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Cancer Research

मानव परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में γ-H2AX Foci परख के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म स्कोरिंग विधि

Published: December 25, 2021 doi: 10.3791/62623
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1, 1, 1, 1, 4, 5, 6, 1
1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department, iThemba LABS, 2Department of Biotechnology, University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences, University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences, Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine, University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Summary

यह प्रोटोकॉल परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स पर γ-H2AX फोसी परख की स्लाइड तैयारी और स्वचालित स्कोरिंग प्रस्तुत करता है। परख की विधि और संवेदनशीलता को समझाने के लिए, विट्रो मेंअलग-थलग लिम्फोसाइट्स को विकिरणित किया गया था। डीएनए डीएसबी डिटेक्शन की यह स्वचालित विधि तेज और उच्च थ्रूपुट जैविक दोसिमेत्री अनुप्रयोगों के लिए उपयोगी है।

Abstract

आयनीकरण विकिरण डीएनए क्षति का एक शक्तिशाली प्रेरक और एक अच्छी तरह से प्रलेखित कार्सिनोजन है। जैविक डोसिमेट्री में व्यक्तिगत खुराक मूल्यांकन करने के लिए आयनीकरण विकिरण के संपर्क में आने से प्रेरित जैविक प्रभावों का पता लगाना शामिल है। यह विकिरण आपात स्थिति के ढांचे में प्रासंगिक है, जहां स्वास्थ्य आकलन और उजागर पीड़ितों के लिए नैदानिक उपचार की योजना महत्वपूर्ण हैं । चूंकि डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) को विकिरण-प्रेरित डीएनए क्षति का सबसे घातक रूप माना जाता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल रक्त नमूनों में डीएनए डीएसबी का पता लगाने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। यह कार्यप्रणाली फ्लोरोसेंट लेबल वाले फॉस्फोरिलेटेड डीएनए रिपेयर प्रोटीन, नामत γ-एच2एक्स का पता लगाने पर आधारित है । प्रति सेल γ-एच2एएक्स फोसी की संख्या स्कोर करने के लिए एक स्वचालित माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग टर्न-अराउंड समय में महत्वपूर्ण कमी के साथ एक मानकीकृत विश्लेषण की अनुमति देता है। इसलिए, γ-H2AX परख जैविक dosimetry के लिए सबसे तेज और संवेदनशील परख में से एक होने की क्षमता है । इस प्रोटोकॉल में, स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों से पूरे रक्त नमूनों को संसाधित किया जाएगा और बायोडोसिमिट्री अनुप्रयोगों के लिए स्वचालित और संवेदनशील γ-H2AX फोसी परख के उपयोग को समझाने के लिए विट्रो में विकिरणित किया जाएगा। एक एकीकृत फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ एक स्वचालित स्लाइड स्कैनिंग सिस्टम और विश्लेषण मंच का उपयोग किया जाता है, जो पूर्वाग्रह की कम डिग्री के साथ डीएनए डीएसबी के तेज, स्वचालित स्कोरिंग की अनुमति देता है।

Introduction

अपनी खोज के बाद से, आयनीकरण विकिरण (आईआर) वर्तमान चिकित्सा और औद्योगिक प्रथाओं में एक अनिवार्य उपकरण बन गया है, साथ ही कृषि और सैन्य अनुप्रयोगों में भी। हालांकि, आईआर के व्यापक उपयोग से पेशेवर विकिरण श्रमिकों के साथ-साथ जनता के सदस्यों के लिए विकिरण ओवरएक्सपोजर का खतरा भी बढ़ जाता है। आईआर एक प्रसिद्ध भौतिक कैंसरकारक है जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष तरीके से डीएनए क्षति को प्रेरित कर सकता है, जिससे महत्वपूर्ण स्वास्थ्य जोखिम 1,2हो सकते हैं। इसलिए, खुराक मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि एक्सपोजर की डिग्री विकिरण दुर्घटना 1के प्रबंधन में एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक कदम बनाती है।

बड़े पैमाने पर परमाणु या रेडियोलॉजिकल आपात स्थिति की स्थिति में, खुराक आकलन की संख्या है कि प्रदर्शन की जरूरत है कुछ से हजारों लोगों को दुर्घटना के आकार के आधार पर रेंज कर सकते हैं3। इन परिदृश्यों में, भौतिक डोसिमेट्री भी अस्पष्ट हो सकता है (उदाहरण के लिए, यदि डोसिमीटर ठीक से नहीं पहना जाता है) या अनुपलब्ध, जब जनता के सदस्य शामिल होते हैं। जबकि नैदानिक लक्षणों ट्राइएज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, वे जरूरी विकिरण विशिष्ट नहीं है और एक झूठी निदान में परिणाम कर सकते हैं । इसलिए, भौतिक डोसिमेट्री और नैदानिक आकलन के साथ जैविक डोसिमेट्री का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। यह विधि सेलुलर स्तर पर विकिरण-प्रेरित परिवर्तनों के विश्लेषण की अनुमति देती है और उन उजागर व्यक्तियों की स्पष्ट पहचान को सक्षम बनाती है जिन्हें चिकित्सा उपचार की आवश्यकता होती है4। चिकित्सक तो इस जैविक खुराक मूल्यांकन का उपयोग करने के लिए शारीरिक खुराक पुनर्निर्माण और अंय नैदानिक निदान पूरक कर सकते हैं, ताकि उचित चिकित्सा देखभाल5लिख । जैविक dosimetry के लिए की जरूरत विशेष रूप से त्रई और हताहतों की चिकित्सा प्रबंधन के लिए उच्च होगा जब जोखिम परिदृश्य अच्छी तरह से जाना जाता है और जब पीड़ितों को जनता के सदस्य हैं । ट्राइएज का मुख्य उद्देश्य "चिंतित अच्छी तरह से' व्यक्तियों को प्रभावी ढंग से अलग करना है, जिनके पास प्रोड्रोमल लक्षण हो सकते हैं, लेकिन जिन्हें उच्च खुराक प्राप्त नहीं हुई, तत्काल चिकित्सा सहायता और विशेष देखभाल की आवश्यकता वाले उजागर व्यक्तियों से। विकिरण खुराक का सीमा स्तर जो विकिरण बीमारी का कारण बन सकता है वह लगभग 0.75 - 1.00 Gy है। फिर, जिन व्यक्तियों को > 2 जीवाई ऑफ एक्सपोजर प्राप्त होता है , उन्हें तीव्र विकिरण सिंड्रोम के लिए अधिक खतरा होता है और उन्हें त्वरित चिकित्सा उपचार प्राप्त करना चाहिए6,7. ऐसी आपदाओं की गोलीबारी में पकड़े गए पीड़ितों के लिए समय पर और सटीक जैविक खुराक का अनुमान महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, यह भी आराम और न्यूनतम उजागर पीड़ितों को आश्वस्त कर सकते हैं8।

विकिरण संरक्षण प्राधिकरण विभिन्न बायोडोसिमेट्री मार्कर का उपयोग करते हैं, जो मुख्य रूप से सुसंस्कृत मानव लिम्फोसाइट्स9में साइटोजेनेटिक क्षति, जैसे डाइसेंट्रिक गुणसूत्रों या माइक्रोन्यून्यूक्लियी का पता लगाने पर आधारित होते हैं। साइटोजेनेटिक क्षति का पता10 सीटू संकरण (मछली) स्थानांतरण परख में फ्लोरोसेंट द्वारा भी किया जा सकता है। हालांकि, पारंपरिक साइटोजेनेटिक तरीकों की प्रमुख खामी आपातकालीन स्थिति में परिणाम प्राप्त करने के लिए लंबा बदलाव समय है8।

डीएनए डीएसबी मान्यता प्रक्रिया में शुरुआती चरणों में से एक हिस्टोन संस्करण एच2एक्स का फॉस्फोरिलेशन है, जिससे γ-एच2एक्स का गठन होता है, और मरम्मत कारकों की बाद की भर्ती होती है। पिछले एक दशक में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में विकिरण-प्रेरित γ-एच2एक्स फोसी का पता लगाने से एक विश्वसनीय जैविक डोसिमेट्री उपकरण11, 12,13,14,15के रूप में बढ़ता हुआ ध्यान मिला है। विकिरण की गुणवत्ता और कोशिका प्रकार के आधार पर, विकिरण16, 17के बाद 0.5 - 1 घंटे के भीतर γ-एच2एक्स फोसी की अधिकतम उपज का पता लगायाजाताहै। यह अनुमान लगाया गया है कि डीएनए डीएसबी और γ-एच2एक्स फोसी की संख्या के साथ-साथ फोसी और डीएसबी मरम्मत के गायब होने के बीच घनिष्ठ संबंध है। एक स्पंदित लेजर माइक्रोबसम के साथ लेजर कैंची प्रयोगों ने दिखा दिया है कि γ-एच2एक्स फोसी डीएनए डीएसबी18की साइटों पर स्थानीयकृत हैं। हालांकि यह सक्रिय बहस का विषय बना हुआ है, 125के साथ शुरुआती अध्ययनों में से एक मैंने प्रति कोशिका विघटन की गणना संख्या (विकिरण-प्रेरित डीएनए डीएसबी की संख्या के लिए प्रतिनिधित्व करने योग्य) और γ-एच2एक्स फोसी की संख्या के बीच एक-से-एक संबंध का सुझाव दिया जो19,20रन बनाए गए थे।

पिछले एक दशक में, यूरोपीय संघ ने जैविक और पूर्वव्यापी डोसिमेट्री में एक टिकाऊ नेटवर्क बनाने के लिए मल्टीबायोडोज (उच्च पैमाने पर रेडियोलॉजिकल हताहतों का प्रबंधन करने के लिए बहु-अनुशासनात्मक बायोडोसिमेट्रिक उपकरण) और रेनेबी (बायोडोसिमेट्री के यूरोपीय नेटवर्क को साकार करने) परियोजनाओं को वित्त पोषित किया21,22. इस परियोजना में रेडियोलॉजिकल आपातकाल की स्थिति में आपातकालीन प्रतिक्रिया क्षमताओं का मूल्यांकन करने के लिए पूरे यूरोप में विभिन्न प्रयोगशालाएं शामिल थीं14,21,22. γ-H2AX foci परख में कई फायदे हैं, जैसे कि तेजी से प्रसंस्करण का समय, उच्च थ्रूपुट के लिए अनुमति देने वाले बैच प्रसंस्करण की क्षमता, साथ ही एक्सपोजर के बाद कुछ घंटों के भीतर उपयोग की जाने वाली इसकी उच्च संवेदनशीलता13,23,24. कम खुराक सीमा में परख की उच्च संवेदनशीलता के परिणामस्वरूप कई अध्ययन हुए जहां γ-एच2एक्स फोसी परख का उपयोग रेडियोथेरेपी के साथ-साथ नैदानिक इमेजिंग अनुप्रयोगों दोनों में चिकित्सा विकिरण जोखिम के प्रभाव के संकेतक के रूप में किया गया था25,26,27,28,29,30. इन विशेषताओं γ-H2AX foci परख बड़े परमाणु दुर्घटनाओं में जल्दी त्रई के लिए अंय तरीकों के लिए एक अत्यधिक प्रतिस्पर्धी विकल्प बनाने के लिए गंभीर रूप से कम जोखिम वाले व्यक्तियों से उजागर अलग । कई अनुकूलन प्रयोगों ने स्पष्ट किया है कि रक्त की छोटी मात्रा के साथ γ-एच2एक्स फोसी परख करना संभव है, जैसे कि मोकेट एट अल का अध्ययन। जिन्होंने बताया कि रक्त की केवल एक बूंद (उंगली चुभन) के साथ γ-H2AX फोसी परख करना संभव है31. इसी तरह के दृष्टिकोण का उपयोग पूरी तरह से स्वचालित उच्च-थ्रूपुट रैबिट (रैपिड ऑटोमेटेड बायोडोसिमेट्री टूल) प्रणाली के विकास में किया गया था जिसे रक्त के फिंगरस्टिक-व्युत्पन्न नमूनों से γ-H2AX पैदावार को मापने के लिए अनुकूलित किया गया था।32,33. कुल मिलाकर, मल्टीबायोडोज और रेनेबी अंतर-तुलना अध्ययनों के परिणाम बताते हैं कि γ-एच2एएक्स फोसी परख हाल ही में (24 घंटे तक) तीव्र विकिरण जोखिम के बाद एक बहुत ही उपयोगी ट्राइएज उपकरण हो सकता है12,13,14. एक कम खुराक रेंज अंतर तुलना अध्ययन में, 10 mGy के रूप में कम के रूप में एक खुराक नकली-विकिरणित नियंत्रण नमूनों से प्रतिष्ठित किया जा सकता है, कम खुराक रेंज में परख की संवेदनशीलता पर प्रकाश डाला34. यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि परख की उच्च संवेदनशीलता लिम्फोसाइट्स के लिए विशेष रूप से सच है, जो उन्हें कम खुराक वाले एक्सपोजर के मूल्यांकन के लिए सबसे उपयुक्त सेल प्रकारों में से एक बनाता है। लिम्फोसाइट्स मुख्य रूप से गैर-साइकिल कोशिकाएं हैं और एक समकालिक आबादी का प्रतिनिधित्व करती हैं। बाद γ की अभिव्यक्ति से बचा जाता है-H2AX डीएनए प्रतिकृति के साथ जुड़ा हुआ है, जो काफी परख की संवेदनशीलता को कम कर देता है के लिए विकिरण का पता लगाने के लिए G2 और सेल चक्र के एस चरण के दौरान DSB प्रेरित35. लिम्फोसाइट्स के लिए कम खुराक के प्रति इसकी संवेदनशीलता के अलावा, γ-एच2एक्स फोसी परख का बदलाव का समय डाइसेंट्रिक और माइक्रोन्यूक्लिस परख जैसी साइटोजनेटिक तकनीकों की तुलना में काफी तेज है, क्योंकि इसके लिए लिम्फोसाइट्स की उत्तेजना की आवश्यकता नहीं होती है। इसलिए, साइटोजेनेटिक तकनीकों के लिए कुछ दिनों की तुलना में कुछ घंटों के भीतर परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। परख की एक बड़ी खामी γ-H2AX फोसी सिग्नल का तेजी से गायब होना है, जो आम तौर पर डीएनए मरम्मत काइनेटिक्स के आधार पर विकिरण जोखिम के बाद दिनों के भीतर बेसलाइन स्तर तक कम हो जाएगा36. इसलिए, बायोडोसिमेट्री संदर्भ में परख का सबसे उपयुक्त अनुप्रयोग प्रारंभिक ट्राइएज उद्देश्यों के लिए है और कुछ पीड़ितों के लिए अधिक समय लेने वाली साइटोजेनेटिक जैविक डोसिमेट्री अनुवर्ती को प्राथमिकता देना है। हालांकि, सटीक पूर्वव्यापी बायोडोसिमेट्री और दीर्घकालिक प्रभावों के लिए, किसी को कई साल पहले एक्सपोजर होने की स्थिति में स्थिर गुणसूत्र विपथनों का पता लगाने के लिए तीन रंग की मछली विश्लेषण जैसी साइटोजेनेटिक तकनीकों पर निर्भर रहना पड़ता है।10.

कई बायोडोसिमेट्री पहलों के हिस्से के रूप में, बड़े पैमाने पर रेडियोलॉजिकल आपात स्थितियों में लोगों को ट्राइएज करने के लिए γ-एच2एक्स फोसी परख के बगल में ट्राइएज उद्देश्यों के लिए कई परखों का मूल्यांकन किया गया है; जैसे डिसेंट्रिक्स परख, साइटोकिनेसिस-ब्लॉक माइक्रोन्यूक्लिस परख, इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेच (ईपीआर), सीरम प्रोटीन परख (एसपीए), त्वचा स्पेक्टल परख (एसएसए), ऑप्टिकली उत्तेजित ल्यूमिनेसेंस (ओएसएल), साथ ही जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 37,38। γ-H2AX foci परख डीएनए डीएसबी गठन और मरम्मत३९के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, परख समय पर निर्भर है क्योंकि डीएनए डीएसबी मरम्मत काइनेटिक्स40के कारण विकिरण के बाद γ-एच2एक्स फोसी का स्तर समय के साथ बदलता रहता है। एक तुलनात्मक अध्ययन सचित्र है कि जेड चरण क्षमता के साथ सूक्ष्म स्कोरिंग विकिरण के 1 Gy के बाद सबसे सटीक परिणाम प्रदान करता है, जबकि प्रवाह साइटोमेट्री केवल आईआर४१की उच्च खुराक पर विश्वसनीय परिणाम देता है । 42 , 43,44 ,45,46में उपयोग के लिए छवि विश्लेषणसमाधानोंके विकास की कई रिपोर्टें हैं। इस प्रोटोकॉल में, परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में γ-एच2एक्स फोसी का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित, उच्च-थ्रूपुट फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी प्लेटफॉर्म का उपयोग किया जाता है। एक स्वचालित स्कोरिंग प्रणाली का उपयोग अंतर-प्रयोगशाला और अंतर-पर्यवेक्षक स्कोरिंग पूर्वाग्रह दोनों से बचा जाता है, जबकि यह अभी भी 1 Gy47से नीचे की खुराक का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता की अनुमति देता है। फोसी स्कोरिंग के लिए मुफ्त ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर की तुलना में इस प्रणाली का प्राथमिक लाभ यह तथ्य है कि स्लाइड की स्कैनिंग से कैप्चरिंग और स्कोरिंग तक पूरी प्रक्रिया स्वचालित है। उपयोगकर्ता-परिभाषित और स्टोर करने योग्य क्लासिफायर की अवधारणा प्रजनन क्षमता की गारंटी देती है जो परिणामों में गुणवत्ता की निष्पक्ष डिग्री जोड़ती है। इसलिए, यह काम दिखाता है कि कैसे γ-H2AX फोसी परिणाम एक स्वचालित सूक्ष्म स्कैनिंग और स्कोरिंग विधि का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है जिसका उपयोग तब किया जा सकता है जब संभावित रूप से अधिक उजागर व्यक्तियों से रक्त नमूने जैविक डॉसिमेट्री उद्देश्यों के लिए रेडियोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं द्वारा प्राप्त किए जाते हैं।

Protocol

इस अध्ययन को यूनिवर्सिटी ऑफ वेस्टर्न केप एथिक्स कमेटी-कोड बीएम18/6/12 की बायोमेडिकल रिसर्च एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

1. समाधान की तैयारी48

  1. सेल निर्धारण समाधान (पीबीएस में 3% पीएफए)
    1. उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें और एक धुएं हुड में काम कर रहे हैं, विघटन में सहायता करने के लिए मिश्रण को 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें आसुत एच 2 ओ के 200 एमएल में20ग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें।
    2. एक बार पीएफए भंग हो जाने के बाद, 30 मिनट से अधिक ध्यान से 5 एन नाओह की 40 बूंदें जोड़ें और कमरे के तापमान को ठंडा करें। 1 एम एचसीएल का उपयोग करके पीएच 7 में समायोजित करें और आसुत एच 2 ओ के साथ250एमएल की अंतिम मात्रा तक बनाएं (एलिकोट्स को 1 वर्ष के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है)। 3% पीएफए समाधान खरीदने के लिए इस समाधान से 25 एमएल 41.7 एमएल पीबीएस जोड़ें।
  2. 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) समाधान: पीएसए के 10 ग्राम को पीबीएस के 1000 मिलीएल में जोड़ें और भंग होने तक मिलाएं। उपयोग (अधिकतम 72 घंटे) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ट्राइटन-एक्स सॉल्यूशन 1:500 की एकाग्रता में: ट्राइटन-एक्स के 1 माइक्रोन को पीबीएस के 500 माइक्रोन में जोड़ें, उपयोग (अधिकतम 24 घंटे) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. एंटीबॉडी सॉल्यूशंस
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी - 1:500 की एकाग्रता में एंटी-γ-एच2एक्स: एंटी-γ-एच2एएक्स के 1% बीएसए समाधान के 500 माइक्रोन में 1 माइक्रोन जोड़ें, उपयोग (अधिकतम 24 घंटे) तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. माध्यमिक एंटीबॉडी - 1:1000 की एकाग्रता में बांध-TRITC: 1% बीएसए समाधान के 1000 माइक्रोन में बांध-TRITC के 1 μL जोड़ें, उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (अधिकतम 24 घंटे)।
  5. पूरा रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट (cRPMI) मीडिया
    1. 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन की अंतिम एकाग्रता देने के लिए एक बाँझ बोतल में आरएमआई 1640 मीडिया में फ़िल्टर किए गए भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें।

2. नमूनों की तैयारी

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, परिधीय पूरे रक्त नमूने स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों से लिथियम-हेपरिन संग्रह ट्यूबों में venipuncture द्वारा एकत्र कर रहे है (सूचित सहमति के साथ-BM18/6/12 पश्चिमी केप नैतिकता समिति के विश्वविद्यालय के जैव चिकित्सा अनुसंधान नैतिकता समिति) । शुरुआत से पहले, यह सुनिश्चित करें कि 1.077 ग्राम/एमएल के रक्त और घनत्व माध्यम को कमरे के तापमान में स्वीकार किया जाता है।

  1. एक तैयार जैव सुरक्षा कैबिनेट में, पीबीएस के साथ 1:1 मात्रा में परिधीय पूरे रक्त को पतला करें और धीरे-धीरे पतला रक्त को 1.077 ग्राम/एमएल के घनत्व के साथ मध्यम की दो-मात्रा में समान मात्रा पर लेयर करें। ट्यूब को 45 डिग्री पर तिरछा करके घनत्व माध्यम पर रक्त को धीरे-धीरे परत करना महत्वपूर्ण है, यह सुनिश्चित करना कि रक्त और घनत्व माध्यम मिश्रण न करें।
  2. ध्यान से निलंबन को एक अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें और 20 मिनट के लिए 900 x g पर स्पिन करें। इसके बाद, केवल एक नई बाँझ शंकु नली के लिए 'बादल' परत को पिपेट करें और 1000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए पीबीएस और अपकेंद्रित्र के साथ ट्यूब भरें। इसके बाद, एक पिपेट के साथ सुपरनेट को एस्पिरेट करें, गोली को परेशान न करने के लिए सतर्क रहें, पीबीजी गोली को 1 एमएल पीबीएस में सावधानी से रीस्प्रल करें और ट्यूब को पीबीएस से भरें।
  3. कुल तीन वॉश को पाने के लिए उपरोक्त वॉश स्टेप को दो बार और दोहराएं।
  4. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके पीबीएमएमसी की संख्या गिनें, पता है कि वयस्क दाता से परिधीय रक्त के प्रत्येक एमएल के परिणामस्वरूप 1 - 1.5 x 106 पीबीएमसी49का मोटा औसत होगा। गिनती के बाद, पीबीएमसी गोली को CRPMI के 1 मिलील में 8 x10 5 लिम्फोसाइट्स की एकाग्रता के लिए पतला करें। फिर अलग पीबीएमसी समाधान से लगभग 2 x10 6 पीबीएमसी या 2.5 एमएल को विकिरणों के लिए बाँझ, शंकु नली में जोड़ें।

3. नमूना विकिरण

सावधानी: विकिरण संरक्षण दिशानिर्देशों के अनुसार विकिरण इकाई को संभालें और हर समय एक भौतिक डोसिमीटर पहनें। सुनिश्चित करें कि उपयोग की गई विकिरण प्रणाली को कैलिब्रेट किया जाता है और इस तरह स्थापित किया जाता है कि सही अपेक्षित खुराक प्राप्त की जाती है।

  1. 60सह स्रोत का उपयोग करके कमरे के तापमान पर पीबीएमसी को विकिरणित करें। एक किसान 117 चैंबर के साथ कैलिब्रेट (टीआरएस-398 प्रोटोकॉल) जिसके लिए दक्षिण अफ्रीका के राष्ट्रीय मेट्रोलॉजी संस्थान (एनएमआईएसए)50से प्राप्त एक कक्ष अंशांकन कारक।
    1. इस परख के लिए, शंकु नलियों को 5 मिमी ऐक्रेलिक शीट (बीम प्रवेश बिल्ड-अप के लिए उपयोग किया जाता है) और 50 मिमी बैकस्कैटर सामग्री के साथ 0.57Gy/मिनट की वर्तमान 60 सह स्रोत खुराक दर के साथ 300 मिमी × 300 मिमी समरूप क्षेत्र आकार के लिए 750 मिमी स्रोत से सतह दूरी पर रखें।
  2. 0.125, 0.500, 1.000, 1.500 और 2.000 Gy की वर्गीकृत खुराक के साथ पीबीएमसी को विकिरणित करें, और नियंत्रण कक्ष में नकली-विकिरणित नियंत्रण नमूनों को बनाए रखें, केवल परिवेश विकिरण जोखिम प्राप्त करते हैं।
  3. γ-एच2एक्स फोसी की अधिकतम संख्या तक पहुंचने के लिए आर्द्रीकृत 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर1 घंटे के लिए विकिरणित नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार संशोधित किया जा सकता है ।

4. स्लाइड तैयारी

नोट: स्लाइड सेटअप के लिए देखें चित्रा 1।

  1. विकिरण की स्थिति (या शंकुदाता के अनुसार) में आसंजन में सुधार करने के लिए सकारात्मक आवेशित सतह के साथ लेपित स्लाइडों का उपयोग करके 3 स्लाइड (तकनीकी दोहराता है) तैयार करें। क्लिप धारक में स्लाइड रखें, इसके ऊपर फिल्टर कार्ड जोड़ें, और अंत में फ़नल करें। स्लाइड क्लिप सुरक्षित और साइटोसेंट्रफ्यूज में जगह है।
  2. कीप (200,000 कोशिकाओं/स्लाइड) के लिए सेल निलंबन के 250 μL जोड़ें और एक साइटोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करके 5 मिनट के लिए 30 x ग्राम के लिए स्पिन।
  3. साइटोसेंट्रफ्यूगेशन के बाद, क्लिप धारक से स्लाइड को हटा दें और हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके, धुंधला प्रक्रिया के दौरान बंधे कोशिकाओं पर इम्यूनोफ्लोरेसेंट दाग को बनाए रखने के लिए कोशिकाओं के साथ जगह के चारों ओर एक सर्कल बनाएं।

5. फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस γ-H2AX धुंधला

नोट: सभी समाधान सावधानी से सेल क्षेत्र है जो एक हाइड्रोफोबिक सर्कल द्वारा चिह्नित है पर सीधे जोड़ा जाता है । धुंधला समाधान कोशिकाओं को बाधित करने के लिए पिपेट टिप की अनुमति के बिना स्लाइड से थोड़ा ऊपर तिरस्कृत कर रहे हैं । समाधान पूरी स्लाइड में नहीं जोड़े जाते हैं।

  1. 20 मिनट के लिए ताजा तैयार 3% पीएफए में स्लाइड्स फिक्स करें।
    नोट: स्लाइड्स को इम्यूनोदाटेनिंग करने से पहले अधिकतम 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5% पीएफए युक्त पीबीएस में संग्रहीत किया जा सकता है। इसके बाद, 5 मिनट के लिए पीबीएस के साथ एक कॉपलिन जार में स्लाइड धोएं, फिर कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए ठंड ट्राइटन-एक्स समाधान के 100 माइक्रोन के साथ कवर करें ताकि पारमेबिलाइजेशन की अनुमति दी जा सके।
  2. टिश्यू पेपर पर ट्राइटन-एक्स सॉल्यूशन को टिप करें और 1% बीएसए सॉल्यूशन में तीन बार स्लाइड्स को 10 मिनट तक धोएं । यह गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी बाइंडिंग को अवरुद्ध करके अवांछित पृष्ठभूमि को रोकने के लिए किया जाता है।
  3. 1:500-पतला प्राथमिक विरोधी γ-H2AX एंटीबॉडी के 1 घंटे के लिए एक आर्द्रता कक्ष में 100 माइक्रोन के साथ कमरे के तापमान पर incubate स्लाइड, आसानी से एक आयताकार स्लाइड भंडारण बॉक्स के आधार पर गीला ऊतक कागज जोड़कर पूरा किया ।
    1. ऊतक कागज पर एंटीबॉडी समाधान को टिप करें और अनबाउंड प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने और माध्यमिक एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए कोप्लिन जार में 10 मिनट के लिए 1% बीएसए समाधान के साथ तीन धोते हैं।
  4. 1:1000 के 100 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट स्लाइड-पतला माध्यमिक बांध-TRITC एंटीबॉडी समाधान के लिए 1 घंटे के लिए humidifying कक्ष में । एंटीबॉडी समाधान टिप ऊतक कागज पर बंद और 10 मिनट के लिए तीन बार PBS में स्लाइड धोते हैं ।
  5. अंत में नरम, धूल मुक्त ऊतक कागज के साथ हाइड्रोफोबिक सर्कल के बाहर स्लाइड सूखी और एक जलीय बढ़ते माध्यम में हल DAPI की 1-2 बूंदें जोड़ें और धीरे से एक 24 x ५० मिमी कवर पर्ची के साथ स्लाइड को कवर, यह सुनिश्चित करना है कि वहां कोई फंस हवा बुलबुले और फ्रिज में जगह 4 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस रात ोंरात । स्लाइड स्कैनिंग से पहले अधिकतम 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

6. स्वचालित स्कैनिंग और स्लाइड की स्कोरिंग

नोट: स्कैनिंग सिस्टम में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप, वीडियो छवियों के वास्तविक समय के डिजिटलीकरण के लिए एक फ्रेम हथियाने से जुड़ा एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन सीसीडी (चार्ज किया गया युग्मित डिवाइस) कैमरा, एक स्कैनिंग चरण, मैनुअल आंदोलनों के लिए ट्रैकबॉल, 3 डी माउस, फास्ट पीसी और मॉनिटर, और संग्रह के लिए हार्ड ड्राइव(चित्रा 2)की आवश्यकता है।

  1. क्लासिफायर सेटअप
    नोट: क्लासिफायर मापदंडों का एक सेट है जो परिभाषित करता है कि सिस्टम कोशिकाओं का पता कैसे लगाता है। यह पूर्व वर्गीकृत छवि क्षेत्रों के आधार पर प्रशिक्षण से परिणाम है । एक क्लासिफायर माइक्रोस्कोप आवर्धन, सेल प्रकार और प्रयोगशाला के लिए विशिष्ट है। इसलिए क्लासिफायर्स को वर्तमान परिस्थितियों में अनुकूलित करने के लिए निम्नलिखित मापदंडों में संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है। मूल्यांकन से पहले संदर्भ स्लाइड के साथ सेटिंग्स का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
    1. छवि अधिग्रहण: इमेजिंग के लिए 40x शुष्क उद्देश्य का उपयोग करें। सभी कोशिकाओं में तुलनीय छवि गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, कैमरा एकीकरण समय स्वचालित मोड के लिए निर्धारित करें। दोनों रंग चैनलों (कैमरा लाभ 4.0) के लिए अधिकतम एकीकरण समय को कम से कम 1 सेकंड के लिए सेट करें। सिग्नल चैनल विमानों के बीच 10 फोकस विमानों और 14/40 माइक्रोन के साथ अधिग्रहीत किया जाता है ।
    2. सेल चयन: 20.00 माइक्रोन2 और 76.00 माइक्रोन2 की सीमा के भीतर पीबीएमसी का पता लगाया जाता है। अधिकतम संक्षिप्तता गहराई को 0.05 और अधिकतम आस्पेक्ट रेशियो को 1.4 तक सेट करें। सापेक्ष ग्रे स्तर की सीमा को 20% तक सेट करें।
    3. सेल प्रोसेसिंग: पृष्ठभूमि को कम करने के लिए हिस्टोग्राम अधिकतम एल्गोरिदम के साथ DAPI काउंटरदाग चैनल को संसाधित करें। सिग्नल चैनल को पृष्ठभूमि को कम करने और संकेतों को बढ़ाने के लिए टॉपहाट फिल्टर (ताकत 7, चौरसाई कारक 0) के साथ संसाधित किया जाता है।
    4. सिग्नल काउंटिंग: डिवाइस की ऑब्जेक्ट काउंट सुविधा का उपयोग करके फोसी गिनें। शेष पृष्ठभूमि संकेतों के झूठे-सकारात्मक मूल्यांकन से बचने के लिए, केवल वे संकेत जो कोशिका में प्रतिभाशाली वस्तु की तुलना में कम से कम 30% तीव्रता दिखाते हैं।
  2. किसी भी धूल को हटाने के लिए, 70% इथेनॉल से धीरे-धीरे साफ करने के बाद स्वचालित स्कैनिंग प्लेटफ़ॉर्म या स्लाइड स्टेज पर स्लाइड डालें।
  3. स्लाइड सेटअप - ओपन स्लाइड सेटअप डायलॉग मेन्यू(चित्रा 3)
    1. सही डेटा पथका चयन करें, यह निर्दिष्ट करता है कि खोज के परिणामस्वरूप स्लाइड फ़ाइलें कहां संग्रहीत की जाती हैं।
    2. स्लाइड एक नाम दें, प्रत्येक स्लाइड को एक अद्वितीय नाम दिया जाना चाहिए। यदि स्लाइड की एक श्रृंखला गणना सूची के रूप में दर्ज की जाती है, तो स्लाइड नंबर के लिए वाइल्डकार्ड के रूप में '?' का उपयोग किया जा सकता है।
    3. धारा 1.1 - 1.4(चित्र 4)में वर्णित उपयुक्त क्लासिफायर का चयन करें।
    4. खोज विंडो का चयन करें और प्रीडिभाषित चुनें यदि साइटोसेंट्रफ्यूज सेल सर्कल से मेल खाती खोज विंडो परिभाषा मौजूद है, तो आकार कॉलम में संबंधित परिभाषा का चयन करें, या यदि कोई पूर्वनिर्धारित खोज विंडो परिभाषा उपलब्ध नहीं है तो मैनुअल का चयन करें। इस मामले में, आकार कॉलम सेट करने की नहीं है।
    5. अधिकतम सेल काउंट चुनें और स्कैन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की अधिकतम संख्या जोड़ें। मैक्स सेल काउंट पहुंचते ही चयनित सर्च विंडो को अभी तक पूरी तरह से स्कैन नहीं किया गया है, तब भी सर्च टर्मिनेट कर दी गई है। बायोडोसिमेट्री अनुप्रयोगों के लिए, प्रति स्लाइड 1000 कोशिकाओं का स्वचालित स्कोरिंग पर्याप्त है, यह देखते हुए कि प्रति रक्त नमूना 3 स्लाइड तैयार किए जाते हैं। सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए ओके पर क्लिक करें।
  4. स्लाइड स्कैनिंग सेटअप
    1. साइड बार पर सर्च बटन पर क्लिक करें। यदि सेटिंग मैनुअल सर्च विंडो को स्लाइड सेटअप में चुना गया था, तो स्कैन क्षेत्र(चित्र 5)के निर्धारण के लिए एक संवाद खुलेगा। 10x उद्देश्य का उपयोग करके, माउस के बाएं क्लिक द्वारा खोज क्षेत्र के दो कोनों को ठीक करके स्लाइड पर आयताकार खोज क्षेत्र का चयन करें। इसकी पुष्टि ओके बटन से की जा सकती है। यदि खोज विंडो एक पूर्वनिर्धारित खोज खिड़की का जिक्र कर रही है, तो इस कदम को छोड़ दिया जाएगा।
    2. उपयोगकर्ता को फोकस स्टार्ट स्थिति को समायोजित करने के लिए कहा जाता है। एक संदर्भ वस्तु को स्वचालित रूप से चुना जाएगा, सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता को प्रत्येक स्लाइड के लिए एक संदर्भ नाभिक (40x उद्देश्य का उपयोग करके) केंद्रित करने और ठीक के साथ सेटिंग्स की पुष्टि करने के लिए प्रेरित करेगा। सिस्टम स्वचालित रूप से क्रमबद्ध रूप से सभी स्लाइडों पर ले जाएगा। यदि आवश्यक हो, तो लाइव इमेज सेटअप को समायोजित करें - इस चरण के लिए एकीकरण समय(चित्रा 5)।
    3. सभी माइक्रोस्कोप सेटिंग्स की जांच करें और ठीक केसाथ सिस्टम की पुष्टि करें। सिस्टम स्वचालित फोकसिंग और स्कैनिंग प्रक्रिया शुरू करेगा। स्कैनिंग पूरी हो जाने के बाद डेटा को विश्लेषण के लिए कंप्यूटर में सेव कर दिया जाता है । स्कैन पूरा होने के बाद स्कैनिंग सिस्टम अपने आप स्विच ऑफ हो जाता है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप ट्यूब का लीवर ऐसी स्थिति में है जो सभी प्रकाश को कैमरे में डायवर्ट कर देता है।
    4. खोज अंत, खोज समाप्त हो जाती है यदि पूरी खोज स्कैन की गई है, यदि अधिकतम सेल काउंट पहुंच गया है या यदि खोज रद्द कर दी गई है।
  5. स्लाइड विश्लेषण
    नोट: पूरा स्कैन चित्रा 6में प्रतिनिधित्व किया है ।
    1. स्कैन पूरा होने पर साइड बार पर गैलरी बटन पर क्लिक करें। गैलरी की समीक्षा करें, जिसमें पता लगाया गया कोशिकाओं की छोटी छवियां शामिल हैं। इस विंडो(चित्रा 7)में, यह निर्दिष्ट करता है कि गैलरी में संग्रहीत कोशिकाओं को ड्रॉप-डाउन मेनू से चुना जाना चाहिए। कोशिकाओं को आम तौर पर उस क्रम में प्रदर्शित किया जाता है जिसमें उनका पता लगाया गया है।
    2. पता लगाया कोशिकाओं के लिए गुणवत्ता उपाय के वितरण देने के लिए गुणवत्ता हिस्टोग्राम/फीचर वैल्यू आरेख (चित्रा 8)पर क्लिक करें, साथ ही साधन, और foci के मानक विचलन रन बनाए ।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के लिए, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीएमबीसी) को चार स्वस्थ वयस्क स्वयंसेवकों के पूरे रक्त से अलग किया गया था और 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 और 2.000 जीवाई की विकिरण खुराक के संपर्क में थे। इसके बाद 5 प्रतिशत सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे तक नमूने लिए गए। फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होने के बाद, स्लाइड स्वचालित रूप से स्कैन और रन बनाए जाते हैं। आंकड़े 6,7, और 8 उपयोगकर्ता को सॉफ्टवेयर आउटपुट का प्रतिनिधित्व देते हैं। स्कैन पूरा होने के बाद एक विश्लेषण खिड़की दिखाई देती है, जिससे फोसी का अवलोकन होता है। गैलरी सभी foci एक इंटरैक्टिव मेनू है कि outliers को नष्ट कर सकते है और अंत में एक विस्तृत डेटा सारांश के साथ एक हिस्टोग्राम दिया जाता है के साथ रन बनाए देता है ।

γ-किरणों के संपर्क में आने के बाद γ-H2AX फोसी यील्ड चित्र 9में प्रस्तुत की जाती है । बढ़ती खुराक के साथ γ-H2AX foci की संख्या में धीरे-धीरे वृद्धि हुई थी। यह ग्राफ न केवल खुराक निर्भरता और परख की संवेदनशीलता को स्पष्ट करता है, बल्कि फिट का उपयोग खुराक अनुमान लगाने के लिए भी किया जा सकता है जब एक नमूना किसी व्यक्ति से प्राप्त होता है जो अज्ञात खुराक के संपर्क में आया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस व्यक्ति के लिए किसी के पास नकली-विकिरणित नियंत्रण या पृष्ठभूमि फोसी स्तर नहीं होगा। इसलिए, चित्रा 9 में नकली-विकिरणित नियंत्रण नमूनों का 0 जीवाई मूल्य शामिल है, जो इस अध्ययन में चार वयस्क दानदाताओं के लिए 0.57 ± 0.23 Gy था।

Figure 1
चित्रा 1- साइटो सेंट्रलाइजेशन के लिए स्लाइड्सकीतैयारी। क्लिप धारक में स्लाइड रखें, इसके ऊपर फिल्टर कार्ड जोड़ें, और अंत में फ़नल करें। स्लाइड क्लिप सुरक्षित और साइटोसेंट्रफ्यूज में जगह है। साइटोसेंट्रफ्यूगेशन के बाद, क्लिप धारक से स्लाइड को हटा दें और हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग करके कोशिकाओं के साथ घटनास्थल के चारों ओर एक सर्कल बनाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया स्वचालित स्कैनिंग प्लेटफ़ॉर्म, जिसमें फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप से जुड़ा एक स्वचालित स्कैनर होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3:स्लाइड सेटअप के लिए मेनू। साइडबार में सेटअप बटन पर क्लिक करके संवाद खोलें। परिणाम फ़ाइलों के लिए लक्ष्य निर्देशिका का चयन करें या दर्ज करें कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:क्लासिफायर सेटअप मेनू। सुनिश्चित करें कि चयनित क्लासिफायर सेटिंग्स वर्तमान सेल प्रकार, तैयारी की स्थिति और नमूने के धुंधला पैटर्न से मेल खाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:मैनुअल सर्च विंडो के लिए सेटअप मेनू। विंडो स्लाइड सेटअप में चुना गया था; एक बातचीत स्कैन क्षेत्र के निर्धारण के लिए अनुमति खोलने के लिए होगा । 10x उद्देश्य का उपयोग करके, स्लाइड पर आयताकार खोज क्षेत्र माउस के बाएं क्लिक द्वारा खोज क्षेत्र के दो कोनों को ठीक करके इंटरैक्टिव रूप से चुना जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:विश्लेषण विंडो, एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, विश्लेषण विंडो स्कैन के परिणामों को दिखाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:चयनित स्लाइड के लिए गैलरी देखें। गैलरी टैब साइड बार पर पाया जाता है। छवि गैलरी में पता लगाया कोशिकाओं की छोटी छवियों के होते हैं, एक संयुक्त DAPI-TRITC छवि के रूप में प्रदर्शित । प्रत्येक छवि के निचले बाएं और दाएं कोने में प्रत्यक्ष फोसी गिनती और सही फोसी काउंट प्रदर्शित किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:चयनित स्लाइड के लिए हिस्टोग्राम छवियां। हिस्टोग्राम पर सही क्लिक करके यह विंडो खोली जाती है। हिस्टोग्राम पर क्लिक करके, हिस्टोग्राम टैब शीट एक डेटा सारांश प्रदान करता है जो विश्लेषण कोशिकाओं के मतलब, मानक विचलन, भिन्नता के गुणांक, न्यूनतम, अधिकतम और औसत मूल्यों को सूचीबद्ध करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: 60सह γ-किरणों के संपर्क में लिम्फोसाइट्स के लिए खुराक के एक समारोह के रूप में γ-H2AX foci की संख्या। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन दाताओं के बीच अंतरविभाजनीय भिन्नता का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । डेटा चार स्वस्थ स्वयंसेवकों के मानक विचलन ± γ-H2AX foci की औसत संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल γ-एच2एक्स फोसी परख के स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी-आधारित स्कोरिंग के लिए एक स्टेपवाइज प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह एक विकिरण दुर्घटना परिदृश्य में जैविक खुराक मूल्यांकन करने के लिए परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में विकिरण प्रेरित डीएनए डीएसबी की संख्या का विश्लेषण करने के लिए एक समय कुशल विधि के रूप में फोसी परख की उपयोगिता दिखाता है जहां व्यक्तियों को आईआर के अज्ञात स्तरों से अवगत कराया जा सकता है।

इस विशिष्ट प्रोटोकॉल में, पीबीएमसी को विट्रो में विकिरणित किया गया था ताकि वीवो विकिरण एक्सपोजर में नकल की जा सके। एक बार विकिरण और एक घंटे के इनक्यूबेशन समय पूरा हो जाने के बाद, स्लाइड पर कोशिकाओं की एकाग्रता स्थान बनाने के लिए साइटोसेंट्रफ्यूज का उपयोग करके स्लाइड बनाई जाती हैं। स्वचालित स्कोरिंग के लिए मानकीकृत स्थितियों को प्राप्त करने के लिए साइटोसेंट्रफ्यूज का उपयोग महत्वपूर्ण है। पूरा होने पर, एक हाइड्रोफोबिक पेन का उपयोग कोशिकाओं के चारों ओर एक सर्कल बनाने के लिए किया जाता है, ताकि उपयोगकर्ता को धुंधला अभिकर्मकों को स्थानीयकृत करने की अनुमति देकर अभिकर्मकों की बर्बादी को कम किया जा सके। इस प्रकार की पेन का उपयोग पैराफिन सेक्शन, फ्रोजन सेक्शन और साइटोलॉजी की तैयारी जैसे विभिन्न इम्यूनोदाता तकनीकों में किया जा सकता है। इसके अलावा, हाइड्रोफोबिक पेन का चयन करना महत्वपूर्ण है जो एंजाइम और फ्लोरोसेंट-आधारित डिटेक्शन सिस्टम के साथ संगत है। स्लाइड तैयारी के बाद फिक्सेशन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस γ-H2AX धुंधला हुआ । इस प्रोटोकॉल में, कोशिकाओं को 20 मिनट के लिए एक पीबीएस समाधान में 3% पीएफए का उपयोग करके तय किया जाता है। सफल होने के लिए, यह आवश्यक है कि कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को बनाए रखा जाए और एंटीजेनिक साइटों का उपयोग किए जा रहे डिटेक्शन रिएजेंट्स के लिए सुलभ हो। पीएफए निर्धारण के लिए अपेक्षाकृत सौम्य एजेंट है और प्रोटीन संरचनाओं के संरक्षण के दौरान कोशिकाओं को स्थिर करता है51. उच्च पीएफए सांद्रता और लंबे समय तक निर्धारण के समय के साथ अनुकूलन प्रयोगों के परिणामस्वरूप स्लाइड गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा, लेकिन 0.5% पीएफए में 24 घंटे तक आगे भंडारण (रातोंरात) अच्छे परिणाम मिले।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला प्राथमिक, 2F3 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी डीएनए डीएसबी प्रेरण के बाद सेरीन 139 पर फॉस्फोरिलेटेड होने पर हिस्टोन संस्करण एच2एक्स पर प्रतिक्रिया करता है। एंटीबॉडी अन्य फॉस्फोरिलेटेड हिटोन52के साथ क्रॉस रिएक्टिविटी के साथ फॉस्फोरिलेटेड अवशेषों से बांधने में सक्षम है। चूंकि यह एक प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी है, इसलिए एक वैकल्पिक मेजबान, अर्थात् गधा-एंटी-माउस (DAM) -TRITC में उठाए गए प्राथमिक एंटीबॉडी की मेजबान प्रजातियों के खिलाफ एक माध्यमिक एंटीबॉडी का चयन किया गया था। जबकि इम्यूनोफ्लोर्सेंट धुंधला विशिष्ट एंटीबॉडी-एपिटोप बाइंडिंग पर आधारित है, कई इंटरमॉलिकुलर बलों के परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला भी हो सकता है। गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को कम करने के लिए, इम्यूनोफ्लोर्सेंट स्टेनिंग प्रोटोकॉल53में एक अवरुद्ध अभिकर् ता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है; हमने बीएसए समाधान का उपयोग किया। इसके अलावा, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला करने से पहले कम से कम 20 मिनट के लिए समाधान में स्लाइड छोड़कर इस अवरुद्ध कदम के लिए पर्याप्त समय आवंटित किया जाना चाहिए। इसके अलावा बीएसए सॉल्यूशन को प्राइमरी और सेकेंडरी एंटीबॉडी के लिए भी डिलुएंट के तौर पर इस्तेमाल किया जाना चाहिए। दागने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटी-γ-एच2एक्स और माध्यमिक एंटीबॉडी के आधार पर, इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अलग-अलग एंटीबॉडी कमजोर करने के परीक्षण पर विचार करना चाहिए। अधिक सटीक स्कोरिंग के लिए, अतिरिक्त डीएनए डीएसबी मरम्मत प्रोटीन एंटीबॉडी जोड़कर एक डबल धुंधला किया जा सकता है।

विश्लेषण के इस प्रकार का एक बड़ा नुकसान जोखिम के बाद जितनी जल्दी हो सके रक्त के नमूनों को प्राप्त करने की जरूरत है, के रूप में foci की अधिकतम संख्या के लिए ४८ घंटे के भीतर सामांय स्तर पर वापस कम करने के लिए जाना जाता है विकिरण के बाद । इसलिए, जब विकिरण दुर्घटना और बाद में रक्त नमूने का समय ज्ञात होता है, तो इन विट्रो विकिरण (जैसे, 4, 8, 12 और 24 घंटे) के बाद अलग-अलग समय बिंदुओं पर स्थापित किए गए विभिन्न अंशांकन घटता के साथ काम करना उपयोगी हो सकता है। हालांकि, जैसा कि पहले से ही पांडुलिपि के परिचय अनुभाग में उल्लेख किया गया है, γ-एच2एएक्स फोसी परख की ताकत प्रारंभिक, तेज ट्राइएज उद्देश्यों में निहित है और इसका उपयोग अधिक समय लेने वाली साइटोजेनेटिक जैविक डोसिमेट्री को प्राथमिकता देने के लिए किया जाना चाहिए। एक संयुक्त परिदृश्य जहां समानांतर में कई बायोडोसिमेट्री बायोमार्कर का उपयोग कियाजाता है, सबसे विश्वसनीय खुराक अनुमान उत्पन्न करेगा और दुनिया भर में विभिन्न बायोडोसिमेट्री प्रयोगशालाएं राष्ट्रव्यापी नेटवर्क स्थापित करने के लिए सेना में शामिल हो गई हैं जिन्हें सक्रिय किया जा सकता है और विभिन्न विशेषज्ञता37,54, 55के साथ प्रयोगशालाओं द्वारा कई, समानांतर बायोडोसिमेट्री आकलन की अनुमति देने के लिए उपयोग किया जा सकता है . इसके अलावा, दुर्घटना स्थल56पर या उसके पास मोबाइल प्रयोगशाला जैसे सुपरफास्ट विश्लेषण के लिए विकास चल रहे हैं। नए, आशाजनक बायोडोसिमेट्री तरीकों को लगातार विकसित किया जा रहा है, जिसके परिणामस्वरूप भविष्य में57में और भी तेज़ और अधिक विश्वसनीय थ्रूपुट होगा।

स्वचालित छवि विश्लेषण प्रणाली के लिए, स्लाइड स्वचालित स्कैनिंग प्लेटफ़ॉर्म या स्लाइड चरण पर डाले जाते हैं या रखे जाते हैं। इसके बाद, संलग्न कंप्यूटर पर उपयुक्त फ़ोल्डर में स्लाइड विवरण का नाम और सेव करें। इस प्रयोग के लिए, स्वचालित नाभिक और फोसी डिटेक्शन संबंधित क्लासिफायर सेटिंग्स पर आधारित है। क्लासिफायर बनाने पर, यह सुनिश्चित करें कि चयनित क्लासिफायर सेटिंग्स वर्तमान सेल प्रकार, तैयारी की स्थिति और नमूने के इम्यूनोफ्लोरेटेंट धुंधला से मेल खाती हैं। प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के उत्तेजन स्पेक्ट्रम से मेल खाने वाले उपयुक्त फ्लोरोसेंट चैनल क्लासिफायर में सेट किए जाते हैं। क्लासिफायर यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त स्कोरिंग पैरामीटर स्थापित करने की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, नाभिक का आकार, फ्लोरोसेंट तीव्रता, जैसा कि धारा 6.1 में वर्णित है)। यदि दो या अधिक डीएनए मरम्मत प्रोटीन (जैसे, γ-H2AX और 53BP1) एक प्रयोग में संयुक्त कर रहे हैं, प्रणाली भी संकेतों के सह स्थानीयकरण का पता लगाने में सक्षम है । सबसे पहले, सिस्टम DAPI छवियों को प्राप्त करता है, छवि प्रसंस्करण लागू करता है, और क्लासिफायर में सेट रूपात्मक मानदंडों का उपयोग करके नाभिक की पहचान करता है। ट्राईटीसी सिग्नल फोकल प्लेन47के बीच 0.35 मिमी के स्टेप साइज के साथ 10 जेड-स्टैक का इस्तेमाल करते हुए हासिल किए जाते हैं। क्लासिफायर ने डायरेक्ट फोसी काउंट का इस्तेमाल किया, जहां नाभिक के भीतर अलग-अलग ट्राइटीसी संकेतों की संख्या अर्जित की जाती है। यहां, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि विकिरण की बढ़ती खुराक के साथ, फोसी सिग्नल बड़ी वस्तुओं में विलय करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप वास्तविक फोसी संख्या का अनुमान लगाया जाता है यदि वस्तुओं को सीधे गिना जाता है। यह यहां वर्णित विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं था, लेकिन इस समस्या को हल करने के लिए सही फोसी काउंट के साथ एक अतिरिक्त कदम लागू किया जा सकता है। उत्तरार्द्ध सिस्टम को पता लगाया संकेतों के आकार प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है और तदनुसार उनका वजन करता है। दोनों गिनती विधियों का उपयोग उच्च खुराक पर foci की वास्तविक संख्या का एक अधिक यथार्थवादी अनुमान प्रदान कर सकते हैं ।

स्वचालित स्कैनिंग शुरू करने के लिए, स्कैन क्षेत्र माउस के बाएं क्लिक द्वारा खोज क्षेत्र के दो कोनों को ठीक करके आयताकार खोज क्षेत्र बनाने के लिए माइक्रोस्कोप के 10x उद्देश्य का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है (अंक 5), शुरू की स्थिति पर ध्यान केंद्रित करने के बाद । संदर्भ वस्तु का चयन स्वचालित रूप से किया जाता है, और सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता को प्रत्येक स्लाइड के लिए संदर्भ नाभिक (40x उद्देश्य का उपयोग करके) केंद्रित करने और केंद्र बनाने के लिए प्रेरित करता है। खोज शुरू होने के बाद, सिस्टम पहले चयनित स्लाइड की खोज खिड़की के केंद्र में जाएगा और संदर्भ ऑब्जेक्ट को केंद्र और केंद्रित करने का अनुरोध करेगा। इस ऑब्जेक्ट को बाद में सेल की स्थिति में किसी भी बदलाव को सही करने के लिए स्थिति संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। संदर्भ क्षेत्र का दूसरा उद्देश्य स्वचालित प्रकाश समायोजन है, प्रेषित प्रकाश मोड में प्रकाश को इष्टतम प्रकाश स्तर तक पहुंचने तक समायोजित किया जाता है। फ्लोरेसेंस मोड में लाइट लेवल तय हो जाता है, लेकिन सीसीडी कैमरे के इंटीग्रेशन टाइम को तब तक बढ़ाया जा सकता है, जब तक जरूरी सिग्नल नहीं मापा जाता। एक सही प्रकाश समायोजन को सक्षम करने के लिए, संदर्भ में विशिष्ट धुंधला के साथ वस्तुओं को शामिल किया जाना चाहिए। यह एक क्षेत्र है जो बहुत उच्च धुंधला तीव्रता के साथ कलाकृतियों है का उपयोग नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है । प्रकाश समायोजन के बाद, सिस्टम संदर्भ क्षेत्र के निकटतम ग्रिड स्थिति पर ग्रिड ऑटोफोकस शुरू होता है। यह एक नियमित ग्रिड पर क्षेत्रों को ध्यान केंद्रित करने के लिए जारी है, सामने और खोज खिड़की के पीछे की ओर एक meander में चलती है । ग्रिड ऑटोफोकस पूरा होने पर स्कैनिंग शुरू होती है। डेटा कैप्चर करने के लिए फ़ील्ड के बाद चरण को एक मेंंडर पैटर्न फ़ील्ड में ले जाया जाता है। जब एक सेल का पता चला है, उसकी स्थिति और गैलरी छवि संग्रहीत कर रहे है और स्क्रीन पर प्रदर्शित और सेल गिनती अद्यतन किया जाता है । यदि माइक्रोस्कोप, चरण या फीडर त्रुटि होती है, तो खोज स्वचालित रूप से रद्द हो जाती है। एकमात्र कदम जहां ऑपरेटर से मैन्युअल हस्तक्षेप होता है, स्लाइड स्कैनिंग सेट-अप के दौरान होता है। यह भी बिंदु है जहां एक त्वरित गुणवत्ता नियंत्रण जांच होती है (हवा के बुलबुले, कम सेल नंबर, फ्लोरोसेंट सिग्नल धुंधला कलाकृतियों की लुप्त होती) और जहां इसे अवर गुणवत्ता की स्लाइड की स्कैनिंग को निरस्त करने का फैसला किया जा सकता है। यदि पूरी स्लाइड को स्कैन किया गया है, यदि अधिकतम सेल काउंट पहुंच गया है, या यदि खोज रद्द कर दी गई है, तो खोज समाप्त कर दी गई है। एक बार स्कैन पूरा हो जाने के बाद, डेटा प्रस्तुत किया जाता है जैसा कि देखा जाता है अंक 6. स्कैन की गई कोशिकाओं को देखने के लिए, गैलरी विंडो खोली जाती है और प्रत्येक कोशिका को देखा जा सकता है (अंक 7). यह एक और बिंदु है जहां ऑपरेटर गैलरी छवियों और कुल कोशिकाओं की कुल संख्या की जांच करके गुणवत्ता नियंत्रण कर सकता है। यदि बहुत अधिक कोशिकाएं फोकस से बाहर हैं या बहुत कम कोशिकाओं को सिस्टम द्वारा यथार्थवादी खुराक अनुमान बनाने के लिए पता लगाया गया था (उदाहरण के लिए, 100 कोशिकाओं के बजाय इच्छित 1000 कोशिकाओं), तो अंतिम मूल्यांकन से स्लाइड और स्वचालित स्कोर को बाहर करने का निर्णय लिया जाना चाहिए। सभी डेटा को हिस्टोग्राम में संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है (अंक 8), वितरण के बारे में जानकारी के साथ, साधन, और प्रत्येक सेल के लिए बनाए गए foci के मानक विचलन। हिस्टोग्राम का उपयोग समीक्षा के लिए स्वचालित निष्कर्षों के आधार पर नाभिक की उप-आबादी का चयन और प्रदर्शन करने के लिए भी किया जा सकता है। परिणामों पर सांख्यिकीय विश्लेषण वितरण, मतलब के बाद किया जाता है, और प्रति सेल संख्या फोसी के मानक विचलन को मैन्युअल रूप से दर्ज किया गया है। ग्राफ का उपयोग बायोडोसिमेट्री नमूने की खुराक अनुमान लगाने के लिए अंशांकन वक्र के रूप में किया जा सकता है। यह प्राप्त खुराक का अनुमान लगाने के लिए ट्रेंड लाइन के समीकरण का उपयोग करके किया जा सकता है। इसके अलावा अंक 9 दिखाता है कि स्वचालित स्कैनिंग कम खुराक पर प्रेरित फोसी का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है। इसके अलावा, परिणाम खुराक के साथ प्रति सेल फोसी की संख्या में स्पष्ट रैखिक वृद्धि दिखाते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि परिणाम केवल उपयोग किए गए क्लासिफायर के लिए प्रतिनिधि हैं, परिणाम विभिन्न क्लासिफायर मापदंडों के लिए अलग होंगे। इसलिए, बायोडोसिमेट्री विश्लेषण के मामले में, यह महत्वपूर्ण है कि एक ही क्लासिफायर और स्लाइड तैयारी का उपयोग बायोडोसिमेट्री नमूनों के लिए किया जाता है क्योंकि कैलिब्रेशन वक्र स्थापित करने के लिए उपयोग किया जाता है जिसका उपयोग खुराक अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। हालांकि यह इस अध्ययन के दायरे से बाहर था, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि γ-H2AX foci परख भी आंशिक शरीर विकिरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिकांश आकस्मिक विकिरण एक्सपोजर असंगत या आंशिक शरीर के एक्सपोजर होते हैं, जहां शरीर के केवल एक स्थानीयकृत क्षेत्र को उच्च खुराक एक्सपोजर प्राप्त होता है। कई अध्ययनों से यह स्पष्ट होता है कि γ-एच2एएक्स फोसी परख का उपयोग शरीर के अंश का अनुमान लगाना संभव है जिसे विकिरणित किया गया है और किरणित अंश की खुराक42. जब पूरे शरीर का विकिरण होता है, तो सभी कोशिकाओं में डीएनए डीएसबी का यादृच्छिक प्रेरण होगा और कोई भी पॉइसन वितरण खोजने की उम्मीद कर सकता है। साइटोजेनिक तरीकों के समान जहां क्रोमोसोमल विपथनों का प्रेरण परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में फैलाया जाता है जहां सामान्य मेटाफेस के साथ कई विपथन और कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं की एक उच्च बहुतायत है, दूषित फोसीवियन पर सुझाए गए एक दूषित फॉसन विधि का उपयोग करके γ-एच2एक्स फोसी का फैलाव विश्लेषण58. बाद में भी पुष्टि की थी in vivo मिनीपिग्स और एक रीसस मकाक के साथ प्रयोग59.

Disclosures

सी Schunck मेटासिस्टम्स हार्ड एंड सॉफ्टवेयर जीएमबीएच, अल्तालुशेम, जर्मनी के कर्मचारी हैं ।

Acknowledgments

लेखक अध्ययन प्रतिभागियों को उनके रक्तदान के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं, साथ ही रक्त नमूना संग्रह के लिए नर्स वी प्रिंस । इस शोध के प्रति दक्षिण अफ्रीकी राष्ट्रीय अनुसंधान प्रतिष्ठान (एनआरएफ) की वित्तीय सहायता को स्वीकार किया जाता है । व्यक्त की राय, और निष्कर्ष पर पहुंचे, लेखकों के उन है और जरूरी नहीं कि एनआरएफ के लिए जिंमेदार ठहराया जा रहे हैं । इस काम को अंतरराष्ट्रीय परमाणु ऊर्जा एजेंसी (आईएईए) द्वारा डब्ल्यू मार्टिनेज-लोपेज़ के साथ-साथ समन्वित अनुसंधान परियोजना E35010 (अनुबंध संख्या: 22248) का समर्थन करने के लिए तकनीकी सहयोग परियोजना (संख्या: URU6042) के माध्यम से आर्थिक रूप से समर्थन दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine serum albumin - BSA Merck A3059
Coplin Jar Sigma S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) Lasec Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL) WhiteSci 607101
Cytospin Healthcare Technologies JC370-12-L
Cytospin Clips Healthcare Technologies JC302
Cytospin filter cards Healthcare Technologies JC307
Cytospin Funnels Healthcare Technologies JC372
DAM-TRITC Invitrogen A16022
DAPI-Fluroshield Sigma/Merck F6057
Ethanol Kimix ETD901
Filter tips WhiteSci  200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl Merck
Histopaque Sigma/Merck 10771
lithium–heparin collection tubes The Scientific Group 367526
MetaSystems - Metafer Metasystems Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH Merck 221465
NovoPen Leica Biosystems NCL-PEN
Paraformaldehyde Sigma/Merck 158127
Phosphate-buffered saline Tablets Separations SH30028,02
Pipettes WhiteSci P11037 and P1033 X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613402 / 100 μg
RPMI medium WhiteSci BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9) Sigma/Merck T-9284
Tubes (15ml) WhiteSci 601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped SMM Technologies 3800200E

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References

  1. Barnes, J. L., et al. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  2. Little, J. B. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis. 21 (3), 397-404 (2000).
  3. Barquinero, J. F., et al. Lessons from past radiation accidents: Critical review of methods addressed to individual dose assessment of potentially exposed people and integration with medical assessment. Environment International. 146, 106175 (2021).
  4. International Atomic Energy Agency. Radiotherapy in Cancer Care: Facing The Global Challenge. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2017).
  5. Achel, D. G., et al. Towards establishing capacity for biological dosimetry at Ghana Atomic Energy commission. Genome Integrity. 7 (1), 1-5 (2016).
  6. Sullivan, J. M., et al. Assessment of biodosimetry methods for a mass-casualty radiological incident: Medical response and management considerations. Health Physics. 105 (6), 540-554 (2013).
  7. Rea, M. E., et al. Proposed triage categories for large-scale radiation incidents using high-accuracy biodosimetry methods. Health Physics. 98 (2), 136-144 (2010).
  8. Swartz, H. M., et al. A critical assessment of biodosimetry methods for large-scale incidents. Health Physics. 98 (2), 95-108 (2010).
  9. International Atomic Energy Agency. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. International Atomic Energy Agency. , IAEA. Vienna. (2011).
  10. Grégoire, E., et al. Twenty years of FISH-based translocation analysis for retrospective ionizing radiation biodosimetry. International Journal of Radiation Biology. 94 (3), 248-258 (2018).
  11. Moroni, M., et al. Evaluation of the gamma-H2AX assay for radiation biodosimetry in a swine model. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14119-14135 (2013).
  12. Rothkamm, K., et al. Laboratory Intercomparison on the γ-H2AX Foci Assay. Radiation Research. 180 (2), 149 (2013).
  13. Barnard, S., et al. The first gamma-H2AX biodosimetry intercomparison exercise of the developing european biodosimetry network RENEB. Radiation Protection Dosimetry. 164 (3), 265-270 (2015).
  14. Moquet, J., et al. The second gamma-H2AX assay inter-comparison exercise carried out in the framework of the European biodosimetry network (RENEB). International Journal of Radiation Biology. 93 (1), 58-64 (2017).
  15. Vinnikov, V., et al. Clinical Applications of Biomarkers of Radiation Exposure: Limitations and Possible Solutions Through Coordinated Research. Radiation Protection Dosimetry. 186 (1), 3-8 (2019).
  16. Mariotti, L. G., et al. Use of the γ-H2AX assay to investigate DNA repair dynamics following multiple radiation exposures. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  17. Ivashkevich, A. N., et al. γH2AX foci as a measure of DNA damage: A computational approach to automatic analysis. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 711 (1-2), 49-60 (2011).
  18. Rogakou, E. P., et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-915 (1999).
  19. Sedelnikova, O. A., et al. Quantitative Detection of 125 IdU-Induced DNA Double-Strand Breaks with γ-H2AX Antibody. Radiation Research. 158 (4), 486-492 (2002).
  20. Han, J., et al. Quantitative analysis reveals asynchronous and more than DSB-associated histone H2AX phosphorylation after exposure to ionizing radiation. Radiation Research. 165 (3), 283-292 (2006).
  21. Jaworska, A., et al. Operational guidance for radiation emergency response organisations in Europe for using biodosimetric tools developed in EU multibiodose project. Radiation Protection Dosimetry. 164 (1-2), 165-169 (2015).
  22. Kulka, U., et al. Realising the european network of biodosimetry RENEB - status quo. Radiation protection dosimetry. 164 (1), 42-45 (2015).
  23. Sánchez-Flores, M., et al. γH2AX assay as DNA damage biomarker for human population studies: Defining experimental conditions. Toxicological Sciences. 144 (2), 406-413 (2015).
  24. Raavi, V., et al. Potential application of γ-H2AX as a biodosimetry tool for radiation triage. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 787, 108350 (2020).
  25. Lassmann, M., et al. In vivo formation of γ-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  26. Vandevoorde, C., et al. γ-H2AX foci as in vivo effect biomarker in children emphasize the importance to minimize x-ray doses in paediatric CT imaging. European Radiology. 25 (3), 800-811 (2015).
  27. Beels, L., et al. γ-H2AX foci as a biomarker for patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: Are we underestimating radiation risks. Circulation. 120 (19), 1903-1909 (2009).
  28. Bogdanova, N. V., et al. Persistent DNA double-strand breaks after repeated diagnostic CT scans in breast epithelial cells and lymphocytes. Frontiers in Oncology. 11, 1-14 (2021).
  29. Schumann, S., et al. DNA damage in blood leukocytes of prostate cancer patients undergoing PET/CT examinations with [68Ga]Ga-psma. Cancers. 12 (2), 1-14 (2020).
  30. Ivashkevich, A., et al. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  31. Moquet, J., et al. Gamma-H2AX biodosimetry for use in large scale radiation incidents: Comparison of a rapid "96 well lyse/fix" protocol with a routine method. PeerJ. 2014 (1), 1-11 (2014).
  32. Turner, H. C., et al. Adapting the γ-H2AX Assay for Automated Processing in Human Lymphocytes. Radiation Research. 175 (3), 282-290 (2008).
  33. Sharma, P. M., et al. High Throughput Measurement of γ H2AX DSB Repair Kinetics in a Healthy Human Population. PLoS ONE. 10 (3), 0121083 (2015).
  34. Vandevoorde, C., et al. EPI-CT: In vitro assessment of the applicability of the γ-H2AX-foci assay as cellular biomarker for exposure in a multicentre study of children in diagnostic radiology. International Journal of Radiation Biology. 91 (8), 653-663 (2015).
  35. MacPhail, S. H., et al. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: Reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiation Research. 159 (6), 759-767 (2003).
  36. Barnard, S., et al. The shape of the radiation dose response for DNA double-strand break induction and repair. Genome Integrity. 4 (1), 1 (2013).
  37. Kulka, U., et al. Biodosimetry and biodosimetry networks for managing radiation emergency. Radiation Protection Dosimetry. 182 (1), 128-138 (2018).
  38. Macaeva, E., et al. Gene expression-based biodosimetry for radiological incidents: assessment of dose and time after radiation exposure. International Journal of Radiation Biology. 95 (1), 64-75 (2018).
  39. Khanna, K. K., et al. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  40. Rothkamm, K., et al. γ-H2AX as protein biomarker for radiation exposure. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita. 45 (3), 265-271 (2009).
  41. Borràs, M., et al. Comparison of methods to quantify histone H2AX phosphorylation and its usefulness for prediction of radiosensitivity. International Journal of Radiation Biology. 91 (12), 915-924 (2015).
  42. Horn, S., et al. Gamma-H2AX-based dose estimation for whole and partial body radiation exposure. PLoS ONE. 6 (9), 1-8 (2011).
  43. Costes, S. V., et al. Imaging Features that Discriminate between Foci Induced by High- and Low-LET Radiation in Human Fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  44. Leatherbarrow, E. L., et al. Induction and quantification of γ-H2AX foci following low and high LET-irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (2), 111-118 (2006).
  45. Mistrik, M., et al. Low-dose DNA damage and replication stress responses quantified by optimized automated single-cell image analysis. Cell Cycle. 8 (16), 2592-2599 (2009).
  46. Oeck, S., et al. The Focinator - a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiation Oncology. 10 (1), 1-11 (2015).
  47. Vandersickel, V., et al. Early increase of radiation-induced γH2AX foci in a humanku70/80 knockdown cell line characterized by an enhanced radiosensitivity. Journal of Radiation Research. 51 (6), 633-641 (2010).
  48. Sambrook, J., et al. Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
  49. Rifai, A., et al. B and T lumphocytes. Recent Advances in IgA Nephropathy. (6), 193-210 (2009).
  50. Andreo, P., et al. Absorbed dose determination in external beam radiotherapy: An international code of practice for dosimetry based on absorbed dose to water. International Atomic Energy Agency. , Technical Report Series No. 398 (2001).
  51. Jamur, M. C., et al. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  52. Rogakou, E. P., et al. DNA Double-stranded Breaks Induce DNA Double-stranded Breaks Induce Histone H2AX Phosphorylation on Serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 1-12 (1998).
  53. Kyuseok, I. An introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  54. Ainsbury, E. A., et al. Multibiodose radiation emergency triage categorization software. Health Physics. 107 (1), 83-89 (2014).
  55. Ainsbury, E. A., et al. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 290-295 (2010).
  56. Turner, H. C., et al. The RABiT: High-throughput technology for assessing global DSB repair. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 265-272 (2014).
  57. Wang, Q., et al. Development of the FAST-DOSE assay system for high-throughput biodosimetry and radiation triage. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  58. Rothkamm, K., et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  59. Redon, C. E., et al. an analysis method for partial-body radiation exposure using γ-H2AX in nonhuman primate lymphocytes. Radiation Measurements. 46 (9), 877-881 (2011).

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कैंसर अनुसंधान अंक 178
मानव परिधीय रक्त लिम्फोसाइट्स में γ-H2AX Foci परख के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म स्कोरिंग विधि
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Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., … More

Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., Engelbrecht, M., du Plessis, P., Bolcaen, J., Fisher, R., Ndimba, R., Cunningham, C., Martínez-López, W., Schunck, C., Vandevoorde, C. An Automated Microscopic Scoring Method for the γ-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes. J. Vis. Exp. (178), e62623, doi:10.3791/62623 (2021).

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