Summary
Makropinocytose er en svært konservert endokytisk prosess initiert av dannelsen av F-aktinrike arklignende membranprojeksjoner, også kjent som membran ruffles. Økt grad av makropinocytotisk solute internalisering har vært involvert i ulike patologiske forhold. Denne protokollen presenterer en metode for å kvantifisere membran ruffle formasjon in vitro ved hjelp av skanning elektronmikroskopi.
Abstract
Membran ruffling er dannelsen av motile plasmamembran fremspring som inneholder et nettingverk av nylig polymeriserte aktinfilamenter. Membran ruffles kan dannes spontant eller som svar på vekstfaktorer, inflammatoriske cytokiner og phorbol estere. Noen av membranutstikkene kan omorganisere seg til sirkulære membran ruffles som smelter sammen ved deres distale marginer og danner kopper som lukker og skiller seg inn i cytoplasmaet som store, heterogene vakuoler kalt makropinosomer. Under prosessen fanger ruffles ekstracellulær væske og løsemidler som internaliserer i makropinosomer. Høyoppløselig skanning elektronmikroskopi (SEM) er en vanlig brukt bildeteknikk for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring og lukkede makropinocytiske kopper på celleoverflaten. Følgende protokoll beskriver cellekulturforholdene, stimulering av membranen ruffle formasjon in vitro, og hvordan å fikse, dehydrere og forberede celler for avbildning ved hjelp av SEM. Kvantifisering av membran ruffling, data normalisering, og stimulatorer og hemmere av membran ruffle formasjon er også beskrevet. Denne metoden kan bidra til å svare på sentrale spørsmål om makropinocytoserollen i fysiologiske og patologiske prosesser, undersøke nye mål som regulerer membran ruffle dannelse, og identifisere ennå ukarakteriserte fysiologiske stimulatorer samt nye farmakologiske hemmere av makropinocytose.
Introduction
Makropinocytose er en endokytisk prosess som er ansvarlig for å internalisere en stor mengde ekstracellulær væske og dets innhold via dannelsen av dynamiske og aktindrevne plasmamembranutstikk som kalles membran ruffles1. Mange av disse membran ruffles danner kopper som lukker og smelter tilbake på cellen og skiller seg fra plasmamembranen som store, heterogene intracellulære endosomer også kjent som makropinosomer1. Selv om makropinocytose er indusert av vekstfaktorer som makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF) og epidermal vekstfaktor (EGF) i et bredt spekter av celletyper, har en ekstra unik, kalsiumavhengig prosess kjent som konstituerende makropinocytose også blitt observert i medfødte immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellenes evne til å internalisere ekstracellulært materiale via makropinocytose har vist seg å spille en viktig rolle i en rekke fysiologiske prosesser som spenner fra næringsopptak til patogenfangst og antigenpresentasjon 9,10,11. Men fordi denne prosessen er ikke-selektiv og inducible, har den også blitt involvert i en rekke patologiske forhold. Faktisk antydet tidligere studier at makropinocytose spiller en viktig rolle i Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, kreft, nephrolithiasis og aterosklerose 12,13,14,15,16. Videre har visse bakterier og virus vist seg å bruke makropinocytose for å få inngang i vertsceller og indusere infeksjon17,18. Interessant nok kan stimulering av makropinocytose også utnyttes for målrettet levering av terapeutiske midler under ulike sykdomstilstander19,20.
Tidligere studier har utforsket makropinocytose ved å kvantifisere internaliserte fluorescerende taggede væskefasemarkører i fravær og tilstedeværelse av farmakologiske midler som hemmer makropinocytose ved hjelp av strømningscytometri og konfomisk avbildning21,22. Tilgjengelige farmakologiske verktøy som hemmer makropinocytose er begrenset til og består av 1) aktinpolymerisasjonshemmere (cytochalasin D og latrunculins), 2) PI3K-blokkere (LY-290 042 og wortmannin) og 3) hemmere av natrium hydrogenvekslere (NHE) (amilorid og EIPA)5,14,15,23,24,25 . Men fordi disse inhibitorene har endokytoseuavhengige effekter, er det vanskelig å selektivt bestemme bidraget av makropinocytose til løsning av opptak og sykdomspatogenese spesielt in vivo21.
