afhankelijk zijn van het gebruikte extruderproces (zie stap 1.3). Het maximaal aanbevolen volume van de mini-extruder is 1 ml, terwijl het grote extrudervolumebereik 5-50 ml is.
      2. Verwijder chloroform uit lipidenvoorraadoplossing met behulp van een stroom N2-gas (ultrapure 5.0 Grade).
      3. Om ervoor te zorgen dat chloroform volledig wordt verwijderd, sluit u de gedroogde lipidefilm aan op vacuüm en laat u deze minstens 4 uur staan.
        OPMERKING: Het proces kan hier worden gestopt. Als de lipidenfilm niet onmiddellijk na het vacuümdrogen wordt gebruikt, bewaar dan in een exsiccator totdat deze is gebruikt. We hebben waargenomen dat deze lipidefilms blaasjes van vergelijkbare kwaliteit opleveren na 1 week opslag onder deze omstandigheden; de kwaliteit van het blaasje na langere opslagtijden, indien nodig, moet verder worden onderzocht.
    3. Bevriezing-dooi-vortexcycli uitvoeren
      1. Bereid een Tris natriumchloride (NaCl) bufferoplossing met 10 mM Tris base en 100 mM NaCl. Rehydrateer de gedroogde lipidefilm met het vereiste volume Tris NaCl-buffer om een uiteindelijke blaasjesconcentratie van 2,5 mg / ml en vortex gedurende ongeveer 15-30 s te verkrijgen.
      2. Breng de suspensie van het blaasje over in een container met droogijs tot het bevroren is, ongeveer 30 min. Nadat het monster volledig is ingevroren, ontdooit u de suspensie in een waterbad van 30-40 °C. Vortex de ontdooide blaasjessuspensie.
        OPMERKING: Vloeistof N2 kan worden gebruikt in plaats van droogijs. Breng de blaasjessuspensie gedurende 30 s over in vloeibare stikstof en ontdooi dan onmiddellijk in een waterbad van 80 °C.
      3. Herhaal stap 1.1.3.2 nog eens 4 keer, voor een totaal van 5 vries-dooi-vortexcycli.
  2. Extrusie
    OPMERKING: Nadat vries-dooi-vortexcycli zijn voltooid, worden multilamellaire blaasjes gevormd. Extrusie helpt bij het verkleinen van de grootte en het ontwikkelen van grote unilamellaire blaasjes.
    1. Mini (1 ml) extruder proces
      1. Reinig alle componenten van de extruder grondig met een mild reinigingsmiddel in ultrapuur water en spoel minstens drie keer met ultrapuur water om ervoor te zorgen dat al het reinigingsmiddel wordt verwijderd. Droog met N2 gas.
      2. Monteer de twee interne membraansteunen en O-ringen (binnendiameter van 12,7 mm; buitendiameter van 15,2 mm). Plaats elke membraansteun zo dat de O-ring naar boven is gericht.
      3. Bevochtig een filtersteun voor met ultrapuur water. Plaats het op het membraansteunoppervlak in de O-ring. Herhaal dit voor de tweede interne membraanondersteuning.
      4. Plaats één interne membraansteun in de buitenbehuizing van de extruder. Plaats één polycarbonaatmembraan van 100 nm op de interne membraansteun, direct boven de filtersteun.
        OPMERKING: De polycarbonaat membranen worden apart opgeslagen tussen stukjes blauw gekleurd papier. Verwijder het scheidingspapier voordat u het op de membraansteun inbrengt.
      5. Plaats de tweede interne membraansteun in de buitenbehuizing van de extruder met de O-ring en filtersteunzijde naar het polycarbonaatmembraan gericht. Bevestig het PTFE-lager in de houdermoer en schroef gesloten met de buitenbehuizing van de extruder. Klem de extruder in het verwarmingsblok.
      6. Laad de lipidenblaasjessuspensie in een van de spuiten en plaats de spuit in het warmteblok van de extruder, waarbij de naald volledig in het ene uiteinde van de extruder wordt ingebracht. Steek de tweede, lege spuit in de andere kant en vergrendel beide spuiten met behulp van de armclips op het warmteblok.
        OPMERKING: Plaats indien nodig het warmteblok van de extruder op een hete plaat en stel de temperatuur in op een waarde boven de overgangstemperatuur van het lipide. Plaats een thermometer in de houder die in het warmteblok is ingebouwd voor nauwkeurige temperatuurmetingen en wacht tot de vereiste temperatuur is bereikt (~ 15 min). Ei PC lipide blaasjes hebben geen warmte nodig tijdens extrusie.
      7. Duw de vesikelsuspensie langzaam in de lege spuit en vervolgens terug in de oorspronkelijke spuit. Controleer op drukveranderingen gedurende de extrusie die wijzen op een lek. Herhaal nog 20 keer voor een totaal van 21 passages door het polycarbonaatmembraan. Breng de lipideblaasjes over in een schone glazen injectieflacon voor opslag.
        OPMERKING: Het aantal extrusies kan worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de lipidesamenstelling.
      8. Als er warmte is gebruikt, laat dan extruded blaasjes suspensie op kamertemperatuur komen. Bewaar de geëxtrudeerde lipidenblaasjes bij 4 °C tot verder gebruik.
        OPMERKING: De aanbevolen opslagduur van het blaasje is sterk afhankelijk van de lipidensamenstelling en de fysisch-chemische eigenschappen van het blaasje (bijv. Hydrodynamische diameter, zetapotentiaal) moeten in de loop van de tijd worden gecontroleerd. Eier-pc-blaasjes zijn bijvoorbeeld minstens twee weken bewaard zonder verandering in de grootte van het blaasje of de vormingscapaciteit van de dubbellaag.
    2. Groot (5-50 ml) extruderproces
      OPMERKING: Volg stap 1.2.2.1-1.2.2.5 als warmte nodig is voor het gekozen lipide. Ga verder met stap 1.2.2.5 als warmte niet nodig is. Stappen 1.2.2.1-1.2.2.4 zijn niet vereist voor egg PC.
      1. Vul een kolf van 1 L met omgekeerde osmose (RO) water.
        OPMERKING: Gebruik geen ultrapuur water om door het 50 ml-systeem te circuleren, omdat dit ertoe kan leiden dat metaalionen uit de extrudercilinder lekken.
      2. Plaats de kolf van 1 L in een waterbad op een hete plaat en stel de kookplaat in op een temperatuur boven de overgangstemperatuur van het lipide.
      3. Bevestig de monstercilinder met flexibele slang aan de kolf via de inlaat op de monstercilinder. Bevestig de slang aan de uitlaat van de cilinder aan de bovenkant van de kolf van 1 L. Beveilig slangen bij zowel de inlaat als de uitlaat, indien nodig. Hierdoor ontstaat een unidirectionele stroming van het water door de monstercilinder.
      4. Schakel de pomp in om de watercirculatie te starten. Als warmte nodig is, wacht dan ongeveer 30-45 minuten voordat de monstercilinder de gewenste temperatuur bereikt.
      5. Sluit de dop van de monstercilinder aan op een stikstoftank via de flexibele connector die aan de overdrukklepeenheid is bevestigd.
      6. Reinig alle onderdelen van de 50 ml extruder met 70% (v/v) ethanol.
      7. Monteer de extruder door de schermsteun met groot gat, de gesinterde schijf, de afvoerschijven en het polycarbonaatmembraan in de ruimte in de onderste ondersteuning van de extruder te plaatsen. Sluit de bovenste en onderste steunen van de extruder aan met behulp van de vier schroeven en draai deze vast.
      8. Bevestig de extrudereenheid aan de monstercilinder door deze aan de onderkant te schroeven en vast te draaien met een moersleutel om vast te zetten.
        OPMERKING: Als er warmte wordt gebruikt, plaatst u een thermometer in de cilinder en wacht u tot het water de gewenste temperatuur heeft bereikt voordat u doorgaat. Dit zorgt ervoor dat de monstertemperatuur gedurende het hele extrusieproces wordt gehandhaafd.
      9. Vul de monstercilinder met ultrapuur water. Extrudeer het water door de extrudereenheid voordat u het monster in de monstercilinder toevoegt. Dit wordt gedaan om de membranen voor te bevochtigen, vergelijkbaar met de mini-extruder.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de dop volledig is vastgeschroefd en dat het overdrukventiel volledig is gesloten voordat u de stikstof inschakelt. Minimale druk is vereist voor deze stap (~ 5-10 psi).
      10. Voeg de lipidenblaasjessuspensie toe aan de monstercilinder en schroef de bovenkant dicht. Verhoog de druk langzaam totdat het monster met een snelheid van ongeveer 2-3 druppels/s uit de extrudereenheid in een injectieflacon van schoon glas begint te druppelen.
        OPMERKING: Verhoog de druk niet snel bij deze stap, omdat te veel druk de membranen negatief kan beïnvloeden en kan leiden tot mislukte extrusie.
      11. Zodra al het monster is geëxtrudeerd, schakelt u de N2-toevoer uit en laat u de druk in de monstercilinder los door de overdrukklep langzaam te openen. Giet de lipideblaasjes terug in de monstercilinder en herhaal stap 1.2.2.11 nog 9 keer voor een totaal van 10 extrusies.
        OPMERKING: De vereiste druk voor extrusie kan afnemen met een toenemend aantal extrusies, omdat het monster homogener wordt en dichter bij de poriegrootte van het polycarbonaatmembraan komt.
      12. Bewaar geëxtrudeerde lipide blaasjessuspensie bij 4 °C tot verder gebruik.

