Summary
Makropinositoz, membran fırfırları olarak da bilinen F-aktin bakımından zengin tabaka benzeri membran projeksiyonlarının oluşumu ile başlatılan oldukça korunmuş bir endositik işlemdir. Makropinositotik solut içselleştirme oranının artması çeşitli patolojik durumlarda rol oynamıştır. Bu protokol, taramalı elektron mikroskobu kullanarak membran fırfırı oluşumunu in vitro olarak ölçmek için bir yöntem sunar.
Abstract
Membran karıştırma, yeni polimerize aktin filamentlerinin bir ağını içeren hareketli plazma membran çıkıntılarının oluşumudur. Membran fırfırları kendiliğinden veya büyüme faktörlerine, inflamatuar sitokinlere ve forbol esterlerine yanıt olarak oluşabilir. Membran çıkıntılarının bazıları, distal kenarlarında kaynaşan dairesel membran fırfırları halinde yeniden organize olabilir ve makropinozomlar adı verilen büyük, heterojen vakuoller olarak sitoplazmaya kapanan ve ayrılan kaplar oluşturabilir. İşlem sırasında, fırfırlar hücre dışı sıvıyı ve makropinozomlar içinde içselleşen çözünürleri yakalar. Yüksek çözünürlüklü taramalı elektron mikroskobu (SEM), hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve kapalı makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Aşağıdaki protokol, hücre kültürü koşullarını, membran fırfırı oluşumunun in vitro olarak uyarılmasını ve SEM kullanarak görüntüleme için hücrelerin nasıl düzeltileceğini, dehidre edileceğini ve hazırlanacağını açıklamaktadır. membran karıştırmanın miktarı, veri normalizasyonu ve membran fırfırı oluşumunun uyarıcıları ve inhibitörleri de açıklanmaktadır. Bu yöntem, makropinositozun fizyolojik ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkındaki temel soruları cevaplamaya, membran fırfırı oluşumunu düzenleyen yeni hedefleri araştırmaya ve henüz tanımlanmamış fizyolojik stimülatörlerin yanı sıra makropinositozun yeni farmakolojik inhibitörlerini tanımlamaya yardımcı olabilir.
Introduction
Makrokinositoz, membran fırfırları1 adı verilen dinamik ve aktin güdümlü plazma membran çıkıntılarının oluşumu yoluyla büyük miktarda hücre dışı sıvının ve içeriğinin içselleştirilmesinden sorumlu endositik bir işlemdir. Bu zar fırfırlarının çoğu, hücreye kapanan ve tekrar kaynaşan ve plazma zarından makropinozomlar 1 olarak da bilinen büyük, heterojen hücre içi endozomlarolarak ayrılan bardaklar oluşturur. Makropinositoz, çok çeşitli hücre tiplerinde makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) ve epidermal büyüme faktörü (EGF) gibi büyüme faktörleri tarafından indüklenmesine rağmen, doğuştan gelen immün hücrelerde 2,3,4,5,6,7,8 olarak bilinen ek bir benzersiz, kalsiyum bağımlı süreç de gözlenmiştir.
Hücrelerin makropinositoz yoluyla hücre dışı materyali içselleştirme yeteneğinin, besin alımından patojen yakalamaya ve antijen sunumuna kadar çeşitli fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir 9,10,11. Bununla birlikte, bu süreç seçici olmadığı ve indüklenebilir olduğu için, bir dizi patolojik duruma da dahil olmuştur. Nitekim, önceki çalışmalar makropinositozun Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, kanser, nefrolitiyazis ve aterosklerozda önemli bir rol oynadığını ileri sürmüştür 12,13,14,15,16. Ayrıca, bazı bakteri ve virüslerin konakçı hücrelere girmek ve enfeksiyonu indüklemek için makropinositozu kullandıkları gösterilmiştir17,18. İlginçtir ki, makropinositozun uyarılması, çeşitli hastalık koşullarında terapötik ajanların hedefe yönelik olarak verilmesi için dekullanılabilir19,20.
Önceki çalışmalar, makropinositozu inhibe eden farmakolojik ajanların yokluğunda ve varlığında ekstraktüre floresan etiketli sıvı faz belirteçlerini primer primer ve konfokal görüntüleme kullanarak nicelleştirerek makropinositozu araştırmıştır21,22. Makropinositozu inhibe eden mevcut farmakolojik araçlar, 1) aktin polimerizasyon inhibitörleri (sitokalasin D ve latrunkülinler), 2) PI3K blokerleri (LY-290042 ve wortmannin) ve 3) sodyum hidrojen eşanjörlerinin (NHE) (amilorid ve EIPA) inhibitörleri ile sınırlıdır ve bunlardan oluşur 5,14,15,23,24,25 . Ancak bu inhibitörlerin endositozdan bağımsız etkileri olduğu için makropinositozun özellikle in vivo21 olmak üzere solute alım ve hastalık patogenezine katkısını seçici olarak belirlemek zordur.
Taramalı elektron mikroskobu (SEM), odaklanmış bir elektron demeti kullanarak hücrelerin ultra yüksek çözünürlüklü görüntülerini üreten bir elektron mikroskobu türüdür26. Makropinositoz araştırmalarında, SEM görüntüleme, plazma zarının topografik ve morfolojik özelliklerini görselleştirmek, membran fırfırı oluşumunu ölçmek ve makropinozom içselleştirmeye doğru ilerlemelerini araştırmak için altın standart teknik olarak kabul edilmektedir. Ayrıca, taramalı elektron mikroskobu, makropinositoz blokerlerinin varlığında ve yokluğunda, çözünen alımının nicelleştirilmesi ile birlikte, makropinositotik çözünen içselleştirmeyi in vitro olarak incelemek için güvenilir bir strateji sağlar. Bu yazıda, hücrelerin SEM için nasıl hazırlanacağı, hücre yüzeyinin görselleştirileceği, fırfırlı oluşumunun nasıl ölçüleceği ve fincan kapanışı ve makropinozom içselleştirme yönündeki ilerlemelerinin nasıl inceleneceği konusunda ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Aşağıdakiler, SEM mikroskobu kullanılarak RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu ölçmek için kullanılan genel bir protokoldür. Farklı hücre tipleri için optimizasyon gerekebilir.
1. Hücre hattı ve hücre kültürü
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 (hacim/hacim) ısıyla inaktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 IU/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş RAW 264.7 makrofajlarını nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 °C'de ve %5 CO2'de büyütün. Büyüme medyasını her geçen gün değiştirin.
- Hücreler% 80 birleştiğinde, steril PBS kullanarak plakayı iki kez yıkayın.
- 1.000 μL% 0.5 tripsin-EDTA ekleyerek hücreleri ayırın ve hücre kültürü plakasını 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
- Hücre ayrışmasını doğrulamak için plakayı bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Tripsini etkisiz hale getirmek için %10 FBS içeren 10 mL büyüme ortamı ekleyin.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüp içinde toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj yapın. Tüm hücre kültürü ortamındaki hücreleri nazikçe askıya alın ve Trypan Blue (% 0.4) boyamasını kullanarak hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
NOT: Bu deney için önerilen minimum hücre canlılığı %>90'dır. - Steril cam kapakları, otoklavlanmış forseps kullanarak 24 delikli bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin. Tohum hücreleri, 1 x 106 hücre / mL yoğunlukta kapaklar üzerine kayar ve plakayı 37 ° C'de ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca inkübe eder.
- İşlemden önce her bir kuyucuğun ortamını taze 500 μL tam medya ile değiştirin. Makrofajlara araç (DMSO veya EIPA'yı çözmek için kullanılan diğer çözücüler) veya makropinositoz inhibitörü 5-(N-etil-N-izopropil)-Amilorid (EIPA, 25 μM21) ile 30 dakika boyunca ön işlem yapın.
- Membran karışıklığını teşvik etmek için hücreleri makropinositoz aracı ve uyarıcıları ile tedavi edin: forbol 12-miristat 13-asetat (PMA, 1 μM, 30 dakika21) ve makrofaj kolonisi uyarıcı faktör (M-CSF, 100 ng / mL, 30 dakika3).
NOT: Makropinositozun alternatif inhibitörleri [örneğin, latrunkülin A (1 μM, 30 dakika) veya sitokalasin D (1 μM, 30 dakika)] ve uyarıcılar [örneğin, epidermal büyüme faktörü (EGF, 100 ng / mL, 10 dakika) veya trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF, 100 ng / mL, 15 dakika)] makropinositozu karakterize etmek için de kullanılabilir16,27, 28,29. Hücreler, makropinositozun fizyolojik uyarıcıları ile tedaviden önce gece boyunca serum açlığı gerektirebilir. Diğer hücre tiplerinde makropinositozu uyarmak için en etkili konsantrasyonların ve kuluçka sürelerinin belirlenmesi gerektiğine dikkat etmek önemlidir.
2. SEM sabitleme
- Tedaviden sonra, ortamı kuyulardan aspire edin ve kapakları buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücreleri (0.1 M sodyum kakodilat içinde% 4 paraformaldehit ve% 2 glutaraldehit) sabitleyin, ardından 4 ° C'de fiksatif içinde gece boyunca inkübasyon.
- Hücre tek tabakasını bozmadan kapak kapaklarını 500 μL aşağıdaki reaktiflerle nazikçe yıkayın ve inkübe edin.
- 0.1 M sodyum kakodilatta bir kez yıkayın ve 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla dH2O ile iki kez yıkayın.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 25 etanol ile iki kez yıkayın.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 50 etanol ile iki kez yıkayın.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 75 etanol ile iki kez yıkayın.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 80 etanol ile iki kez yıkayın.
- Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyonla% 95 etanol ile iki kez yıkayın.
- % 100 etanol ile iki kez yıkayın. Her yıkamada 10 dakikalık inkübasyon yapın.
NOT: Reaktiflerin değiştirilmesi/değiştirilmesi, hücrelerin hava ile kurumasını önlemek için hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Kapaklar 4 °C'de birkaç gün boyunca% 100 etanol içinde bırakılabilir. Uzun süreli depolama için, ilave %100 etanol ekleyin ve numunenin havayla kurumasını önlemek için kuyuları parafilm ile örtün.
3. Kritik nokta kurutma
- Kapak fişlerini Kritik Nokta Kurutucuya yerleştirin ve% 100 etanol ile örtün. Güç düğmesine basın ve CO2 tankını açın.
- Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine yaklaşık 30 s basın. Bölme penceresinde bir kabarcık görünene kadar Doldur düğmesine basın.
- Temizleme egzozundan gelen etanol kokusu kaybolana kadar Temizle düğmesine basın. Sıcaklık 0 °C'ye düşene kadar Serin düğmesine tekrar basın.
- Doldurmak ve Temizle düğmelerini kapatmak ve CO2 deposunu kapatmak için düğmesine basın. Kapatmak için Soğut düğmesine basın ve Isı düğmesine basın.
- Sıcaklığı 42 °C'ye ve basıncı 1.200 psi'ye ayarlayın. Basınç ve sıcaklık dengelendikten sonra, basıncın yavaşça düşmesine izin vermek için Boşaltma düğmesine basın.
- Oda basıncı 150 psi'ye ulaştığında, Havalandırma düğmesine basın ve basınç 0 psi'ye düşene kadar bekleyin. Kritik nokta kurutucuyu kapatın ve kapak kapaklarını çıkarın.
- Karbon Yapışkan tırnaklar kullanılarak SEM alüminyum numune montajları üzerine montaj kapakları kayar ve bir püskürtme kaplayıcısında altın/paladyum kullanılarak püskürtme kaplamasına tabi tutulur.
- Güç düğmesini açın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Gaz anahtarını kapatıp Fine gaz valfini saat yönünün tersine çevirerek nemi ve havayı gidermek için odayı yıkayın.
- Vakum 200 mTorr'a yükseldiğinde gaz anahtarını kapatın ve vakum 30 mTorr'a ulaşana kadar bekleyin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Zamanlayıcı düğmesine basın ve gösterge 10 mA okuyana kadar Voltaj düğmesini ayarlayın. Kaplamalı kapak kapaklarını odadan çıkarın.
NOT: Numunenin kritik nokta kurutma ve püskürtme kaplamasını gerçekleştirmek için üreticinin talimatlarına uyun.
4. Görüntüleme ve niceleme
- Numune kapaklarını taramalı elektron mikroskobunun odasına yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Evac düğmesine basın.
- SEM işletim yazılımını açın. Hızlanan voltajı 15 kv'ye ve çalışma mesafesini 10 mm'ye ayarlayın.
- Koordinatlar düğmesine basın ve hücreler gözlem ekranının ortasında görünene kadar kontrol cihazının etrafında hareket edin. Büyütmeyi 3.500x olarak ayarlayın ve Fotoğraf düğmesini tıklatarak örneği görüntüleyin.
NOT: Plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek bir büyütme düzeyi (8.500x ila 16.000x) kullanın. - Kapak fişlerinde en az 10 rastgele konumdan görüntü çekerek her mikroskobik alanın birden fazla hücre içerdiğinden emin olun. Görüntüleri .tif dosyaları olarak kaydedin.
- Görüntülerden, plazma zarının çıkıntılı battaniye benzeri kıvrımları olarak tanımlanan, 500 nm'den büyük bir boyuta sahip membran fırfırlarını bulun (Şekil 1). Hücre başına fırfırlı sayısını sayın.
NOT: C-şekilli fırfırlar, lateral uçlarında kaynaşmayan kavisli membran çıkıntıları olarak tanımlanmıştır [(Şekil 1 (M-BOS tedavisi) ve Şekil 2B]. Kaynaşmış dairesel membran fırfırları, kapanmadan önce, makropinositotik kaplar olarak tanımlandı (Şekil 2C). - Membran fırfırlarının sayısını, değerlendirilen mikroskobik alandaki toplam hücre sayısına normalleştirin. Her gruptan örnekler için bu analizi tekrarlayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada, sunulan teknikten elde edilen sonuçları açıklıyoruz. Şekil 1'de gösterilen temsili SEM görüntüleri, PMA ve M-CSF ile tedaviyi takiben RAW 264.7 makrofajlarında membran fırfırı oluşumunu göstermektedir. Görüntüler ilk önce nicelleştirme amacıyla 3.500x'lik bir büyütmede ve daha sonra plazma zarını daha ayrıntılı olarak göstermek için daha yüksek büyütme seviyelerinde (8.500x ila 16.000x) yakalandı. Makrofajların makropinositoz inhibitörü EIPA ile ön tedavisi membran fırfırı oluşumunu zayıflattı (Şekil 1). Makronositozla ilişkili plazma membran aktiviteleri ardışık beş adıma ayrılabilir: 1) membran fırfırlamasının başlatılması, 2) daireselleşme, 3) fincan oluşumu, 4) fincan kapatılması ve 5) makropinozom oluşumu yoluyla hücre dışı sıvının ve ilişkili çözünenlerin içselleştirilmesi. Şekil 2, M-CSF stimülasyonunu takiben bu morfolojik olarak farklı plazma membran aktivitelerinin temsili görüntülerini göstermektedir. Büyük tabaka benzeri fırfırlar (Şekil 2A), dairesel C şeklindeki fırfırlar (Şekil 2B) ve makropinositik kaplar (Şekil 2C) 6.000x ila 7.000x büyütmede yakalandı. Taramalı elektron mikroskobu, hücre yüzeyinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamak için kullanılabilir, ancak içselleştirilmiş makropinozomları görselleştirmek için kullanılamaz. PMA ve M-CSF tedavisini takiben membran fırfırlarının miktarının belirlenmesi Şekil 3'te gösterilmiştir. Makropinozom oluşumu, Şekil 4'te gösterildiği gibi konfokal mikroskopi de dahil olmak üzere alternatif görüntüleme teknikleri ile doğrulanabilir. Son olarak, membran karıştırmanın SEM miktarı, makropinositozun uyarılmasını doğrulamak için bir floresan sıvı faz belirtecinin (örneğin, FITC- veya Texas kırmızı-dekstran) akış sitometrisi nicelleştirmesi ile tamamlanmalıdır (Şekil 5).
Resim 1: RAW 264.7 makrofajlarının elektron mikroskobu görüntülerinin taranması. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve membran karıştırmasını uyarmak için PMA (1 μM, 30 dakika) veya M-CSF (100 ng / mL, 30 dakika) ile inkübe edildi. Sağdaki görüntüler hücre yüzeyinin daha yüksek büyütülmesini göstermektedir. Kırmızı oklar: membran fırfırlar. Yeşil ok: c şeklindeki fırfır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Taramalı elektron mikroskobu ile yakalanan makropinositozun morfolojik evreleri. RAW 264.7 makrofajlar 30 dakika boyunca M-CSF (100 ng / mL) ile tedavi edildi ve SEM görüntüleme için hücreler işlendi. (A ) tabaka benzeri membran çıkıntısı, ( B ) C şekilli membran fırfırı ve (C) makropinositik kap. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Membran fırfırı oluşumunun miktarının belirlenmesi. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve membran karıştırmasını uyarmak için PMA (1 μM, 30 dakika) veya M-CSF (100 ng / mL, 30 dakika) ile inkübe edildi. Çubuk grafik, toplam hücre sayısına normalleştirilmiş membran fırfırlarının sayısını gösterir (n = 3). Veriler SEM'± ortalamasını temsil etmektedir. *p < araca karşı 0,05, PMA veya M-CSF tedavisine karşı 0,05 < #p. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: Makropinozom oluşumu. Hücreler 30 dakika boyunca PMA ile ön işlemden geçirildi ve 10 dakika boyunca Texas kırmızı-dekstran (25 μg / mL, kırmızı) ve FM4-64 (5 μg / mL, yeşil) ile inkübe edildi. Görüntüleme konfokal mikroskop kullanılarak yapıldı. Mavi oklar: zar karıştırma, sarı oklar: Teksas kırmızı-dekstran içeren makropinozom, yeşil oklar: makropinozomlar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Makropinositozun miktarı. RAW 264.7 makrofajları 30 dakika boyunca araç (DMSO kontrolü) veya EIPA (25 μM) ile ön işlemden geçirildi ve 2 saat boyunca PMA (1 μM) ve FITC-dextran (100 μg / mL; 70.000 MW) ile inkübe edildi. Çubuk grafik, araç tedavisine normalleştirilmiş ortalama floresan yoğunluğu (MFI) katlama değişimini gösterir (n = 3, üçlü olarak gerçekleştirilir). Veriler SEM'± ortalamasını temsil etmektedir. *p < araca karşı 0,05, #p < 0,05 ile PMA. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut SEM görüntüleme protokolü, in vitro hücre yüzeyindeki membran fırfırı oluşumunu, dairesel çıkıntıları ve makropinositik kapları görselleştirmek ve ölçmek için bir araç sağlar. Mevcut protokol makrofajlara odaklanmasına rağmen, çalışmalar membran fırfırı oluşumunun dendritik hücreler, fibroblastlar, nöronlar ve kanser hücreleri 11,12,14,21,30 dahil olmak üzere diğer çeşitli hücre tiplerinde de meydana geldiğini göstermiştir. Bu göz önüne alındığında, hücre kültürü koşullarının optimizasyonu ve diğer hücre tiplerinde membran fırfırlarının görselleştirilmesi için farklı uyarıcıların veya tedavi koşullarının kullanılması gerekebilir.
Numune hazırlama için bir miktar boşluk olmasına rağmen, hücre yüzey mimarisini korumak için dehidrasyon ve kritik nokta kurutma adımları tam olarak izlenmelidir. Ek olarak, suyun veya etanol gibi diğer çözücülerin varlığı, SEM görüntüleme için gerekli olan vakumu bozar ve bu nedenle, numune morfolojisini sağlam tutmak için kontrollü bir şekilde çıkarılması gerekir14.
Elektron mikroskopları, aydınlatma kaynağı olarak hızlandırılmış elektron demeti kullanır. İlk elektron mikroskopları, dalga boyu ışık mikroskoplarında sınırlayıcı faktör haline geldiğinde geliştirilmiştir31. Elektronlar çok daha kısa dalga boylarına sahiptir, bu nedenle elektron mikroskopları ışık mikroskoplarından daha yüksek bir çözme gücüne sahiptir ve yüksek çözünürlüklü görüntüler sağlamak ve çok çeşitli biyolojik örneklerin ultrayapısını araştırmak için kullanılabilir. Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, SEM'in, membran fırfırlarının görselleştirilmesine, makropinositik kaplara geçişlerine ve makropinozomların oluşumuna izin verecek floresan canlı hücre görüntülemesinin aksine, plazma zarı morfolojisinin sadece bir anlık görüntüsünü sağlaması gerçeğinin etrafında dönmektedir. Canlı hücre görüntüleme, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve floresan dekstran alım testleri, makropinositoz, makropinozom translokasyonu ve olgunlaşması ve makropinositozu düzenleyen hücre içi sinyal mekanizmaları yoluyla floresan solutların içselleştirilmesini araştırmak için kullanılabilir. SEM, örtü kapaklarına sabitlenmeyi gerektirdiğinden, hücrenin sadece dorsal tarafı ve periferik bölgesi görselleştirilebilir, bu da bu tekniğin bir başka sınırlamasıdır.
Bazen makropinositozdan bağımsız membran çıkıntısı oluşumu ile makropinositik membran karışıklığı arasında ayrım yapmanın zor olduğunu da eklemek isteriz. Çıkıntının kenarındaki herhangi iki nokta arasında en az 0,5 μm minimum mesafeye sahip membran fırfırlarını tanımlayarak nicelleştirmemizi standartlaştırdık. Hücre başına membran fırfırlarının sayısı oldukça değişkendir ve uyarıcı, konsantrasyonu, kuluçka süresi ve hücre tipi32 dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır. PMA ve M-CSF ile, çoklu membran fırfırlarına sahip hücreler gördük, ancak niceliksel verilerimizi daha iyi temsil eden temsili görüntüler seçtik (hücre başına 1-2 fırfır). SEM, plazma membranının topografik ve morfolojik özelliklerini in vitro olarak değerlendirmek için altın standart teknik olmaya devam etmektedir. Bu yöntemin canlı hücre görüntüleme ve çözünen içselleştirmenin akım sitometri analizi ile kombinasyonu, çeşitli hücre tiplerinde makropinositozu analiz etmek için güvenilir bir strateji sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar, SEM örnek hazırlığındaki yardımları için Libby Perry'ye (Augusta Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01HL139562 (G.C.) ve K99HL146954 (BS)] ve Amerikan Kalp Derneği [17POST33661254 (BS)] tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
