Summary
La macropinocitosi è un processo endocitico altamente conservato avviato dalla formazione di proiezioni di membrana simili a fogli ricchi di F-actina, noti anche come volant di membrana. L'aumento del tasso di internalizzazione del soluto macropinocitotico è stato implicato in varie condizioni patologiche. Questo protocollo presenta un metodo per quantificare la formazione di volant di membrana in vitro utilizzando la microscopia elettronica a scansione.
Abstract
L'arruffamento della membrana è la formazione di sporgenze di membrana plasmatica mobile contenenti una rete di filamenti di actina appena polimerizzati. Le volant di membrana possono formarsi spontaneamente o in risposta a fattori di crescita, citochine infiammatorie e esteri di forbolo. Alcune delle sporgenze di membrana possono riorganizzarsi in volant circolari di membrana che si fondono ai loro margini distali e formano tazze che si chiudono e si separano nel citoplasma come vacuoli grandi ed eterogenei chiamati macropinosomi. Durante il processo, i volant intrappolano il fluido extracellulare e i soluti che si interiorizzano all'interno dei macropinosomi. La microscopia elettronica a scansione ad alta risoluzione (SEM) è una tecnica di imaging comunemente usata per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche chiuse sulla superficie cellulare. Il seguente protocollo descrive le condizioni di coltura cellulare, la stimolazione della formazione di volant di membrana in vitro e come correggere, disidratare e preparare le cellule per l'imaging utilizzando SEM. Sono inoltre descritti la quantificazione dell'increspamento della membrana, la normalizzazione dei dati e gli stimolatori e gli inibitori della formazione di volant di membrana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo della macropinocitosi nei processi fisiologici e patologici, studiare nuovi bersagli che regolano la formazione di increspature di membrana e identificare stimolatori fisiologici ancora non caratterizzati e nuovi inibitori farmacologici della macropinocitosi.
Introduction
La macropinocitosi è un processo endocitico responsabile dell'internalizzazione di una grande quantità di fluido extracellulare e del suo contenuto attraverso la formazione di sporgenze dinamiche e guidate dall'actina della membrana plasmatica chiamate increspature di membrana1. Molti di questi volant di membrana formano coppe che si chiudono e si fondono di nuovo sulla cellula e si separano dalla membrana plasmatica come grandi ed eterogenei endosomi intracellulari noti anche come macropinosomi1. Sebbene la macropinocitosi sia indotta da fattori di crescita come il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e il fattore di crescita epidermico (EGF) in una vasta gamma di tipi di cellule, un ulteriore processo unico e dipendente dal calcio noto come macropinocitosi costitutiva è stato osservato anche nelle cellule immunitarie innate 2,3,4,5,6,7,8.
La capacità delle cellule di internalizzare il materiale extracellulare attraverso la macropinocitosi ha dimostrato di svolgere un ruolo importante in una varietà di processi fisiologici che vanno dall'assorbimento dei nutrienti alla cattura dei patogeni e alla presentazione dell'antigene 9,10,11. Tuttavia, poiché questo processo non è selettivo e inducibile, è stato anche implicato in una serie di condizioni patologiche. Infatti, studi precedenti hanno suggerito che la macropinocitosi svolge un ruolo importante nella malattia di Alzheimer, nel morbo di Parkinson, nel cancro, nella nefrolitiasi e nell'aterosclerosi 12,13,14,15,16. Inoltre, alcuni batteri e virus hanno dimostrato di utilizzare la macropinocitosi per entrare nelle cellule ospiti e indurre l'infezione17,18. È interessante notare che la stimolazione della macropinocitosi può anche essere sfruttata per la somministrazione mirata di agenti terapeutici in varie condizioni di malattia19,20.