2. Karakteriseren van lipideblaasjes

  1. Hydrodynamische diametermeting met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS)
    1. Vortex lipide blaasjes en pipetteer 50 μL van de lipide blaasjessuspensie in een wegwerp cuvette met een laag volume. Afdekking om verontreiniging met stof en vuil te voorkomen.
    2. Laad de blaasjesophanging in het DLS-instrument, voer de monsterdetails in en voer de meting uit met behulp van de bijbehorende software.
  2. Zeta potentieel
    1. Bereid een gevouwen capillaire zetacel door te wassen met ultrapuur water, 70% ethanol en ultrapuur water met spuiten die verbinding maken met de ingang van de cel. Duw de vloeistof voorzichtig 3-4 keer door de cel en leeg de cel volledig voordat u overschakelt naar de volgende oplossing.
    2. Vortex de lipideblaasjes en bereid een 1:10 (v/v) verdunning van lipideblaasjes in ultrapuur water.
    3. Laad de verdunde lipide vesikelsuspensie. Verwijder luchtbellen door de suspensie heen en weer te duwen tussen de spuiten. Bevestig de stoppers aan elke inlaat.
      OPMERKING: Het is cruciaal om alle bubbels te verwijderen, omdat dit van invloed is op de meting.
    4. Plaats de zetacel in de monsterkamer en zorg ervoor dat de elektroden in contact komen. Sluit de bovenkant van de monsterkamer. Voer in de bijbehorende software de monstergegevens in en verzamel de meting.

3. Het vormen van een uni-lipide ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D

  1. Bereidingen van oplossingen
    1. Bereid een 2% (w/v) natriumdodecylodeylsulfaat (SDS)-oplossing in ultrapuur water. Meng op een roerplaat tot het helemaal opgelost is. Aliquot werkoplossingen van ten minste 10 ml ultrapuur water, 2% SDS en Tris NaCl.
    2. Bereid een verdunning van lipideblaasjes in Tris NaCl-buffer. De concentratie van blaasjes is afhankelijk van de toepassing. Voor ei-PC is aangetoond dat concentraties in het bereik van 0,01-0,5 mg / ml resulteren in succesvolle ondersteunde lipide bilayer-vorming.
  2. Reinigen van silica-gecoate kwartskristalsensoren
    OPMERKING: Het reinigen van QCM-D kristallen is afhankelijk van het oppervlaktemateriaal van de gebruikte sensor. Om ondersteunde lipide bilayers te vormen, worden silica-gecoate kwartskristallen gebruikt in dit protocol en hieronder beschreven zoals aangepast aan de standaardwerkprocedure van de fabrikant.
    1. Plaats de met silica gecoate kwartskristalsensor in de stroommodule en zorg ervoor dat de "t" op het kristal uitlijnt met de "t" op de module. Schroef de flowmodule dicht.
      OPMERKING: Als de gebruikte QCM-D het mogelijk maakt om meerdere flowmodules aan te sluiten en tegelijkertijd uit te voeren, herhaalt u indien nodig de volgende procedures voor de extra modules.
    2. Plaats de stromingsmodule in de basis van het instrument met de elektroden van de stroommodule die verbinding maken met het analysesysteem. Vergrendel de module op zijn plaats.
    3. Sluit de inlaat- en uitlaatbuizen aan op de debietmodule en de pomp. Plaats de slang in de beschermers en sluit het deksel van het analysesysteem. Plaats een afvalcontainer aan de uitlaat van de pomp om gebruikte oplossingen op te halen.
    4. Om de reiniging uit te voeren, zet u eerst de pomp aan. Stel de stroomsnelheid in op 400 μL/min. Plaats de inlaatbuis in ultrapuur water en stroom 5-10 ml door de module.
    5. Schakel de inlaatbuis om in 2% SDS en stroom 5-10 ml door de module. Schakel de inlaatbuis terug in ultrapuur water en stroom 10-20 ml door de module. Verwijder de inlaatbuis uit de oplossing en laat lucht door de slang stromen totdat alle vloeistof is uitgeworpen.
      OPMERKING: Het bovenstaande reinigingsprotocol wordt dagelijks voor en na elke meting gebruikt. Een grondige reiniging kan indien nodig worden uitgevoerd. Kortom, om een grondige reiniging uit te voeren, demonteer de stroommodules. Alle componenten, behalve de elektrodezijde van de stromingsmodule, moeten worden ondergedompeld in 2% (w / v) SDS en badsonisch worden gesoniseerd, gevolgd door grondig spoelen met ultrapuur water en drogen met een stroom van N2-gas. Het onderdeel van de stromingsmodule dat de elektrodepennen bevat, mag nooit in contact komen met vloeistof.
    6. Verwijder de sensor uit de stromingsmodule en spoel de sensor af met ultrapuur water. Droog de sensor met een N2 gasstroom. Droog de stromingsmodule met een N2 gasstroom. Zorg ervoor dat de elektrode altijd vrij blijft van vloeistof.
    7. Plaats in een chemische zuurkast de met silica gecoate kwartskristalsensor in een ultraviolet (UV)/ozonreinigingsinstrument. Zet het instrument aan en laat de behandeling minstens 2 minuten toe. Verwijder de sensoren voorzichtig en keer terug in de flowmodule.
  3. Een Tris NaCl baseline vormen
    1. Schakel het analyse-instrument in om verbinding te maken met de bijbehorende software en stel de temperatuur in op de gewenste waarde voor de ondersteunde lipide bilayer. Laat de temperatuur stabiliseren tot de gewenste ingang.
      OPMERKING: Als de ingestelde temperatuur boven de kamertemperatuur ligt, moeten alle oplossingen met behulp van een warmteblok tot dezelfde temperatuur worden verwarmd.
    2. Configureer de meting en zoek alle sensorresonantiefrequenties en dissipaties voor boventonen 3, 5, 7, 9, 11 en 13 voordat u met de meting begint.
      OPMERKING: De1e boventoon kan worden genegeerd omdat deze harmonische overgevoelig is en luidruchtige gegevens produceert.
    3. Schakel de pomp in en stel het debiet in op 175 μL/min of het gewenste experimentele debiet.
    4. Veeg de inlaatslang af met ethanol voordat u deze in Tris NaCl inbrengt. Start de meting en begin met het stromen van Tris NaCl.
      OPMERKING: Gegevens worden in realtime verzameld en bewaakt. De verandering van lucht naar vloeistof in de stroommodule zal worden waargenomen in de gegevensverzamelingssoftware door een snelle dissipatieverandering (ΔD) toename en frequentieverandering (ΔF) afname.
    5. Laat Tris NaCl gedurende 5-10 minuten door de module stromen en zorg ervoor dat de uitgangswaarden ΔF en ΔD in vloeistof stabiel blijven.
  4. Het vormen van een uni-lipide ondersteunde lipide bilayer
    1. Stop de pomp en verwijder de inlaatslang uit de Tris NaCl-oplossing en breng voorzichtig in de lipidenblaasoplossing. Terugstroom gedurende 5 s om eventuele luchtbellen uit de inlaatbuis te verwijderen en ga dan verder met de voorwaartse stroom. Start de meting opnieuw in de software om de basislijn op nul te zetten.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u luchtbellen in de buis vermijdt, die door de module kunnen stromen en de vorming van twee lagen en de gegevensregistratie kunnen verstoren.
    2. Stroming lipide blaasjes tot de vorming van twee lagen wordt waargenomen in real-time in de data-acquisitie software (ten minste 8 min voor ei PC blaasjes).
    3. Herhaal stap 3.4.1 om de inlaatbuis van lipidenblaasjes terug te veranderen in de Tris NaCl-buffer.
      OPMERKING: Als de gewenste toepassing is om moleculaire interacties te bestuderen, gaat u direct verder met stap 6.1 zonder de oplossingsstroom of gegevensverzameling te stoppen. Als bilaagse vorming het eindpunt is, gaat u verder met stap 3.4.4.
    4. Stop in de software de meting en sla het bestand op. Stop de pomp.
    5. Reinig de stromingsmodule en de met silica gecoate kwartskristalsensor volgens de protocolstappen 3.2.4 en 3.2.5.