Skanning av elektronmikroskopi (SEM) er en type elektronmikroskop som produserer bilder med ultrahøy oppløsning av celler ved hjelp av en fokusert stråle av elektroner26. I makropinocytoseforskning anses SEM-avbildning som gullstandardteknikken for å visualisere topografiske og morfologiske egenskaper ved plasmamembranen, kvantifisere membran ruffle formasjon og undersøke deres progresjon mot makropinosom internalisering. Videre gir skanning av elektronmikroskopi kombinert med kvantifisering av løsningsmiddelopptak, i nærvær og fravær av makropinocytoseblokkere, en pålitelig strategi for å undersøke makropinocytotisk solute internalisering in vitro. Dette dokumentet gir en detaljert protokoll om hvordan du forbereder celler for SEM, visualiserer celleoverflaten, kvantifiserer ruffleformasjon og undersøker deres fremgang mot kopplukking og makropinosom internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Følgende er en generell protokoll som brukes til å kvantifisere membran ruffle formasjon i RAW 264.7 makrofager ved hjelp av SEM mikroskopi. Optimalisering kan være nødvendig for forskjellige celletyper.
1. Cellelinje og cellekultur
- Vokse RAW 264.7 makrofager i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% (vol /vol) varme-inaktivert Fetal Bovine Serum (FBS), 100 IE /ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 %CO2. Bytt ut vekstmedier annenhver dag.
- Når cellene blir 80% sammenløp, vask platen to ganger ved hjelp av steril PBS.
- Løsne celler ved å tilsette 1000 μL 0,5% trypsin-EDTA og inkubere cellekulturplaten i 3-5 min i en fuktet inkubator ved 37 °C.
- Undersøk platen under et lysmikroskop for å bekrefte celledissosiasjon. Legg til 10 ml vekstmedier som inneholder 10% FBS for å inaktivere trypsin.
- Samle cellefjæringen i et 50 ml konisk rør og sentrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Resuspend celler forsiktig i hele cellekulturmediet og bestemme celleantallet og levedyktigheten ved hjelp av Trypan Blue (0,4%) farging.
MERK: Anbefalt minimum celle levedyktighet for dette eksperimentet er >90%. - Plasser sterile glassdeksler i brønner på en 24-brønnsplate ved hjelp av autoklavede tang. Frøceller på deksler med en tetthet på 1 x 106 celler / ml og inkuberer platen over natten i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5 % CO2.
- Bytt media av hver brønn med friske 500 μL komplette medier før behandling. Forbehandle makrofager med kjøretøy (DMSO eller andre løsningsmidler som brukes til å oppløse EIPA) eller makropinocytosehemmeren 5-(N-etyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM21) i 30 min.
- Behandle celler med kjøretøy og stimulatorer av makropinocytose for å fremme membranruffling: phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA, 1 μM, 30 min21) og makrofagkolonistimulerende faktor (M-CSF, 100 ng/ml, 30 min3).
MERK: Alternative hemmere [f.eks. latrunculin A (1 μM, 30 min) eller cytochalasin D (1 μM, 30 min)] og stimulatorer [f.eks. epidermal vekstfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) eller blodplate-avledet vekstfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] makropinocytose kan også brukes til å karakterisere makropinocytose i makrofager og andre celletyper16,27, 28,29. Celler kan kreve serum sult over natten før behandling med fysiologiske stimulatorer av makropinocytose. Det er viktig å merke seg at de mest effektive konsentrasjonene og inkubasjonstidene må bestemmes for å stimulere makropinocytose i andre celletyper.
2. SEM-fiksering
- Etter behandlingen aspirerer du media fra brønner og vasker deksler med iskald PBS to ganger.
- Fest celler (4% paraformaldehyd og 2% glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakroktylat) i 30 min ved romtemperatur, etterfulgt av inkubering over natten i fikseringsmiddelet ved 4 °C.
- Vask forsiktig og inkuber deksler med 500 μL følgende reagenser uten å forstyrre cellemonolayeren.
- Vask en gang i 0,1 M natriumkaktokylat og inkuber i 15 min.
- Vask to ganger med dH2O med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 25% etanol med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 50% etanol med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 75% etanol med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 80% etanol med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 95% etanol med 10 min inkubasjon i hver vask.
- Vask to ganger med 100% etanol. Utfør 10 min inkubasjon i hver vask.
MERK: Endring/utskifting av reagenser bør gjøres raskt for å forhindre lufttørking av celler. Deksler kan stå i 100% etanol i flere dager ved 4 °C. For langtidslagring, tilsett ytterligere 100% etanol og dekk brønner med parafilm for å forhindre lufttørking av prøven.
3. Kritisk punkttørking
- Plasser deksler i en kritisk punkttørker og dekk med 100% etanol. Trykk på strømknappen og åpne CO2-tanken .
- Trykk på avkjølingsknappen i ca. 30 s til temperaturen synker til 0 °C. Trykk på Fyll-knappen til det vises en boble i kammervinduet.
- Trykk på renseknappen til lukten av etanol fra renseeksosen forsvinner. Trykk på avkjølingsknappen igjen til temperaturen synker til 0 °C.
- Trykk på fyll- og utrenskningsknappene igjen for å slå dem av og lukke CO2-tanken . Trykk på Cool-knappen igjen for å slå den av og trykk på Heat-knappen .
- Still inn temperaturen ved 42 °C og trykk ved 1200 psi. Når trykket og temperaturen stabiliserer seg, trykker du på Lufteknappen for å la trykket synke sakte.
- Når kammertrykket når 150 psi, trykker du på Vent-knappen og venter til trykket synker til 0 psi. Slå av den kritiske tørketrommelen og fjern dekslene.
- Monter deksler på SEM aluminiumsprøvefester ved hjelp av karbonlimttappene og underlagt sputterbelegg ved hjelp av gull/palladium i en sputterfrakker.
- Slå på strømknappen og vent til vakuumet når 30 mTorr. Skyll kammeret for å fjerne fuktighet og luft ved å slå av gassbryteren og dreie den fine gassventilen mot klokken.
- Når vakuumet øker til 200 mTorr slår du av gassbryteren og venter til vakuumet når 30 mTorr. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
- Trykk på timerknappen og juster spenningsknappen til måleren viser 10 mA. Fjern belagte deksler fra kammeret.
MERK: Følg produsentens instruksjoner for å utføre kritisk punkttørking og sputterbelegg av prøven.
4. Avbildning og kvantifisering
- Sett prøvedeksler inn i kammeret til et skanningselektronmikroskop. Lukk døren og trykk på Evac-knappen .
- Åpne SEM-operasjonsprogramvaren. Sett akselerasjonsspenningen til 15 kv og arbeidsavstanden til 10 mm.
- Trykk koordinatknappen og flytt rundt kontrolleren til cellene vises midt på observasjonsskjermen. Sett forstørrelsen til 3500x, og bilde eksemplet ved å klikke Bilde-knappen.
MERK: Bruk et høyere forstørrelsesnivå (8500x til 16 000x) for å vise plasmamembranen med større detaljer. - Ta bilder fra minst 10 tilfeldige steder på omslagsslipsene, og sørg for at hvert mikroskopisk felt inneholder flere celler. Lagre bilder som .tif filer.
- Fra bildene finner du membran ruffles, definert som fremspringende teppelignende folder av plasmamembranen, med en størrelse større enn 500 nm (figur 1). Tell antall ruffles per celle.
MERK: C-formede ruffles ble identifisert som buede membranutstikk som ikke fusjonerte på sideendene [(Figur 1 (M-CSF-behandling) og figur 2B]. Smeltede sirkulære membran ruffles, før de ble stengt, ble identifisert som makropinocytotiske kopper (figur 2C). - Normaliser antall membran ruffles til totalt antall celler i det mikroskopiske feltet evaluert. Gjenta denne analysen for eksemplene fra hver gruppe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her beskriver vi resultatene fra den presenterte teknikken. Representative SEM-bilder vist i figur 1 viser membran ruffle dannelse i RAW 264.7 makrofager etter behandling med PMA og M-CSF. Bilder ble først tatt med en forstørrelse på 3500x for kvantifiseringsformål og deretter ved høyere forstørrelsesnivåer (8500x til 16 000x) for å vise plasmamembranen med større detaljer. Forbehandling av makrofager med makropinocytosehemmeren EIPA svekket membran ruffle formasjon (figur 1). Makropinocytose-assosiert plasmamembranaktiviteter kan deles inn i fem påfølgende trinn: 1) initiering av membranruffling, 2) sirkularisering, 3) koppdannelse, 4) kopplukking og 5) internalisering av ekstracellulær væske og tilhørende løsningsmidler via makropinosomdannelse. Figur 2 viser representative bilder av disse morfologisk distinkte plasmamembranaktivitetene etter M-CSF-stimulering. Store arklignende ruffles (figur 2A), sirkulæriserte C-formede ruffles (figur 2B) og makropinocytiske kopper (figur 2C) ble fanget ved en forstørrelse på 6000x til 7000x. Skanning elektronmikroskopi kan brukes til å gi høyoppløselige bilder av celleoverflaten, men kan ikke brukes til å visualisere internaliserte makropinosomer. Kvantifisering av membran ruffles etter PMA og M-CSF behandling er vist i figur 3. Makropinosomdannelse kan bekreftes ved hjelp av alternative avbildningsteknikker, inkludert konfektmikroskopi, som vist i figur 4. Til slutt bør SEM-kvantifisering av membranruffling suppleres med strømningscytometri-kvantifisering av en fluorescerende væskefasemarkør (f.eks.
Figur 1: Skanne elektronmikroskopibilder av RAW 264.7-makrofager. RAW 264,7 makrofager ble forbehandlet med kjøretøy (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 minutter og inkubert med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) for å stimulere membranruffling. Bilder til høyre viser høyere forstørrelse av celleoverflaten. Røde piler: membran ruffles. Grønn pil: c-formet ruffle. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Morfologiske stadier av makropinocytose fanget ved skanning av elektronmikroskopi. RAW 264,7 makrofager ble behandlet med M-CSF (100 ng/ml) i 30 minutter og celler ble behandlet for SEM-avbildning. (A) arklignende membranutstikk, (B) C-formet membran ruffle og (C) makropinocytisk kopp. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av membran ruffle formasjon. RAW 264,7 makrofager ble forbehandlet med kjøretøy (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 minutter og inkubert med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) for å stimulere membranruffling. Stolpediagram viser antall membran ruffles normalisert til totalt cellenummer (n = 3). Data representerer gjennomsnittet ± SEM. Enveis ANOVA; *p < 0,05 vs. kjøretøy, #p < 0,05 vs. PMA- eller M-CSF-behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Makropinosomdannelse. Celler ble forbehandlet med PMA i 30 min og inkubert med Texas red-dextran (25 μg/ml, rød) og FM4-64 (5 μg/ml, grønn) i 10 min. Avbildning ble utført ved hjelp av et konfokalt mikroskop. Blå piler: membran ruffling, gule piler: makropinosom som inneholder Texas rød-dextran, grønne piler: makropinosomer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av makropinocytose. RAW 264,7 makrofager ble forhåndsbehandlet med kjøretøy (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 min og inkubert med PMA (1 μM) og FITC-dextran (100 μg/ml; 70 000 MW) i 2 timer. Stanggrafen viser gjennomsnittlig fluorescensintensitet (MFI) fold endring normalisert til kjøretøy behandling (n = 3, utført i triplikater). Data representerer gjennomsnittet ± SEM. Enveis ANOVA; *p < 0,05 vs. kjøretøy, #p < 0,05 vs. PMA. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nåværende SEM-bildeprotokollen gir et verktøy for å visualisere og kvantifisere membran ruffle formasjon, sirkulære fremspring, og makropinocytiske kopper på celleoverflaten in vitro. Selv om den nåværende protokollen fokuserer på makrofager, har studier vist at membran ruffle formasjon også forekommer på ulike andre celletyper, inkludert dendritiske celler, fibroblaster, nevroner og kreftceller 11,12,14,21,30. Gitt dette kan optimalisering av cellekulturforhold og bruk av forskjellige stimulatorer eller behandlingsforhold være nødvendig for visualisering av membran ruffles i andre celletyper.