Studi precedenti hanno esplorato la macropinocitosi quantificando marcatori in fase fluida internati con tag fluorescenti in assenza e presenza di agenti farmacologici che inibiscono la macropinocitosi utilizzando la citometria a flusso e l'imaging confocale21,22. Gli strumenti farmacologici attualmente disponibili che inibiscono la macropinocitosi sono limitati e comprendono 1) inibitori della polimerizzazione dell'actina (citocalasina D e latrunculine), 2) bloccanti PI3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibitori degli scambiatori di idrogeno di sodio (NHE) (amiloride ed EIPA)5,14,15,23,24,25 . Tuttavia, poiché questi inibitori hanno effetti indipendenti dall'endocitosi, è difficile determinare selettivamente il contributo della macropinocitosi all'assorbimento del soluto e alla patogenesi della malattia, specialmente in vivo21.
La microscopia elettronica a scansione (SEM) è un tipo di microscopio elettronico che produce immagini ad altissima risoluzione di cellule utilizzando un fascio focalizzato di elettroni26. Nella ricerca sulla macropinocitosi, l'imaging SEM è considerato la tecnica gold standard per visualizzare le caratteristiche topografiche e morfologiche della membrana plasmatica, quantificare la formazione di volant di membrana e studiare la loro progressione verso l'internalizzazione dei macropinosomi. Inoltre, la microscopia elettronica a scansione combinata con la quantificazione dell'assorbimento del soluto, in presenza e assenza di bloccanti della macropinocitosi, fornisce una strategia affidabile per esaminare l'internalizzazione del soluto macropinocitotico in vitro. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato su come preparare le cellule per il SEM, visualizzare la superficie cellulare, quantificare la formazione di volant ed esaminare i loro progressi verso la chiusura della coppa e l'internalizzazione dei macropinosomi.
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Protocol
NOTA: Di seguito è riportato un protocollo generale utilizzato per quantificare la formazione di increspature di membrana nei macrofagi RAW 264.7 utilizzando la microscopia SEM. L'ottimizzazione può essere necessaria per diversi tipi di celle.
1. Linea cellulare e coltura cellulare
- Coltiva 264,7 macrofagi RAW nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% (vol/vol) di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO2. Sostituisci i substrati di crescita a giorni alterni.
- Quando le cellule diventano confluenti all'80%, lavare la piastra due volte usando PBS sterile.
- Staccare le cellule aggiungendo 1.000 μL di tripsina-EDTA allo 0,5% e incubare la piastra di coltura cellulare per 3-5 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C.
- Esaminare la piastra al microscopio ottico per confermare la dissociazione cellulare. Aggiungere 10 ml di substrati di crescita contenenti il 10% di FBS per inattivare la tripsina.
- Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 mL e centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendare delicatamente le cellule nel terreno di coltura cellulare completo e determinare il numero di cellule e la vitalità utilizzando la colorazione Trypan Blue (0,4%).
NOTA: la vitalità cellulare minima raccomandata per questo esperimento è >90%. - Posizionare le coperture di vetro sterile nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti usando una pinza autoclavata. Seminare le cellule su coverslips ad una densità di 1 x 106 cellule/mL e incubare la piastra durante la notte in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO2.
- Cambiare i mezzi di ciascun pozzetto con mezzi completi freschi da 500 μL prima del trattamento. Pretrattare i macrofagi con veicolo (DMSO o altri solventi usati per sciogliere l'EIPA) o l'inibitore della macropinocitosi 5-(N-etil-N-isopropil)-Amiloride (EIPA, 25 μM21) per 30 min.
- Trattare le cellule con veicolo e stimolatori della macropinocitosi per promuovere l'arruffamento della membrana: phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min21) e fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 100 ng / mL, 30 min3).
NOTA: inibitori alternativi [ad esempio, latrunculina A (1 μM, 30 min) o citocalasina D (1 μM, 30 min)] e stimolatori [ad esempio, fattore di crescita epidermico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) o fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] della macropinocitosi possono essere utilizzati anche per caratterizzare la macropinocitosi nei macrofagi e in altri tipi di cellule16,27, 28,29. Le cellule possono richiedere la fame sierica durante la notte prima del trattamento con stimolatori fisiologici della macropinocitosi. È importante notare che le concentrazioni e i tempi di incubazione più efficaci dovranno essere determinati per stimolare la macropinocitosi in altri tipi di cellule.
2. Fissazione SEM
- Dopo il trattamento, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavare due volte i coperchi con PBS ghiacciato.