4. Het vormen van een gesuspendeerde lipide bilayer

OPMERKING: Het protocol voor het vormen van een gesuspendeerde lipide bilayer is aangepast van het parallelle kunstmatige membraandoorlaatbaarheidstest (PAMPA) protocol dat wordt geleverd door de filterplaatfabrikant37.

  1. Oplosbare lipide in dodecaan bij 20 mg / ml (bijv. 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC)).
  2. Voeg 5 μL van de lipide-oplossing toe aan het donorcompartiment, een poreuze polyvinylideendifluoride (PVDF) 96-well multiscreen filterplaat (poriegrootte van 0,45 μm).
  3. Dompel de filterplaat onmiddellijk onder in het acceptorcompartiment, een transportontvangerplaat met 300 μL 1× fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 200 μL 1× PBS toe aan het donorcompartiment.
    OPMERKING: Controles van filters met alleen lipiden en onbehandelde filters die zijn blootgesteld aan 1× PBS kunnen worden opgenomen.
  4. Ga direct verder naar rubriek 6.2 om moleculaire interacties met de gesuspendeerde lipide bilayer te onderzoeken. Het wordt aanbevolen om het onderzoek binnen 16 uur na het vormen van de gesuspendeerde dubbellaag te voltooien.

5. Het ontwikkelen van multi-lipide cel nabootsende blaasjes en bilayers

  1. Lipide-extractie uit zoogdiercellen
    OPMERKING: Lipide-extractie volgt de Bligh-Dyer-benadering38.
    1. Kweek de gewenste cellijn indien van toepassing. Na het bereiken van 70-80% confluentie (T75-kolf), de cellen losmaken met trypsine-ethyleendiaminetreta-azijnzuur bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    2. Centrifugeer cellen bij 200 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in 1 ml ultrapuur water.
    3. Voeg gedurende 15 minuten 3,75 ml van een 1:2 (v/v) mengsel van chloroform:methanol toe aan de celsuspensie en vortex. Voeg vervolgens 1,25 ml chloroform en vortex toe gedurende 1 minuut. Voeg ten slotte 1,25 ml water en vortex toe gedurende 1 minuut.
    4. Centrifugeer het celmengsel bij 1000 x g gedurende 10 minuten. Verzamel de onderste laag vloeistof, die lipiden bevat in de organische fase. Droog onder een stroom van N2 gas.
    5. Kwantificeer het lipidengehalte met behulp van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) met behulp van een C18 omgekeerde fase, 3,5 μm × kolom van 50 mm.
    6. Bereid voor de mobiele fase twee oplossingen voor, de eerste met 60:40 (v/v) acetonitril:water en de tweede met 90:10 (v/v) isopropanol:acetonitril. Ammoniumformiaat moet aan beide oplossingen worden toegevoegd in een eindconcentratie van 10 mM. Verhoog gedurende 60 minuten de mobiele fasegradiënt van 35% (v/v) van de tweede oplossing naar 95% (v/v).
    7. Detecteer het effluent in negatieve ionisatiemodus, met opeenvolgende full-scan MS en tandem MS / MS. Identificeer de individuele fosfolipidesoorten aan de hand van hun massa-tot-lading (m / z) -verhoudingen. Analyseer de massaspectra van door botsingen geïnduceerde dissociatiefragmentatie met behulp van LIPID MAPS massaspectrometrie-analysetools. Verkrijg geëxtraheerde ionchromatogrammen om het gebied onder de curve te integreren en de abundantie van elke lipidesoort te bepalen.
    8. Voer stappen 5.1.5-5.1.7 uit voor een lipidenstandaard die de belangrijkste lipideklassen bevat om de relatieve detectiegevoeligheden voor elke verschillende fosfolipideklasse te bepalen.
  2. Ontwikkeling van multi-lipide blaasjes
    1. Volg de stappen in 1.1.1 om lipidenvoorraadoplossingen te bereiden voor lipiden die elke gewenste dubbellaagse component vertegenwoordigen, zoals geïdentificeerd in stap 5.1.
    2. Voeg op basis van de lipidesamenstellingen verkregen uit stap 5.1 het juiste volume lipide/chloroformvoorraad toe aan een injectieflacon met schoon glas die nodig is voor een uiteindelijke blaasconcentratie van 2,5 mg/ml. Verwijder de chloorform droogoplossing in bulk onder een stroom van N2-gas.
    3. Volg stap 1.1.2, 1.1.3 en 1.2 om multi-lipide blaasjes te vormen. Volg stap 2 voor de karakterisering van blaasjes.
  3. Het vormen van een multi-lipide ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D
    OPMERKING: Sommige multi-lipide blaasjes kunnen resulteren in spontane lipide blaasjesruptuur en dubbellaagse vorming vergelijkbaar met uni-lipide PC-blaasjes gepresenteerd in stap 3. Complexere multi-lipide blaasjes kunnen echter externe input vereisen om te helpen bij het scheuren van blaasjes. Hier wordt het AH-peptide gebruikt om de buitenste deelfolder van het blaasje te destabiliseren, wat resulteert in de vorming van twee lagen. Andere methoden om destabilisatie en vesikelruptuur te bereiken, kunnen indien gewenst worden overwogen.
    1. Volg stap 3 om de multi-lipide ondersteunde lipide bilayer te vormen met behulp van de multi-lipide blaasjes gevormd in stap 5.2.
    2. Als spontane breuk van de blaasjes in een dubbellaagse niet wordt waargenomen, probeer dan blaasjes te destabiliseren met behulp van het AH-peptide. Bereid de AH-peptide (peptidesequentie: H-Ser−Gly-Ser−Trp-Leu−Arg−Asp−Val−Trp−Asp−Trp−Ile−Cys−Thr−Val−Thr−Asp−Phe−Lys−Thr−Trp-Leu−Gln−Ser−Lys−Leu−Asp−Tyr−Lys−Asp-NH2) oplossing bij 13 μM in Tris NaCl met 1% (v/v) dimethylsulfoxide, DMSO.
    3. Volg de stappen 3.4.1-3.4.3. Vervang na stap 3.4.3 de inlaatslang in de AH-peptideoplossing. Breng de oplossing in de stroommodule totdat ΔF en ΔD worden waargenomen vanuit de toevoeging van de nieuwe oplossing. Stop de pomp en laat het AH-peptide gedurende 10 minuten incuberen met de blaasjes.
