Summary
Denne metodeartikkelen beskriver hovedtrinnene for å måle H + lekkasje over den indre mitokondriemembranen med patch-clamp-teknikken, en ny tilnærming for å studere den termogene kapasiteten til mitokondrier.
Abstract
Mitokondrietermogenese (også kjent som mitokondrie-frakobling) er et av de mest lovende målene for å øke energiforbruket for å bekjempe metabolsk syndrom. Termogene vev som brunt og beige fett utvikler svært spesialiserte mitokondrier for varmeproduksjon. Mitokondrier av andre vev, som primært produserer ATP, konverterer også opptil 25% av den totale mitokondrieenergiproduksjonen til varme og kan derfor ha en betydelig innvirkning på fysiologien til hele kroppen. Mitokondrietermogenese er ikke bare viktig for å opprettholde kroppstemperaturen, men forhindrer også diettindusert fedme og reduserer produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) for å beskytte celler mot oksidativ skade. Siden mitokondrietermogenese er en nøkkelregulator for cellulær metabolisme, vil en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen hjelpe i utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon. Det er viktig at de presise molekylære mekanismene som styrer akutt aktivering av termogenese i mitokondrier er dårlig definert. Denne mangelen på informasjon skyldes i stor grad en rekke metoder for direkte måling av frakobling av proteiner. Den nylige utviklingen av patch-clamp metodikk anvendt på mitokondrier aktivert, for første gang, den direkte studien av fenomenet ved opprinnelsen til mitokondrie termogenese, H + lekkasje gjennom IMM, og den første biofysiske karakteriseringen av mitokondrietransportører som er ansvarlige for det, det frakoblingsprotein 1 (UCP1), spesifikk for brune og beige fettstoffer, og ADP / ATP-transportøren (AAC) for alle andre vev. Denne unike tilnærmingen vil gi ny innsikt i mekanismene som styrer H + lekkasje og mitokondrie termogenese og hvordan de kan målrettes mot å bekjempe metabolsk syndrom. Dette dokumentet beskriver patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier for å studere deres termogene kapasitet ved å måle H + strømmer direkte gjennom IMM.
Introduction
Mitokondrier er kjent for å være cellens kraftstasjon. Faktisk er de den viktigste kilden til kjemisk energi, ATP. Det som er mindre kjent er at mitokondrier også genererer varme. Faktisk genererer hver mitokon hele tiden de to energitypene (ATP og varme) og en fin balanse mellom de to energiformene definerer metabolsk celle homeostase (figur 1). Hvordan mitokondrier distribuerer energi mellom ATP og varme er absolutt det mest grunnleggende spørsmålet innen bioenergetikk, selv om det fortsatt i stor grad er ukjent. Vi vet at økende mitokondrievarmeproduksjon (kalt mitokondrietermogenese), og dermed redusere ATP-produksjonen øker energiforbruket, og dette er en av de beste måtene å bekjempe metabolsk syndrom1.
Mitokondrietermogenese stammer fra H+ lekkasje over den indre mitokondriemembranen (IMM), noe som fører til frakobling av substratoksidasjon og ATP-syntese med påfølgende varmeproduksjon, derav navnet "mitokondrie-frakobling"1 (figur 1). Denne H+ lekkasjen avhenger av mitokondrietransportører kalt frakoblingsproteiner (UCPer). UCP1 var den første UCP identifisert. Det uttrykkes bare i termogent vev, brunt fett og beige fett der mitokondrier er spesialisert for varmeproduksjon 2,3,4. Identiteten til UCP i ikke-fettvev som skjelettmuskulatur, hjerte og lever, har forblitt kontroversielt. Mitokondrier i disse vevene kan ha ca 25% av den totale mitokondrieenergien omdannet til varme, noe som kan påvirke fysiologien til hele kroppen1 betydelig. I tillegg til å opprettholde kroppstemperaturen, forhindrer mitokondrie termogenese også diettindusert fedme ved å redusere kalorier. I tillegg reduserer det produksjonen av reaktive oksygenarter (ROS) av mitokondrier for å beskytte celler mot oksidativ skade1. Dermed er mitokondrietermogenese involvert i normal aldring, aldersrelaterte degenerative lidelser og andre forhold som involverer oksidativt stress, som iskemi-reperfusjon. Derfor er mitokondrietermogenese en kraftig regulator av cellulær metabolisme, og en mekanistisk forståelse av denne grunnleggende prosessen vil fremme utviklingen av terapeutiske strategier for å bekjempe mange patologier forbundet med mitokondrie dysfunksjon.
Mitokondrie respirasjon var den første teknikken for å avsløre den avgjørende rollen av mitokondrie termogenese i cellulær metabolisme og er fortsatt den mest populære i samfunnet1. Denne teknikken er basert på måling av oksygenforbruk av mitokondrie-elektrontransportkjeden (ETC) som øker når mitokondrie H + lekkasje aktiveres. Denne teknikken, selv om den er instrumentell, kan ikke direkte studere mitokondrie H + lekkasje over IMM1, og dermed gjøre presis identifisering og karakterisering av proteinene som er ansvarlige for det vanskelig, spesielt i ikke-fettvev der varmeproduksjonen er sekundær sammenlignet med ATP-produksjon. Nylig ga utviklingen av patch-clamp-teknikken som brukes på mitokondrier, den første direkte studien av H + lekkasje over hele IMM i ulike vev 5,6,7.
Mitokondrie patch-klemmen til hele IMM ble først etablert på en reproduserbar måte av Kirichok et al.8. De beskrev den første direkte målingen av mitokondriekalsium uniporter (MCU) strømmer i 2004 ved hjelp av mitoplaster fra COS-7 cellelinjer8. Senere viste Kirichok-laboratoriet kalsiumstrømmer fra IMMer av mus9 og Drosophila vev9. Andre laboratorier bruker nå rutinemessig denne teknikken til å studere de biofysiske egenskapene til MCU 10,11,12,13,14. Hele IMM patch-clamp analyse av kalium og kloridledning er også mulig og har blitt nevnt i flere papirer, men har ennå ikke vært hovedtema for en publikasjon 6,7,9. Den første målingen av H + strømmer over IMM ble rapportert i 2012 fra musbrun fett mitokondrier6, og fra mus beige fett mitokondrier i 20177. Denne strømmen skyldes det spesifikke frakoblingsproteinet av termogent vev, UCP1 6,7. Nyere arbeid publisert i 2019 karakteriserte AAC som det viktigste proteinet som er ansvarlig for mitokondrie H + lekkasje i ikke-fettvev som hjerte og skjelettmuskulatur5.
Denne unike tilnærmingen gir nå mulighet for direkte høyoppløselig funksjonell analyse av mitokondrieionkanaler og transportører som er ansvarlige for mitokondrietermogenese. For å lette utvidelsen av metoden og for å utfylle andre studier som mitokondrie-respirasjon, er en detaljert protokoll beskrevet nedenfor for måling av H + strømninger som bæres av UCP1 og AAC. Tre viktige trinn er beskrevet: 1) mitokondrieisolasjon fra musbrunt fett for å analysere UCP1-avhengig H + strøm og mitokondrieisolasjon fra hjertet for å analysere AAC-avhengig H + strøm, 2) tilberedning av mitoplaster med en fransk presse for mekanisk brudd på den ytre mitokondriemembranen (OMM), 3) patch-klemmeopptak av UCP1 og AAC-avhengige H + strømmer over hele IMM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer for dyr som ble utført, samsvarer med National Institutes of Health-retningslinjene og ble godkjent av University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
MERK: Mitokondrieisolasjonsprosedyren er basert på differensial sentrifugering og varierer litt fra vev til vev. For eksempel, siden brunt fettvev er ekstremt rik på lipider, krever det et ekstra skritt for å skille celleavfall og organeller fra lipidfasen før høsting av mitokondriene. For å unngå forvirring er de to mitokondrieisolasjonsprosedyrene (den ene fra det brune fettet og den andre fra hjertet) beskrevet nedenfor.
1. Mitokondrieisolasjon fra mus interscapular brunt fett (modifisert fra Bertholet et al. 2020)15
- Euthanize C57BL/6 mannlig mus ved hjelp av CO 2-kvelning og påfølgende cervical dislokasjon, som anbefalt av American Veterinary Medical Association Panel og IACUC Committee.
- Etter å ha plassert musen med magen vendt mot bordet, spray alkohol for å rengjøre og våte håret (modifisert fra Mann et al., 2014)16.
- Lag et snitt på 2 cm i øvre rygg etter å ha tatt tak i huden med pinsett.
- Trekk ut det brune interscapular fettet til musen som tilsvarer et to-lobed organ med en sommerfuglform16.
- Overfør det brune fettet til en 35 mm Petri-tallerken fylt med 5 ml kald isolasjonsbuffer (tabell 1) som tidligere er plassert på is.
- Rengjør det brune fettet fra det hvite fettet under en kikkert.
- Overfør det brune fettet til et 10 ml beger med 5 ml kald isolasjonsbuffer (tabell 1) for å hogge det opp i tynne biter. Overfør til den iskjølte 10 ml glasshomogenisatoren (plastmateriale polytetrafluoretylen (PTFE) pestle).
- Bruk en overhead røre for å homogenisere pre-cut vevet på is med seks milde slag med en kontrollert hastighet på 275 rotasjoner / min.
