Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Tidsupplöst enmolekyls protein-inducerad fluorescens förbättring är en användbar fluorescens spektroskopisk närhetssensor känslig för lokala strukturella förändringar i proteiner. Här visar vi att den kan användas för att upptäcka stabila lokala konformationer i α-Synuclein, som annars kallas klotformigt ostrukturerad och instabil när den mäts med den längre räckvidden FRET-linjalen.

Abstract

Genom att använda spektroskopiska härskare för att spåra flera konformationer av enstaka biomolekyler och deras dynamik har revolutionerat förståelsen av strukturell dynamik och dess bidrag till biologin. Medan fret-baserade linjalen rapporterar om inter-dye avstånd i 3-10 nm intervallet, andra spektroskopiska tekniker, såsom protein-inducerad fluorescens förbättring (PIFE), rapportera om närheten mellan ett färgämne och en protein yta i det kortare 0-3 nm intervallet. Oavsett vilken metod man väljer, dess användning vid mätning av fritt diffuserande biomolekyler en i taget hämtar histogram av den experimentella parametern som ger separata centralt fördelade underpopulationer av biomolekyler, där varje underpopulation representerar antingen en enda konformation som förblev oförändrad inom millisekunder, eller flera konformationer som interkonverterar mycket snabbare än millisekunder, och därmed en genomsnittlig ut-ut-underpopulation. I enmolekyl fret, där den rapporterade parametern i histogram är inter-dye FRET effektivitet, en intrinsically oordnad protein, såsom α-Synuclein monomer i buffert, rapporterades tidigare som uppvisar en enda genomsnittlig ut-ut underpopulation av flera konformationer interconverting snabbt. Medan dessa tidigare resultat beror på 3-10 nm intervallet av FRET-baserade linjalen, försökte vi sätta detta protein på prov med en-molekyl PIFE, där vi spårar fluorescens livslängden för platsspecifika sCy3-märkta α-Synuclein proteiner en i taget. Intressant nog, med hjälp av denna kortare räckvidd spektroskopisk närhetssensor, sCy3-märkta α-Synuclein uppvisar flera livstidsunderpopulationer med tydligt olika genomsnittliga livslängder som interkonverteras i 10-100 ms. Dessa resultat visar att även om α-Synuclein kan vara oordnad globalt, uppnår det ändå stabila lokala strukturer. Sammanfattningsvis lyfter vi i detta arbete fram fördelen med att använda olika spektroskopiska närhetssensorer som spårar lokala eller globala strukturella förändringar en biomolekyl i taget.

Introduction

Under de senaste två decennierna har fluorescensbaserade metoder med en molekyl blivit ett kraftfullt verktyg för att mäta biomolekyler1,2, som undersöker hur olika biomolekylära parametrar fördelar samt hur de dynamiskt interkonverterar mellan olika underpopulationer av dessa parametrar vid sub millisekundsupplösning3,4,5. Parametrarna i dessa tekniker inkluderar energiöverföringseffektiviteten i FRET-mätningar 6,7, fluorescensanisotropi8,9, fluorescenskvantutbyten ochlivstider 10,11, som en funktion av olika fluorescenssläckning12 eller förbättring13 mekanismer. En av dessa mekanismer, mer känd som proteininducerad fluorescensförbättring (PIFE)14 introducerar förbättringen av fluorescenskvantutbyte och livslängd som en funktion av sterisk obstruktion av fluoroforens fria isomerisering när den är i upphetsad tillstånd, orsakad av proteinytor i närheten av färgämnet14,15,16,17,18,19 . Både FRET och PIFE betraktas som spektroskopiska linjaler eller närhetssensorer eftersom deras uppmätta parameter är direkt kopplad till ett rumsligt mått inom den märkta biomolekylen under mätning. Medan FRET-effektiviteten är relaterad till avståndet mellan ett par färgämnen inom ett intervall av 3-10 nm20,ökar PIFE-spåren i fluorescenskvantutbyten eller livstider relaterade till avståndet mellan färgämnet och en yta av ett närliggande protein i intervallet 0-3 nm19.

Enmolekyliga FRET har använts i stor utsträckning för att ge strukturella insikter i många olika proteinsystem, inklusive inneboende oordnade proteiner (IDPs)21, såsom α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kan bilda beställda strukturer efter bindning till olika biomolekyler och under olika förhållanden23,24,25,26,27,28,29,30. Men när den är obunden kännetecknas α-Syn-monomeren av hög konformations heterogenitet med snabbt interkonverterande konformationer31,32.

Konformationerna av α-Syn har tidigare studerats med hjälp av olika tekniker som hjälper till att identifiera konformationsdynamiken hos sådana mycket heterogena och dynamiska proteinsystem33,34,35,36,37,38,39. Intressant nog rapporterade enstaka molekyl FRET (smFRET) mätningar av α-Syn i buffert en enda FRET-population39,40 som är ett resultat av tidsgenomsättning av konformationer dynamiskt interkonverterande ibland mycket snabbare än den typiska diffusionstiden för α-Syn genom den konfokala punkten (gånger så snabbt som några mikrosekunder och till och med snabbare än så, i förhållande till typiska millisekunds diffusionstider)40, 41. Men med hjälp av en FRET spektroskopisk linjal med 3-10 nm avståndskänslighet rapporterar ibland endast om övergripande strukturella förändringar i ett litet protein som α-Syn. Enmolekylsmätningar med hjälp av spektroskopiska närhetssensorer med kortare avståndskänslighet har potential att rapportera om dynamiken i lokala strukturer. Häri utför vi pife-mätningar med en molekyl av α-Syn och identifierar olika underpopulationer av fluorescenslivslängder som kartlägger olika lokala strukturer med övergångar mellan dem så långsamma som 100 ms. Detta arbete sammanfattar tidsupplösta smPIFE-mätningar av fritt diffuserande α-Syn-molekyler en i taget, i buffert och när den är bunden till SDS-baserade membran som en kortdistans enmolekyls spektroskopisk närhetssensor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid omvandling