    4. Schakel de inlaatbuis in Tris NaCl en start de stroom om het AH-peptide uit de gescheurde blaasjes te verwijderen, wat leidt tot een succesvolle vorming van een lipide bilayer.
      OPMERKING: Als de gewenste toepassing is om moleculaire interacties te bestuderen, gaat u verder met de richting van stap 6.1 zonder de oplossingsstroom of gegevensverzameling te stoppen.
    5. Stop in de software de meting en sla het bestand op. Stop de pomp.
    6. Reinig de stroommodule en de met silica gecoate kwartskristalsensor volgens de protocolstappen 3.2.4-3.2.6.
  4. Gesuspendeerde multi-lipide bilayers
    1. Oplosmiddel mengsel van gewenste lipiden in dodecaan bij 20 mg / ml.
    2. Maak een lipidenmixoplossing van 5 μL met behulp van de gewenste celimimerende samenstelling.
    3. Volg stap 4.2 en 4.3.
      OPMERKING: Ga direct verder met stap 6.2 om moleculaire interacties met de gesuspendeerde lipide bilayer te onderzoeken.

6. Molecuulinteractiestudies met uni-lipide en multi-lipide bilayers

  1. Het bestuderen van moleculaire interacties met een ondersteunde lipide bilayer met behulp van QCM-D
    1. Bereid een oplossing van het gewenste molecuul voor om adsorptie te onderzoeken met een ondersteunde lipide bilayer. Bereid bijvoorbeeld een oplossing van 200 μM di(2-ethylhexyl) ftalaat (DEHP) in Tris NaCl met 1% (v/v) DMSO.
    2. Als de molecuuloplossing wordt bereid in Tris NaCl, kan deze direct na stap 3.4.3 worden gestroomd voor een uni-lipide bilayer of 5.3.4 voor een multi-lipid bilayer. Als het molecuul in een ander oplosmiddel moet worden bereid, plaatst u in plaats daarvan de inlaatbuis gedurende ten minste 5 minuten alleen in het gewenste oplosmiddel (bijv. Tris NaCl met 1% (v/v) DMSO voor DEHP).
      OPMERKING: Viscositeitsveranderingen als gevolg van het oplosmiddel kunnen worden gecontroleerd en overwogen door het te laten stromen vóór en na de introductie van het betreffende molecuul.
    3. Schakel de inlaatbuis gedurende ten minste 5 minuten in de oplossing met het molecuul van belang en stroom. De stroom kan ook worden gestopt en vloeistof met het gewenste molecuul kan indien gewenst met de dubbellaag incuberen.
    4. Verander de inlaatslang terug naar het molecuuloplosmiddel alleen als er iets anders is dan Tris NaCl. Stroom gedurende ten minste 5 minuten. Schakel vervolgens de inlaatbuis om in Tris NaCl en laat minstens 5 minuten stromen.
    5. Stop in de software de meting en sla het bestand op. Stop de pomp.
    6. Reinig de stroommodule en de met silica gecoate kwartskristalsensor volgens de protocolstappen 3.2.4-3.2.6.
  2. Het bestuderen van moleculaire interacties met gesuspendeerde lipide bilayers met behulp van PAMPA
    1. Bereid een oplossing van het gewenste molecuul. Bereid bijvoorbeeld een 200 μM DEHP in 1× PBS met 1% (v/v) DMSO.
    2. Bereid een nieuwe transportontvangerplaat voor met 300 μL verse 1x PBS per put.
    3. Onmiddellijk na stap 3.3 voor een uni-lipide gesuspendeerde bilaag of 4.4.3 voor een multi-lipide gesuspendeerde bilayer, verwijdert u de 1× PBS uit het donorcompartiment van de multiscreen filterplaat en vervangt u door 200 μL van de testoplossing. Dompel onmiddellijk onder in de in stap 6.2.2 voorbereide transportontvangerplaat.
    4. Incubeer met zacht wiegen gedurende een gewenste tijd (bijv. 2 uur) bij 25 °C.
    5. Verzamel na incubatie 150 μL van de oplossing uit de donor- en acceptorcompartimenten. Meet de molecuulconcentratie in beide monsters met behulp van een geschikte methode op basis van de eigenschappen van dit molecuul.
      1. Gebruik bijvoorbeeld een microplaatspectrofotometer met de juiste absorptiegolflengte, zoals 280 nm voor DEHP, en vergelijk met een standaardcurve van het betreffende molecuul.
    6. Bereken de schijnbare permeabiliteit (Papp) van het betreffende molecuul met behulp van de volgende vergelijkingen:
      Equation 1 (1)
      Waar Equation 2 (2)
      OPMERKING:[teststof]-acceptor is de concentratie van het betreffende molecuul (bv. DEHP) op tijdstip t, in het acceptorcompartiment; en [teststof]initiaal is de beginconcentratie van het molecuul. A is het membraangebied, t is de tijd, VD is het volume van het donorcompartiment en VA is het volume van het acceptorcompartiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dit protocol beschrijft methoden voor het vormen van ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers (Figuur 1). De eerste stap naar het vormen van een ondersteunde lipide bilayer is het ontwikkelen van lipideblaasjes. Met de mini-extruder kunnen kleine volumes lipideblaasjes worden bereid (1 ml of minder), terwijl de grote extruder het mogelijk maakt om 5-50 ml lipideblaasjes in één batch te bereiden. Grootteverdelingen van uni-lipide blaasjes gevormd door de mini- of grote extruder worden weergegeven in figuur 2A. Omdat de grote extruder hogedruk N2-gas gebruikt om de blaasoplossing door het polycarbonaatmembraan te duwen, resulteren lipideblaasjes in een gemiddelde grootteverdeling bij de beoogde hydrodynamische diameter van 100 nm. De mini-extruder resulteert ook in een uniforme verdeling, hoewel de hydrodynamische diameter van het blaasje iets groter is dan de poriegrootte van polycarbonaat, wat typerend is voor deze handmatige extrusiemethode.