Selv om det finnes noe spillerom for prøvepreparering, må dehydrerings- og kritiskpunkttørkingstrinn følges nøyaktig for å bevare celleoverflatearkitekturen. I tillegg vil tilstedeværelsen av vann eller andre løsningsmidler som etanol forstyrre vakuumet, noe som er viktig for SEM-avbildning, og derfor må det fjernes på en kontrollert måte for å holde prøvemorfologien intakt14.
Elektronmikroskoper bruker en stråle av akselererte elektroner som en belysningskilde. De første elektronmikroskopene ble utviklet da bølgelengden ble den begrensende faktoren i lysmikroskop31. Elektroner har mye kortere bølgelengder, og elektronmikroskop har dermed en høyere løsningskraft enn lysmikroskoper og kan brukes til å gi høyoppløselige bilder og undersøke ultrastrukturen til et bredt spekter av biologiske prøver. En stor begrensning av denne metoden dreier seg om det faktum at SEM bare gir et øyeblikksbilde av plasmamembranmorfologien, i motsetning til fluorescerende levende celleavbildning, noe som vil tillate visualisering av membran ruffles, deres overgang til makropinocytiske kopper og dannelse av makropinosomer. Levende celleavbildning, transmisjonselektronmikroskopi (TEM) og fluorescerende dekstranopptaksanalyser kan brukes til å undersøke internalisering av fluorescerende løsningsmidler via makropinocytose, makropinosom translokasjon og modning, og intracellulære signalmekanismer som regulerer makropinocytose. Fordi SEM krever fiksering på deksler, kan bare dorsalsiden og det perifere området av cellen visualiseres, noe som er en annen begrensning i denne teknikken.
Vi vil gjerne legge til at det noen ganger er vanskelig å skille mellom makropinocytoseuavhengig dannelse av membranutstikk og makropinocytisk membranruffling. Vi standardiserte kvantifiseringen vår ved å identifisere membran ruffles med minst 0,5 μm minimumsavstand mellom to punkter på kanten av fremspringet. Antall membran ruffles per celle er svært variabelt og avhenger av mange faktorer, inkludert sentralstimulerende middel, konsentrasjon, inkubasjonstid og celletype32. Med PMA og M-CSF så vi celler med flere membran ruffles, men valgte representative bilder som bedre representerer våre kvantifiserte data (1-2 ruffles per celle). SEM forblir gullstandardteknikken for å vurdere topografiske og morfologiske egenskaper til plasmamembranin vitroen. Kombinasjonen av denne metoden sammen med levende celleavbildning og strømningscytometrianalyse av løsningsmiddelinter internalisering gir en pålitelig strategi for å analysere makropinocytose i ulike celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne takker Libby Perry (Augusta University) for hennes hjelp med SEM-prøveforberedelsene. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) og K99HL146954 (B.S.)] og American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