  1. Beredning av 0,5 L SOC-medium
    1. Väg 10 g trypton, 2,5 g jästextrakt, 0,25 g natriumklorid (NaCl), 0,1 g kaliumklorid (KCl).
    2. Tillsätt dubbeldestillerat vatten (DDW) tills den totala volymen 0,5 L.
    3. Justera till pH 7 genom att tillsätta natriumhydroxid (NaOH).
    4. Förbered lager aliquots på 100 mL och autoklav.
    5. Tillsätt 0,5 ml steril magnesiumklorid (MgCl2)och 1,8 ml steril glukos till 100 ml SOC innan användning.
  2. Tina BL21 (DE3) kompetenta Escherichia coli-celler på is.
  3. Blanda de behöriga cellerna försiktigt.
  4. Förbered två 15 ml rör. Märk den ena som transformationsreaktionsrör och den andra som kontrollrör.
  5. Alikvot 100 μL kompetenta celler i rören.
  6. Tillsätt 1 μL plasmid i en koncentration av 0,1 ng/μL i omvandlingsreaktionsröret.
  7. Värm SOC-medium i 42 °C vattenbad för användning i steg 1.8.
  8. Värmepuls de två rören i vattenbad på 42 °C under en tid av 45 sekunder. (Kritiskt steg!)
  9. Tillsätt 900 μL uppvärmt SOC-medium till varje rör.
  10. Inkubera rören vid 37 °C under en period av 45 minuter med skakningar med en hastighet av 225 varv/min.
  11. Sprid 200 μL av cellerna med den omvandlade plasmiden på en LB (Luria-Bertani)-agarplatta som innehåller 100 μg/ml ampicillin, med hjälp av en steril cellspridare.
  12. Sprid 200 μL av cellerna med den omvandlade plasmiden på en LB-agarplatta utan ampicillin med hjälp av en steril spridare (positiv kontroll).
  13. Sprid 200 μL av kontrollcellerna (som inte innehåller en plasmid) på en LB-agarplatta som innehåller 100 μg/ml ampicillin med hjälp av en steril spridare(negativ kontroll).
  14. Inkubera plattorna över natten vid 37 °C.

2. Proteinberedning

  1. Rekombinant α-Synuklein uttryck och rening
    1. Välj en enda koloni och odla i 100 ml autoklaverat LB (Luria-Bertani) flytande medium som innehåller 100 μg/ml ampicillin vid 37 °C (starter).
    2. Förbered fyra 2 L Erlenmeyerkolvar, var och en innehållande 1 L autoklaverat LB-medium och 100 μg/ml ampicillin (stor inokulering).
    3. Mät celllösningens optiska densitet (OD vid λ = 600 nm). När startmotorns celltäthet når en ODλ=600nm på 0,6-0,7, tillsätt 10 ml startlösning per varje 1 L LB-medium som bereds i föregående steg.
    4. Odla bakteriemedier i en inkubatorskakapparat vid 37 °C och en hastighet av 200 rpm.
    5. När celltätheten når en ODλ=600nm på 0,6-0,8, inducera proteinuttryck genom att tillsätta isopropyl β-d-1-tiogalactopyranoside (IPTG) per varje 1 L tillväxtmedium till en slutlig koncentration på 1 mM.
      OBS: Lös upp 0,96 g IPTG i 4 ml DDW och tillsätt 1 ml av den resulterande IPTG-lösningen per varje 1 L bakterietillväxt.
    6. Odla cellerna under en varaktighet av 4 timmar och samla dem genom centrifugering i 50 ml-rör med en hastighet av 5 170 x g under en varaktighet av 8 minuter.
      OBS: I varje omgång, kassera supernatanten, behåll pelleten och fyll igen samma rör med bakterietillväxt.
    7. Förvara bakteriepelleten i djupfrysförvaring (t.ex. -80 °C) för nästa dag.
    8. Nästa dag, förbered 200 ml lysbuffert: 40% (w/v) sackaros och buffert A, som inkluderar 30 mM Tris-HCl, 2 mM etylendiamintetraacetic syra (EDTA), 2 mM dithiothreitol (DTT) vid pH 8,0.
    9. Tillsätt 25 ml lysbuffert till varje rör med bakteriell pellet.
    10. Suspendera pelleten (använd sterila pastörpipetter av plast) i Lysisbufferten (se 2.1.8).
    11. Förbered steril 250 ml Erlenmeyerkolv med en omrörarmagnet på is.
    12. Tillsätt 5 ml lysbuffert och överför sedan de homogena om suspenderade cellerna till den.
    13. Rör om cellerna i 20 minuter vid 200 varv/min vid rumstemperatur.
    14. Dela upp lösningen i 50 ml rör och centrifugera vid 4 °C under en period av 30 minuter med en hastighet av 17 400 x g.
    15. Kasta supernatanten.
    16. Förbered steril 250 ml Erlenmeyerkolv med omrörarmagnet på is.
    17. Tillsätt 15 ml upplösningsbuffert (90 ml kyld buffert A och 37 μL MgCl2 upplöst utöver löslighetsgränsen och filtrerad) i varje rör. Använd sterila pastörpipetter av plast och lös upp pelleten.
    18. När en del av lösningen blir homogen, flytta den till en omrörd Erlenmeyerkolv på is.
    19. Bestäm lösningsvolymen i Erlenmeyer.
    20. Tillsätt 10 mg streptomycinsulfat per varje 1 ml lösning (innan du tillsätter, lös streptomycinsulfat i 2 ml buffert A).
      OBS: Detta steg utförs för att ta bort DNA och ribosomer bort.
    21. Rör om lösningen i 10-20 minuter vid rumstemperatur.
    22. Dela upp lösningen i 50 ml rör och centrifugera vid 4 °C och med en hastighet av 20 700 x g under en period av 30 minuter.
    23. Samla supernatanten och kassera pelleten.
    24. Förbered en steril 250 ml Erlenmeyerkolv på is med en omrörare.
    25. Filtrera supernatanten med 0,22 μm sprutafilter i den rena Erlenmeyerkolven.
    26. Bestäm lösningsvolymen och väg 0,3 g ammoniumsulfat per varje 1 ml lösning.
    27. Tillsätt gradvis ammoniumsulfatet till den omrörda lösningen.
      OBS: Detta steg utförs för att fälla ut proteiner. När ammoniumsulfatet binder proteinerna blir lösningen skymd och suddig, vilket visas som vit färg.
    28. Rör om i 30 minuter vid rumstemperatur.
    29. Dela lösningen på 50 ml rör och centrifug vid 4 °C och med en hastighet av 20 700 g under en period av 30 minuter.
    30. Kassera försiktigt supernatanten och behåll pelleten.
    31. Lös upp pelleten med 20 ml buffert A.
    32. Förena alla lösningar i ett rör och mät sedan lösningens UV-absorptionsspektrum.
      OBS: Om spektrumet visar en signatur av aggregering (absorption över en våglängd på 300 nm), fortsätt till nästa steg. Om inte, hoppa över nästa steg och gå till steg 2.1.34.
      OBS: A.I.- (A.I.) beräknat utifrån UV-spektrat som ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Använd 100 kDa cutoff centriprep-rör och centrifugera med en hastighet av 3 590 x g vid 4 °C under en period av 15 minuter. Samla vätskan som passerade genom filtret.
    34. Dialysera lösningen vid 4 °C över natten, mot buffert A, med dialyspåsar med en 3,5 kDa-cutoff.
    35. Utför ytterligare en dialysomgång under minst 4 timmar.
    36. Ladda det dialyserade provet på en 1 mL MonoQ anion exchange kolumn. Använd 30 mM Tris hydroklorid (Tris-HCl) buffert vid pH 7,5 som tvättbuffert och 30 mM Tris-HCl buffert pH 7,5 med 500 mM NaCl som eleuionsbuffert.
    37. Mata in exemplet i kolumnen. Tvätta sedan med 20 kolonnvolymer (CV) av 0% elutionsbuffert och 100% tvättbuffert för att ta bort de obundna proteinerna.
    38. Tvätta med 7 CV:n med 30% elutionsbuffert.
    39. Elute α-Syn proteinprov med en gradient som ändras från 30% till 100% elution buffert för 30 CV, med en flödeshastighet på 1,5 ml/min.
      OBS: α-Syn elutes vid 46-66 CV vid ledningsförmåga 20-24 mS/cm, vilket avser 38-50% elutionsbuffert.
    40. Samla fraktionerna av huvud elutiontoppen. Kontrollera förekomsten av α-Syn genom att köra prover i 15% natrium dodecylsulfatpolyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE), efter färgning med antingen Coomassie Blue eller Fast SeeBand färgning lösning. Ett band på 15 kDa förväntas.
    41. Förena de relevanta fraktionerna och dialysera dem över natten, mot buffert A, med dialyspåsar med en 3,5 kDa-avstängning vid 4 °C.
    42. Förbered alikvoter av proteinprovet och förvara dem vid -20 °C.
  2. Cy3-märkt α-Synuklein
    1. Minska tiaolen i cysteinresterna i α-Syn A56C-mutanten genom att tillsätta DTT till en slutlig koncentration på 2 mM under en period av 1 timme vid rumstemperatur.
    2. Ta bort DTT genom att utföra två dialysomgångar med dialyspåsar på 3,5 kDa. För den första omgången, dialysera mot 30 mM Tris-HCl pH 8,0 och 2 mM EDTA. För den andra omgången, dialyze mot 50 mM HEPES pH 7,2 och 2 mM EDTA.
    3. Minska cysteinresterna genom att tillsätta Tris(2-karboxyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP) till proteinprovet, till en slutlig koncentration av 50 μM under en period av 30 minuter vid rumstemperatur.
      OBS: TCEP är ett icke-sulfhydrylreducerande medel, därför håller det tioolgrupperna reducerade utan att reagera med färgämnet. Vi lade till 0,5 μL från en lagerlösning på 1 M TCEP.
    4. Beräkna de mängder protein som krävs för den slutliga reaktionsvolymen på 1 ml.
      OBS: Här är ett exempel för den beräkning vi använde:
      20 μM slutlig proteinkoncentration × 1 ml slutlig volym = 56 μM initial proteinkoncentration × V-protein som ska tillsättas
    5. Beräkna mängden färgämne som krävs för slutlig reaktionsvolym på 1 ml. Färgmärkning av en enda cystein ska utföras med överskott av färgämne, med ett färgämne:protein molarförhållande på minst 3:1.
      OBS: Ett exempel för den beräkning vi använde:
      60 μM slutlig färgämneskoncentration × 1 ml slutlig volym = 370 μM initial färgämneskoncentration × V-färgämne som ska tillsättas
    6. Beräkna mängden buffert från dialysatet som krävs för att justera den totala reaktionsvolymen till 1 ml.
      OBS: Beräkningsexempel: 1 ml - (V beräknat från steg 2.2.4 + V beräknat från steg 2.2.5)
    7. Förbered reaktionsflaskan med en magnet ovanpå en omrörare.
    8. För det första tillsätt den beräknade mängden protein och buffert. Tillsätt sedan den beräknade mängden färgämne (sulfo-Cy3 maleimid).
    9. Håll reaktionen vid rumstemperatur i mörker i 3-5 timmar.
    10. Avsluta reaktionen genom att lägga till 2 mM DTT och fortsätt i en varaktighet av 1 timme.
    11. Utför tre dialysomgångar mot buffert A med dialyspåsar med en 3,5 kDa-cutoff för att avlägsna överflödigt fritt färgämne från lösningen.
    12. Ladda provet på en kolumn för storleksuteslutning för att ytterligare separera den märkta α-Syn från det fria färgämnet.
    13. Bestäm koncentrationen av renmärkt α-Syn genom att mäta absorptionen av färgämnet (absorptionskoefficienten för sulfo-Cy3 är 162 000 M-1cm-1vid λ=548 nm).
    14. Koncentrera vid behov den rena märkta α-Syn-lösningen med en vakuumkoncentrator (t.ex. SpeedVac). Utför sedan en omgång dialys mot buffert A, använd dialyspåsar med en 3,5 kDa-cutoff och bestäm igen koncentrationen av det märkta proteinet.
    15. Förbered alikvoter av det märkta proteinprovet och förvara dem vid -20 °C.

3. Mätningar

  1. smPIFE experimentell installation
    Obs: Använd följande konfokala konfiguration eller liknande.
    1. Använd en pulsad laserkälla (i vårt fall λ= 532 nm picosekund pulserad laser med pulsbredd på ~ 100 ps FWHM), som arbetar med en lämplig repetitionshastighet (20 MHz i vårt fall) och dirigeras till SYNC av ett tidskorrerat TCSPC-kort (Single Photon Counting), som källa till sulfo-Cy3 (sCy3) excitation.
    2. Använd en dichroisk spegel med hög reflektivitet vid 532 nm, för att separera excitation och spridning från fluorescens.
    3. Använd ett pinhole med 100 μm diameter i fokus för det avgivna ljuset, efter att den kollimerade emissionsstrålen fokuserades av en lins och innan emissionsstrålen har kollimerats av en annan lins.
    4. Använd ett bandpassfilter (585/40 nm i vårt fall) för att ytterligare filtrera sCy3 fluorescens från andra ljuskällor.
    5. Detektera fluorescensen med hjälp av en detektor (enfoton lavindiod eller hybridfotomultiplier, i vårt fall) dirigerad (genom en 4-till-1-router, i vårt fall) till en TCSPC-modul (Becker & Hickl SPC-150, i vårt fall).
      OBS: I vårt fall utförs datainsamling via VistaVision-programvaran (ISSTM)i det tidsmärkta TTTR-filformatet (Time-tagged-time-resolved).
  2. smPIFE provberedning
    1. Förbered 25 pM sCy3-märkt α-Syn i mätbuffert: 10 mM natriumacetat, 10 mM natriumdihydrogenfosfat, 10 mM glycin pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM cysteamin och 1 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboxoxisyra(TROLOX).
      OBS: Om α-Syn mäts i närvaro av SDS-blåsor, lägg till lämplig SDS-mängd också.
    2. Skölj en 18-kammarmikroskopi coverslip slide med 100 μL 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA) under en period av 1 minut och ta sedan bort BSA.
    3. Tillsätt 100 μL av 25 pM sCy3-märkt α-Syn-prov i en kammare i täckslipsrutschbanan.
    4. Utför smPIFE-mätning av exemplet med hjälp av den beskrivna inställningen enligt följande i nästa steg.
  3. smPIFE datainsamling
    1. Använd en objektiv objektiv objektiv för hög numerisk bländare (i vårt fall Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2) och lägg till en droppe ultrarent vatten ovanpå objektivet.
    2. Fäst täckglaset i en scenkammare och montera det ovanpå mikroskopstadiet.
    3. För objektivet uppåt tills vattendroppen ovanpå objektivlinsen smetar i botten av täckglasögon.
    4. Öppna laserluckan och för objektivet uppåt, samtidigt som du inspekterar mönstret på en CMOS-kamera och samlar in ljus som sprids från provet. Observera Airy rings-mönstret: det första representerar fokus vid vattenglasgränssnittet, och sedan representerar det andra fokus vid gränssnittet mellan glaset och provlösningen.
    5. Öka höjden på objektivet med ytterligare 75 μm, vilket ger laserfokus djupt in i lösningen, för att minimera automatisk fluorescens från täckslipets glasyta.
    6. Justera lasereffekten vid objektivet till ~100 μW.
    7. Starta förvärvet av upptäckta fotoner under en fördefinierad tid (2 timmar, i våra mätningar).
      OBS: Majoriteten av förvärvssignalen bör ha en hastighet (mätt i antal per sekund, cps) som liknar den som erhålls vid mätning av bara bufferten. Millisekunds-binned data bör visa knappa foton burst händelser, med majoriteten av facken har en genomsnittlig hastighet som är jämförbar med den typiska detektor bakgrunds hastigheten (<1,000 cps, i vårt fall).