Figuren 2B-D vergelijken grootte, polydispersiteit en zeta-potentieel van uni-lipide ei-PC-blaasjes en twee multi-lipide blaasjessamenstelling. Tabel 1 vergelijkt de gemiddelde hydrodynamische diameter van elke lipideblaasjessamenstelling. De samenstelling van het eerste multi-lipide blaasje (ML1) is representatief voor placenta-trofoblast geïnspireerde lipide blaasjes met een samenstelling van 57:15:8:8:12 % (w/ w) van PC: fosfatidylethanolamine (PE): fosfatidylinositol (PI): fosfatidylserine (PS): sfingomyeline (SPH). De grootteverdeling van de ei-pc-blaasjes en ML1-blaasjes zijn zeer uniform en bijna identiek, met kleine verschillen in de gemiddelde polydispersiteit (figuur 2A,B). Zoals verwacht, als gevolg van verschillen in samenstelling, bleek de zeta potentiaal van de ei PC uni-lipide blaasjes en het ML1-blaasje te verschillen(Figuur 2D). Het tweede multi-lipide blaasje (ML2) is 60% ei PC en 40% 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylfosfocholine (EPC). De positieve lading van EPC leidde tot een positief zeta-potentieel voor deze blaasjes (figuur 2D) en een toename van de polydispersiteitsindex van ML2-blaasjes werd ook waargenomen in vergelijking met ei-PC- of ML1-blaasjes, waarschijnlijk een gevolg van de specifieke samenstelling van deze blaasjes.

QCM-D kan worden gebruikt om ondersteunde lipide bilayers te vormen via blaasjesruptuur op een silica-gecoate sensor, en ΔF en ΔD tijdens dit proces worden in realtime bewaakt. ΔF is omgekeerd evenredig met massaveranderingen en verhoogde ΔD duidt op een toename van de structuurfluïditeit. Naarmate blaasjes adsorberen aan de sensor, neemt ΔF af en neemt ΔD toe. Naarmate het blaasje een kritische vesikeldekking aan het oppervlak bereikt, zal er een plateau van de ΔF en ΔDzijn. Ten slotte, als de blaasjes scheuren, wordt een ΔF-toename en ΔD-afname waargenomen, als gevolg van het vrijkomen van ingekapseld water uit gescheurde blaasjes en de vorming van stijve dubbellaags, respectievelijk. Figuur 3 toont de ΔF en ΔD die optreden als de blaasjes adsorberen en scheuren op het oppervlak voor uni-lipide en multi-lipide bilayer formaties. Uni-lipide ei PC blaasjes gemakkelijk adsorberen aan het oppervlak zoals blijkt uit de ΔF afname en ΔD toename. Kritieke blaasjesdekking wordt binnen 5 minuten bereikt, waarna de blaasjes beginnen te scheuren. De totale ΔF waargenomen bij ondersteunde ei PC bilayer vorming is ~-25 Hz, met ΔD van ~0.

ML1-blaasjes doen er langer over om te adsorberen in vergelijking met ei-pc-blaasjes en in tegenstelling tot deze blaasjes scheuren ze niet spontaan, maar blijven ze stabiel op het oppervlak. In plaats daarvan mag een AH-peptide incuberen met de geadsorbeerde blaasjes waardoor ze scheuren wanneer het AH-peptide wordt verwijderd met een Tris NaCl-spoeling. Tijdens breuk- en dubbellaagse vorming wordt de ΔF-toename en ΔD-afname waargenomen, vergelijkbaar met de ei-PC-blaasjes. De ΔF van deze multi-lipide bilayer resulteert in ongeveer -28 Hz en ΔD van ongeveer 1 × 10-6. Hoewel vergelijkbaar met de ei-PC lipide bilayer, wijzen deze kleine verschillen in ΔF en ΔD waarschijnlijk op de verhoogde vloeibaarheid van de bilayer als gevolg van de meerdere lipidetypen die in de structuur aanwezig zijn.

Na dubbellaagse vorming kunnen deze structuren worden gebruikt om interacties met verschillende verbindingen te bestuderen. Met ondersteunde lipide bilayers kunnen ΔF en ΔD worden geanalyseerd voor en na introductie van de verbinding. Als voorbeeld, DEHP interactie met ondersteunde uni- en multi-lipide (ML1) bilayers worden weergegeven in figuur 4A,B. In dit geval worden vergelijkbare niveaus van DEHP-adsorptie waargenomen voor beide lipide bilayer types (Figuur 4A). Er werden echter verschillen in ΔD waargenomen tussen de bilayers, waarbij een grotere ΔD werd gezien voor de egg PC bilayer in vergelijking met de ML1 bilayer(Figuur 4B). Terwijl de ondersteunde lipide bilayer de studie van de adsorptie en potentiële inbedding van verbindingen van belang mogelijk maakt, samen met mogelijke lipideverwijdering, kunnen gesuspendeerde lipide bilayers informatie geven over de permeabiliteit over de bilayer met behulp van een PAMPA. In het geval van DEHP werd weinig permeatie waargenomen voor zowel uni- als ML1-dubbellagen (figuur 4C). Papp berekend voor DEHP over een uni-lipide (~ 5,5 × 10-11 cm / s) en multi-lipide bilayer (~ 6,5 × 10-6 cm / s) was kenmerkend voor lage permeabiliteit. Andere verbindingen kunnen echter resulteren in een grotere permeabiliteit, die met deze techniek kan worden onderzocht.

Figure 1
Figuur 1: Proces van het vormen van ondersteunde lipide bilayers (boven) en gesuspendeerde lipide bilayers (onder). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Karakterisering van unilipiden en multilipidenblaasjes. (A) Hydrodynamische diameterverdeling van ei-pc-blaasjes gevormd met behulp van een mini-extruder en een grote extruder. (B) Hydrodynamische diameterverdeling van unilipidenblaasjes die ei-PC en twee multilipidenformuleringen bevatten, ML1 (57:15:8:8:12 % (g/g) PC:PE:PI:PS:SPH) en ML2 (60:40 % (m/m) ei PC:EPC). (C) Polydispersiteitsindices van de uni-lipide en multi-lipide blaasjes. (D) Zetapotentialen van de uni-lipide en multi-lipide blaasjes. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische significantie werd berekend met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) met Tukey's post-hocanalyse (α = 0,05, p<0,05 werd als statistisch significant beschouwd, * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001, ****p<0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Uni-lipide ei PC dubbellaagse vorming(ΔF in lichtblauw en ΔD in lichtrood) en een multi-lipide bilayer formatie (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH)(ΔF in donkerblauw en ΔD in donkerrood) in de loop van de tijd gemonitord met QCM-D. Stippellijnen geven oplossingsveranderingen aan voor uni-lipide bilayer-vorming (lichtblauw) en multi-lipide bilayer-vorming (donkerblauw). De ei-pc-bilayer wordt gevormd door ~ 15 min, terwijl de multi-lipide bilayer ~ 45 min duurt en toevoeging van het AH-peptide vereist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Molecuulinteracties met ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayers. (A) ΔF als gevolg van DEHP interactie met uni-lipide en multi-lipide (57:15:8:8:12 % (w/w) PC:PE:PI:PS:SPH) bilayers. (B) ΔD als gevolg van DEHP-interactie met uni-lipide en multi-lipide bilayers. (C) Percentage DEHP doordrongen over de uni-lipide en multi-lipide gesuspendeerde dubbellagen. De resultaten worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische significantie werd berekend met behulp van de t-toetsvan een student (α = 0,05, p<0,05 werd beschouwd als statistisch significant, * p<0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Uni-lipide vs. multi-lipide Compositie Extruder Hydrodynamische diameter (nm)
Uni-lipide 100% ei PC Mini 165 ± 1
Uni-lipide 100% ei PC Groot 108 ± 2
Multi-lipide 57:15:8:8:12 % (w / w) PC: PE: PI: PS: SPH Groot 109 ± 1
Multi-lipide 60:40 % (w/m) ei PC:EPC Groot 91,0 ± 0,2

Tabel 1: Hydrodynamische diameters van lipidenblaasjes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol zorgt voor de vorming van lipideblaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Hier worden kritieke stappen gepresenteerd om elk van deze structuren te vormen. Bij het vormen van lipideblaasjes is het belangrijk om boven de overgangstemperatuur van het lipide uit te extruderen39. Wanneer het onder de overgangstemperatuur ligt, is het lipide fysiek aanwezig in de geordende gelfase39. In deze geordende fase zijn de koolwaterstoflipidenstaarten volledig uitgeschoven, waardoor een nauwe verpakking mogelijk is, waardoor extrusie een uitdagingis 39. Bij verhitting boven de overgangstemperatuur wordt het lipide meer ongeordend, wat resulteert in de vloeibare kristallijne fase39. De koolwaterstofstaarten van het lipide zijn bij deze temperaturen vloeibaarder, waardoor een succesvolle extrusiemogelijk is 39. Lipidekenmerken zoals de samenstelling van de hoofdgroep, verzadiging en lading hebben invloed op hun overgangstemperatuur. Het is ook belangrijk om alle chloroform te verwijderen bij het vormen van de lipidefilm, omdat rest chloroform de vesikelvorming en -eigenschappen na rehydratatie negatief zal beïnvloeden.

Tijdens de ondersteunde lipide bilayer-vorming met behulp van QCM-D is het cruciaal dat de silica-gecoate kwartskristalsensor in onberispelijke staat is. De sensoren kunnen opnieuw worden gebruikt, maar moeten elke keer worden gecontroleerd op krassen, puin of andere slijtage en worden weggegooid als er onvolkomenheden worden gevonden, omdat onvolkomenheden van de sensor de vesikeladsorptie en dubbellaagse vorming kunnen beïnvloeden. De fundamentele frequentie van de piëzo-elektrische kwartssensor is 5 MHz, waarbij ΔF en ΔD worden bewaakt bij oneven boventonen (3, 5, 7, 9, 11 en 13). Ervoor zorgen dat de fundamentele resonantiefrequenties voor elke boventoon die voorafgaand aan de meting wordt gevonden, vergelijkbaar zijn met de verwachte theoretische waarden, kan helpen bij het identificeren van een mogelijk kristalprobleem. Het verzamelen van metingen van meerdere boventonen is belangrijk voor visco-elastische modellering met behulp van de verkregen gegevens. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen lucht in het systeem wordt gebracht tijdens de vloeistofstroom door de QCM-D-stromingsmodules. Lucht zal een lucht-vloeistofverschuiving veroorzaken die zal worden waargenomen in de real-time gegevensverzameling en zal resulteren in verlies van integriteit van de lipide bilayer. Om multi-lipide ondersteunde lipide bilayers te vormen, hebben we het gebruik van een AH-peptide opgemerkt om blaasjesruptuur te induceren. Afhankelijk van de lipidesamenstelling kunnen andere methoden worden onderzocht om blaasjesruptuur te induceren, zoals variërende ionische sterkte, temperatuur en stroming. Het veranderen van de bufferzoutconcentratie is bijvoorbeeld gebruikt om multi-lipide bilayers te bereiken, zoals die bacteriële membranen nabootsen die PE en fosfatidylglycerol (PG) in de samenstelling bevatten. 40 Tijdens de vorming van gesuspendeerde lipide bilayer is het belangrijk dat lipiden worden gekozen die oplosbaar zijn in dodecane, zoals DOPC38,39. Afhankelijk van de toepassing en in het bijzonder voor celmembraan nabootsende bilayers, kan het raadzaam zijn om vergelijkingsdoorlaatbaarheidsstudies uit te voeren tussen de gesuspendeerde lipide bilayers en celmonolagen gevormd op poreuze inserts42,43,44.

Er zijn veel stappen in dit protocol die kunnen worden aangepast of aangepast voor een bepaalde toepassing. De lipiden en de gebruikte samenstellingen, concentratie van de lipide blaasjessuspensie, volume van de geprepareerde blaasjes, vesikelrehydratiebuffer, aantal passages door de extruder, polycarbonaatmembraanporiëngrootte, kwartskristalsubstraatmateriaal, QCM-D-stroomsnelheid, de bestudeerde moleculaire interacties, tijdsduur voor interactie en temperatuur kunnen allemaal worden aangepast, waardoor dit een veelzijdige aanpak is. De extrusieprocessen die hier worden beschreven, kunnen ook worden gebruikt om therapeutische liposomen te vormen. Zo zijn zowel de mini-extruder als de grote extruder gebruikt om antischimmelliposomen te vormen die minstens 140 dagen stabiel blijven bij 4 °C in ultrapuur water45. Andere methoden voor de vorming en karakterisering van blaasjes of lipiden dubbellaags kunnen ook worden overwogen voor vergelijking of aanvullende verificatie. Ultrasoonapparaat is bijvoorbeeld een andere techniek die wordt gebruikt om lipidenblaasjes te vormen46, en technieken zoals cryo-transmissie elektronenmicroscopie kunnen worden gebruikt om lamellaliteit15,45te bevestigen . Atoomkrachtmicroscopie47,oppervlakteplasmonresonantie48en neutronenreflectiviteit49 kunnen ook worden gebruikt in combinatie met QCM-D om ondersteunde lipide bilayers50te bestuderen. Gesuspendeerde lipide bilayers zijn ook gevormd in microfluïdische apparaten30,51 naast het gebruik van de filter- en ontvangerputplaten die in dit protocol worden besproken.

Hoewel de hier beschreven methode gemakkelijke lipide bilayers kan bieden die de cellulaire lipidesamenstelling nabootsen, bieden ze alleen informatie over moleculaire interacties met deze lipiden. Eiwitten zijn ook belangrijke componenten van het celmembraan en kunnen adsorptie, permeabiliteit en actieve en passieve transporteigenschappen beïnvloeden. Het bevorderen van deze modellipide bilayers om eiwitten op te nemen, zal dus resulteren in extra celnabootsende eigenschappen, die de informatie die uit deze benaderingen wordt verkregen, kunnen verbeteren. Een recente studie heeft bijvoorbeeld eiwitten opgenomen in ondersteunde lipide bilayers door mesoporeuze silicasubstraten te gebruiken, waardoor een op maat gemaakte oppervlakteporiëngrootte mogelijk is om inheemse transmembraaneiwitten op te nemen52. Toepassingen waarbij deze dubbellagen bijzonder belangrijk zullen zijn, zijn onder meer toxiciteitstests en farmaceutische screeningstudies24,27. Over het algemeen draagt de veelzijdigheid en reproduceerbaarheid van deze celimitorenmodellen bij aan hun nut voor een reeks onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict of concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgments

Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door de National Science Foundation onder Grant No. 1942418 toegekend aan AS, en een National Science Foundation Graduate Research Fellowship toegekend aan C.M.B.H., onder Grant No. 1644760. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation. De auteurs bedanken Dr. Noel Vera-González voor lipide vesikel karakterisering data acquisitie. De auteurs bedanken professor Robert Hurt (Brown University) voor het gebruik van zijn Zetasizer. De auteurs bedanken de Brown University Mass Spectrometry Facility, in het bijzonder Dr. Tun-Li Shen voor hulp bij het kwantificeren van de lipidensamenstelling.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine  (POPC, 16:0-18:1 PC) Avanti Polar Lipids 850457
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) (POPS, 16:0-18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840034
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (16:0-18:1 PE) Avanti Polar Lipids 850757
1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine (DOPS, 18:1 PS) Avanti Polar Lipids 840035
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (Δ9-Cis) PC) Avanti Polar Lipids 850375
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE, 18:1 (Δ9-Cis) PE) Avanti Polar Lipids 850725
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (chloride salt) (18:0 EPC (Cl Salt)) Avanti Polar Lipids 890703
3 mL Luer-Loc syringes BD 309657
40 mL sample vial, amber with polytetrafluoroethylene (PTFE)/rubber liner Duran Wheaton Kimble W224605
Acetonitrile Sigma-Aldrich 271004
Alconox Fisher Scientific 50-821-781
Ammonium formate Millipore Sigma LSAC70221
C18, 3.5 um x 50 mm column, SunFire Waters  186002551
Chloroform Millipore Sigma LSAC288306
Cuvette UV Micro LCH 8.5 mm, 50 um, RPK Sarstedt 67.758.001
Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) Millipore Sigma 36735
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore Sigma LSAC472301
Ethanol Pharmco 111000200
Filter supports, 10 mm Avanti Polar Lipids 610014 Size for mini extruder
Folded capillary zeta cell Malvern Panalytical DTS1070
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764-4L
Kimwipes Kimberly Clark 34256
L-α-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI) Avanti Polar Lipids 840044
L-α-phosphitidylcholine (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 840051
LiposoFast ® LF-50 Avestin, Inc.
Methanol Sigma-Aldrich 179337 - 4L
Mini-extruder set with holder/heating block Avanti Polar Lipids 610000
MultiScreen-IP Filter Plate, 0.45 µm, clear, sterile Millipore Sigma MAIPS4510 for PAMPA studies
Nitrogen gas, ultrapure TechAir NI T5.0
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 19 mm, 0.1 um Whatman 800309 Size for mini extruder
Nuclepore hydrophilic membranes, polycarbonate, 25 mm, 0.1 um Whatman 110605 Size for large extruder
Parafilm Bemis PM999
Phosphate buffer saline (PBS), 10x Genesee Scienfitic 25-507X Dilute to 1x
Qsoft 401 software Biolin Scientific
Quartz Crystal Microbalance with Dissipation Q-Sense Analyzer Biolin Scientific
Scintillation vials, borosilicate glass vials, 20 mL Duran Wheaton Kimble 986561
Silicon Dioxide, thin QSensors Biolin Scientific QSX 303
Sodium chloride (NaCl) Millipore Sigma LSACS5886
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher Scientific BP166-100
Solvent Safe pipette tips Sigma-Aldrich S8064
Sphingomyelin (Egg, Chicken) Avanti Polar Lipids 860061
Trizma base Millipore Sigma LSACT1503
Trypsin-ethylenediaminetretaacetic acid Caisson Labs TRL01-6X100ML
Whatman drain disc, 25 mm Whatman 230600 Size for large extruder
Zetasizer ZS90 Malvern Panalytical
Zetasizer 7.01 software Malvern Panalytical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lucio, M., Lima, J. L. F. C., Reis, S. Drug-Membrane Interactions: Significance for Medicinal Chemistry. Current Medicinal Chemistry. 17 (17), 1795-1809 (2010).
  2. Mayne, C. G., et al. The cellular membrane as a mediator for small molecule interaction with membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1858 (10), 2290-2304 (2016).
  3. Bunea, A. I., Harloff-Helleberg, S., Taboryski, R., Nielsen, H. M. Membrane interactions in drug delivery: Model cell membranes and orthogonal techniques. Advances in Colloid and Interface Science. 281, 102177 (2020).
  4. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: Applications in drug discovery and drug delivery. Molecular Pharmaceutics. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  5. Richter, R., Mukhopadhyay, A., Brisson, A. Pathways of Lipid Vesicle Deposition on Solid Surfaces: A Combined QCM-D and AFM Study. Biophysical Journal. 85 (5), 3035-3047 (2003).
  6. Lind, T. K., Cárdenas, M., Wacklin, H. P. Formation of supported lipid bilayers by vesicle fusion: Effect of deposition temperature. Langmuir. 30 (25), 7259-7263 (2014).
  7. Mingeot-Leclercq, M. -P., Deleu, M., Brasseur, R., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy of supported lipid bilayers. Nature protocols. 3 (10), 1654-1659 (2008).
  8. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: an integrated view. Langmuir the ACS journal of surfaces and colloids. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  9. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  10. Edvardsson, M., Svedhem, S., Wang, G., Richter, R., Rodahl, M., Kasemo, B. QCM-D and reflectometry instrument: applications to supported lipid structures and their biomolecular interactions. Analytical chemistry. 81 (1), 349-361 (2009).
  11. Rodahl, M., et al. Simultaneous frequency and dissipation factor QCM measurements of biomolecular adsorption and cell adhesion. Faraday Discussions. 107, 229-246 (1997).
  12. Keller, C. A., Glasmästar, K., Zhdanov, V. P., Kasemo, B. Formation of Supported Membranes from Vesicles. Physical Review Letters. 84 (23), 5443-5446 (2000).
  13. Keller, C. A., Kasemo, B. Surface specific kinetics of lipid vesicle adsorption measured with a quartz crystal microbalance. Biophysical journal. 75 (3), 1397-1402 (1998).
  14. Cho, N. -J., Frank, C. W., Kasemo, B., Höök, F. Quartz crystal microbalance with dissipation monitoring of supported lipid bilayers on various substrates. Nature protocols. 5 (6), 1096-1106 (2010).
  15. Bailey, C. M., Tripathi, A., Shukla, A. Effects of Flow and Bulk Vesicle Concentration on Supported Lipid Bilayer Formation. Langmuir. 33 (43), 11986-11997 (2017).
  16. van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nature reviews. Molecular cell biology. 9 (2), 112-124 (2008).
  17. Rossi, C., Chopineau, J. Biomimetic tethered lipid membranes designed for membrane-protein interaction studies. European Biophysics Journal. 36 (8), 955-965 (2007).
  18. Hatty, C. R., et al. Investigating the interactions of the 18 kDa translocator protein and its ligand PK11195 in planar lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (3), 1019-1030 (2014).
  19. Min, Y., Kristiansen, K., Boggs, J. M., Husted, C., Zasadzinski, J. a, Israelachvili, J. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3154-3159 (2009).
  20. Heath, G. R., et al. Layer-by-layer assembly of supported lipid bilayer poly-l-lysine multilayers. Biomacromolecules. 17 (1), 324-335 (2016).
  21. Alberts, B., Lewis, J. The Lipid Bilayer. Molecular Biology of the Cell. , 6-11 (2013).
  22. Cho, N. J., Wang, G., Edvardsson, M., Glenn, J. S., Hook, F., Frank, C. W. Alpha-helical peptide-induced vesicle rupture revealing new insight into the vesicle fusion process as monitored in situ by quartz crystal microbalance-dissipation and reflectometry. Analytical Chemistry. 81 (12), 4752-4761 (2009).
  23. Hardy, G. J., Nayak, R., Munir Alam, S., Shapter, J. G., Heinrich, F., Zauscher, S. Biomimetic supported lipid bilayers with high cholesterol content formed by α-helical peptide-induced vesicle fusion. Journal of Materials Chemistry. 22 (37), 19506-19513 (2012).
  24. Bailey-Hytholt, C. M., Shen, T. L., Nie, B., Tripathi, A., Shukla, A. Placental Trophoblast-Inspired Lipid Bilayers for Cell-Free Investigation of Molecular Interactions. ACS Applied Materials and Interfaces. 12 (28), 31099-31111 (2020).
  25. Domenech, O., Francius, G., Tulkens, P. M., Van Bambeke, F., Dufrêne, Y., Mingeot-Leclercq, M. -P. Interactions of oritavancin, a new lipoglycopeptide derived from vancomycin, with phospholipid bilayers: Effect on membrane permeability and nanoscale lipid membrane organization. Biochimica et biophysica acta. 1788 (9), 1832-1840 (2009).
  26. Bailey, C. M., Kamaloo, E., Waterman, K. L., Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. a Size dependence of gold nanoparticle interactions with a supported lipid bilayer: A QCM-D study. Biophysical Chemistry. 203-204, 51-61 (2015).
  27. Bailey-Hytholt, C. M., Puranik, T., Tripathi, A., Shukla, A. Investigating interactions of phthalate environmental toxicants with lipid structures. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 190, 110923 (2020).
  28. Wang, K. F., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Antimicrobial peptide alamethicin insertion into lipid bilayer: a QCM-D exploration. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces. 116, 472-481 (2014).
  29. Lozeau, L. D., Rolle, M. W., Camesano, T. A. A QCM-D study of the concentration- and time-dependent interactions of human LL37 with model mammalian lipid bilayers. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 167 (1), 229-238 (2018).
  30. Kongsuphol, P., Fang, K. B., Ding, Z. Lipid bilayer technologies in ion channel recordings and their potential in drug screening assay. Sensors and Actuators B: Chemical. 185, 530-542 (2013).
  31. Ren, X., et al. Design, fabrication, and characterization of archaeal tetraether free-standing planar membranes in a PDMS-and PCB-based fluidic platform. ACS Applied Materials & Interfaces. 6 (15), 12618-12628 (2014).
  32. Seo, P. R., Teksin, Z. S., Kao, J. P. Y., Polli, J. E. Lipid composition effect on permeability across PAMPA. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 29 (3-4), 259-268 (2006).
  33. Avdeef, A. The rise of PAMPA. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 1 (2), 325-342 (2005).
  34. Avdeef, A., Artursson, P., Neuhoff, S., Lazorova, L., Gråsjö, J., Tavelin, S. Caco-2 permeability of weakly basic drugs predicted with the Double-Sink PAMPA method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 24 (4), 333-349 (2005).
  35. Campbell, S. D., Regina, K. J., Kharasch, E. D. Significance of Lipid Composition in a Blood-Brain Barrier-Mimetic PAMPA Assay. Journal of Biomolecular Screening. 19 (3), 437-444 (2014).
  36. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  37. Schmidt, D., Lynch, J. Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permation Assays (PAMPA). EMD Millipore Corporation. , (2020).
  38. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
  39. Nayar, R., Hope, M. J., Cullis, P. R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylcholines by extrusion technique. BBA - Biomembranes. 986 (2), 200-206 (1989).
  40. Lind, T. K., Skida, M. W. A., Cárdenas, M. Formation and Characterization of Supported Lipid Bilayers Composed of Phosphatidylethanolamine and Phosphatidylglycerol by Vesicle Fusion, a Simple but Relevant Model for Bacterial Membranes. ACS Omega. 4 (6), 10687-10694 (2019).
  41. Berben, P., et al. Drug permeability profiling using cell-free permeation tools: Overview and applications. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 119, 219-233 (2018).
  42. Bermejo, M., et al. PAMPA-a drug absorption in vitro model: 7. Comparing rat in situ, Caco-2, and PAMPA permeability of fluoroquinolones. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 21 (4), 429-441 (2004).
  43. Kerns, E. H., Di, L., Petusky, S., Farris, M., Ley, R., Jupp, P. Application of parallel artificial membrane permeability assay and Caco-2 permeability. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (6), 1440-1453 (2004).
  44. Masungi, C., et al. Parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA) combined with a 10-day multiscreen Caco-2 cell culture as a tool for assessing new drug candidates. Pharmazie. 63 (3), 194-199 (2008).
  45. Vera-González, N., et al. Anidulafungin liposome nanoparticles exhibit antifungal activity against planktonic and biofilm Candida albicans. Journal of Biomedical Materials Research - Part A. 108 (11), 2263-2276 (2020).
  46. Barenholz, Y., Gibbes, D., Litman, B. J., Goll, J., Thompson, T. E., Carlson, F. D. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (1), 2806-2810 (1977).
  47. El Kirat, K., Morandat, S., Dufrêne, Y. F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1798 (4), 750-765 (2010).
  48. Tawa, K., Morigaki, K. Substrate-supported phospholipid membranes studied by surface plasmon resonance and surface plasmon fluorescence spectroscopy. Biophysical Journal. 89 (4), 2750-2758 (2005).
  49. Koenig, B. W., et al. Neutron Reflectivity and Atomic Force Microscopy Studies of a Lipid Bilayer in Water Adsorbed to the Surface of a Silicon Single Crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  50. Lind, T. K., Cárdenas, M. Understanding the formation of supported lipid bilayers via vesicle fusion-A case that exemplifies the need for the complementary method approach (Review). Biointerphases. 11 (2), 020801 (2016).
  51. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  52. Isaksson, S., et al. Protein-Containing Lipid Bilayers Intercalated with Size-Matched Mesoporous Silica Thin Films. Nano Letters. 17 (1), 476-485 (2017).

Tags

Bio-engineering Nummer 174
Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., … More

Bailey-Hytholt, C. M., LaMastro, V., Shukla, A. Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions. J. Vis. Exp. (174), e62599, doi:10.3791/62599 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter