Summary
Macropinocytose is een sterk geconserveerd endocytisch proces geïnitieerd door de vorming van F-actine-rijke plaatachtige membraanprojecties, ook bekend als membraanrulingen. Verhoogde snelheid van macropinocytotische opgeloste stof internalisatie is betrokken bij verschillende pathologische aandoeningen. Dit protocol presenteert een methode om de vorming van membraanrommels in vitro te kwantificeren met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Abstract
Membraanrommel is de vorming van beweeglijke plasmamembraanuitsteeksels die een maaswerk van nieuw gepolymeriseerde actinefilamenten bevatten. Membraanrusels kunnen zich spontaan vormen of als reactie op groeifactoren, inflammatoire cytokines en phorbolesters. Sommige van de membraanuitsteeksels kunnen reorganiseren in cirkelvormige membraanrukels die aan hun distale randen samensmelten en kopjes vormen die sluiten en scheiden in het cytoplasma als grote, heterogene vacuolen die macropinosomen worden genoemd. Tijdens het proces vangen ruches extracellulaire vloeistof en opgeloste stoffen op die zich internaliseren binnen macropinosomen. Hoge resolutie scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een veelgebruikte beeldvormingstechniek om de vorming van membraanrommels, cirkelvormige uitsteeksels en gesloten macropinocytische cups op het celoppervlak te visualiseren en te kwantificeren. Het volgende protocol beschrijft de celkweekomstandigheden, stimulatie van de membraanrommelvorming in vitro en hoe cellen te fixeren, uitdrogen en voorbereiden voor beeldvorming met behulp van SEM. Kwantificering van membraanruling, gegevensnormalisatie en stimulatoren en remmers van membraanrommelvorming worden ook beschreven. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de rol van macropinocytose in fysiologische en pathologische processen, het onderzoeken van nieuwe doelen die de vorming van membraanrommel reguleren en het identificeren van nog niet-gekarakteriseerde fysiologische stimulatoren en nieuwe farmacologische remmers van macropinocytose.
Introduction
Macropinocytose is een endocytisch proces dat verantwoordelijk is voor het internaliseren van een grote hoeveelheid extracellulaire vloeistof en de inhoud ervan via de vorming van dynamische en actine-aangedreven plasmamembraanuitsteeksels die membraanruches worden genoemd1. Veel van deze membraanruches vormen cups die sluiten en terugsmelten naar de cel en scheiden van het plasmamembraan als grote, heterogene intracellulaire endosomen, ook bekend als macropinosomen1. Hoewel macropinocytose wordt geïnduceerd door groeifactoren zoals macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF) en epidermale groeifactor (EGF) in een breed scala van celtypen, is een extra uniek, calciumafhankelijk proces dat bekend staat als constitutieve macropinocytose ook waargenomen in aangeboren immuuncellen 2,3,4,5,6,7,8.
Het is aangetoond dat het vermogen van cellen om extracellulair materiaal te internaliseren via macropinocytose een belangrijke rol speelt in een verscheidenheid aan fysiologische processen, variërend van opname van voedingsstoffen tot het vangen van pathogenen en de presentatie van antigeen 9,10,11. Omdat dit proces echter niet-selectief en induceerbaar is, is het ook betrokken bij een aantal pathologische aandoeningen. Inderdaad, eerdere studies suggereerden dat macropinocytose een belangrijke rol speelt bij de ziekte van Alzheimer, de ziekte van Parkinson, kanker, nefrolithiasis en atherosclerose 12,13,14,15,16. Bovendien hebben bepaalde bacteriën en virussen aangetoond macropinocytose te gebruiken om toegang te krijgen tot gastheercellen en infectie te induceren17,18. Interessant is dat stimulatie van macropinocytose ook kan worden gebruikt voor gerichte toediening van therapeutische middelen in verschillende ziekteomstandigheden 19,20.
Eerdere studies hebben macropinocytose onderzocht door geïnternaliseerde fluorescerend gelabelde vloeistoffasemarkers te kwantificeren in afwezigheid en aanwezigheid van farmacologische middelen die macropinocytose remmen met behulp van flowcytometrie en confocale beeldvorming21,22. Momenteel beschikbare farmacologische hulpmiddelen die macropinocytose remmen, zijn beperkt tot en bestaan uit 1) actinepolymerisatieremmers (cytochalasine D en latrunculinen), 2) PI3K-blokkers (LY-290042 en wortmannine) en 3) remmers van natriumwaterstofwisselaars (NHE) (amiloride en EIPA)5,14,15,23,24,25 . Omdat deze remmers echter endocytose-onafhankelijke effecten hebben, is het moeilijk om selectief de bijdrage van macropinocytose aan de opname van opgeloste stoffen en de pathogenese van ziekten te bepalen, vooral in vivo21.
Scanning elektronenmicroscopie (SEM) is een type elektronenmicroscoop dat beelden met ultrahoge resolutie van cellen produceert met behulp van een gerichte bundel elektronen26. In macropinocytose-onderzoek wordt SEM-beeldvorming beschouwd als de gouden standaardtechniek om topografische en morfologische kenmerken van het plasmamembraan te visualiseren, membraanrommelvorming te kwantificeren en hun progressie naar macropinosoominternalisatie te onderzoeken. Bovendien biedt scanning elektronenmicroscopie in combinatie met de kwantificering van de opname van opgeloste stoffen, in de aan- en afwezigheid van macropinocytoseblokkers, een betrouwbare strategie om de internalisatie van macropinocytotische opgeloste stoffen in vitro te onderzoeken. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol over hoe cellen voor te bereiden op SEM, het celoppervlak te visualiseren, ruchesvorming te kwantificeren en hun voortgang naar bekersluiting en macropinosoominternalisatie te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Het volgende is een algemeen protocol dat wordt gebruikt om de vorming van membraanrommels in RAW 264.7-macrofagen te kwantificeren met behulp van SEM-microscopie. Optimalisatie kan nodig zijn voor verschillende celtypen.
1. Cellijn en celkweek
- Kweek RAW 264,7 macrofagen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% (vol/vol) warmte-geïnactiveerd Foetaal Runderserum (FBS), 100 IE/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2. Vervang groeimedia om de dag.
- Wanneer cellen 80% confluent worden, wast u de plaat twee keer met steriel PBS.
- Maak cellen los door 1.000 μL 0,5% trypsine-EDTA toe te voegen en incubaleer de celkweekplaat gedurende 3-5 minuten in een bevochtigde incubator bij 37 °C.
- Onderzoek de plaat onder een lichtmicroscoop om celdissociatie te bevestigen. Voeg 10 ml groeimedia met 10% FBS toe om trypsine te inactiveren.
- Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 50 ml en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend cellen voorzichtig in het volledige celkweekmedium en bepaal het celgetal en de levensvatbaarheid met behulp van Trypan Blue (0,4%) kleuring.
OPMERKING: De aanbevolen minimale levensvatbaarheid van cellen voor dit experiment is >90%. - Plaats steriele glazen afdekplaten in putten van een 24-putplaat met behulp van een geautoclaveerde tang. Zaadcellen op coverslips met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml en incubeer de plaat een nacht in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Vervang de media van elke put met verse 500 μL complete media vóór de behandeling. Macrofagen voorbehandelen met medium (DMSO of andere oplosmiddelen die worden gebruikt om EIPA op te lossen) of de macropinocytoseremmer 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride (EIPA, 25 μM21) gedurende 30 minuten.
- Behandel cellen met vehikel en stimulatoren van macropinocytose om membraanrommel te bevorderen: phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA, 1 μM, 30 min21) en macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min3).
OPMERKING: Alternatieve remmers [bijv. latrunculine A (1 μM, 30 min) of cytochalasine D (1 μM, 30 min)] en stimulatoren [bijv. epidermale groeifactor (EGF, 100 ng/ ml, 10 min) of van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF, 100 ng / ml, 15 min)] van macropinocytose kunnen ook worden gebruikt om macropinocytose in macrofagen en andere celtypen te karakteriseren16,27, 28,29. Cellen kunnen 's nachts serumuithongering vereisen voorafgaand aan de behandeling met fysiologische stimulatoren van macropinocytose. Het is belangrijk op te merken dat de meest effectieve concentraties en incubatietijden moeten worden bepaald om macropinocytose in andere celtypen te stimuleren.
2. SEM-fixatie
- Na de behandeling aspiraleer je de media uit putten en was je dekens twee keer met ijskoude PBS.
- Fixeer cellen (4% paraformaldehyde en 2% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaat) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door interubatie gedurende een nacht in het fixatief bij 4 °C.
- Was en incubeer voorzichtig coverslips met 500 μL volgende reagentia zonder de celmonolaag te verstoren.
- Was eenmaal in 0,1 M natriumcacodylaat en incubeer gedurende 15 min.
- Was tweemaal met dH2O met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 25% ethanol met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 50% ethanol met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 75% ethanol met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 80% ethanol met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 95% ethanol met 10 minuten incubatie in elke wasbeurt.
- Was tweemaal met 100% ethanol. Voer 10 minuten incubatie uit in elke wasbeurt.
OPMERKING: Het vervangen/vervangen van reagentia moet snel gebeuren om te voorkomen dat cellen aan de lucht drogen. Coverslips kunnen meerdere dagen bij 4 °C in 100% ethanol worden bewaard. Voeg voor langdurige opslag extra 100% ethanol toe en bedek putten met parafilm om te voorkomen dat het monster aan de lucht droogt.
3. Drogen met kritieke punten
- Plaats coverslips in een Critical Point Dryer en dek af met 100% ethanol. Druk op de aan/uit-knop en open de CO2-tank .
- Druk ongeveer 30 s op de knop Koelen totdat de temperatuur daalt tot 0 °C. Druk op de vulknop totdat er een bel in het kamervenster verschijnt.
- Druk op de Purge-knop totdat de geur van ethanol uit de purge-uitlaat verdwijnt. Druk nogmaals op de knop Koelen totdat de temperatuur daalt tot 0 °C.
- Druk op de knoppen Vullen en Verwijderen om ze uit te schakelen en de CO2-tank te sluiten. Druk op de knop Cool om deze uit te schakelen en druk op de Heat-knop .
- Stel de temperatuur in op 42 °C en de druk op 1.200 psi. Zodra de druk en temperatuur stabiliseren, drukt u op de Bleed-knop om de druk langzaam te laten afnemen.
- Zodra de kamerdruk 150 psi bereikt, drukt u op de ontluchtingsknop en wacht u tot de druk afneemt tot 0 psi. Schakel de kritische puntdroger uit en verwijder de afdekplaten.
- Monteer coverslips op SEM aluminium monster mounts met behulp van Carbon Adhesive tabs en onderworpen aan sputter coating met goud / palladium in een sputter coater.
- Schakel de aan /uit-knop in en wacht tot het vacuüm 30 mTorr bereikt. Spoel de kamer om vocht en lucht te verwijderen door de gasschakelaar uit te schakelen en de fijngasklep tegen de klok in te draaien.
- Zodra het vacuüm toeneemt tot 200 mTorr schakelt u de gasschakelaar uit en wacht u tot het vacuüm 30 mTorr bereikt. Herhaal deze stap 3 keer.
- Druk op de timerknop en pas de spanningsknop aan totdat de meter 10 mA aangeeft. Verwijder gecoate dekzeilen uit de kamer.
OPMERKING: Volg de instructies van de fabrikant om kritische puntdroging en sputtercoating van het monster uit te voeren.
4. Beeldvorming en kwantificering
- Plaats monsterdeksels in de kamer van een scanning elektronenmicroscoop. Sluit de deur en druk op de Evac-knop .
- Open de SEM-bewerkingssoftware. Stel de versnellingsspanning in op 15 kv en de werkafstand op 10 mm.
- Druk op de knop Coördinaten en beweeg rond de controller totdat de cellen in het midden van het observatiescherm verschijnen. Stel de vergroting in op 3.500x en geef het voorbeeld een afbeelding door op de knop Foto te klikken.
OPMERKING: Gebruik een hoger vergrotingsniveau (8.500x tot 16.000x) om het plasmamembraan op grotere details weer te geven. - Maak afbeeldingen van ten minste 10 willekeurige locaties op de coverslips en zorg ervoor dat elk microscopisch veld meerdere cellen bevat. Sla afbeeldingen op als .tif bestanden.
- Zoek uit de afbeeldingen membraanruches, gedefinieerd als uitstekende dekenachtige plooien van het plasmamembraan, met een grootte van meer dan 500 nm (figuur 1). Tel het aantal ruches per cel.
OPMERKING: C-vormige ruches werden geïdentificeerd als gebogen membraanuitsteeksels die niet samensmolten aan hun laterale uiteinden [(Figuur 1 (M-CSF-behandeling) en Figuur 2B]. Gesmolten ronde membraanruches, voorafgaand aan hun sluiting, werden geïdentificeerd als macropinocytotische cups (figuur 2C). - Normaliseer het aantal membraanruches tot het totale aantal cellen in het geëvalueerde microscopische veld. Herhaal deze analyse voor de monsters van elke groep.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hier beschrijven we de resultaten van de gepresenteerde techniek. Representatieve SEM-beelden in figuur 1 tonen de vorming van membraanrommels in RAW 264.7 macrofagen na behandeling met PMA en M-CSF. Beelden werden eerst vastgelegd met een vergroting van 3.500x voor kwantificeringsdoeleinden en vervolgens met hogere vergrotingsniveaus (8.500x tot 16.000x) om het plasmamembraan op grotere details te laten zien. Voorbehandeling van macrofagen met de macropinocytoseremmer EIPA verzwakte membraanrommelvorming (figuur 1). Macropinocytose-geassocieerde plasmamembraanactiviteiten kunnen worden onderverdeeld in vijf opeenvolgende stappen: 1) initiatie van membraanrommeling, 2) circularisatie, 3) cupvorming, 4) cupsluiting en 5) internalisatie van extracellulaire vloeistof en de bijbehorende opgeloste stoffen via macropinosomevorming. Figuur 2 toont representatieve beelden van deze morfologisch verschillende plasmamembraanactiviteiten na M-CSF-stimulatie. Grote velachtige ruches (figuur 2A), geronde C-vormige ruches (figuur 2B) en macropinocytische cups (figuur 2C) werden vastgelegd bij een vergroting van 6.000x tot 7.000x. Scanning elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om beelden met hoge resolutie van het celoppervlak te leveren, maar kan niet worden gebruikt om geïnternaliseerde macropinosomen te visualiseren. Kwantificering van membraanrusels na behandeling met PMA en M-CSF is weergegeven in figuur 3. Macropinosoomvorming kan worden bevestigd door alternatieve beeldvormingstechnieken, waaronder confocale microscopie, zoals weergegeven in figuur 4. Ten slotte moet de SEM-kwantificering van membraanrommeling worden aangevuld met flowcytometriekwantificering van een fluorescerende vloeistoffasemarker (bijv. FITC- of Texas red-dextran) om de stimulatie van macropinocytose te bevestigen (figuur 5).
Figuur 1: Scanning elektronenmicroscopie beelden van RAW 264.7 macrofagen. RAW 264,7 macrofagen werden voorbehandeld met medium (DMSO-controle) of EIPA (25 μM) gedurende 30 minuten en geïncubeerd met PMA (1 μM, 30 min) of M-CSF (100 ng/ml, 30 min) om membraanrommel te stimuleren. Afbeeldingen aan de rechterkant tonen een hogere vergroting van het celoppervlak. Rode pijlen: membraanruches. Groene pijl: c-vormige ruche. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologische stadia van macropinocytose vastgelegd door scanning elektronenmicroscopie. RAW 264,7 macrofagen werden behandeld met M-CSF (100 ng/ml) gedurende 30 minuten en cellen werden verwerkt voor SEM-beeldvorming. (A) plaatachtig membraanuitsteeksel, (B) C-vormige membraanrommel en (C) macropinocytische cup. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van de vorming van membraanrommels. RAW 264,7 macrofagen werden voorbehandeld met medium (DMSO-controle) of EIPA (25 μM) gedurende 30 minuten en geïncubeerd met PMA (1 μM, 30 min) of M-CSF (100 ng/ml, 30 min) om membraanrommel te stimuleren. Staafdiagram toont het aantal membraanruches genormaliseerd tot totaal celnummer (n = 3). Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Eenrichtingsverkeer ANOVA; *p < 0,05 vs. voertuig, #p < 0,05 vs. PMA of M-CSF behandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Macropsosoomvorming. Cellen werden voorbehandeld met PMA gedurende 30 minuten en geïncubeerd met Texas red-dextran (25 μg / ml, rood) en FM4-64 (5 μg / ml, groen) gedurende 10 minuten. Beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop. Blauwe pijlen: membraan ruches, gele pijlen: macropinosoom met Texas rood-dextran, groene pijlen: macropinosomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van macropinocytose. RAW 264.7 macrofagen werden voorbehandeld met medium (DMSO-controle) of EIPA (25 μM) gedurende 30 minuten en geïncubeerd met PMA (1 μM) en FITC-dextran (100 μg/ml; 70.000 MW) gedurende 2 uur. Staafdiagram toont de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) vouwverandering genormaliseerd naar voertuigbehandeling (n = 3, uitgevoerd in drielicaten). Gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde ± SEM. Eenrichtingsverkeer ANOVA; *p < 0,05 vs. voertuig, #p < 0,05 vs. PMA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het huidige SEM-beeldvormingsprotocol biedt een hulpmiddel om membraanrommelvorming, cirkelvormige uitsteeksels en macropinocytische cups op het celoppervlak in vitro te visualiseren en te kwantificeren. Hoewel het huidige protocol zich richt op macrofagen, hebben studies aangetoond dat membraanrommelvorming ook voorkomt op verschillende andere celtypen, waaronder dendritische cellen, fibroblasten, neuronen en kankercellen 11,12,14,21,30. Daarom kan optimalisatie van celkweekomstandigheden en het gebruik van verschillende stimulatoren of behandelingsomstandigheden nodig zijn voor de visualisatie van membraanrulingen in andere celtypen.
Hoewel er enige speelruimte bestaat voor monstervoorbereiding, moeten de uitdrogings- en kritieke puntdroogstappen precies worden gevolgd om de architectuur van het celoppervlak te behouden. Bovendien zou de aanwezigheid van water of andere oplosmiddelen zoals ethanol het vacuüm verstoren, wat essentieel is voor SEM-beeldvorming en daarom moet het op een gecontroleerde manier worden verwijderd om de morfologie van het monster intact te houden14.
Elektronenmicroscopen gebruiken een bundel versnelde elektronen als bron van verlichting. De eerste elektronenmicroscopen werden ontwikkeld toen de golflengte de beperkende factor werd in lichtmicroscopen31. Elektronen hebben veel kortere golflengten, dus elektronenmicroscopen hebben een hoger oplossend vermogen dan lichtmicroscopen en kunnen worden gebruikt om beelden met een hoge resolutie te leveren en de ultrastructuur van een breed scala aan biologische monsters te onderzoeken. Een belangrijke beperking van deze methode draait om het feit dat SEM slechts een momentopname van de plasmamembraanmorfologie biedt, in tegenstelling tot de fluorescerende live cell imaging, die visualisatie van membraanrukels, hun overgang naar macropinocytische cups en vorming van macropinosomen mogelijk zou maken. Live cell imaging, transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en fluorescerende dextran opname assays kunnen worden gebruikt om de internalisatie van fluorescerende opgeloste stoffen via macropinocytose, macropinosoom translocatie en rijping, en intracellulaire signaleringsmechanismen die macropinocytose reguleren te onderzoeken. Omdat SEM fixatie op coverslips vereist, kunnen alleen de dorsale zijde en het perifere gebied van de cel worden gevisualiseerd, wat een andere beperking is voor deze techniek.
We willen eraan toevoegen dat het soms moeilijk is om onderscheid te maken tussen macropinocytose-onafhankelijke vorming van membraanuitsteeksels en macropinocytische membraanruling. We hebben onze kwantificering gestandaardiseerd door membraanrugels te identificeren met een minimale afstand van ten minste 0,5 μm tussen twee willekeurige punten aan de rand van het uitsteeksel. Het aantal membraanruches per cel is zeer variabel en hangt af van tal van factoren, waaronder het stimulerende middel, de concentratie, incubatietijd en celtype32. Met PMA en M-CSF zagen we wel cellen met meerdere membraanruches, maar kozen we representatieve beelden die onze gekwantificeerde gegevens beter weergeven (1-2 ruches per cel). SEM blijft de gouden standaardtechniek voor het beoordelen van topografische en morfologische kenmerken van het plasmamembraan in vitro. De combinatie van deze methode samen met live cell imaging en flowcytometrie-analyse van opgeloste internalisatie biedt een betrouwbare strategie voor het analyseren van macropinocytose in verschillende celtypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten te hebben.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Libby Perry (Augusta University) voor haar hulp bij de SEM-monstervoorbereiding. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) en K99HL146954 (B.S.)] en American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