4. smPIFE burst analys

  1. Konvertering av rådata
    OBS: Data lagras vanligtvis i en binär fil med ett format som fördefinierades av företaget som tillverkar TCSPC-kortet (.spc-filer i vårt fall).
    1. Konvertera rådatafilen till foton-HDF5 universellt filformat42, med hjälp av programvarusviten phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Ring rådatafilen som en indata och konvertera till en raw data .hdf5 fil med lämplig kod i phconvert-sviten (Convert ns-ALEX Becker-Hickl filer till Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook, i vårt fall).
      OBS: Konverteringen till en .hdf5-fil omfattar: (1) fastställande av relevanta fotonströmmar i rådata (dvs. fotonströmmar av registrerade fotoner av relevant detektor-ID); (2) Relevanta fotonnanotider (fotondetekteringstiderna i förhållande till excitationssynkroniseringstiden). och (3) lade till metadata.
  2. Burst-sökning och markering med FRETbursts43
    OBS: Alla foton-HDF5-rådatafiler för smPIFE-mätningarna, liksom koden som sammanfattar analysen av rådata, lagras i Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Alla steg nedan är detaljerade och visas i Jupyter-anteckningsböckerna, som också levereras i Zenodo-arkivlänken.
    1. Öppna Jupyter Notebooks (inom Anaconda-ramverket, i vårt fall).
    2. Öppna den bärbara datorn smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Slutlig anteckningsbok).ipynb (den finns i Zenodo-länken).
    3. Ladda FRETbursts.
    4. Ladda foton HDF5-datafilen.
    5. BG-hastighetsbedömning: Med hjälp av histogrammet mellan fotontiderna beräknar du bakgrundshastigheterna (BG) för varje 30 sekunders datainsamling i foton HDF5-datafilen.
      Obs: Följande steg beskriver burst-sökningen med hjälp av skjutfönsteralgoritmen44,45,46.
    6. Flytta ett tidsfönster på m=20 på varandra följande fotoner, en foton i taget.
    7. Samla bara in fotondata om den ögonblickliga fotonhastigheten ( Equation 1 ), är minst F = 11 gånger större än BG-hastigheten för den perioden av datainsamlingen.
      OBS: En burst konstrueras av alla på varandra följande fotoner som samlades in genom att skjuta fönstret en foton i taget (steg 4.2.6.) och hålla med fotonhastighetskriteriet (steg 4.2.7).
    8. Beräkna följande burst-egenskaper:
      Burst storlek: mängden fotoner i en burst.
      Burst-varaktighet: tidsskillnaden mellan den senaste och den första fotondetekteringstiderna i en burst.
      Burst-ljusstyrka: det största värdet av den ögonblickliga fotonhastigheten i en burst.
      Burst-separation: tidsintervallet mellan på varandra följande bursts.
      OBS: Följande punkter beskriver den ytterligare burst-urvalsproceduren.
    9. Rita histogrammet av burst-ljusstyrkevärden (den högsta momentana fotonhastigheten i en burst), med händelsernas axel i logaritmisk skala.
    10. Definiera tröskelvärdet för burst-ljusstyrka som det minimala burst-ljusstyrkan från vilket histogrammet uppvisar ett förfallet mönster.
    11. Välj bursts med ljusstyrka värden som är större än tröskelvärdet för burst-ljusstyrka.
      OBS: Nästa steg beskriver burst betyder fluorescenslivslängder.
    12. Plot histogrammet av fotonnanotider för alla fotoner i alla valda bursts med fotonräkningsaxeln i logaritmisk skala.
    13. Definiera nanotidströskeln som det minimala nanotidsvärdet från vilket histogrammet av fotonnanotider uppvisar ett förfallet mönster.
    14. Välj endast fotoner med nanotider som är större än nanotidströskeln.
    15. Beräkna det algebraiska medelvärdet för alla valda fotonnanotider.
    16. Subtrahera nanotidströskeln från fotonna nanotid algebraiskt medelvärde. Resultatet är den genomsnittliga fotonnanotiden för sprängningen, som är direkt proportionell mot den genomsnittliga fluorescenslivslängden.
    17. Plot histogrammet av alla burst betyder fluorescens livstider. Centralt fördelade underpopulationer av fluorescenslivslängd kan förekomma. Underpopulationer med låga medelvärden representerar molekylarter med sCy3 som inte varsteriskt blockerade, medan delpopulationer med högre värdegenomsnitt representerar molekylarter med sCy3 som var mer steriskt blockerade.
      OBS: Nästa steg beskriver långsam dynamik mellan burst baserat på burst återkommande analys47
    18. Plotta histogrammet av burst separationstider, med separationstidsaxeln i logaritmisk skala.
      OBS: Två underpopulationer av burst-separationstider visas:
      En större delpopulation med separationstider på sekunder, som representerar på varandra följande sprängningar som härrör från olika på varandra följande uppmätta molekyler.
      En mindre delpopulation med separationstider ~<100 ms, som representerar på varandra följande bursts som båda härrör från samma molekyl, återkommer tillbaka genom den konfokala volymen.
    19. Välj om du vill spara alla par på varandra följande bursts som separeras med mindre än en maximal separationstid som definierar underpopulationen med samma molekyl (<100 ms, i vårt fall).
    20. Rita ett histogram eller en spridningsplott av den genomsnittliga fluorescenslivslängden för den första och andra bursts för alla par av bursts som återkommit under en viss separationstidströskel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som en IDP, när den inte är bunden till en annan biomolekyl, uppvisar α-Syn strukturell dynamik mellan flera konformationer, med övergångar vid några mikrosekunder40 och till och med vid hundratals nanosekunder41. När α-Syn korsar den konfokala platsen kan den genomgå tusentals övergångar mellan konformationer. Detta var faktiskt fallet när smFRET användes39,40. Här utför vi smPIFE-mätningar för att undersöka den lokala konformationsdynamiken hos α-Syn.

Mätningen registrerar fluorescensfotoner som avges från ett sulfo-Cy3 (sCy3) färgämne, fäst vid tiaolgruppen av cystein i α-Syn A56C mutant. SCy3 fluorofor kan genomgå isomerization när den är i upphetsad tillstånd. SCy3 avger dock en foton när den avexciterar från sin trans isomer. Därför, om ingenting steriskt hindrar sCy3 upphetsad-tillstånd isomerization, det kommer att avge få fotoner i genomsnitt, men kommer att uppvisa en låg fluorescens kvantutbyte och kort fluorescens livstid. Men om den upphetsade isomeriseringen av sCy3 hindras av till exempel ytan av ett närliggande protein, kommer isomeriseringen att minska, vilket i sin tur kommer att leda till fler av-excitationer från transisomer, och därmed fler fotoner, en högre fluorescenskvantutbyte och längre fluorescenslivslängder. Detta är mer känt som PIFE-effekten.

Med hjälp av smPIFE mätte vi den genomsnittliga fluorescenslivslängden för sCy3-märkning α-Syn vid rester 56 en α-Syn i taget, där sCy3-färgämnet känner av proteinmiljön runt resterna 56. Proteinet mättes med en koncentration av 25 pM, där det huvudsakligen finns som monomer. Resultaten av smPIFE-mätningarna visas som histogram av medelfluorescenslivslängder för enstaka α-Syn-molekyler (figur 1). Den genomsnittliga fluorescenslivslängden kan grupperas i två större delpopulationer (figur 1A). Den första underpopulationen uppvisar korta fluorescenslivslängder, med en karakteristisk fluorescenslivslängd på 1,6 ns, som representerar α-Syn-konformationstillstånd med inga eller få proteinytor som finns i närheten av rester 56. Den andra delpopulationen uppvisar längre fluorescenslivslängder, med en karakteristisk fluorescenslivslängd på 3,5 ns, vilket representerar α-Syn-konformationstillstånd med fler proteinytor som finns i närheten av rester 56.

Det är känt att i närvaro av ~ 5-10 mM SDS antar N-terminal- och NAC-segmenten av nästan alla α-Syn-molekyler i lösning en spiralformad hårnålstruktur vid bindning till SDS-blåsor40. Eftersom rester 56 finns inom NAC-segmentet förväntas fluorescens från sCy3-märkningsrester 56 känna av en ganska enhetlig mikromiljö, eftersom majoriteten av nästan alla α-Syn-molekyler bör förvärva den vesicle-bundna spiralformade hårnålsstrukturen. Därför utförde vi liknande smPIFE mätningar men i närvaro av 5 mM SDS som en kontroll, förväntar sig att identifiera en enda population av fluorescens livstider. Dessa mätningar resulterar i en enda population av fluorescenslivslängder med en karakteristisk fluorescenslivslängd på 3,1 ns (figur 1B). Den karakteristiska fluorescenslivslängden på ~3 ns pekar på en lokal struktur i närheten av rester 56, som inte finns i den ~1,5 ns livstidsunderpopulationen av α-Syn i lösning, med betoning på den strukturering α-Syn genomgår när den spiralformade hårnålen bildas och bindningen till SDS vesikelytan har inträffat. Intressant nog har den enskilda befolkningen en kortare karakteristisk fluorescenslivslängd i förhållande till ~3,5 ns livstidsunderpopulationen av α-Syn i lösning.

