Summary
Vi introduserer en protokoll for måling av sanntids legemiddel- og strålingsrespons av brystkreft hjernemetastatiske celler i en organotypisk hjerneskivemodell. Metodene gir en kvantitativ analyse for å undersøke de terapeutiske effektene av ulike behandlinger på hjernemetastaser fra brystkreft på en ex vivo-måte i hjernemikromiljøet.
Abstract
Hjernemetastase er en alvorlig konsekvens av brystkreft for kvinner, da disse svulstene er vanskelige å behandle og er forbundet med dårlige kliniske utfall. Prekliniske musemodeller av brystkreft hjernemetastatisk (BCBM) vekst er nyttige, men er dyre, og det er vanskelig å spore levende celler og tumorcelleinvasjon i hjernen parenchyma. Presentert her er en protokoll for ex vivo hjerneskive kulturer fra xenografted mus som inneholder intracranially injisert brystkreft hjernesøkende klonale underlinjer. MDA-MB-231BR luciferase taggede celler ble injisert intracranially i hjernen til Nu / Nu kvinnelige mus, og etter tumordannelse ble hjernene isolert, skiver og dyrket ex vivo. Tumorskivene ble avbildet for å identifisere tumorceller som uttrykker luciferase og overvåke spredning og invasjon i hjernen parenchyma i opptil 10 dager. Videre beskriver protokollen bruken av tidsforløpmikroskopi for å avbilde veksten og den invasive oppførselen til tumorcellene etter behandling med ioniserende stråling eller kjemoterapi. Responsen fra tumorceller til behandlinger kan visualiseres ved levende avbildningsmikroskopi, måling av bioluminescensintensitet og utføre histologi på hjernestykket som inneholder BCBM-celler. Dermed kan denne ex vivo-skivemodellen være en nyttig plattform for rask testing av nye terapeutiske midler alene eller i kombinasjon med stråling for å identifisere legemidler som er personlig tilpasset for å målrette en individuell pasients brystkrefthjerne metastatisk vekst i hjernemikromiljøet.
Introduction
Brystkreft hjernemetastaser (BCBM) utvikler seg når celler sprer seg fra den primære brystsvulsten til hjernen. Brystkreft er den nest hyppigste årsaken til hjernemetastase etter lungekreft, med metastaser som forekommer hos 10-16% av pasientene1. Dessverre forblir hjernemetastaser uhelbredelige ettersom >80% av pasientene dør innen et år etter hjernemetastasediagnosen, og deres livskvalitet er svekket på grunn av nevrologiske dysfunksjoner2. Det er et presserende behov for å identifisere mer effektive behandlingsalternativer. Monolayer todimensjonale eller tredimensjonale kulturmodeller er de mest brukte metodene for å teste terapeutiske midler i laboratoriet. Imidlertid etterligner de ikke det komplekse BCBM mikromiljøet, en stor driver for tumorfenotype og vekst. Selv om disse modellene er nyttige, fanger de ikke de komplekse tumor-stromale interaksjonene, de unike metabolske kravene og heterogeniteten til svulstene3. For mer trofast å rekapitulere tumor-stromale interaksjoner og mikromiljø heterogenitet, har vår gruppe og andre begynt å generere organotypiske hjernemetastasekulturer med pasientavledede tumorceller (primære eller metastatiske) eller kreftcellelinjer 4,5,6. Sammenlignet med klassiske in vitro-systemer, kan denne kortsiktige ex vivo-modellen gi mer relevante forhold for screening av nye terapeutiske behandlinger før preklinisk vurdering i store dyrekohorter.
Ex vivo modeller har blitt konstruert og vellykket brukt primært for identifisering av vellykkede behandlinger av ulike kreftformer. De krever få dagers vurdering og kan i tillegg skreddersys til pasientspesifikk legemiddelscreening. For eksempel har human blære og prostatakreft ex vivo vev vist en doseavhengig anti-tumor respons av docetaksel og gemcitabine7. Lignende kolorektal karsinom ex vivo vev ble utviklet for å screene kjemoterapeutiske legemidler Oxaliplatin, Cetuximab og Pembrolizumab8. Denne applikasjonen har blitt mye brukt i bukspyttkjertelkreft, med tanke på det essensielle samspillet mellom det stromale miljøet og de genotypiske og fenotypiske egenskapene til bukspyttkjertelkanal adenokarsinom 9,10. Videre er slike organotypiske modeller utviklet for lignende screeninger i hode-, nakke-, mage- og brystsvulster 11,12.
Her genereres en ex vivo hjerneskivemodell av xenografted brystkreft hjerne metastatiske tumorceller i mikromiljøet. Mus ble intracranially injisert med brystkreft hjerne metastatisk hjerne trofisk MDA-MB-231BR celler13 i cerebral cortex parietal lobe- et vanlig sted for TNBC metastasering14,15 og fikk lov til å utvikle svulster. Hjerneskiver ble generert fra disse xenografterte dyrene og opprettholdt ex vivo som organotypiske kulturer som beskrevet16,17. Denne nye ex vivo-modellen tillater analyse av BCBM-cellens vekst i hjerneparenchyma og kan brukes til å teste terapeutiske midler og strålingseffekter på tumorceller i hjernemikromiljøet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble godkjent og følger retningslinjene for dyrepleie av Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Nu/Nu athymic kvinnelige mus (6-8 uker gamle) ble brukt i denne studien.
1. Intrakraniell injeksjon av tumorceller
- Steriliser alt utstyr (pinsett, saks, suturering saks, håndbor) under en tørr syklus av en autoklav i opptil 45 minutter i steriliseringsposer, inkludert en steriliseringsindikator. Hvis du utfører operasjoner på flere dyr, steriliser verktøy mellom dyr ved hjelp av en oppvarmet perlesterilisator (opptil 3x).
- Bedøv musene i henhold til brukernes dyrepleieprotokoll (f.eks. isofluran (4% for induksjon, 1-2% vedlikehold) og administrer analgesi (subkutan, 0,1 ml 0,1 mg/kg buprenorfin SR-LAB) før operasjonsstart. Sørg for optimal anestesidybde med en tåklemme.
- Plasser musene i en stereotaxisk ramme og immobiliser hodet ved hjelp av standard ørestenger (figur 1A). Påfør oftalmisk salve på øynene.
- Steriliser overflaten av hodet ved gjentatt, vekslende påføring (3x) av jodpinner og 70% etanol før snitt.
- Bruk en kirurgisk skalpell for å lage et 1 cm midtlinje snitt gjennom huden i en litt diagonal vinkel til den imaginære linjen som deler musenes hjerne i to symmetriske halvdeler for å eksponere skallen. Tørk av blod med en bomullspinne.
- Avbøy huden sidelengs for å eksponere injeksjonsstedet: 2 mm til høyre, 1 mm forover med referanse til bregma (+2 middelmådig (+2 ML), +1 rostral/kaudal (+1RC).
- Bruk en borbits (0,73 mm) for å trenge inn i skallen +2ML, +1RC til bregmaen og bor et hull ved hjelp av lett trykk og vridningsbevegelse.
- Bruk en hjerneinjeksjonssprøyte til å injisere 5 μL av en 100 000 MDA-MB-231BR (stabilt uttrykke GFP-Luciferase) celler/μL oppløsning i steril 1x PBS ved først å sette inn sprøyten 3,5 mm i dybden til hjernen.
- La sprøyten slå seg til ro i 2 min. Trekk den opp ca. 1 mm, og etter 2 min injiserer du sakte første halvdel av volumet.
- Vent i ytterligere 2 minutter før du injiserer resten, og trekk deretter sprøyten sakte 3 min etter den endelige injeksjonen.
MERK: Langsom injeksjon er empirisk ved å la volumet absorberes godt av hjernevevet og ikke skape lekkasje etter å ha trukket sprøyten, noe som kan føre til at kreftceller vokser utenfor det tiltenkte stedet. - Påfør benvoks på injeksjonsstedet på skallen og bruk deretter polypropylen suturer for å suturere vevet. Mus vil gjenopprette innen 5 min etter fjerning av anestesi.
- Overvåk deres oppførsel rett etter operasjonen i ca 10 min, 3 timer senere og neste dag for å avgjøre om spesiell behandling, inkludert saltvannsinjeksjon, myk mat, etc., er nødvendig for å hjelpe rask gjenoppretting.
- Overvåk tumorveksten via bioluminescensavbildning på bildesystemet.
- For dette må du først slå på oksygen og isofluran på bildesystemet. Tillat at begge fordeles til det separate kammeret utenfor bildeboksen.
- Slå deretter på programvaren, initialiser instrumentet og velg riktig alternativ for å visualisere og fange hele musekroppen.
- Plasser musene i det separate kammeret med isofluran og sørg for optimal anestesidybde med en tåklemme. Injiser musene intraperitonealt med 200 μL 30 mg/ml luciferin.
- Overfør musenes mage ned til bildekammerets nese som leveres med oksygen og isofluran. Lås kammeret, og velg 2 min tidseksponering for å starte bildebehandlingen.
- Bruk ROI (region av interesse) verktøyet av programvaren for å kvantifisere bioluminescent signalet av svulsten.
- For å analysere tumorstørrelsen, velg sirkelformverktøyet, monter det rundt tumorformen og størrelsen. Mål avkastningen og rapporter de totale avlesningene.
- Tillat solid tumorvekst i 12-14 dager (eller til luciferase når ca. 7,0 x 106 enheter) (figur 1B) før du genererer hjerneskiver.
MERK: Økning av antall celler som skal injiseres vil føre til raskere tumorvekst; Derfor kan genereringen av hjerneskiver forekomme tidligere enn 12 dager. På den annen side vil en større svulst føre til flere GFP + skiver hvis de får lov til å vokse i 14 dager. Etter 14 dager begynner musenes helse å forverres raskt; Derfor bør dyrehelseovervåking økes til en gang daglig etter 10-dagers tidspunktet, og eventuelle mus som viser tegn på smerte og / eller ubehag, bør brukes til å generere skiver.
2. Generer hjerneskiver
MERK: Utfør trinnene etter hjerneisolasjon i en steril laminær strømningshette. Det er vanligvis mulig å generere 35-40 individuelle skiver som inneholder tumorceller (luciferasesignal) fra en mus injisert med MDA-MB-231BR celler (figur 1C).
- Steriliser alle kirurgiske verktøy i en autoklav. Plasser vevsskiven i den sterile laminære strømningshetten og rengjør alle verktøy og instrumenter med 70% etanol.
- Etter 12-14 dager etter intrakraniell MDA-MB-231BR celleinjeksjon, bedøv musene i henhold til brukernes dyrepleieprotokoll som beskrevet i 1.2. Sørg for optimal anestesidybde med en tåklemme.
- Fjern og plasser hjernen raskt (innen 45 s) i iskalde (4 °C) sukrose-ACSF sammensatt av følgende: 280 mM sukrose, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM glukose, 10 mM HEPES, 5 mM Na +-ascorbate, 3 mM thiourea, 2 mM Na +, 29 mM pyruvat; pH=7,3.
- Bruk en skarp, steril skalpell eller barberblad, kutt bort overflødige deler av hjernen som ikke inneholder noen svulst fra alle sider, inkludert den nederste delen av hjernen.
- Ta formen på hjernen til en ikke-perfekt terning for å sitte flatt på ACSF fuktet filterpapir på et 60 mm parabollokk for å lette kuttingen.
MERK: Ekstra vev i hjernen der svulsten er usannsynlig å ha vokst, fjernes før kutting for å tillate generering av for det meste GFP + skiver og skape en form av hjernen som er stabil på overflaten av instrumentet og vil ikke bli forstyrret av vibrasjonene forårsaket av kuttingen. - Legg flere ark med for-våte (med ACSF) filterpapirsirkler på skjæreplattformen og plasser det blokkerte vevet på toppen av dette.
- Sett kuttstørrelsen på instrumentet til 2 eller 2,5 enheter på den medfølgende linjalen for å skjære vevet i 200-250 μm seksjoner.
MERK: Skiver opp til 350 μm eller så tynne som 100 μm er levedyktige. For skiver <200 μm, bruk en vibratom eller kompressomi. - Bruk en pensel (sabel) til å overføre hjerneskiver til en tallerken som inneholder sukrose ACSF og skille skivene under et lett mikroskop ved hjelp av 27 G nåler.
- Identifiser GFP-positive skiver under det fluorescerende mikroskopet og overfør dem til en ny 60 mm tallerken som inneholder 2-3 ml voksenskivemedier (Neurobasal medium A, 2% B12 supplement, 1% N2 supplement, 1% glutamin, 0,5% glukose, 10 U / ml penicillin og 100 μg / ml streptomycin) ved hjelp av en steril 1 ml ødelagt pipette (bred åpning).
MERK: Hjerneskivene som inneholder tumorceller som vokser over hjerneoverflaten (kanskje på grunn av lekkasje av injeksjonsceller, etc.) er utelukket. - Overfør 3-5 skiver på hver 30 mm, 0,4 μm porestørrelse vevskulturinnsats i 6-brønnsplater på avstand som ikke tillater dyrking i hverandre.
- Fjern overflødig medium fra overflaten av innsatsen ved hjelp av en P1000 pipette, tilsett 1 ml voksen musskive medium under hver innsats og likevekt mediet i inkubatoren før kutting.
- Inkuber vevet ved 37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet i 24 timer før avbildning.
3. IVIS-avbildning av skiver
MERK: Utfør tilsetningstrinn for luciferase og hemmer i en steril laminær strømningshette.
- Pipette 5 μL 30 mg/ml luciferinoppløsning i mediet under innsatsene ved å løfte innsatsen med tang og plassere dem tilbake i brønnen etter tilsetning av luciferin til media i brønnen.
- Plasser 6-brønnsplaten med lokket inne i instrumentets bildekammer under det stasjonære kameraet og lås kammerdøren.
- Åpne programvaren og initialiser instrumentet.
- Velg kamerainnstillinger som tillater visualisering og opptak av bare én brønn per bilde. Flytt scenen opp (FOV på 5 cm) og plasser brønnen som må avbildes direkte under kameraet.
- Sett bildetiden til mest hensiktsmessig avhengig av intensiteten av luciferase som svulsten vil avgi, som kan variere fra 10 s til 5 min. Begynn med å sette det til 10 s og øk deretter hvis signalet er lavt, men hold det konsistent for alle tidspunkter og forhold til slutten av eksperimentet (figur 1D).
- Bruk ROI-verktøyet (sirkelformverktøy), monter det rundt tumorformen og -størrelsen, mål avkastningen og rapporter de totale avlesningene for å kvantifisere bioluminescentsignalet til hver svulst på skiven.
- Før platen tilbake til den sterile laminære strømningshetten, bruk tang for å løfte innsatsen litt fra brønnen.
- Aspirer mediet, erstatt det med 1 ml friskt medium og legg innsatsen tilbake i brønnen.
- For eksperimenter der skivene behandles med ulike forbindelser som inhibitorer, metabolitter, etc., forberede riktig konsentrasjon av reagenset i 1,2 ml hjerneskivemedier i et 1,5 ml rør og deretter overføre 1 ml til brønnen som inneholder skiven.
- Gjenta denne prosessen hver 48.
4. Levende avbildning av tumorvekst i ex vivo hjerneskiver
MERK: Tilførselsinnsatser med nok medium (1,5 ml) til å vare lengden på eksperimentet, da det ikke er mulig å legge til ekstra medium under live-bildet.
- Plasser 6-brønnsplaten på den automatiserte mikroskopplateholderen inne i inkubatoren (37 °C, 5 % CO2 og 95 % fuktighet).
- Åpne programvaren, slå på brightfield på den første kvadranten for å justere eksponeringen som trengs for å se stykkene. For å finne posisjonen (koordinatene "xy") til stykket, naviger med "xy" på den andre kvadranten for å kontrollere koordinatene "xyz" til mikroskopet.
- Velg 6-brønnsplate som labware som brukes til dette eksperimentet. Velg ROI-kartredigeringsprogrammet og registrer denne posisjonen ved å velge en ny avkastning, legge til og lagre avkastningen.
- Gjenta de samme trinnene for alle de andre regionene av interesse for andre brønner. Når du har lagt til alle ROIene, lagrer du alle ROIene.
- Under Protokoll velger du Fjern eksisterende og velger Tidsforløp under Anskaffelse, etterfulgt av valg av interessekanaler (i dette tilfellet GFP).
- Deaktiver Autofokus i fokusoppsettet , og juster manuelt til riktig fokus for alle sektorene. Til slutt justerer du Brightfield Intensity og Fluorescent Channel Excitation and Exposure Time til riktig nivå.
- Sett protokollen til å skaffe bilder hvert 15.
- Lagre og kjør protokollen. På slutten av eksperimentet vil den lagrede filen inneholde både brightfield- og GFP-bilder tatt for hver avkastning.
- Hvis du vil kombinere bildene i en video, endrer du navnet på alle bilder av interesse med samme navn etterfulgt av et binært tall for å organisere dem i den rekkefølgen de ble tatt (f.eks.
- Åpne ImageJ og importer bildene ved å klikke på Fil > Importer > bildesekvens. Velg filnavnene som vises i en liste, og skriv innholdet i filnavnet i boksen Filnavn inneholder som vises for å identifisere filene som er valgt for videoen.
- Lagre de kombinerte bildene under Fil > Lagre som > AVI.
5. MTS-analyse og immunhiistokjemi av ex vivo hjernevev
- MTS ANALYSE
- Slukk skivene ved å kutte vevskulturmembranen under hver skive langs kantene av vevet og overfør vevet, som fortsatt er festet til membranen, til en 96-brønns plate.
- Tilsett MTS-reagenset blandet i et 1:5-forhold med kulturmedier og 0,01% triton (1x) for å tillate penetrasjon av løsningen i vevet, i et totalt volum på 120 μL i hver brønn.
- Bruk 4% Paraformaldehyd (PFA) som et middel for å gjøre hjerneskiver uunngåelige, og dermed en positiv kontroll for dette eksperimentet. Senk hjernestykket av interesse i 4% PFA i 1 time ved RT (romtemperatur) eller over natten ved 4 °C før du fortsetter med MTS-analysen.
- La MTS-reagenset reagere på skivene i 4 timer, fjern skivene fra brønnene og mål absorbansen ved 490 nm for alle forhold, inkludert en tom brønn uten skive som referanse.
- Rapporter målingene som en funksjon av vevsskiveområdet, målt med en digital kaliperlinjal.
- Immunohistokjemi forberedelse
- Senk hjerneskivene festet til membraninnsatsoverflaten i 10 % formalin over natten ved 4 °C.
- Utfør innebygging, behandling, blokkering og generering av unstained lysbilder av vevet. Bruk standard immunhiistokjemi fargebehandlingsprotokoll for å flekke for H&E, Ki-67, gamma-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI
6. Bestråling av tumor i ex vivo hjerneskiver
- Bestråle svulsten med 6 Gy (310 kVp røntgenstråler).
MERK: Enhetene som er angitt for å få den totale dosen på 6 Gy er 3522 enheter etter å ha vurdert R-enheter (målt ved hjelp av Victoreen-elektrometer) og korreksjoner for fingerbøl, lufttetthet og cGy/R som tidligere beskrevet18. Eksponeringstiden er 130,9 s. - Bruk 0,25 mm Cu +1 mm Al tilsatt filtrering, 50 cm SSD, 125 cGy per min.
- Utfør dosimetri av et in-the-beam ioniseringskammer kalibrert mot en primær standard.
- Gjør korrigeringer daglig for fuktighet, temperatur og barometrisk trykk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-celler ble intracranially injisert i høyre halvkule av 4-6 uker gamle Nu / Nu-mus som forklart ovenfor (figur 1A) og fikk lov til å vokse i 12-14 dager, i løpet av hvilken tid tumorvekst ble overvåket av bioluminescensavbildning (figur 1B). Vi injiserte 100.000 kreftceller intracranially som rapportert av andre grupper19, men det er mulig å injisere så lavt som 20.000 celle20. Etter hjerneskivegenerering (figur 1C), som beskrevet ovenfor, ble skiver avbildet på IVIS for å bestemme tumortilstedeværelse via bioluminescent avbildning etter 24 timers inkubasjon. Dette regnes som dag 0. Tumorvekst ble overvåket ved å kvantifisere bioluminescent signalering hver 48 h, noe som indikerte progressiv vekst over 6 dager (figur 1D). H&E-fargingen og GFP-positiv fluorescens bekrefter tilstedeværelsen av en svulst i hjernestykket (figur 1D). Vi var også i stand til å oppdage farging av reaktive astrocytter, visualisert ved farging for Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP)-positive celler, synlig mellom klyngen av kreftceller (GFP-positiv) (Figur 1D) lik det som er sett in vivo21. I motsetning til modeller som inokulerer kreftceller ex vivo inn i en musehjerneskive22, inneholder denne modellen reaktive astrocytter som er et viktig aspekt av BCBM tumormikromiljøet. Vi oppdager også økt Ki-67 farging som bekrefter at kreftceller er svært proliferative (figur 1D). Dermed kan tumorceller i hjernen parenchyma overleve og spre seg i en hjerneskive ex vivo i flere dager og inneholder også tumor-assosiert stroma.
Bestråling (IR) er en av de første behandlingslinjene for pasienter som presenterer med hjernemetastaser i klinikken. For å forstå hvordan ex vivo-skivemodellen ville reagere på slik behandling, ble hjerneskiver som inneholder MDA-MB-231BR-GFP Luciferase-svulster utsatt for 6Gy bestråling. Svulster i hjerneskiver som ikke ble utsatt for bestråling fortsatte å vokse eks vivo, mens svulster utsatt for bestråling viste en forsinket vekst (figur 2A). Hjerneskiver som inneholder MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase-svulster ble også overvåket via levende avbildning i 48 timer etter dag 4 for å visualisere tumorvekst i hjernemikromiljøet etter IR-behandling (figur 2B). I samsvar med bioluminescent avbildning, kontrollere kreftceller blir sett raskt voksende som GFP intensitet øker og en rekke celler er sett invadere hjernen parenchyma (Video 1). I motsetning til dette er kreftceller i hjerneskiver behandlet med 6Gy IR cytostatiske, og GFP-intensiteten opprettholdes (Video 2). H&E-farging bekrefter mindre svulster i IR-behandlede celler (figur 2C). Vi oppdaget også store multinukleerte kreftceller og en økning i farging av DNA-skademarkør g-H2AX i IR-behandlede kreftceller (figur 2C). Det ble ikke oppdaget noen økning i apoptose i IR-behandlede skiver, noe som tyder på at IR kan redusere spredning (figur 2C). Likevel ble det påvist en økning i farging i reaktive astrocytter, visualisert ved farging for GFAP-positive celler, som er synlige rundt klyngen av kreftceller (GFP-positiv) behandlet av IR (figur 2C). Dette antyder at denne ex vivo-modellen også kan være nyttig for å forstå hvordan noen tumor-stromakomponenter reagerer på behandlinger. I tillegg oppdaget vi ingen apoptose forårsaket av IR-behandling av tumorfrie hjernemusskiver (figur 2D).
Vi testet også om MDA-MB-231BR preformerte svulster i hjerneskiver ville reagere på kjemoterapi. Hjerneskivene som inneholder MDA-MB-231BR-svulster ble behandlet til forskjellige konsentrasjoner av paclitaxel (figur 3A), et kjemoterapeutisk legemiddel som brukes hos brystkreftpasienter23. Behandlingen reduserte svulstens størrelse som kvantifisert ved bioluminescerende signalering, men denne hemmingen var bare signifikant etter dag 10 av behandlingen (figur 3A). Dette kan skyldes en heterogen respons på paclitaxel ex vivo. For eksempel, i 40 nM behandlet godt, reduseres en skive som inneholder en svulst (topp) mens svulsten (bunnen) i samme brønn ser ut til å vokse. Noen av de mindre svulstene så også ut til å være mer følsomme for paclitaxel og viste redusert bioluminescens, mens de større svulstene virket ildfaste (figur 3A, 80 nM behandling). I samsvar med redusert tumorstørrelse ble det påvist en økning i apoptose i paclitaxelbehandlede tumorceller sammenlignet med kontroller (figur 3B). Viktigst, ved hjelp av en levedyktighet MTS-analyse som er tilpasset fra Mews et al. for å inkorporere bruken av triton24, testet vi at inhibitorbehandling ikke endret hjernevevs levedyktigheten (i fravær av svulst) (figur 3C). I samsvar med dette resultatet oppdaget og økte vi ikke apoptose målt ved spaltet kaspase 3 farging i paclitaxelbehandlet tumorfri musehjerneskive (figur 3D). Disse dataene antyder at denne modellen kan være nyttig for å forstå den kjemoterapeutiske responsen og motstanden til BCBM i et hjernemikromiljø. På grunn av modellens natur, en ex vivo-innstilling som bevarer hjernesvulstegenskapene og interaksjonen, står dens essensialitet i å gi primære bevis på BCBMs respons på kjemoterapeutiske reagenser og dermed eliminere stoffer som ikke krymper svulsten i denne modellen fra fremtidige in vivo-studier , som fortsatt er avgjørende for å validere effekten av legemidler som gir positive resultater i denne modellen, den systemiske responsen i organismen, og evnen til å krysse blod-hjernebarrieren.
Figur 1. Intrakraniell injeksjon, hjerneskivegenerering og BCBM vekst ex vivo. (A) Skjematisk fremstilling av mus under intrakraniell injeksjon under et stereotaktisk instrument. (B) Representative bilder av bioluminescent deteksjon av svulster fra 4-6 uker gamle Nu / Nu mus injisert med 5 x 105 MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler 12 dager etter injeksjon. (C) Skjematisk representasjon av genereringen av ex vivo mus hjerne skiver fra (B). (D) Representative bilder som viser tumorvekst i organotypiske hjerneskiver avledet fra mus intracranially injisert med MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler oppdaget via bioluminescens over 6 dager. H&E & Ki-67, GFP (tumorceller) GFAP (reaktive astrocytter) DAPI (kjerne) farging av en representativ hjerneskive med tumor (bildeforstørrelse 20x, skalastang: 200 μm). Kvantifisering av tumorvekst representerer bioluminescenssignal i forhold til dag 0 (n = 3). Studentens t-test rapportert som gjennomsnittlig ± SEM, * p < 0,05. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2. Behandling av BCBM organotypiske hjerneskiver med stråling. (A) Representative bilder som viser tumorvekst i organotypiske hjerneskiver avledet fra mus intracranially injisert med MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler oppdaget via bioluminescens. Svulster utsettes for ingen bestråling eller 6 Gybestråling (en dose) og får lov til å vokse i de angitte dagene. Kvantifisering av tumorvekst på indikert dag (kontroll. n = 3; 6Gy, n = 3). Studentens t-test rapportert som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05. (B) Hjerneskiver ble avbildet i 48 timer hvert 15. Representative bilder av videoer av ikke-bestrålede og bestrålede prøver indikerer tumorvekst. (C) Skiver, som behandlet i (A), ble festet og analysert for H&E-, g-H2AX-, DAPI-, cleaved-Caspase-3 (CC3) og GFP-farging (bildeforstørrelse 20x, skalalinje: 200 μm). (D) Tumorfrie musehjerneskiver ble behandlet som i (A) og ble fikset og analysert for CC3 og DAPI (bildeforstørrelse 20x, skalalinje: 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Behandling av BCBM organotypiske hjerneskiver med paclitaksel. (A) Hjerneskiver avledet fra mus intracranially injisert med MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler behandlet med DMSO eller etter behandling av paclitaxel ved 40 nM, 80 nM, 160 nM og 320 nM i 10 dager, etterfyller mediet hver 48 h og får lov til å vokse for de angitte dagene (bildeforstørrelse 20x, skalalinje: 200 μm). Kvantifisering av tumorvekst på angitt dag (kontroll n = 6, Paclitaxel n = 3) (bunn). Studentens t-test rapportert som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05. (B) Ex vivo hjerneskive som behandlet i (A) med enten DMSO eller 320 nM paclitaxel ble samlet inn, fikset og analysert for GFP, CC3 og DAPI (bildeforstørrelse 20x, skalalinje: 200 μm). (C) Ex vivo hjerneskive som behandlet i (A) (uten svulst) med enten DMSO eller 320 nM-paclitaksel ble samlet inn på dag 10 og analysert for celle levedyktighet (MTS-analyse). Som en positiv kontroll ble skiver behandlet med paraformaldehyd (PFA) som gjør hjerneskivene uunngåelige (n = 3) Studentens t-test rapportert som gjennomsnittlig ± SEM. * p < 0,05. (D) Ex vivo hjerneskive som behandlet i (A) (uten svulst) med enten DMSO eller 320 nM paclitaxel ble samlet inn, fikset og analysert for CC3 og DAPI (bildeforstørrelse 20x, skalalinje: 200 μm). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1. Levende avbildning av BCBM organotypiske hjerneskiver. Hjerneskiver avledet fra mus intracranially injisert med MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler fikk lov til å vokse i 4 dager og deretter plassert under et live bildemikroskop i 48 timer hvor bilder ble tatt hver 15 min og kombinert for å lage en video ved hjelp av ImageJ. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2. Levende avbildning av bestrålede BCBM organotypiske hjerneskiver. Hjerneskiver avledet fra mus intracranially injisert med MDA-MB-231BR-GFP-Luciferase celler ble bestrålet dagen etter at skiver ble generert og 4 dager senere ble avbildet hver 15 min i 48 h. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien etablerer en ny ex vivo hjernekulturmetode for utplantede xenograft hjernesvulster. Vi viser at BCBM celler MDA-MB-231BR celler intracranially injisert i hjernen til mus kan overleve og vokse i ex vivo hjerne skiver. Studien testet også intracranially injiserte U87MG glioblastom (GBM) celler og fant også at disse kreftcellene overlever og vokser i hjerneskiver (data ikke vist). Vi tror denne modellen kan utvides utover BCBM og GBM til andre kreftformer som lett metastaser til hjernen, inkludert lungekreft og melanom. Intrakranielle injeksjoner av brystkreft hjerne trofiske celler ble valgt siden det er en enkel og rask metode for å generere hjernesvulster og anses som en passende modell for hjernemakrometastaser25. Imidlertid kan lignende tumorskivemodeller utvikles fra enten intrakariac inokulering eller ortotopiske injeksjoner til primære fettputer. Optimalisering av kulturforholdene ved å dyrke voksne hjerneskiver i serumfritt medium og forsyne friskt medium hver 48 h ga bedre bevaring av vevets levedyktighet og overlevelse og vekst av svulster. De 0,4 μm innleggene som brukes under hyperoksiske forhold av inkubatoren tjener som strukturell støtte for ex vivo hjerneskiver og gir også en forbindelse til kunstig tilførsel av næringsstoffer og oksygen til vev og tumorceller i fravær av blodtilførsel som ser ut til å være tilstrekkelig for å opprettholde vevs levedyktighet i minst ti dager i kulturen. Levende bildebehandling representerer tumorvekst som en funksjon av GFP-signaløkning. Programvaren har imidlertid en terskel for maksimal GFP-lysstyrke som metter signalet og ikke tillater riktig identifisering av encellet motilitet i hjernemikromiljøet. Fremtidig modifikasjon av signaldeteksjonen av mikroskopisk programvare vil forbedre evnen til å rapportere den tidsmessige økningen i GFP-signalet nøyaktig som en funksjon av tumorvekst.
Denne modellen muliggjør også overvåking av tumorvekst og levedyktighet gjennom immunhiistokjemisk farging. Viktigst, denne modellen vil tillate rask testing av effekten av strålingsfølsomhet med eller uten små molekylhemmere av svulster dyrket i hjernens mikromiljø. Vi viser at denne modellen er mottagelig for både behandlinger med stråling og kjemoterapeutikk. I tillegg kan dette systemet brukes til omics studier som proteomikk, metabolomikk og genomikk for å ytterligere forstå kreftvekst og respons på behandlinger i hjernen mikromiljøet. Videre vil testing av potensiell tilbakefall av svulster ved fjerning av inhibitorer etter kortere eksponering tillate ytterligere forståelse av chemoresistant veier som er unike for kreftceller i hjernemikromiljøet.
Oppsummert har vi utviklet en ny ex vivo hjerneskive av xenograft tumorvev som vil overvåke tumorvekst og interaksjon med hjernesvulstmikromiljøet og for rask screening av terapeutiske midler for å blokkere tumorvekst i hjernen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingen økonomiske konflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi vil takke Julia Farnan, Kayla Green og Tiziana DeAngelis for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble delvis støttet av Pennsylvania Commonwealth Universal Research Enhancement Grant Program (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH) og W.W. Smith Charitable Trusts (EjH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