- Sentrifuger homogenatet ved 8500 x g i 10 min ved 4 °C i et 15 ml iskaldt konisk rør. Kast supernatanten som inneholder lipidfasen.
- Resuspend pellet i 5 ml iskald isolasjonsbuffer (tabell 1) og homogeniser, en gang til, suspensjonen på is med seks langsomme slag med en hastighet på 275 rotasjon / min.
- Overfør homogenatet i et 15 ml iskaldt konisk rør og sentrifuger det ved 700 x g i 10 min ved 4 °C for å pellet alle nuklei og ubrutte celler.
- Samle supernatanten i et friskt 15 ml rør og legg det på is.
- Sentrifuger supernatanten ved 8500 x g i 10 min ved 4 °C for å få en pellets som inneholder mitokondrier.
- Resuspendpellet som inneholder mitokondrier i 3,8 ml iskald hypertonisk-mannitolbuffer (tabell 2) og inkuberer mitokondriefjæringen på is i 10-15 min.
2. Mitokondrieisolasjon fra musehjertet (modifisert fra Garg et al. 2019)17
- Euthanize C57BL/6 mannlig mus ved hjelp av CO 2-kvelning og påfølgende cervical dislokasjon, som anbefalt av American Veterinary Medical Association Panel og IACUC Committee.
- Etter å ha plassert musen på ryggen, spray alkohol for å rengjøre og våte håret. Deretter gjør du et 2 cm snitt på thoraxen etter å ha tatt tak i huden med pinsett.
- Disseker hjertet fra dyrets bryst og skyll det for å fjerne alt blodet i et 10 ml beger med 5 ml av den kalde isolasjonsløsningen (tabell 1).
- Når hjertet er ryddet for spor av blod, overfør det til et annet 10 ml beger som inneholder 5 ml kald isolasjonsbuffer (tabell 1) for å hogge det opp i tynne stykker. Deretter overføres til en iskjølt 10 ml glasshomogenisator (PTFE pestle).
- Bruk en overhead røre for å homogenisere pre-cut vevet på is med seks milde slag med en kontrollert hastighet på 275 rotasjoner / min.
- Overfør homogenatet til et 15 ml iskaldt konisk rør og sentrifuger det ved 700 x g i 10 minutter ved 4 °C til pelletskjerner og ubrutte celler.
- Samle supernatanten i et friskt 15 ml rør og legg det på is.
- Sentrifuger supernatanten ved 8500 x g i 10 min ved 4 °C for å få en pellets som inneholder mitokondrier.
- Resuspend mitokondriepellet i 3,8 ml iskald hypertonisk-mannitolbuffer (tabell 2) og inkuber mitokondriefjæringen på is i 10-15 min.
3. Tilberedning av mitoplaster med fransk presse for mekanisk brudd på OMM.
MERK: Den franske presseprosedyren gjør at IMM kan frigjøres fra OMM med sin integritet bevart, inkludert matrisen og crista (figur 2)18. Mitokondrier er forhåndsinkubert i en hypertonisk-mannitolbuffer (tabell 2) og utsatt for lavere trykk under den franske presseprosedyren for å unngå drastisk strekk av IMM når OMM er sprukket.
- Fyll mitokondrie-hyperton-mannitol-fjæringen i en nedkjølt minitrykkcelle (stempeldiameter 3/8") av den franske pressen (figur 3A).
- Velg Medium-modus for den franske pressen og komprimer suspensjonen gjennom minitrykkcellen ved 110 på den franske pressens urskive for de brune fete mitokondriene og ved 140 for hjertegetokondriene (~ 2000 psi). Påse at fjæringen kommer ut av minitrykkcellen med en hastighet på ca. 1 dråpe/s.
- Samle dråpene i et 15 ml iskjølt konisk rør.
- Sentrifuger suspensjonen ved 10.500 x g i 10 min ved 4 °C.
- Resuspend mitoplaster pellet i 0,5-2 ml iskald Hypertonic-KCl buffer (Tabell 3) og lagre suspensjonen på is.
MERK: Brunt fett og hjerte mitoplaster er klare for patch-clamp opptak og bør forbli brukbare i ca 3-6 h.
4. Elektrofysiologiske opptak av H + lekkasje gjennom UCP1 og AAC 5,7,15
MERK: Bruk følgende elektrofysiologiske oppsett (figur 3B): invertert mikroskop med differensialinterferenskontrast (DIC), 60x vanninnlevelsesmål, vibrasjonsisolasjonsbord og et Faraday-bur, en standard forsterker som støtter lavstøyopptak, en standard digitaliseringsenhet som brukes til elektrofysiologisk oppsett, pClamp 10, en mikromanipulator, badreferanseelektrode (3 M KCl-agar saltbro satt inn i en mikroelektrodeholder som inneholder en sølv / sølvkloridpellet støpt inn i holderkroppen (beskrevet i Liu et al. 2021)19, perfusjonskammer med en 0,13 mm glassdekslerlipbunn, koblet til et tyngdekraftmatet perfusjonssystem.
- Trekk borosilikatglassfilamentene på innspillingsdagen ved hjelp av en mikropipettetrekker. Sett et program på trekkeren som brukes til å generere pipetter med høy grad av reproduserbarhet20.
MERK: Denne programdesignen krever flere forsøk på å få pipetter optimalisert for IMM patch-clamp. En standard pipette har fine spisser med en progressiv konisk form. - Sett inn en glassfilament i trekkeren og trekk for å få nesten to identiske patchpipetter fra en borosilikatfilament.
- Juster programmet når pipetter blir inkonsekvente mellom trekksykluser på grunn av aldring av varmeboksens filament av trekkeren.
- Plasser pipetten inne i pipettepusseren og plasser spissen nær filamentet under 100x forstørrelse for å brannpolere den.
- Trykk på fotpedalen flere ganger for å varme opp filamentet uten å tette eller skade spisskurven.
- Poler til pipetter med motstand mellom 25 og 35 MΩ oppnås når de fylles med TMA-basert pipetteoppløsning (TMA for tetrametylammoniumhydroksid, tabell 4).
- For-inkuber deksler (5 mm diameter, 0,1 mm tykkelse) med 0,1% gelatin for å redusere mitoplastadhesjonen og skyll dem med KCl-badeløsningen (tabell 5) før du deponerer mitoplastfjæringen.
- Forbered en rå fortynning ved å blande ~ 35 μL av den konsentrerte mitoplastfjæringen med 500 μL av KCl-badeløsningen (tabell 5) og legg den på deksler som tidligere var plassert i en brønn på en 4-brønns plate.
- Inkuber på is i 15 til 20 min for mitoplaster til sediment på dekslene.
- Fyll badekammeret helt med ~50 μL av KCl-badeløsningen (tabell 5).
- Overfør en coverlip med mitoplaster i kammeret ved hjelp av tynne mikrodeseksjon pinsett med bøyd spiss.
- Ordne dekslene på bunnen av kammeret. Ikke forfør kammeret for å holde mitoplastene stabile på dekslene.
- Velg en individuell ikke-klebende mitoplast i form av 8 ved å skanne dekslene under mikroskopet med et 60x mål.
- Legg pipetten med pipetteoppløsningen (~50 μL) og plasser den i pipetteholderen.
- Ta pipetten inn i badeløsningen med en mikromanipulator og nærme deg den rett over den valgte mitoplasten for å komme nær IMM. Forsterkerprogrammet gir pipettens motstand når den er i badeløsningen. Hold membranpotensialet på 0 mV og påfør 10 mV pulser ved hjelp av membrantestkommandoen i forsterkerprogrammet.
- Påfør et lite negativt trykk for raskt å lage en gigaseal med IMM (figur 2B).
- Strekk pipetten med mitoplasten festet for å holde dem borte fra dekslene for å unngå tetningsbrudd på grunn av pipettedriften under eksperimentet.
- Kompenser de bortkomne kapasitanstransientene med kommandoen "membrantest" i forsterkerprogrammet før du tester hel-mitoplastkonfigurasjonen for å oppnå riktig kapasitansmåling (Cm) for mitoplastmembranen etter innbruddet.
- Påfør spenningspulser med kort varighet (5-15 ms) (250-600 mV) med forsterkerprogrammet for å sprekke membranplasten under glasspipetten og oppnå hel-mitoplastkonfigurasjonen (figur 2C). Vellykket innbrudd gjenspeiles av gjenkomsten av kapasitans forbigående transienter.
- Etter innbruddet monterer du kapasitanstransientene med forsterkerprogrammets membrantestalternativ for å vurdere membrankapasitansen (som reflekterer størrelsen på mitoplasten) og tilgangsmotstanden Ra (som reflekterer kvaliteten på hel-mitoplastkonfigurasjonen). Etter innbruddet skal Ra være mellom 40 og 80 MΩ. Mitoplaster (2-6 μm i størrelse) som brukes til patch-clamp eksperimenter har vanligvis membran kapasitanser på 0,5-1,1 pF.
- Umiddelbart etter innbruddet må KCl-badeløsningen (tabell 5) skiftes ut med HEPES-badeløsningen (tabell 6) ved å starte perfusjonen.
- Påfør en 850 ms rampeprotokoll designet med forsterkerprogrammet, fra -160 mV til +100 mV med et intervall på 5 s, mens du holder mitoplasten på 0 mV. Denne protokollen fungerer for UCP1 6,7,15 og AAC5 studier (figur 4 og figur 5).
MERK: Det anbefales for UCP1- og AAC-avhengige H+ strømmålinger å innhente alle elektrofysiologiske data ved 10 kHz og filtrere ved 1 kHz ved hjelp av tilstrekkelig programvare som driver forsterkeren og digitaliseringsenheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utviklingen av patch-clamp-metoden som brukes på mitokondrier, ga den første direkte studien av H + lekkasje gjennom IMM og mitokondrietransportører, UCP1 og AAC, som er ansvarlige for den. Den elektrofysiologiske analysen av UCP1- og AAC-avhengige H+ lekkasjer kan gi et første blikk på den termogene kapasiteten til mitokondrier. Resultatdelen beskriver standardprosedyrene for å måle H+ lekkasje via UCP1 og AAC.
UCP1-avhengig H+ gjeldende måling (figur 4)6,7,15
Påføring av spenningsrampeprotokollen induserer en stor amplitude H + strøm over IMM av brunt fett uten tilsetning av eksogene fettsyrer (FA), de nødvendige aktivatorene til UCPer (figur 4A). Dette er en spesifikk egenskap ved brunt og beige fett IMM på grunn av lokal produksjon av FA ved en fosfolipaseaktivitet forbundet med membranen. Når H+ strømmen utvikler seg som svar på rampeprotokollen, er det viktig å vente på at den nåværende amplituden stabiliserer seg. Kvantifisering av H+ nåværende amplitude via UCP1 krever bestemmelse av grunnlinjen tilsvarende en null UCP1-strøm. Når stabiliteten til H+ strømamplituden er nådd, Det anbefales å parfyme enten UCP1-hemmer Guanosine difosfat (BNP - 1 mM, figur 4A) eller en FA-chelator (0,5% FA-fri bovint serumalbumin, ikke vist) eller 10 mM Methyl Beta Cyclodextrin (MβCD) for den endogene membranutvinningen, figur 4B, svart spor). Reststrømmen er strømmen som amplituden til UCP1-strømmene vil bli bestemt fra. For å sammenligne amplitudene til UCP1-strømmer i forskjellige mitoplaster beregnes den nåværende tettheten (pA/pF) for hver mitoplast ved å normalisere UCP1-strømmene med mitoplast-kapasitansen (Cm)5,7. Strømmen kan reaktiveres ved tilsetning av eksogen langkjede FA ved hjelp av arakidonsyre (AA) eller oljesyre (OA) (1-2 μM). Siden både brune og beige fett IMMs har PLA2 aktivitet, endogen membran FAs er delvis regenerert innen få minutter etter vask MβCD / albumin fra badekaret, noe som fører til reaktivering av H + strøm via UCP1 6,7. Som forventet forsvinner denne strømmen helt i IMM av UCP1-/- mus (figur 4A)6,7.
En mer presis måte å sammenligne tettheten og aktiviteten til UCP1 av forskjellige mitoplaster av samme vev eller mitoplaster fra forskjellige vev (brunt og beige fett) er å kontrollere FA-konsentrasjonen på overflaten av IMM 6,7. Faktisk kan H + nåværende amplitude variere mellom mitoplaster på grunn av UCP1 proteinmengden per IMM, men også på grunn av produksjon av endogen FA. Dermed anbefales det å trekke ut endogen FA fra IMM og å reaktivere UCP1-avhengig H + strøm ved å legge til eksogen FA ved en kjent konsentrasjon. For å gjøre dette må endogene FAer først ekstraheres fra IMM ved å parfymere en HEPES-badeløsning (tabell 6) som inneholder 10 mM MβCD. Deretter, for å tillate reaktivering av H + -strømmen via UCP1 med bare en presis konsentrasjon av eksogene FAer, vil sistnevnte bli perfundert på en HEPES / MβCD-bakgrunn for å kontinuerlig trekke ut FAer produsert fra IMM.
Studien av konkurransen mellom purinkjernen og FA for binding til UCP1 er også mulig med patch-clamp-teknikken 6,7,15. Hemming av UCP1 ved purinkjerner (f.eks. mg2+-fri ATP) kan sammenlignes med to forskjellige konsentrasjoner av FA (ideelt 10 ganger). Til dette formål fjernes endogene membraner FA først ved å bruke 10 mM MβCD (figur 4B, svart spor). Påføring av eksogene FAer (f.eks. her, bare 0,5 mM FAer vises) påført på en bakgrunn på 10 mM MβCD tillater presis kontroll av konsentrasjonen av aktiverende FAer fordi lokalt produserte FAer umiddelbart ekstraheres fra membranen. I denne tilstanden er eksogene FAer primært ansvarlige for utviklingen av H + -strømmen. Ulike konsentrasjoner av ATP legges deretter til OA/MβCD-løsningen for å vurdere IC50ATP for hver FA-konsentrasjon som testes, og dermed fastslå om FA konkurrerer med purinkjernerotider for binding til UCP1.
AAC-avhengig H+ strømmåling (figur 5)5
I motsetning til brunt fett utvikler ikke IMM av ikke-fettvev som skjelettmuskulatur og hjertet ikke en målbar H + umiddelbart etter innbruddet (figur 5, svarte spor). For å indusere en målbar H+ strøm gjennom AAC, er det viktig å påføre HEPES-badeløsningen (tabell 6) som inneholder 1-2 μM eksogen FA (AA, figur 5A, rød spor). Dette kan tyde på at IMM av ikke-fettvev ikke har et FA-produksjonsmaskineri i IMM som finnes i IMM av brunt og beige fett.
Grunnlinjen (eller nullstrømmen) for kvantifisering av H+ strømamplituden via AAC tilsvarer HEPES-badeløsningen (tabell 6) som er perfundert på overflaten av IMM før FA tilf. For å bekrefte at den målte H + strømmen bæres av AAC, er det viktig å bruke spesifikke hemmere av AAC lagt til FA, 1 μM karboksyatractyloside (CATR, figur 5A) eller 4 μM bonkgrekic acid (BKA, ikke vist)5, som nesten helt hemmer H + strøm. Denne strømmen forsvinner helt i IMM av AAC1-/- mus (figur 5A), AAC1 er den dominerende isoformen i hjertet5.
Patch-clamp analyse av samspillet mellom FA-avhengig H + lekkasje og nukleotider er også mulig med AAC5. Det er imidlertid en viktig forskjell mellom AAC og UCP1: AAC bærer ikke bare H + , men hovedfunksjonen er å transportere adeninkjerner ADP og ATP21. For å studere hvordan adenin nukleotidutveksling påvirker FA-avhengig H + lekkasje, legges 1 mM Mg2 + -fri ADP til pipetteoppløsningen. Deretter blir FA perfundert for å aktivere H + strøm via AAC. Bare ADP i pipetteoppløsningen forstyrrer ikke H+ strømmen5. Når en stabil H + strømamplitude er nådd, blir ADP perfundert samtidig med FA. Først når ADP er til stede på begge sider av membranen for å generere en aktiv nukleotidutveksling via AAC, er en konstant, men aldri fullstendig hemming av H + lekkasje oppnådd (figur 5B). Dette kan tyde på at de to transportmodusene til AAC (FA-H+ strøm og ADP/ATP-utveksling) konkurrerer og sannsynligvis vil skje via samme translokasjonsbane. ADP/ADP homoexchange ble valgt for å unngå den ekstra strømmen knyttet til den fysiologiske ADP/ATP heteroexchange5.
Figur 1: Mitokondrieenergifordeling mellom varme- og ATP-produksjon. Mekanismer for mitokondrie ATP og varmeproduksjon. Mitokondrier har to membraner [OMM (lilla) og IMM (oransje)], som inneholder maskineriet for ATP og varmeproduksjon. ETC genererer en elektrokjemisk gradient på H+ over IMM, som brukes av ATP-syntase (AS) til å produsere ATP og brukes av UCPer til å generere varme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Mitokondrie patch-clamp teknikk (modifisert fra Bertholet et al. 2020)15. (A) Mitokondrier er isolert fra vev lysat ved sentrifugering (OMM i lilla og IMM i oransje). (B) Lavtrykk fransk presse brister OMM for å frigjøre IMM som gir en mitoplast. Venstre panel representerer en mitoplast, som antar en 8-formet form med rester av OMM festet til IMM. En glasspipette nærmer seg IMM for å danne en gigaohm-forsegling (mitoplast-festet konfigurasjon). Et bilde av den mitoplast-tilkoblede konfigurasjonen vises i panelet til høyre. (C) Konfigurasjonen av hele IMM (diagram i venstre panel) oppnås etter å ha brutt membranplasteret under pipetten med flere spenningspulser (200-500 mV). Et bilde av hele IMM-konfigurasjonen vises i høyre panel. Innoverstrømmer (I, rød) er negative. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Fransk presse og elektrofysiologisk oppsett. (A) Bilde av Fransk Presse, som bidrar til å bryte OMM for å frigjøre IMM. (B) Bilde av et Faraday-bur, invertert mikroskop med differensialinterferenskontrast (DIC), 60x vanninnlevelsesmål, et vibrasjonsisolasjonsbord og en mikromanipulator. Standardforsterkeren, en standard digitaliseringsenhet og PC-datamaskin vises ikke på bildet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: H+ strøm via UCP1 i brunt fett. (A) Representant UCP1-avhengig H+ strøm registrert fra brunt fett mitoplast isolert fra WT (øvre panel) og UCP1−/− mus (nedre panel). Kontrollen H+ strømspor vist i svart tilsvarer den stabiliserte strømamplituden etter at IMM er ødelagt. 