Utseendet på två distinkta centralt fördelade underpopulationer av enmolekylssprängningar är en välkänd signatur av molekylär heterogenitet. Eftersom det inte rör sig om någon blandning av separata märkta molekyler representerar båda livstidsunderpopulationerna två separata arter av sCy3-märkningsrester 56 i α-Syn (figur 1A). Därför rapporterar resultaten dynamisk heterogenitet. Detta beror på att parametern som rapporteras i histogrammet beräknas med hjälp av alla fotoner i en burst under de få ms varaktigheten av diffusa α-Syn inuti den konfokala volymen. Därför korsade sCy3-märkta α-Syn-molekyler den konfokala volymen antingen när de uppvisade en kort eller en lång medellivslängd. Övergångarna mellan dessa arter måste ske långsammare än de karakteristiska diffusionstiderna genom den konfokala fläcken, därav långsammare än några millisekunder. För att bedöma detta dynamiska beteende utförde vi burst-recurrence analys47. Kort sagt, eftersom vi försöker bedöma dynamik som uppstår ibland längre än varaktigheten av en enda molekyl burst, testade vi möjligheten att en enda α-Syn-molekyl uppvisar en förändring i sCy3 genomsnittlig fluorescenslivslängd mellan på varandra följande korsningar av den konfokala fläcken. För att göra det skiljer vi först mellan två typer av på varandra följande bursts: i) på varandra följande bursts av olika α-Syn-molekyler med burst-separationstider som distribueras i sekunder, och ii) på varandra följande bursts av samma α-Syn-molekyl som återkommer i den konfokala volymen efter en burst-separationstid, ibland så långsamt som ~ 100 ms (Figur 2A). Efter de två genomsnittliga livstidsunderpopulationerna valde vi att inspektera par av på varandra följande skurar som är åtskilda med högst 100 ms (figur 2A), där den första av de två skurarna uppvisade genomsnittlig fluorescenslivslängd inom den korta livstidsunderpopulationen (0-2 ns) eller inom den långa livstidsunderpopulationen (>3,5 ns; Bild 2B, färgade nyanser). Inspektionstesterna som av utbrotten av återkommande sprängningar, representerade av den andra sprängningen i paret av på varandra följande skurar, uppvisar genomsnittlig fluorescenslivslängd inom livstidsunderpopulationen motsatt den i den första sprängningen. Man kan konstatera att en bråkdel av molekyler som börjar som en bristning under den korta livstidsunderpopulationen återkommer som en bristning utanför det intervallet och till och med inom den långa livstidssubpopulationen (figur 2C), och att en bråkdel av molekyler som börjar som en bristning i den långa livstidsunderpopulationen återkommer som en bristning utanför det intervallet och även inom den korta livstidssubpopulationen (figur 2D), allt inom 10-100 ms.

Figure 1
Figur 1: Genomsnittliga fluorescenslivslängdsunderpopulationer av sCy3-märkningsrester 56 i α-Syn A56C. medelvärdet av fluorescenslängds histogram av fritt diffuserande sCy3-märkt α-Syn A56C (vid 25 pM) i frånvaro (A) och närvaro (B) på 5 mM SDS. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: PIFE burst återkommande analys visar enskilda molekyler genomgår övergångar mellan olika genomsnittliga livstidsvärden inom 100 ms. Uppifrån och ned: (A) histogrammet av separationstider mellan på varandra följande enmolekylssprängningar. Den orange nyansen representerar separationstider mellan på varandra följande utbrott av återkommande molekyler, där den första och andra bursts uppstår från samma molekyl. (B) Det genomsnittliga fluorescenslivslängds histogrammet för alla enmolekylssprängningar. De gula och gröna nyanserna representerar det intervall av genomsnittliga livstidsvärden som valts för att representera värden inom korta respektive långa genomsnittliga livstidsunderpopulationer. c)ellerD). Medelvärdet fluorescens livstid histogram av sprängningar som separerades från en tidigare burst av en tid inom den orange-skuggade tidsskalan (i A), och där den tidigare burst hade en genomsnittlig livslängd inom intervallet representeras av de gula eller gröna nyanserna, respektive. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omfattande biokemiska och biofysiska studier utfördes för att studera de strukturella egenskaperna hos α-Syn och dess oordnade natur33,34,35,36,37,38. Flera verk har redan använt fritt diffuserande smFRET för att undersöka den intramolekylära dynamiken hos α-Syn-monomer fri från bindning. Dessa arbeten rapporterade den höga dynamiska heterogeniteten hos α-Syn, vilket leder till medelvärde av flera olika strukturella arter inom de typiska diffusionstiderna genom den konfokala punkten, vilket leder till utseendet på en enda FRET-population39,40. Man måste dock komma ihåg att smFRET-mätningar rapporterar om förändringar i inter-dye avstånd som förekommer inom 3-10 nm, en skala som kännetecknar övergripande strukturella förändringar i ett litet protein som α-Syn.

Vi var nyfikna på vilka resultat vi skulle kunna hitta när vi använder en annan fluorescensbaserad sensor av rumsliga förändringar inom ett protein som är känsligt för lokal strukturell dynamik och som har använts även på enmolekylnivå. smPIFE kan spåra lokala rumsliga förändringar i närheten av sCy3 som märker en specifik aminosyrarester i intervallet 0-3 nm.

I denna studie använde vi smPIFE för att undersöka dynamiken i lokala strukturer inom α-Syn och mer specifikt lokala strukturförändringar i närheten av NAC-resterna 56. Resultaten tyder på att regionen i närheten av rester 56 i α-Syn uppvisar några distinkta strukturella underpopulationer som är tillräckligt stabila termodynamiskt för att interkonvertera in så långsamt som 100 ms, och kanske ännu långsammare. Dessa subpopulationer identifieras genom inspektion av medelfluorescenslivslängderna för uppmätta sCy3-märkta single α-Syn-molekyler. I dessa subpopulationer, ju längre den karakteristiska fluorescenslivslängden för underpopulationen är, desto mer närliggande hindrar en proteinyta den upphetsade isomeriseringen av sCy3, och därmed ju närmare proteinytan är till den sCy3-märkta resten.

Liksom andra internflyktingar har α-Syn rapporterats ha interaktioner med andra biomolekyler, liksom självassociering, där dessa bindande händelser i många fall innebär stabilisering av en specifik struktur inom α-Syn-underenheten56,57,58,59. Vissa proteiner förvärvar en specifik struktur vid bindning, via en inducerad passformsmekanism. Andra proteiner interkonverterar dock spontant mellan flera distinkta konformationer och bindningshändelsen till en specifik biomolekyl stabiliserar bara en av de befintliga konformationerna. För det senare fallet är ett av kraven att konformationen som ska stabiliseras kommer att överleva tillräckligt länge för att rymma den ursprungliga bindningen. Därför, ju längre en strukturell region i ett protein överlever, desto högre blir bindningseffektiviteten. Vi föreslår att de observerade millisekund-stabila underpopulationer representerar förekomsten av distinkta arter av lokal struktur i närheten av rester 56. Dessa pekar på olika lokala strukturarter i närheten av NAC- och NTD-segmenten. I ett nytt arbete rapporterar vi detta och andra sCy3-märkta rester i dessa segment uppvisar också sådana underpopulationer60. Detta resultat visar att den strukturella dynamiken hos den fria α-Syn-monomer bäst kan beskrivas som snabb (några mikrosekunder som mest40) övergripande proteindynamik, med lokala strukturella segment som förblir stabila i millisekunder. Andra IDPs som Tau och amyloid-β var kända för att dela liknande egenskaper av att bära en lokal strukturerad region48,49,50.

smPIFE har främst använts för att studera interaktionerna mellan separata biomolekyler. Här använder vi smPIFE för att undersöka PIFE inom segment av samma protein. Det är viktigt att nämna att majoriteten av tidigare smPIFE-experiment utfördes genom att spåra relativa förändringar i fluorescensintensiteter av enstaka immobiliserade sCy3-märkta molekyler13,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Även om det är användbart för immobiliserade molekyler, är denna procedur mindre informativ när man mäter fritt diffuserande enmolekyler. har visat hur man mäter PIFE-effekten också genom att spåra förändringar i fluorescenslivslängder, som rapporterar direkt om förändringen i den upphetsade isomeriseringsdynamiken hos sCy319. Här undersöker vi PIFE-effekten av enkel diffusering α-Syn via sCy3-medelfluorescenslivslängderna, snarare än att spåra relativa förändringar i fluorescensintensiteter. På så sätt kunde vi förvärva PIFE-relaterade delpopulationer trots den korta uppehållstiden för varje enskild α-Syn-molekyl på den konfokala platsen. Faktum är att den genomsnittliga fluorescenslivslängden visade sig vara användbar inte bara för att definiera PIFE-relaterade underpopulationer, utan också vid bedömning av långsam PIFE-relaterad dynamik med hjälp av ramverket för analys av burst-upprepningar47. Det krävs dock mer arbete för att utveckla förfaranden som gör det möjligt att korrekt bedöma snabbare PIFE-dynamik. Det finns gott om befintliga fotonstatistikverktyg, som används för att bedöma snabb FRET-dynamik i fritt diffusa smFRET-experiment, som vi avser att återanvända för att användas i smPIFE54,55.

Sammanfattningsvis använde vi i detta arbete den relativt nya kombinationen av PIFE-mätningar av fritt diffuserande enskilda molekyler för att identifiera ms-stabila delpopulationer av lokala strukturer i α-Syn, som inte återfanns av smFRET. Vi använde smPIFE-mätningar för att studera α-Syn som modell IDP och våra resultat sträcker sig bortom tidigare resultat av α-Syn är globalt oordnad. Resultaten tyder på α-Syn kan bära ms-stabil beställda lokala strukturer och vi t ställa hypotesen att dessa lokala strukturer kan tjäna en roll i bindande erkännande.

Hittills användes smPIFE som medel för att studera interaktioner mellan sCy3-märkta nukleinsyror med deras omärkta proteinmotsvarigheter51. Genom det användes smPIFE som ett kraftfullt verktyg för att känna av biomolekylära interaktioner, och därmed skulle det naturliga nästa steget i den riktningen vara att använda det för att känna av protein-proteininteraktioner och deras dynamik, ett komplex i taget.

Kraften i att använda en kortdistans närhetssensor som smPIFE kan hjälpa till att identifiera stabil lokal strukturering inom andra proteinsystem som anses oordnade och strukturellt instabila. Kraften i att använda en fluorescensbaserad kort närhetssensor med en molekyl stannar dock inte där. Det finns många biomolekylära system som uppvisar kortskala konformationsdynamik för att underlätta deras funktion, till exempel många jonkanaler. Vi tror att smPIFE kan fungera som ett verktyg som komplement till enmolekylig FRET, i sådana fall där det dynamiska området för närhetsförändringar inom proteinsystemet inte matchar det dynamiska avståndet som FRET kan upptäcka och lösa. Sammanfattningsvis främjar vi användningen av smPIFE som en närhetssensor som kompletterar enmolekyliga FRET-mätningar, för att täcka en bredare skala av biomolekylära närhet, och kanske observerar tydliga millisekundgenomsnitt av de uppmätta parametrarna som rapporterar om stabila strukturer som är antingen lokala eller övergripande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare delar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

PT-t7 plasmid kodning A56C α-Syn mutant gavs till oss som en present från Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir och Dr. Elisha Haas. Detta dokument stöddes av National Institutes of Health (NIH, anslag R01 GM130942 till E.L. som subaward), Israel Science Foundation (anslag 3565/20 inom KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fund och Hebrew University of Jerusalem (startup funds).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Biokemi nummer 171 Enmolekylär proteininducerad fluorescensförbättring fluorescenslivslängder α-synuklein konformationer dynamik i sig oordnat protein
Använda tidsupplöst proteininducerad fluorescensförbättring för att identifiera stabila lokala konformationer en α-synukleinmonomer i taget
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter