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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

Abstract

분광 눈금을 사용하여 단일 생체 분자와 역학의 여러 적합성을 추적함으로써 구조적 역학에 대한 이해와 생물학에 대한 기여에 혁명을 일으켰습니다. FRET 기반 눈금자는 3-10 nm 범위에서 염료 간 거리에 대해 보고하는 동안, 단백질 유발 형광 향상(PIFE)과 같은 다른 분광 기술, 짧은 0-3 nm 범위에서 염료와 단백질 표면 사이의 근접성에 대한 보고. 선택의 방법에 관계없이, 한 번에 하나씩 자유롭게 확산되는 생체 분자를 측정하는 데 사용하는 것은 각 하위 집단이 밀리초 이내에 변경되지 않은 단일 형태 또는 밀리초보다 훨씬 빠르게 상호 변환되는 다중 적합성을 나타내는 생체 분자의 분리된 중앙 분산 하위 집단을 산출하는 실험 파라미터의 히스토그램을 검색합니다. 히스토그램에 보고된 파라미터가 염료 FRET 효율인 단일 분자 FRET에서, 완충제의 α-시뉴클레인 단조근과 같은 본질적으로 무질서한 단백질은 이전에 빠르게 상호 변환하는 다중 적합성의 단일 평균 아웃 하위 집단을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 과거 발견은 FRET 기반 통치자의 3-10 nm 범위에 의존하는 동안, 우리는 우리가 사이트 특정 sCy3 표지 α-시뉴클레인 단백질의 형광 수명을 추적 단일 분자 PIFE를 사용하여 테스트에이 단백질을 넣어 하고자 한 번에 하나씩. 흥미롭게도, 이 짧은 범위 분광 근접 센서를 사용하여, sCy3 표지 α-Synuclein는 10-100 ms에서 상호 변환하는 명백하게 다른 평균 수명을 가진 몇몇 일생 하위 인구를 전시합니다. 이러한 결과는 α-시뉴클레인이 전 세계적으로 무질서할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 안정적인 지역 구조를 달성한다는 것을 보여줍니다. 요약하자면, 이 작품에서는 한 번에 하나의 생체 분자를 로컬 또는 글로벌 구조 변화를 추적하는 다양한 분광 근접 센서를 사용하는 이점을 강조합니다.

Introduction

지난 2년간, 단일 분자 형광계 방법은 생체 분자1,2,다른 생체 분자 파라미터가 어떻게 분포되는지뿐만 아니라 하위 밀리초 해상도3,4,5에서이러한 매개 변수의 상이한 하위 집단 간에 동적으로 상호 작용하는 방법을 탐구하는 강력한 도구가 되었다. 이러한 기술의 파라미터는 FRET 측정 6,7,형광 이소트로피8,9,형광 양자 수율 및 수명10,11에서에너지 전달 효율을 포함하며, 12 또는 개선 된13 메커니즘의 상이한 형광의 함수로서. 단백질 유발 형광 향상(PIFE) (PIFE)(PIFE) 14는 염료14,15,16,18,18, 18, 18, 18의 부근의 단백질 표면에 의해 유발된 흥분 상태에서 형광의 자유 이소성 화에 대한 비질 방해의 함수로서 형광 양자 수율 및 수명의 향상을 소개합니다. . FRET와 PIFE 는 측정된 파라미터가 측정 중인 표지된 생체 분자 내의 공간 측정에 직접 연결되기 때문에 분광 눈금자 또는 근접 센서로 간주됩니다. FRET 효율은 3-10 nm20범위 내에서 염료 쌍 사이의 거리와 관련이 있지만, PIFE 트랙은 0-3 nm19범위내에서 염료와 인근 단백질의 표면 사이의 거리와 관련된 형광 양자 수율 또는 수명이 증가한다.

단일 분자 FRET는 본질적으로 무질서한 단백질(IDP)(21) (21)예를 들어, α-시뉴클레인(α-Syn)(22)와같은 많은 다른 단백질 시스템에 대한 구조적 통찰력을 제공하는 데 널리 사용되어 왔다. α-신은 상이한 생체분자에 결합하고 상이한 조건하에서23,24,25,26,27,28,29,30의상이한 조건하에서 정렬된 구조를 형성할 수 있다. 그러나, 결합되지 않은 경우, α-Syn 단백체는 빠르게 상호 변환적합성(31,32)과높은 형태 이질성을 특징으로 한다.

α-Syn의 적합성은 이전에 이러한 고이질 및 동적 단백질 시스템의 형성 역학을 식별하는 데 도움이 되는 다양한 기술을 사용하여 연구되었으며,33,34,35,36,37,38, 39. 흥미롭게도, 완충제에서 α-Syn의 단일 분자 FRET(smFRET) 측정은 단일 FRET 인구39,40을 보고한결과,이는 공초점 지점을 통해 α-Syn의 일반적인 확산 시간보다 훨씬 빠른 시간에 동적으로 상호 변환되는 적합성의 시간 평균 결과이며(보통 보다 적은 마이크로초, 심지어 는 그보다 빠른40배) 41. 그러나, 3-10 nm 거리 감도를 가진 FRET 분광 눈금자를 사용하여 때때로 α-Syn과 같은 작은 단백질의 전반적인 구조 적 변화에 대해서만 보고합니다. 거리 민감도가 짧은 분광 근접 센서를 활용한 단일 분자 측정은 현지 구조물의 역학에 대해 보고할 가능성이 있습니다. 본명 에서 우리는 α-Syn의 단일 분자 PIFE 측정을 수행하고 100 ms만큼 느린 그들 사이의 전환과 다른 지역 구조에 매핑 형광 수명의 다른 하위 집단을 식별합니다. 이 작업은 버퍼에서 자유 확산 α-Syn 분자의 시간 해결 된 smPIFE 측정을 요약하고 단거리 단일 분자 분광 근접 센서로서 SDS 기반 멤브레인에 바인딩될 때.

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Protocol

1. 플라스미드 변환

  1. SOC 배지 0.5 L 준비
    1. 트라이프톤 10g, 효모 추출물 2.5g, 염화나트륨 0.25g(NaCl), 염화칼륨 0.1g(KCl)의 무게를 측정합니다.
    2. 총 부피가 0.5L까지 이중 증류수(DDW)를 추가합니다.
    3. 수산화 나트륨(NaOH)을 추가하여 pH 7에 적응합니다.
    4. 100mL 및 오토클레이브의 주식 알리쿼트를 준비합니다.
    5. 사용하기 전에 멸균 마그네슘 염화물(MgCl2)과1.8mL의 멸균 포도당을 SOC100mL에 추가합니다.
  2. 얼음에 해동 BL21 (DE3) 유능한 대장균 세포.
  3. 유능한 셀을 부드럽게 섞습니다.
  4. 15mL 튜브 2개를 준비합니다. 하나는 변형 반응 튜브로 표시하고 다른 하나는 제어 튜브로 레이블을 지정합니다.
  5. 관에 유능한 세포의 알리쿼트 100 μL.
  6. 변환 반응 튜브에 0.1 ng/μL의 농도로 플라스미드 1 μL을 추가합니다.
  7. 42°C 수조에 SOC 배지를 가열하여 1.8단계에서 사용한다.
  8. 42°C 수조에서 2개의 튜브를 45초동안 가열펄스한다. (중요한 단계!)
  9. 각 튜브에 가열된 SOC 배지 의 900 μL을 추가합니다.
  10. 225 rpm의 속도로 흔들면서 45 분 동안 37 °C에서 튜브를 배양하십시오.
  11. 멸균 세포 스프레더를 사용하여 1LB(Luria-Bertani)-마고 플레이트에 변형된 플라스미드를 사용하여 세포의 200 μL을 1LB(Luria-Bertani)-agar 플레이트에 퍼뜨리도록 하였다.
  12. 멸균 스프레더(positive control)를사용하여, 암피실린 없이 한 LB-agar 플레이트에 변형된 플라스미드로 세포의 200 μL을 확산시킨다.
  13. 멸균 스프레더(음의대조군)를사용하여 100 μg/mL 암피실린을 함유한 LB-agar 플레이트에 대조군 세포의 200 μL(플라스미드를 함유하지 않음)을 확산시다.
  14. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

2. 단백질 제제

  1. 재조합 α-시뉴클레인 발현 및 정제
    1. 단일 콜로니를 선택하고 37 °C (스타터)에서100 μg / mL 암피실린을 함유 한 오토 클레이브 LB (Luria-Bertani) 액체 배지의 100 mL에서 성장한다.
    2. 4 L Erlenmeyer 플라스크를 준비, 각각 포함 1 L 의 오토 클레이브 LB 매체와 100 μg/mL 암피실린 (큰 접종).
    3. 셀 용액의 광학 밀도(λ = 600 nm에서 OD)를 측정합니다. 스타터의 세포 밀도가 0.6-0.7의 ODλ=600nm에 도달하면 이전 단계에서 제조된 LB 배지 의 각 1L당 10mL의 스타터 용액을 추가합니다.
    4. 인큐베이터 셰이커에서 세균 성 배지를 37°C에서 성장시키고 200 rpm의 속도로 성장합니다.
    5. 세포 밀도가 0.6-0.8의 ODλ=600nm에 도달하면, 각 1L의 성장 배지에 각각의 1L씩 이소프로필 β-d-1-티오갈라ctopyranoside(IPTG)를 추가하여 단백질 발현을 유도하여 1mM의 최종 농도를 유도한다.
      참고: DDW의 4mL에 0.96 g의 IPTG를 용해하고 세균 성장의 각 1L당 결과 IPTG 용액의 1mL을 추가합니다.
    6. 세포를 4시간 동안 재배하고 50mL 튜브에서 원심분리로 수집하여 5,170 x g의 속도로 8분간 수집합니다.
      참고 : 각 라운드에서, 상체를 폐기 펠릿을 유지하고 세균 성장과 같은 튜브를 다시 채우기.
    7. 세균성 펠릿을 다음 날 깊은 동결 보관(예: -80°C)에 보관합니다.
    8. 다음날, 200mL의 용해 완충제를 준비: 40% (w/v) 자당 및 버퍼 A, 포함 30 mM Tris-HCl, 2 mM 에틸렌디아민테트라아세산 (EDTA), 2 mM 디티오트레이톨 (DTT) pH 8.0.
    9. 세균성 펠릿으로 각 튜브에 25mL의 리시스 버퍼를 추가합니다.
    10. 리시스 버퍼에서 펠릿(멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫 사용)을 다시 일시 중단합니다(참조 2.1.8 참조).
    11. 멸균 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 얼음 위에 교반자석으로 준비합니다.
    12. 5mL의 용해 버퍼를 추가한 다음 균일한 다시 중단된 셀을 전달합니다.
    13. 실온에서 200 rpm에서 20 분 동안 세포를 저어줍니다.
    14. 용액을 50mL 튜브와 원심분리기를 4°C에서 4°C로 나누어 17,400 x g의 속도로 30분간 지속합니다.
    15. 상부체를 폐기합니다.
    16. 멸균 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 얼음 에 교반 자석으로 준비합니다.
    17. 각 튜브에 15mL의 용해 버퍼(90mL 냉각 버퍼 A 및 MgCl2의 37 μL)를 추가합니다. 멸균 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하고 펠릿을 녹입니다.
    18. 용액의 일부가 균일해지면 얼음 위에 있는 에를렌마이어 플라스크로 이동합니다.
    19. 에를렌마이어의 솔루션 볼륨을 결정합니다.
    20. 10 mg의 연쇄상 구균 황산염을 각 1 mL 의 용액 (추가하기 전에 2 mL의 완충A에 연쇄 절제술 황산염을 녹입니다).
      참고: 이 단계는 DNA와 리보솜을 제거하기 위해 수행됩니다.
    21. 실온에서 10-20분 동안 용액을 저어줍니다.
    22. 용액을 4°C에서 50mL 튜브와 원심분리기로 나누고 30분 동안 20,700 x g의 속도로 분할합니다.
    23. 상체를 수집하고 펠릿을 폐기합니다.
    24. 멸균 250 mL Erlenmeyer 플라스크를 얼음 위에 교반기와 함께 준비합니다.
    25. 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 깨끗한 에를렌마이어 플라스크에 초신을 걸러넣습니다.
    26. 용액 의 부피를 결정하고 용액의 각 1 mL 당 암모늄 황산염의 0.3 g의 무게.
    27. 점차적으로 황산 암모늄을 교반 용액에 추가합니다.
      참고: 이 단계는 단백질을 침전시키기 위해 수행됩니다. 황산암모늄이 단백질을 묶으면 용액이 가려지고 흐려져 흰색으로 표시됩니다.
    28. 실온에서 30분간 저어줍니다.
    29. 용액을 50mL 튜브와 원심분리기를 4°C에서, 30분 동안 20,700g의 속도로 나누어 놓습니다.
    30. 상체를 조심스럽게 버리고 펠릿을 보관하십시오.
    31. 버퍼 A의 20mL로 펠릿을 녹입니다.
    32. 모든 용액을 하나의 튜브로 통합한 다음 용액의 UV 흡수 스펙트럼을 측정합니다.
      참고: 스펙트럼이 집계의 서명(300nm의 파장 위의 흡수)을 표시하는 경우 다음 단계로 계속 합니다. 그렇지 않은 경우 다음 단계를 건너뛰고 2.1.34 단계로 이동합니다.
      참고: UV 스펙트럼에서 ODλ=350nm/(OD λ=280nm- ODλ=350nm)×100으로 계산된 집계 인덱스(A.I.). 41
    33. 100 kDa 컷오프 원심 준비 튜브와 원심분리기를 4°C에서 3,590 x g의 속도로 15분간 사용하십시오. 필터를 통과한 액체를 수집합니다.
    34. 버퍼 A에 대해 밤새 4°C에서 3.5 kDa 컷오프가 있는 투석 백을 사용하여 용액을 투석합니다.
    35. 적어도 4 시간의 기간 동안 투석의 또 다른 라운드를 수행.
    36. 투석된 샘플을 1mL MonoQ 음이온 교환 열에 로드합니다. 30m MM Tris-HCl(Tris-HCl) 버퍼를 pH 7.5에서 세척 버퍼로 사용하고 30m Tris-HCl 버퍼 pH 7.5를 500m MM NaCl을 용출 버퍼로 사용한다.
    37. 컬럼에 샘플을 삽입합니다. 그런 다음 언바운드 단백질을 제거하기 위해 0% 용출 버퍼와 100% 세척 버퍼의 20컬럼 볼륨(CV)으로 세척합니다.
    38. 30% 용출 버퍼의 7 CV로 세척하십시오.
    39. 30CV용 용출 완충제의 30%에서 100% 로 변경되는 그라데이션을 사용하여 α-Syn 단백질 샘플을 1.5mL/min의 유량으로 엘테.
      참고: 전도도 20-24 mS/cm에서 46-66 CV에서 α-Syn elutes, 이는 38-50% 용출 버퍼를 참조합니다.
    40. 주 용출 피크의 분수를 수집합니다. 쿠마시 블루 또는 패스트 시밴드 염색 용액으로 염색한 후 15% 나트륨 도데실 황산 폴리아크릴아미드 젤 전기포고증(SDS-PAGE)에서 샘플을 실행하여 α-Syn의 존재를 확인합니다. 15 kDa의 밴드가 예상됩니다.
    41. 관련 분획을 통합하고 버퍼 A에 대해 4 °C에서 3.5 kDa 컷오프가있는 투석 백을 사용하여 밤새 투석을 합니다.
    42. 단백질 샘플의 알리쿼트를 준비하고 -20°C에 보관하십시오.
  2. Cy3 라벨 α-시뉴클레인
    1. α-신 A56C 돌연변이체에서 시스테인 잔류물의 티올을 실온에서 1시간 동안 2mM의 최종 농도에 추가하여 감소시.
    2. 3.5 kDa 컷오프 투석 백을 사용하여 투석 2라운드를 수행하여 DTT를 제거하십시오. 첫 번째 라운드에서는 30m Tris-HCl pH 8.0 및 2mM EDTA를 상대로 투석을 합니다. 두 번째 라운드의 경우 50m HEPES pH 7.2 및 2 mM EDTA에 대해 투석합니다.
    3. 단백질 샘플에 Tris(2-carboxyethyl)인산염(TCEP)을 추가하여 시스테인 잔류물을 50 μM의 최종 농도로 실온에서 30분 동안 감소시.
      참고: TCEP는 비sulfhydryl 감소 제, 따라서 그것은 염료에 반응 하지 않고 감소 된 티올 그룹을 유지. 1M TCEP의 스톡 용액에서 0.5 μL을 추가했습니다.
    4. 1 mL의 최종 반응 부피에 필요한 단백질의 양을 계산합니다.
      참고: 사용한 계산의 예는 다음과 같습니다.
      20 μM 최종 단백질 농도 × 1mL 최종 부피 = 56 μM 초기 단백질 농도 × V 단백질 추가
    5. 1 mL의 최종 반응 부피에 필요한 염료의 양을 계산합니다. 단일 시스테인의 염료 라벨링은 최소 3:1의 단백질 어금반염에서 과도한 염료로 수행되어야 한다.
      참고: 사용한 계산의 예:
      60 μM 최종 염료 농도 × 1mL 최종 부피 = 370 μM 초기 염료 농도 × V 염료를 추가
    6. 총 반응 볼륨을 1mL로 조정하는 데 필요한 투석에서 버퍼양을 계산합니다.
      참고: 계산 예: 1 mL - (2.2.4 단계에서 계산된 V + 2.2.5 단계에서 계산된 V)
    7. 교반기 위에 자석으로 반응 유리병을 준비합니다.
    8. 첫째, 단백질과 완충제의 계산된 양을 추가한다. 그 후, 염료(설포-키3 말레니드)의 계산된 양을 추가한다.
    9. 3-5 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 반응을 유지합니다.
    10. 2mM DTT를 추가하여 반응을 종료하고 1시간 동안 계속합니다.
    11. 버퍼 A에 대한 투석의 세 라운드를 수행, 용액에서 초과 무료 염료를 제거하기 위해 3.5 kDa 컷오프투석 가방을 사용하여.
    12. 크기 제외 열에 샘플을 로드하여 레이블이 표시된 α-Syn을 무료 염료에서 더 분리합니다.
    13. 염료의 흡수를 측정하여 순수한 라벨α-Syn의 농도를 결정합니다(설포-Cy3의 흡수 계수는 λ=548 nm에서 162,000M-1cm-1)이다.
    14. 필요한 경우 진공 농축기(예: SpeedVac)를 사용하여 순수 라벨이 부착된 α-Syn 솔루션을 농축합니다. 이어서, 완충A에 대하여 투석의 1라운드를 수행하고, 3.5 kDa 컷오프를 가진 투석 백을 사용하여 다시 표지된 단백질의 농도를 결정한다.
    15. 표지된 단백질 샘플의 알리쿼트(aliquots)를 준비하고 -20°C에 보관합니다.

3. 측정

  1. smPIFE 실험 설정
    참고: 다음 공초점 기반 설정 또는 이와 유사한 설정을 사용합니다.
    1. 펄스 레이저 소스(당사의 경우, λ= 532 nm 피코초 펄스 레이저 ~100ps FWHM의 펄스 폭) 적절한 반복 속도(당사의 경우 20MHz)로 작동하고, 설포-Cy3(SCy3)의 원천으로서 시간 상관단일 광자 계수(TCSPC) 카드의 SYNC로 라우팅된다.
    2. 532 nm에서 반사율이 높은 이색 거울을 사용하여 흥분을 분리하고 형광으로부터 산란합니다.
    3. 방출된 빛의 초점에 100 μm 직경핀홀을 사용하고, 충돌방출 빔이 렌즈에 의해 집중된 후, 배출 빔이 다른 렌즈에 의해 다시 정렬되기 전에.
    4. 밴드 패스 필터(케이스의 585/40 nm)를 사용하여 다른 광원으로부터 sCy3 형광을 더 걸러내십시오.
    5. TCSPC 모듈(베커 & 히클 SPC-150)으로 라우팅된 검출기(단일 광자 눈사태 다이오드 또는 하이브리드 광증증)를 사용하여 형광을 감지합니다( 당사의 경우 베커 & 히클 SPC-150).
      참고: 당사의 경우 데이터 수집은 TTTR(시간 태그시간 해결) 파일 형식의 VISTAVision 소프트웨어(ISSTM)를통해 수행됩니다.
  2. smPIFE 샘플 준비
    1. 측정 버퍼에서 25 pM sCy3 라벨 α-Syn 준비: 10 mM 나트륨 아세테이트, 10mM 나트륨 이수소 인산염, 10mM 글리신 pH 8.0, 20mM NaCl, 10mM 시스팀신 및 1mM 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸클로만-2-카복실산(TROLOX) 저단백질 결합 튜브.
      참고: α-Syn이 SDS 소포가 있는 경우 적절한 SDS 양을 추가합니다.
    2. 18 챔버 현미경 커버 슬립 슬라이드를 1 mg / mL 소 세럼 알부민 (BSA)의 100 μL을 1 분 동안 헹구고 BSA를 제거합니다.
    3. 커버슬립 슬라이드의 챔버에 25 pM sCy3 라벨α-Syn 샘플의 100 μL을 추가합니다.
    4. 다음 단계에서와 같이 설명된 설정을 사용하여 샘플의 smPIFE 측정을 수행합니다.
  3. smPIFE 데이터 수집
    1. 높은 숫자 조리개 물 침지 목표 렌즈(당사의 경우 올림푸스 UPLSAPO 60x N.A. 1.2)를 사용하고, 객관적인 렌즈 위에 초순수 한 방울을 추가합니다.
    2. 스테이지 챔버에서 커버슬립 슬라이드를 수정하고 현미경 단계 위에 설치합니다.
    3. 객관적인 렌즈를 위쪽으로 가져와서 객관적인 렌즈 위에 있는 물방울이 커버슬립 슬라이드 의 바닥에 얼룩질 때까지 하십시오.
    4. CMOS 카메라의 패턴을 검사하면서 레이저 셔터를 열고 객관적인 렌즈를 위쪽으로 가져와 샘플에서 흩어진 빛을 수집합니다. Airy 링 패턴을 관찰합니다: 첫 번째는 물 유리 인터페이스의 초점을 나타내고 두 번째 는 유리와 샘플 솔루션 사이의 인터페이스에서 초점을 나타냅니다.
    5. 목표 렌즈의 높이를 추가로 75μm로 늘려 레이저 초점을 솔루션 깊숙이 가져와 커버슬립의 유리 표면으로부터 자동 형광을 최소화합니다.
    6. 목표 렌즈에서 레이저 전원을 ~100 μW로 조정합니다.
    7. 미리 정의된 시간(측정에서 2시간)에 대해 감지된 광자 인수를 시작합니다.
      참고: 대부분의 획득 신호에는 버퍼만 측정할 때 획득한 것과 유사한 속도(초당 카운트, cps로 측정)가 있어야 합니다. 밀리초 비닝 데이터는 부족한 광자 버스트 이벤트를 보여주어야 하며, 대부분의 쓰레기통은 일반적인 검출기 배경 비율(<1,000 cps)과 비교할 수 있는 평균 비율을 가지고 있습니다.

4. smPIFE 버스트 분석

  1. 원시 데이터 변환
    참고: 데이터는 일반적으로 TCSPC 카드(당사의 경우.spc 파일)를 제조하는 회사에서 미리 정의된 형식의 이진 파일에 저장됩니다.
    1. 원시 데이터 파일을 소프트웨어 제품군 변환(https://github.com/Photon-HDF5/phconvert)을 사용하여 광자-HDF5 범용 파일형식(42)으로변환합니다.  원시 데이터 파일을 입력으로 호출하고 phconvert 제품군의 적절한 코드를 사용하여 원시 데이터 .hdf5 파일로 변환합니다(변환 ns-ALEX 베커-히클 파일은 Photon-HDF5.ipynb Jupyter 노트북으로 변환합니다.)
      참고: .hdf5 파일로 변환하는 것은 다음과 같습니다: (1) 원시 데이터에서 관련 광자 스트림을 결정하는 것(즉, 관련 검출기 ID의 등록된 광자 스트림) (2) 관련 광자 나노타임(흥분 SYNC 시간에 비해 광자 검출 시간); (3) 메타데이터를 추가했습니다.
  2. 버스트 검색 및 선택 FRETbursts43
    참고: smPIFE 측정의 모든 광자-HDF5 원시 데이터 파일과 원시 데이터의 분석을 요약한 코드는 제노도(https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698)에 저장됩니다. 아래의 모든 단계는 제노도 리포지토리 링크에 제공된 Jupyter 노트북 내에 상세하고 표시됩니다.
    1. 주피터 노트북을 엽니다(아나콘다 프레임워크 내에서 우리의 경우).
    2. 노트북 smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer(최종 노트북).ipynb(제노도 링크에서 찾을 수 있음)를 엽니다.
    3. 로드 FRETbursts.
    4. 광자 HDF5 데이터 파일을 로드합니다.
    5. BG 속도 평가: 광자 간 시간의 히스토그램을 사용하여 광자 HDF5 데이터 파일에서 30초마다 데이터 수집에 대한 배경(BG) 비율을 계산합니다.
      참고: 다음 단계는 슬라이딩 윈도우 알고리즘44,45, 46을사용하여 버스트 검색을설명합니다.
    6. 한 번에 하나의 광자인 m=20 연속 광자의 시간 창을 이동합니다.
    7. 즉각적인 광자 Equation 1 속도()가 데이터 수집 기간 동안 BG 속도보다 적어도 F=11배 큰 경우에만 광자 데이터를 수집합니다.
      참고: 한 번에 하나의 광자를 한 번에 하나의 광자를 슬라이딩하고 광자 속도 기준(4.2.7 단계)에 동의하여 수집된 모든 연속 광자에서 버스트가 생성됩니다.
    8. 다음 버스트 특성을 계산합니다.
      버스트 크기: 광자의 양이 터져 나오다.
      버스트 지속 시간: 버스트에서 마지막 광자 감지 시간과 첫 번째 광자 감지 시간의 시간 차이입니다.
      버스트 밝기: 버스트에서 순간 광자 속도의 가장 큰 값입니다.
      버스트 분리: 연속 버스트 사이의 시간 간격입니다.
      참고: 다음 점은 추가 버스트 선택 절차를 설명합니다.
    9. 파열 밝기 값(버스트에서 가장 높은 순간 광자 속도)의 히스토그램을 로그리스믹 스케일에서 이벤트 축으로 플롯합니다.
    10. 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소 버스트 밝기 값으로 버스트 밝기 임계값을 정의합니다.
    11. 버스트 밝기 임계값보다 큰 밝기 값을 가진 버스트를 선택합니다.
      참고: 다음 단계는 파열평균 형광 수명을 설명합니다.
    12. 로개스믹 스케일의 광자 카운트 축을 사용하여 선택한 모든 버스트에서 모든 광자 나노타임의 히스토그램을 플롯합니다.
    13. 나노시간 임계값을 광나노시간의 히스토그램이 부패 패턴을 나타내는 최소한의 나노시간 값으로 정의한다.
    14. 나노타임 임계값보다 나노미터 가큰 광자만 선택합니다.
    15. 선택한 모든 광자 나노타임의 대수 평균을 계산합니다.
    16. 광자 나노시간 대수 평균으로부터 나노시간 임계값을 뺍니다. 결과는 버스트의 평균 광나노시이며, 이는 평균 형광 수명에 직접적으로 비례한다.
    17. 모든 버스트 평균 형광 수명의 히스토그램을 플롯. 형광 수명의 중앙 분산 하위 인구가 나타날 수 있습니다. 낮은 값 평균을 가진 하위 인구는 sCy3를 가진 분자 종을 나타내며, 값이 높은 평균을 가진 하위 인구는 더 sterically 가려진 sCy3를 가진 분자 종을 나타냅니다.
      참고: 다음 단계는 버스트 되풀이 해석47을 기반으로 느린 버스트 사이 역학을 설명합니다.
    18. 파열 분리 시간의 히스토그램을 로개스믹 스케일의 분리 시간 축으로 플롯합니다.
      참고: 버스트 분리 시간의 하위 개체수가 두 개 나타납니다.
      초의 분리 시간을 가진 주요 하위 인구는, 다른 연속 측정 분자에서 유래 연속 버스트를 나타냅니다.
      분리 시간 ~<100 ms를 가진 경미한 하위 인구는 동일한 분자에서 유래되는 연속 버스트를 나타내며, 공초점 부피를 통해 다시 반복됩니다.
    19. 동일한 분자 하위 모집단(<100 ms,이 경우)을 정의하는 최대 분리 시간 미만으로 구분되는 연속 버스트의 모든 쌍을 저장하려면 선택합니다.
    20. 히스토그램 또는 특정 분리 시간 임계값 이하로 되풀이되는 모든 버스트 쌍에 대한 첫 번째 및 두 번째 버스트의 평균 형광 수명의 분산 플롯을 플롯합니다.

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Representative Results

IDP로서, 다른 생체 분자에 바인딩되지 않을 때, α-Syn은 몇 마이크로초40에서, 심지어 수백 나노초41에서전이와 함께 다중 적합성 사이의 구조적 역학을 나타낸다. α-Syn이 공초점 지점을 교차하면 적합성 간에 수천 번의 전환이 발생할 수 있습니다. 실제로, 이것은 smFRET가39,40을사용했을 때의 경우였습니다. 여기서 우리는 α-Syn의 로컬 형태 역학을 조사하기 위해 smPIFE 측정을 수행합니다.

이 측정은 α-Syn A56C 돌연변이체에서 시스테인의 티올 그룹에 부착된 설포-Cy3(sCy3) 염료로부터 방출되는 형광광자를 기록한다. sCy3 플루오로포어는 흥분된 상태에서 이소성화를 겪을 수 있습니다. 그러나 sCy3은 트랜스 이좀러에서 흥분을 일으킬 때 광자를 방출합니다. 따라서, sCy3 흥분 상태 이소성화를 방해하지 않으면 평균적으로 광자를 거의 방출하지 만 형광 양자 수율이 낮고 짧은 형광 수명을 나타낼 것이다. 그러나, sCy3의 흥분 상태 이소성 화가, 예를 들어, 가까운 단백질의 표면에 의해 방해되는 경우에, 이소성화의 비율은 감소할 것이고, 차례차례로 트랜스 이소머에서 더 많은 발산으로 이끌어 낼 것이고, 따라서 더 많은 광자, 더 높은 형광 양자 수율 및 더 긴 형광 수율. 이것은 PIFE 효과로 더 잘 알려져 있습니다.

smPIFE를 사용하여 우리는 sCy3 라벨링 α-Syn의 평균 형광 수명을 한 번에 56 의 α-Syn로 측정하여 sCy3 염료가 잔류물 56 주위의 단백질 환경을 감지합니다. 단백질은 주로 단량체로 발견되는 25 pM의 농도로 측정되었다. smPIFE 측정의 결과는 단일 α-Syn 분자의 평균 형광 수명의 히스토그램(도1)으로도시된다. 평균 형광 수명은 2개의 중요한 하위인구(그림 1A)로그룹화될 수 있습니다. 첫 번째 하위 인구는 잔류물 56 부근에서 발견되는 단백질 표면이 없거나 거의 없는 α-Syn 형성 상태를 나타내는 1.6ns의 특징적인 형광 수명을 가진 짧은 형광 수명을 나타낸다. 두 번째 하위 인구는 3.5 ns의 특징적인 형광 수명을 가진 더 긴 형광 수명을 나타내며, α-Syn 형성 상태를 나타내며 잔류물 56 부근에서 더 많은 단백질 표면을 발견합니다.

~5-10mMMM SDS의 존재에서, 용액에서 거의 모든 α-Syn 분자의 N 단말 및 NAC 세그먼트는 SDS소포(40)에결합시 헬기체 헤어핀 구조를 채택하는 것으로 알려져 있다. 잔류물(56)은 NAC 세그먼트 내에 위치하기 때문에, sCy3 라벨링 잔류물(56)로부터의 형광은 거의 모든 α-Syn 분자의 대부분이 소포 바인딩 헬리칼 헤어핀 구조를 획득해야 하기 때문에 다소 균일한 미세 환경을 감지할 것으로 예상된다. 따라서 유사한 smPIFE 측정을 수행했지만 5mM SDS가 있는 상황에서 단일 형광 수명을 식별할 것으로 예상했습니다. 실제로, 이러한 측정은 3.1ns(도 1B)의특징적인 형광 수명을 가진 형광 수명의 단일 집단귀착됩니다. ~3ns 특성형 형광 수명은 잔류물(56) 부근의 국소 구조를 가리킨다, 이는 α-Syn의 ~1.5ns 평생 하위 집단에 존재하지 않는, 백혈구 모핀이 형성되고 SDS 소포 표면에 결합이 발생할 때 α-Syn이 겪는 구조화를 강조한다. 흥미롭게도, 그 단일 인구는 용액에서 α-Syn의 ~3.5 ns 평생 하위 인구에 비해 더 짧은 특성 형광 수명을 가지고 있습니다.

단일 분자 버스트의 두 개의 뚜렷한 중앙 분산 하위 집단의 출현은 분자 이질성의 잘 알려진 서명입니다. 별도의 표지된 분자의 혼합물이 관련되지 않았기 때문에, 두 평생 하위 집단은 α-Syn(그림1A)에서sCy3 라벨링 잔류물 56의 두 개의 별개의 종을 나타낸다. 따라서 결과는 동적 이질성을 보고합니다. 이는 히스토그램에 보고된 매개 변수가 공초점 부피 내부의 확산 α-Syn의 몇 ms 지속 시간 동안 버스트에 있는 모든 광자를 사용하여 계산되기 때문이다. 따라서, sCy3 표지된 α-Syn 분자는 짧거나 긴 평균 수명을 나타낼 때 어느 쪽도 공초점 부피를 교차하였다. 이 종 사이의 전환은 공초점 지점을 통해 특성 확산 시간보다 느리게 발생해야하므로 몇 밀리초보다 느립니다. 이러한 동적 동작을 평가하기 위해 버스트 재발분석(47)을수행했습니다. 요컨대, 단일 분자 버스트의 지속 시간보다 더 긴 시간에 발생하는 역학을 평가하기 위해 노력하기 때문에, 우리는 단일 α-Syn 분자가 공초점 지점의 연속 횡단 사이의 형광 수명을 의미하는 sCy3의 변화를 나타낼 가능성을 테스트했습니다. 이를 위해, 먼저 연속 버스트의 두 가지 유형을 구별: i) 초 단위로 분배하는 버스트 분리 시간을 가진 다른 α-Syn 분자의 연속 버스트, ii) 버스트 분리 시간 후 공초점 부피에서 재귀하는 동일한 α-Syn 분자의 연속 버스트, 때로는 ~100ms(그림 2A)로느립니다. 두 평균 일생 하위 인구에 따라, 우리는 최대 100 ms(그림 2A)로분리되는 연속 버스트의 쌍을 검사하기로 결정했습니다, 버스트의 쌍 중 첫 번째는 짧은 수명 하위 인구 (0-2 ns) 또는 긴 일생 하위 인구 (>3.5 ns) 내에서 평균 형광 수명을 나타냈다. 그림 2B,컬러 쉐이드). 연속 버스트 쌍의 두 번째 버스트로 표시되는 반복 버스트의 버스트 중 검사 테스트는 첫 번째 버스트에서 하나와 반대로 일생 하위 집단 내에서 형광 수명을 의미합니다. 짧은 수명 하위 집단에서 파열로 시작하는 분자의 일부가 그 범위를 벗어나심지어 긴 수명 하위 집단(그림2C)내에서 파열로 재발하고, 긴 수명 하위 집단에서 파열로 시작하는 분자의 일부가 그 범위를 벗어나 짧은 수명 하위 집단(그림 2D) 내에서도 파열되는 것을 관찰할 수 있다(그림 2D), 모두 10-100 ms 이내.

Figure 1
그림 1: α-Syn A56C에서 sCy3 라벨링 잔류물 56의 평균 형광 수명 하위 집단. 5mM SDS의 부재(A) 및 존재(B)에서 자유 확산 sCy3 라벨α-Syn A56C(25 pM)의 형광 수명 히스토그램을 의미한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: PIFE 버스트 재발 분석은 개별 분자가 100 ms 내의 다른 평균 수명 값 사이의 전이를 겪는 것을 보여줍니다. 위에서 아래로:(A)연속 단일 분자 버스트 사이의 분리 시간의 히스토그램. 주황색 그늘은 동일한 분자에서 첫 번째 와 두 번째 파열이 발생하는 반복 분자의 연속 버스트 사이의 분리 시간을 나타냅니다. (B)모든 단일 분자 버스트의 평균 형광 수명 히스토그램. 노란색 과 녹색 음영은 각각 짧고 긴 평균 수명 하위 모집단 내에서 값을 나타내도록 선택한 평균 수명 값의 범위를 나타냅니다. (C)또는(D). 주황색 음영이 있는 시간 척도(A)에서이전 버스트와 분리된 버스트의 평균 형광 수명 히스토그램은 각각 노란색 또는 녹색 음영으로 표시된 범위 내에서 평균 수명을 가졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

광범위한 생화학 적 및 생물리 연구는 α 신과 그 무질서한 자연33,34,35,36,37,38의구조적 특성을 연구하기 위해 수행되었다. 여러 작품은 이미 자유롭게 확산 smFRET를 활용하여 결합이 없는 α-Syn 단조량의 분자 내 역학을 조사합니다. 이러한 작품들은 α-Syn의 높은 동적 이질성을 보고하여, 공초점 지점을 통해 일반적인 확산 시간 내에 여러 가지 구조 종의 평균 아웃으로 이어져 단일 FRET 인구39,40의출현으로 이어진다. 그러나, smFRET 측정은 3-10 nm 내에서 발생하는 간 염료 거리의 변화에 대한 보고, α-Syn과 같은 작은 단백질의 전반적인 구조적 변화를 특징으로 하는 척도임을 기억해야 한다.

우리는 국소 구조 역학에 민감하고 단일 분자 수준에서도 활용된 단백질 내에서 공간 변화의 다른 형광 기반 센서를 사용할 때 어떤 결과를 찾을 수 있는지 궁금했습니다. smPIFE는 0-3 nm 범위에서 특정 아미노산 잔류물을 라벨링sCy3 근처의 로컬 공간 변화를 추적할 수 있다.

이 연구에서는 smPIFE를 활용하여 α-Syn 내의 지역 구조물의 역학을 조사하고 NAC 잔류물 56 근처의 보다 구체적으로 현지 구조 변경사항을 조사했습니다. 결과는 α-Syn의 잔류물 56 부근의 지역이 100 ms만큼 느리게 상호 변환할 만큼 열역학적으로 안정된 몇 가지 뚜렷한 구조 하위 인구를 나타내며, 아마도 더 느려질 수도 있음을 시사합니다. 이러한 하위 집단은 측정된 sCy3 표지된 단일 α-Syn 분자의 평균 형광 수명을 검사하여 확인된다. 이러한 하위 집단에서, 하위 인구의 특성 형광 수명이 길수록, 단백질 표면이 sCy3의 흥분 상태 이소성화를 방해하고, 따라서 그 단백질 표면이 sCy3 표지잔류에 가까울수록.

다른 IDP와 마찬가지로, α-Syn은 다른 생체 분자와 상호 작용뿐만 아니라 자기 협회를 갖는 것으로 보고되었으며, 이러한 결합 이벤트는 α-Syn 서브유닛56,57,58,59내의 특정 구조의안정화를수반한다. 일부 단백질은 유도된 맞춤 메커니즘을 통해 결합시 특정 구조를 획득합니다. 그러나 다른 단백질은 자발적으로 여러 가지 뚜렷한 적합성 과 결합 이벤트를 특정 생체 분자로 상호 변환하여 기존의 적합성 중 하나를 안정화시합니다. 후자의 경우, 요구 사항 중 하나는 안정화 될 변형이 초기 바인딩을 수용 할 만큼 오래 살아남을 수 있다는 것입니다. 따라서 단백질의 구조 영역이 길수록 결합 효율이 높을수록 생존효율이 높아집니다. 우리는 관찰 된 밀리초 안정 하위 인구가 잔류물 56 부근에서 지역 구조의 별개의 종의 존재를 나타내는 것이 좋습니다. 이러한 점은 NAC 및 NTD 세그먼트의 중간 근처에 있는 다른 지역 구조 종을 가리킵니다. 최근 작업에서, 우리는 이 세그먼트에 이 및 그밖 sCy3 표지된 잔류물을 보고합니다 또한 그 같은 하위 인구를전시60. 이러한 결과는 자유 α-Syn 단조량의 구조적 역학이 수초 동안 안정적으로 유지되는 지역 구조 세그먼트를 운반하는 빠른(최대40초에서몇 마이크로초)으로 가장 잘 설명될 수 있음을 보여줍니다. 타우 및 아밀로이드 β 같은 다른 IDP는 지역 구조화지역(48,49,50)을운반하는 유사한특성을공유하는 것으로 알려졌다.

smPIFE는 주로 별도의 생체 분자 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용되어 왔다. 여기서, 우리는 동일한 단백질의 세그먼트 내에서 PIFE를 조사하기 위해 smPIFE를 사용합니다. 이전 smPIFE 실험의 대부분은 단일 고정 sCy3 표지 분자13,14,15,16,17,18,19,51,52,53의 형광 강도의 상대적 변화를 추적하여 수행되었다는 것을 언급하는 것이중요합니다. . 고정 된 분자에 대 한 유용, 이 절차는 자유 확산 단일 분자를 측정 할 때 덜 유익한. 황 외.는 형광 수명 변화를 추적하여 PIFE 효과를 측정하는 방법을 보여 주었으며, 이는 sCy319의흥분 상태 이소성 역학의 변화에 직접 보고된다. 여기서 우리는 형광 강도의 상대적 변화를 추적하는 대신 sCy3 평균 형광 수명을 통해 단일 확산 α-Syn의 PIFE 효과를 조사합니다. 이렇게, 우리는 공초점 자리에 있는 각 1개의 α-Syn 분자의 짧은 거주 시간에도 불구하고 PIFE 관련 하위 인구를 취득할 수 있었습니다. 실제로, 평균 형광 수명은 PIFE 관련 하위 인구를 정의하는 것뿐만 아니라 버스트 재발 분석 프레임 워크(47)를사용하여 느린 PIFE 관련 역학을 평가하는 데 유용함을 입증했다. 그러나 더 빠른 PIFE 역학을 적절하게 평가할 수 있는 절차를 개발하는 데 더 많은 작업이 필요합니다. smPIFE54,55에사용되려면 용도를 변경하려는 smFRET 실험에서 급속한 FRET 역학을 평가하는 데 사용되는 기존 광자 통계 도구가 많이 있습니다.

요약하자면, 이 작업에서 우리는 smFRET에 의해 복구되지 않은 α-Syn에서 지역 구조물의 ms-안정적인 하위 집단을 식별하기 위해 자유롭게 확산되는 단일 분자의 PIFE 측정의 비교적 새로운 조합을 사용했습니다. 우리는 모델 IDP로 α-Syn을 연구하기 위해 smPIFE 측정을 사용했으며, 우리의 결과는 전 세계적으로 무질서한 α-Syn의 과거 연구 결과를 넘어 확장됩니다. 연구 결과는 α-Syn이 ms-stable 주문된 로컬 구조를 운반할 수 있으며 이러한 지역 구조가 구속력 인식에 역할을 할 수 있다고 가설을 세울 수 있음을 시사합니다.

지금까지, smPIFE는 그들의 표지되지 않은 단백질대응51을가진 sCy3 표지된 핵산의 상호작용을 연구하는 수단으로 이용되었다. 이를 통해 smPIFE는 생체 분자 상호 작용을 감지하는 강력한 도구로 활용되었으며, 따라서 그 방향의 자연스러운 다음 단계는 단백질 단백질 상호 작용과 역학을 감지하기 위해 한 번에 하나의 복합체를 감지하기 위해 사용하는 것입니다.

smPIFE와 같은 단거리 근접 센서를 사용하는 힘은 무질서하고 구조적으로 불안정한 것으로 간주되는 다른 단백질 시스템 내에서 안정적인 지역 구조화를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나 단일 분자 형광 계 의 짧은 근접 센서를 사용하는 힘은 거기서 멈추지 않습니다. 많은 이온 채널과 같은 기능을 용이하게 하기 위해 단기 적인 형성 역학을 나타내는 많은 생체 분자 시스템이 있습니다. 우리는 smPIFE가 단일 분자 FRET에 보완적인 공구역할을 할 수 있다고 믿으며, 이러한 경우 단백질 시스템 내의 근접 성의 동적 범위가 FRET가 감지하고 해결할 수 있는 동적 범위와 일치하지 않는 경우. 요약하자면, 당사는 단일 분자 FRET 측정에 대한 근접 센서 보완체로서 smPIFE의 사용을 촉진하고, 더 넓은 규모의 생체 분자 근접성을 커버하고, 아마도 측정된 파라미터의 명확한 밀리초 평균 하위 집단을 관찰하여 로컬 또는 전체적으로 안정적인 구조물에 대해 보고하고 있습니다.

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Disclosures

모든 저자는 이해 상충을 공유하지 않습니다.

Acknowledgments

A56C α-Syn 돌연변이를 코딩하는 pT-t7 플라스미드는 아사프 그루피 박사, 댄 아미르 박사, 엘리샤 하스 박사의 선물로 우리에게 주어졌습니다. 이 논문은 국립 보건원 (NIH, 보조금 R01 GM130942 E.L. 하위 상으로), 이스라엘 과학 재단 (보조금 3565/20 킬코로나 내에서 - 코로나 바이러스 연구 프로그램을 억제), 밀너 기금과 예루살렘히브리어 대학 (시작 기금).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

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생화학 제171 단일 분자 단백질 유발 형광 향상 형광 수명 α-시뉴클레인 적합성 역학 본질적으로 무질서한 단백질
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Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

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