1 mM BNP legges deretter til badeløsningen (oransje). Spenningsrampeprotokollen er vist over WT-sporene. PH på bade- og pipetteløsningene er vist i pipette-mitoplastdiagrammet. (B) Hemming av UCP1 ved purinkjerner i brunt fett. Representative UCP1-avhengige H + strømspor i ulike konsentrasjoner av ATP på det cytosoliske ansiktet til IMM av brunt fett av mus ved termoneutralitet. UCP1-avhengig H + strøm ble aktivert med 0,5 mM oljesyre (OA) blandet med 10 mM MβCD.Spenningsprotokollen er angitt øverst. I det nedre panelet er det samme sporet representert, men ikke normalisert med mitoplastmembran kapasitans. Den brune fete mitoplasten i denne figuren hadde en membran kapasitans på 0,624 pF. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: FA-avhengig H+ -strøm via AAC i hjertemitoplast. (A) Representativ AAC-avhengig H+ strøm når den påføres 2 μM AA i badeløsningen (øvre panel, oransje) i WT hjerte mitoplaster og hemmet av 1 μM CATR (lilla). Representativt spor registrert i AAC1 -/− hjertemitoplast er i nedre panel. Kontrollstrømmen er i svart. Spenningsrampeprotokollen er vist over WT-sporene. PH på bade- og pipetteløsningene er vist i pipette-mitoplastdiagrammet. (B) Mens pipetteoppløsningen inneholdt 1 mM ADP, induseres AAC-avhengig H+ strøm med 2 μM AA (oransje) og hemmes ved tilsetning av 1 mM ADP til bad (lilla). Spenningsrampeprotokollen vises over sporet. PH på bade- og pipetteløsningene er vist i pipette-mitoplastdiagrammet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| sukrose | 250 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH justert til 7.2 med TrisBase |
Tabell 1: Mitokondrieisolasjonsbuffer (tonicity ~ 300 mmol per kg)
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| sukrose | 140 mM |
| D-mannitol | 440 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH justert til 7.2 med TrisBase |
Tabell 2: Hypertonisk mannitolbuffer
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| KCl | 750 mM |
| HEPES | 20 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH justert til 7.2 med TrisBase |
Tabell 3: Hypertonisk KCl-buffer
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| Tma | 130 mM |
| HEPES | 100 mM |
| EGTA | 1 mM |
| MgCl2 for UCP1-opptak | 2 mM |
| eller | |
| TrisCl for AAC-opptak | |
| pH justert til 7,0 eller 7,5 med D-glukonsyre |
Tabell 4: TMA-basert pipetteoppløsning (tonicity ~ 360 mmol per kg)
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| KCl | 150 mM |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH justert til 7.0 med TrisBase |
Tabell 5: KCl badeløsning (tonicity ~ 300 mmol per kg)
| Reagent | Endelig konsentrasjon |
| sukrose | 100 mM for UCP1-opptak |
| eller | |
| 150 mM for AAC-opptak | |
| HEPES | 150 mM for UCP1-opptak |
| eller | |
| 100 mM for AAC-opptak | |
| 1 mM EGTA | |
| pH justert til 7.0 med TrisBase |
Tabell 6: HEPES badeløsning (tonicity ~ 300 mmol per kg)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metodeartikkelen tar sikte på å presentere patch-clamp teknikken som nylig ble brukt på mitokondrier, en ny tilnærming for å direkte studere H + lekkasje gjennom IMM ansvarlig for mitokondrie termogenese 5,6,7,15. Denne teknikken er ikke begrenset til vev og kan også brukes til å analysere H + lekkasje og andre ledninger av IMM i forskjellige standard menneske- og cellemodeller som HAP1, COS7, C2C12 og MEF-celler. Imidlertid krever hver mitokondrieisolasjon noen justeringer som er spesifikke for hver celle eller vevstype.
Hovedtrinnene i direkte måling av H + strømmer gjennom IMM av brunt fett 5,6 og hjertet5 er oppsummert her for å illustrere mekanismene som er ansvarlige for mitokondrietermogenese i spesialiserte termogene og ikke-fettvev. Faktisk tillater utviklingen av denne teknikken for første gang høyoppløselig funksjonell analyse av de to viktigste UCPene (UCP1 og AAC) i sitt opprinnelige membranmiljø med presis kontroll av kritiske eksperimentelle forhold som: 1) pH av pipette- og badeløsninger, 2) kontroll av membranpotensial over IMM, og 3) presis sammensetning av løsninger for å utelukke eventuelle ioner og metabolitter som kan brukes til IMM annet enn H +. Den TMA-baserte pipetten (tabell 4) og HEPES badeløsninger (tabell 6) er formulert for å registrere H + strømmer og inneholder bare salter som dissosierer seg i store anioner og kasjoner som normalt er ugjennomtrengelige for IMM. Mens badeløsningen kan endres ved hjelp av et perfusjonssystem, slik at forskjellige behandlinger kan påføres den cytosoliske siden av membranen, er det ikke mulig å endre sammensetningen av intrapipetteoppløsningen. Dette begrenser forståelsen av reguleringsmekanismene som oppstår på matrisesiden. Faktisk må forbindelser være til stede innenfor intrapipetteoppløsningen på tidspunktet for fylling av pipetten. Derfor kan H + lekkasje studeres isolert av andre strømmer. Farmakologiske studier og bruk av KO-mus var avgjørende for karakterisering og identifisering av proteinene som er ansvarlige for H + strømmen gjennom IMM av ulike vev 5,6,7. Disse resultatene slo fast at UCP1 er den viktigste UCP av brunt og beige fett, og AAC i ikke-fettvev. Vi kan ikke helt utelukke muligheten for eksistensen av andre H + strømmer som ikke er mediert av UCP1 og AAC. Imidlertid, hvis andre H + strømmer eksisterer, var deres amplitude utenfor oppløsningen av vårt elektrofysiologiske oppsett. Vi måler ikke H + pumping av ETC under forholdene som er beskrevet i dette papiret. Når vi har nådd hele IMM-konfigurasjonen, vaskes mitokondriematrisen ut ved perfusjon av intrapipetteoppløsningen. Intermembrane-rommet eksisterer ikke lenger siden trinnet med å bryte OMM med den franske pressen. Det er ikke tilsatt substrater av luftveiene som er avgjørende for H + pumping gjennom ETC. Det er derfor usannsynlig å utvikle aktiv H + pumping under de elektrofysiologiske forholdene som er beskrevet her.
Enkeltkanalsinnspillinger av avgiftsbelagte oppdateringer er ikke beskrevet i denne artikkelen. Selv om UCP1- og AAC-avhengige H+ strømmer over hele IMM er robuste på grunn av deres høye proteintetthet, kunne ikke enkeltkanalsåpningene løses fordi amplituden til UCP1- og AAC-enhetsstrømmene sannsynligvis er for små.
I motsetning til biokjemiske studier trenger mitokondrieisolasjonen beskrevet i denne artikkelen ikke å resultere i et høyt nivå av mitokondrie renhet. Faktisk skannes mitokondriepreparatet som består av en rekke individualiserte mitoplaster og celleavfall under mikroskopet for å finne en 8-formet mitoplast å lappe. Den 8-formede formen på mitoplasten skyldes frigjøring av IMM gjennom et hull i OMM forårsaket av den franske presseprosedyren (figur 2). Den mindre tette loben tilsvarer IMM15,17. Et passende preparat kan defineres ved fritt bevegelige mitoplaster som lett kan skille seg fra cellulært rusk. Det er imidlertid viktig å redusere antall rusk for å unngå forurensning av IMM, noe som kan påvirke kvaliteten på forseglingen av glasspipetten med membranen. Dette skannetrinnet under mikroskopet gjør det mulig å velge en mitoplast med høy IMM-integritet anerkjent av en mindre tett lobe enn den som er avgrenset av OMM og øker derfor sjansene for et vellykket innbrudd.
Denne teknikken ga for første gang direkte måling av UCP1- og AAC-avhengige H+ strømmer i deres opprinnelige membran. Imidlertid eksisterer mitokondrieintegritet og oppdeling ikke lenger på grunn av bruddet på OMM og sannsynligvis cristae. Det er derfor viktig å utfylle patch-clamp analyse med andre klassiske metoder som mitokondrie respirasjon for å bekrefte den fysiologiske rollen til nylig karakteriserte proteiner i intakt mitokondrier.
Patch-clamp teknikken som brukes på mitokondrier gir nye muligheter for å bedre forstå molekylære mekanismer som er ansvarlige for mitokondrie H + lekkasje og termogenese. Kombinert med moderne cellulære og molekylære teknikker, vil denne innovative tilnærmingen gi ny innsikt i mekanismene som styrer den termogene kapasiteten til mitokondrier og hvordan de kan målrettes mot å bekjempe sykdommer forbundet med mitokondrie dysfunksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Jeg takker Dr. Yuriy Kirichok for den store vitenskapen jeg var en del av i laboratoriet hans og medlemmene av Kirichok-laboratoriet for de nyttige diskusjonene. Jeg takker også Dr. Douglas C. Wallace for å ha gitt AAC1 knockout mus. Finansiering: A.M.B ble støttet av American Heart Association Career Development Award 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
- Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
- Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
- Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
- Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
- Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
- Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
- Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317 (2012).
- Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704 (2013).
- Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
- Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
- Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
- Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
- Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326 (2020).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174 (2014).
- Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
- Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
- Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
- Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
- Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).