- Fissare le cellule (4% paraformaldeide e 2% glutaraldeide in cacodilato di sodio 0,1 M) per 30 minuti a temperatura ambiente, seguite da incubazione notturna nel fissativo a 4 °C.
- Lavare e incubare delicatamente le coperture con 500 μL dei seguenti reagenti senza disturbare il monostrato cellulare.
- Lavare una volta in cacodilato di sodio 0,1 M e incubare per 15 minuti.
- Lavare due volte con dH2O con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 25% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 50% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 75% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo all'80% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 95% con 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
- Lavare due volte con etanolo al 100%. Eseguire 10 minuti di incubazione in ogni lavaggio.
NOTA: la sostituzione /sostituzione dei reagenti deve essere effettuata rapidamente per evitare l'essiccazione all'aria delle celle. I coverslip possono essere lasciati in etanolo al 100% per diversi giorni a 4 °C. Per la conservazione a lungo termine, aggiungere ulteriore etanolo al 100% e coprire i pozzetti con parafilm per evitare l'essiccazione all'aria del campione.
3. Punto critico di asciugatura
- Posizionare i coverslip in un essiccatore a punto critico e coprire con etanolo al 100%. Premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio CO2 .
- Premere il pulsante Cool per circa 30 s fino a quando la temperatura non scende a 0 °C. Premere il pulsante Riempi finché non viene visualizzata una bolla nella finestra della camera.
- Premere il pulsante Purge fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare. Premere nuovamente il pulsante Cool fino a quando la temperatura non scende a 0 °C.
- Reprimere i pulsanti Fill e Purge per spegnerli e chiudere il serbatoio CO2 . Reprimi il pulsante Cool per spegnerlo e premi il pulsante Heat .
- Impostare la temperatura a 42 °C e la pressione a 1.200 psi. Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante Al vivo per consentire alla pressione di diminuire lentamente.
- Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 psi, premere il pulsante di sfiato e attendere che la pressione scenda a 0 psi. Spegnere l'essiccatore del punto critico e rimuovere i coperchi.
- Montare i coverslip su supporti per campioni di alluminio SEM utilizzando linguette adesive in carbonio e soggetti a rivestimento sputter utilizzando oro / palladio in un rivestimento sputter.
- Accendi il pulsante di accensione e attendi che il vuoto raggiunga i 30 mTorr. Lavare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario.
- Una volta che il vuoto aumenta a 200 mTorr spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga 30 mTorr. Ripetere questo passaggio 3 volte.
- Premere il pulsante Timer e regolare la manopola Tensione fino a quando l'indicatore non legge 10 mA. Rimuovere le coperture rivestite dalla camera.
NOTA: seguire le istruzioni del produttore per eseguire l'essiccazione del punto critico e il rivestimento sputter del campione.
4. Imaging e quantificazione
- Inserire i coverslip del campione nella camera di un microscopio elettronico a scansione. Chiudi la porta e premi il pulsante Evac .
- Aprire il software operativo SEM. Impostare la tensione di accelerazione a 15 kv e la distanza di lavoro a 10 mm.
- Premere il pulsante Coordinate e spostarsi all'interno del controller finché le celle non vengono visualizzate al centro della schermata di osservazione. Imposta l'ingrandimento su 3.500x e visualizza l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto.
NOTA: utilizzare un livello di ingrandimento più elevato (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica in modo più dettagliato. - Scatta immagini da almeno 10 posizioni casuali sui coverslip, assicurandoti che ogni campo microscopico contenga più celle. Salva le immagini come file .tif.
- Dalle immagini, individuare le increspature della membrana, definite come pieghe sporgenti simili a coperte della membrana plasmatica, con una dimensione superiore a 500 nm (Figura 1). Contare il numero di volant per cella.
NOTA: le volant a forma di C sono state identificate come sporgenze di membrana curve che non si fondevano sulle loro estremità laterali [(Figura 1 (trattamento M-CSF) e Figura 2B]. Le volant circolari a membrana fuse, prima della loro chiusura, sono state identificate come coppe macropinocitotiche (Figura 2C). - Normalizzare il numero di volant di membrana al numero totale di cellule nel campo microscopico valutato. Ripetere questa analisi per i campioni di ciascun gruppo.
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Representative Results
Qui, descriviamo i risultati della tecnica presentata. Le immagini SEM rappresentative mostrate nella Figura 1 mostrano la formazione di volant di membrana nei macrofagi RAW 264.7 dopo trattamento con PMA e M-CSF. Le immagini sono state prima catturate con un ingrandimento di 3.500x per scopi di quantificazione e poi a livelli più elevati di ingrandimento (da 8.500x a 16.000x) per mostrare la membrana plasmatica a maggiori dettagli. Pretrattamento dei macrofagi con l'inibitore della macropinocitosi EIPA attenuato formazione di increspature di membrana (Figura 1). Le attività della membrana plasmatica associate alla macropinocitosi possono essere suddivise in cinque fasi consecutive: 1) inizio dell'arruffamento della membrana, 2) circolarizzazione, 3) formazione della tazza, 4) chiusura della tazza e 5) internalizzazione del fluido extracellulare e dei suoi soluti associati tramite formazione di macropinosomi. La Figura 2 mostra immagini rappresentative di queste attività morfologicamente distinte della membrana plasmatica dopo stimolazione M-CSF. Grandi volant simili a fogli (Figura 2A), volant circolari a forma di C (Figura 2B) e coppe macropinocitiche (Figura 2C) sono stati catturati con un ingrandimento da 6.000x a 7.000x. La microscopia elettronica a scansione può essere utilizzata per fornire immagini ad alta risoluzione della superficie cellulare, ma non può essere utilizzata per visualizzare macropinosomi interiorizzati. La quantificazione delle increspature di membrana dopo il trattamento con PMA e M-CSF è mostrata nella Figura 3. La formazione di macropinosomi può essere confermata da tecniche di imaging alternative, compresa la microscopia confocale, come mostrato nella Figura 4. Infine, la quantificazione SEM dell'arruffamento della membrana dovrebbe essere integrata dalla quantificazione della citometria a flusso di un marcatore fluorescente in fase fluida (ad esempio, FITC o Texas red-dextran) per confermare la stimolazione della macropinocitosi (Figura 5).
Figura 1: Immagini al microscopio elettronico a scansione di macrofagi RAW 264.7. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) per stimolare l'arruffamento della membrana. Le immagini a destra mostrano un ingrandimento maggiore della superficie cellulare. Frecce rosse: increspature a membrana. Freccia verde: volant a forma di C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Fasi morfologiche della macropinocitosi catturate mediante microscopia elettronica a scansione. I macrofagi RAW 264.7 sono stati trattati con M-CSF (100 ng / mL) per 30 minuti e le cellule sono state elaborate per l'imaging SEM. (A) protrusione di membrana simile a un foglio, (B) volant di membrana a forma di C e (C) coppa macropinocitica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione della formazione di increspature di membrana. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM, 30 min) o M-CSF (100 ng/mL, 30 min) per stimolare l'arruffamento della membrana. Il grafico a barre mostra il numero di volant di membrana normalizzati al numero totale di cellule (n = 3). I dati rappresentano la media ± SEM. ANOVA unidirezionale; *p < 0,05 vs. veicolo, #p < 0,05 vs. trattamento PMA o M-CSF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Formazione di macropinosomi. Le cellule sono state pre-trattate con PMA per 30 minuti e incubate con texas rosso-destrano (25 μg / mL, rosso) e FM4-64 (5 μg / mL, verde) per 10 minuti. L'imaging è stato eseguito utilizzando un microscopio confocale. Frecce blu: increspature di membrana, frecce gialle: macropinosoma contenente texas rosso-destrano, frecce verdi: macropinosomi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Quantificazione della macropinocitosi. I macrofagi RAW 264.7 sono stati pre-trattati con veicolo (controllo DMSO) o EIPA (25 μM) per 30 minuti e incubati con PMA (1 μM) e FITC-destrano (100 μg/mL; 70.000 MW) per 2 ore. Il grafico a barre mostra il cambiamento medio di piega dell'intensità di fluorescenza (IFM) normalizzato al trattamento del veicolo (n = 3, eseguito in triplicati). I dati rappresentano la media ± SEM. ANOVA unidirezionale; *p < 0,05 vs veicolo, #p < 0,05 vs PMA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'attuale protocollo di imaging SEM fornisce uno strumento per visualizzare e quantificare la formazione di volant di membrana, sporgenze circolari e coppe macropinocitiche sulla superficie cellulare in vitro. Sebbene l'attuale protocollo si concentri sui macrofagi, gli studi hanno dimostrato che la formazione di volant di membrana si verifica anche su vari altri tipi di cellule tra cui cellule dendritiche, fibroblasti, neuroni e cellule tumorali 11,12,14,21,30. Detto questo, l'ottimizzazione delle condizioni di coltura cellulare e l'uso di diversi stimolatori o condizioni di trattamento possono essere necessari per la visualizzazione di volant di membrana in altri tipi di cellule.
Sebbene esista un certo margine di manovra per la preparazione del campione, le fasi di disidratazione e asciugatura del punto critico devono essere seguite esattamente per preservare l'architettura della superficie cellulare. Inoltre, la presenza di acqua o altri solventi come l'etanolo disturberebbe il vuoto, che è essenziale per l'imaging SEM e quindi, deve essere rimosso in modo controllato per mantenere intatta la morfologia del campione14.
I microscopi elettronici utilizzano un fascio di elettroni accelerati come fonte di illuminazione. I primi microscopi elettronici sono stati sviluppati quando la lunghezza d'onda è diventata il fattore limitante nei microscopiottici 31. Gli elettroni hanno lunghezze d'onda molto più corte, quindi i microscopi elettronici hanno un potere risolutivo più elevato rispetto ai microscopi ottici e possono essere utilizzati per fornire immagini ad alta risoluzione e studiare l'ultrastruttura di una vasta gamma di campioni biologici. Una delle principali limitazioni di questo metodo ruota attorno al fatto che il SEM fornisce solo un'istantanea della morfologia della membrana plasmatica, al contrario dell'imaging fluorescente delle cellule vive, che consentirebbe la visualizzazione delle volant di membrana, la loro transizione alle coppe macropinocitiche e la formazione di macropinosomi. L'imaging a cellule vive, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e i saggi di assorbimento del destrano fluorescente possono essere utilizzati per studiare l'internalizzazione dei soluti fluorescenti tramite macropinocitosi, traslocazione e maturazione dei macropinosomi e meccanismi di segnalazione intracellulare che regolano la macropinocitosi. Poiché il SEM richiede la fissazione su coverslip, è possibile visualizzare solo il lato dorsale e la regione periferica della cellula, che è un'altra limitazione a questa tecnica.
Vorremmo aggiungere che a volte è difficile distinguere tra la formazione indipendente dalla macropinocitosi delle sporgenze di membrana e l'arruffamento della membrana macropinocitica. Abbiamo standardizzato la nostra quantificazione identificando le increspature a membrana con almeno 0,5 μm di distanza minima tra due punti qualsiasi sul bordo della protrusione. Il numero di increspature di membrana per cellula è molto variabile e dipende da numerosi fattori tra cui lo stimolante, la sua concentrazione, il tempo di incubazione e il tipo di cellula32. Con PMA e M-CSF, abbiamo visto cellule con più volant di membrana, ma abbiamo scelto immagini rappresentative che rappresentano meglio i nostri dati quantificati (1-2 volant per cellula). La SEM rimane la tecnica gold standard per la valutazione in vitro delle caratteristiche topografiche e morfologiche della membrana plasmatica. La combinazione di questo metodo con l'imaging di cellule vive e l'analisi citometrica a flusso dell'internalizzazione del soluto fornisce una strategia affidabile per l'analisi della macropinocitosi in vari tipi di cellule.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Libby Perry (Augusta University) per il suo aiuto nella preparazione del campione SEM. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) e K99HL146954 (BS)] e dall'American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
