Summary
여기에서는 20N 이상의 60 순환 압박에 의해 생성 된 쥐 무릎의 순환 로딩 유도 관절 내 연골 병변 모델을 제시하여 쥐의 대퇴 과두 연골에 손상을 입 힙니다.
Abstract
원발성 골관절염 (OA)의 병태 생리학은 아직 명확하지 않습니다. 그러나 상대적으로 젊은 연령 그룹에서 OA의 특정 하위 분류는 관절 연골 손상 및 인대 경련의 병력과 관련이 있을 수 있습니다. 무릎 OA의 수술 동물 모델은 외상 후 OA의 발병 및 진행을 이해하는 데 중요한 역할을 하며 이 질병에 대한 새로운 치료법 개발을 돕습니다. 그러나 최근 중재 평가에 영향을 미칠 수있는 외상성 염증을 피하기 위해 비수술 모델이 고려되었습니다.
이 연구에서는 생체 내 주기적 압축 하중에 의해 유도된 관절 내 연골 병변 쥐 모델이 개발되어 연구자들은 (1) 국소 연골 손상을 일으킬 수 있는 최적의 하중 크기, 속도 및 지속 시간을 결정할 수 있었습니다. (2) 연골세포 활력의 외상 후 시공간적 병리학적 변화를 평가하고; (3) 관절 압축 하중에 대한 적응 및 복구 메커니즘에 관여하는 파괴 또는 보호 분자의 조직학적 발현을 평가합니다. 이 보고서는 쥐 모델에서이 새로운 연골 병변에 대한 실험 프로토콜을 설명합니다.
Introduction
전통적으로 내측 반월판의 전방 십자 인대 (ACL) 절개 또는 불안정화는 작은 동물의 외상 후 골관절염 (PTOA)을 조사하는 데 최적으로 간주되었습니다. 최근 몇 년 동안 비 침습적 순환 압축 모델이 PTOA를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 모델은 원래기계적 하중1에 대한 해면골 반응을 조사하기 위해 설계되었으며 PTOA 연구 2,3,4,5,6을 위한 비수술적 동물 모델로 수정되었습니다. 이론적 근거는 주기적인 외력을 가하여 관절 연골을 충돌시켜 일련의 염증 반응을 유발하는 것입니다. 그러나이 모델은 마우스에만 적용되었으며 더 큰 동물에 대한 적절한 하중 크기는 논의되지 않았습니다.
이전 모델의 또 다른 문제점은 대용량 프로토콜이 너무 많은 사이클을 포함하여,여러 샘플에서 원치 않는 부작용인 연골하 뼈의 과도한 비후를 유발한다는 것이다7. 따라서, 큰 동물에 대해 적절한 크기와 더 낮은 로딩 부작용을 갖는 주기적 압축의 새로운 방법이 개발되었다8. 현재 기사의 전반적인 목표는 쥐에서 비침습적 순환 압축 모델의 프로토콜을 설명하고 연골 변성의 대표적인 결과를 관찰하는 것입니다. 현재 프로토콜은 쥐에 대한 비 침습적 순환 압축 모델의 적용에 관심이있는 독자를 도울 것입니다.
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Protocol
이 프로토콜은 교토 대학 동물 연구위원회 (승인 번호 : Med kyo 17616)의 승인을 받았습니다.
1. 쥐 무릎에 생체 내 순환 압박 수행
- 실험동물 마취 유도
- 12주령의 Wistar 랫트(256.8 ± 8.7 g)를 마취 박스에 5% 이소플루란 용액을 흡입하여 마취를 유도하였다.
- 메데토미딘, 미다졸람, 부토르파놀을 포함한 3가지 마취제9의 혼합물을 쥐 체중 2mg/kg에 복강 주사하고 오른쪽 무릎 관절 주변을 면도합니다. 발가락 꼬집음에 대한 페달 반사가 부족하여 충분한 마취를 확인하십시오.
- 마취 된 쥐를 고정 장치에 장착하십시오.
- 마취된 쥐를 베이스 플레이트(그림 1)의 배에 놓고 오른쪽 무릎을 오목한 홈이 있는 작은 수지 조각에 부착합니다. 오른쪽 뒷다리를 고관절 확장, 무릎 굴곡 및 발목 확장 위치에 놓고 무릎을 약 140° 구부립니다. 움직일 수있는 고정 장치의 쐐기 모양의 홈에 쥐의 발 뒤꿈치를 수용하십시오.
- 고정 장치를 응력/인장 시험 기기로 옮깁니다( 재료 표 참조). 로드셀과의 접촉이 없는지 확인한 후 응력/인장 시험 기기 제어 소프트웨어(재료 표)를 열고 교정 버튼을 클릭합니다. 교정 후 프레임 상단을로드 셀에 조심스럽게 부착하십시오. 무릎 관절을 프레임에 밀접하게 부착하려면 예압이 5N에 도달할 때까지 이동식 주 작동 패널의 회전 손잡이를 천천히 켭니다.
- 로딩 방법을 빌드하고 압축 테스트를 설정합니다.
- 주 메뉴에서 새 메서드 만들기를 클릭합니다| 시스템 레이블. 테스트 모드를 주기로 설정하고 테스트 유형을 압축으로 설정합니다. 센서 레이블을 클릭하고 테스트 탭을 선택하여 한계가 60N 이내인지 확인합니다. 또한 스트로크 탭을 선택하고 한계가 500mm 이내인지 확인합니다.
알림: 위의 단계는 응력 지점에 큰 변위가 있는 경우 즉시 작동을 중지합니다. - 테스트 컨트롤 레이블 아래에서 성장 기원을 선택하여 0.3%/전체 배율로 기본 프로그램을 시작합니다. 로딩 사이클의 4개 섹션 중 1번째 및 3번째 섹션에서 제어되는 스트로크 속도를 1mm/s로 설정합니다. 2번째 섹션의 최대 테스트 힘을 20N으로 설정하고 4번째 섹션의 최소 테스트 힘을 5N으로 설정합니다. "유지 지속 시간"을 피크 부하의 경우 0.5초, 최소 부하의 경우 10초로 설정합니다(그림 2).
알림: 이 단계는 모든 사이클을 정의하므로 조인트 표면이 서로 접촉하고 적절한 속도로 움직이며 동작이 유지되는지 확인하십시오. - 페이지 하단의 사전 로드 탭에서 On 이 선택되어 있고 처짐 제거 속도가 100mm/min으로 설정되어 있으며 최대 힘이 5N인지 확인합니다. 시편 레이블에서 재질 을 금속으로 설정합니다.
참고: 이러한 세부 설정은 각 제조업체에 따라 다를 수 있습니다. - 주 메뉴의 메서드 및 테스트 선택 섹션에서 방금 빌드한 메서드를 선택하고 시작을 클릭하여 테스트를 시작합니다.
알림: 하단의 표는 피크 하중 및 변위의 실제 측정값을 보여줍니다. - 주기 수를 60으로 설정합니다.
참고: 전체 로딩 세션에는 약 12분 동안 지속되는 60개의 사이클이 포함됩니다. 대조군에서, 랫트는 동일한 조건 하에서 12분 예비로딩 동안 5N 예비로딩을 받았다.
- 주 메뉴에서 새 메서드 만들기를 클릭합니다| 시스템 레이블. 테스트 모드를 주기로 설정하고 테스트 유형을 압축으로 설정합니다. 센서 레이블을 클릭하고 테스트 탭을 선택하여 한계가 60N 이내인지 확인합니다. 또한 스트로크 탭을 선택하고 한계가 500mm 이내인지 확인합니다.
- 적재 후 쥐를 새장으로 돌려 보내고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 케이지에서 12-12 시간의 밝은 어두운 일정을 유지하여 충분한 공간과 음식을 자유롭게 유지하십시오 . 필요한 실험 기간 후에, 분석을 위해 복강 내 주사 또는 이산화탄소 흡입 (1 h-8 주)에 주사 된 3 개의 마취제 혼합물의 과다 복용으로 랫트를 희생시킨다.
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Representative Results
20 N 순환 로딩을 실시한 샘플에서 연골세포 생존율의 단기 변화(1시간 및 12시간)의 대표적인 결과가 얻어졌다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 죽은 연골 세포의 수 (적색 형광)는 외상 후 12 시간에 증가했습니다. 반대로, 살아있는 연골 세포의 수 (녹색 형광)는 계속 감소했으며, 일부 샘플에는 감염된 부위에 살아있는 연골 세포가 포함되어 있지 않았습니다.
조직학은 20N 동적 로딩을받은 쥐 무릎의 관절 연골이 손상되었음을 보여 주었고, 모든 샘플에서 외측 대퇴 과두에서 하나의 국소 병변 영역이 확인되었습니다 (그림 4). 그러나 병변 크기는 8 주 관찰 기간 동안 점진적으로 증가하지 않았습니다. 병변과 영향을받지 않은 연골의 계면에 해당하는 경계가 감염된 부위에서 관찰 될 수 있습니다.
그림 1: 고정 장치는 베이스 플레이트와 고정 장치로 구성됩니다. 베이스 플레이트 (길이 : 27.5cm, 너비 : 13cm)에는 쥐의 구부러진 무릎 관절을 수용하기 위해 뒤쪽에 수지 오목한 홈 (길이 : 0.8cm, 너비 : 0.4cm)이 있습니다. 고정 장치에는 두 개의 금속 막대 사이의베이스 플레이트에 중첩 된 쥐의 발 뒤꿈치를 수용하는 쐐기 모양의 홈 (홈 너비 : 1.5cm, 홈 깊이 : 1cm)이 있습니다. 고정 장치의 상단은 응력 / 인장 시험 장비의 로드셀과 직접 접촉합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 한 번의 로드 주기에 대한 로드 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 병변 영역에서 연골 세포 생존력의 시공간 평가. 희생 후, 무릎 관절은 작은 집게와 가위를 사용하여 해부되고 분리되었습니다. 칼세인 AM 및 EthD-1 염색의 용액은 원래 키트(재료 표)를 각각 5mL의 PBS에서 1:500 및 1:4,000으로 희석하여 제조하였다. 샘플을 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 대조군 샘플을 동일한 조건하에서 PBS에 침지시켰다. 형광 이미지는 플루오레세인 이소티오시아네이트(495nm/519nm) 및 요오드화프로피듐(535nm/617nm) 채널을 사용하여 형광 현미경(재료 표)을 사용하여 획득했습니다. 중요한 연골 세포는 녹색 형광을 나타내는 반면 죽은 세포는 빨간색 형광을 나타 냈습니다. 대조군 샘플 (A)의 연골 세포와 비교하여, 적재 된 쥐 무릎의 죽은 연골 세포의 수는 1 시간 (B)에 증가되었고 12 시간 (C)에 영향을받은 부위의 대부분의 영역을 차지했습니다. 녹색과 적색 형광은 각각 살아있는 연골 세포와 죽은 연골 세포의 영역을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어: 칼세인 AM = 칼세인 아세톡시메틸 에스테르; 에티듐 호모다이머-1 = 에티듐 호모다이머-1; PBS= 인산염 완충 식염수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대표적인 사프라닌 로딩된 무릎에서 대퇴 과두의 염색. 측면 대퇴 과두의 시상 부분을 보여주는 슬라이드로, 사프라닌 O/Fast Green 및 헤마톡실린 용액으로 염색되었습니다. 대조군에 비해 로딩 후 환부의 사프라닌 O 염색 강도가 감소하고 상부/석회화된 연골의 명확한 경계(화살표)가 관찰되었습니다. 스케일 바 = 100 μm. 약어 : w = 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
처음으로, 현재 프로토콜은 마우스2와 같은 더 작은 설치류에서의 관절 내 손상 모델과 유사하게 쥐의 외측 대퇴 과두에 로딩 유도 연골 병변의 모델을 확립하는 방법을 보여줍니다. 그러나 마우스의 로딩 프로토콜은 심각한 골괴사 형성 및 십자 인대 병변을 유발하여 주기적 압축의 효과를 평가하는 데 이상적이지 않았습니다. 현재의 프로토콜은 훨씬 낮은 로딩 포스를 가진 쥐에서 국소 연골 병변을 생성했습니다. 적절한 크기, 속도 및 스트레스 지속 시간만이 뼈 조직을 손상시키지 않고 연골을 파괴할 수 있기 때문에 올바른 로딩 방법 설정은 프로토콜에 매우 중요합니다.
변위 한계 설정 (프로토콜 단계 1.3.1)은 인대 파열시 또는 쥐가 로딩 세션 중에 마취에서 깨어난 경우 즉시 기기를 중지하기 때문에 중요합니다. 최적의 최대 하중과 쥐의 나이는 아직 결정되지 않았습니다. 그러나 예비 실험에서 50N 이상의 하중은 쥐의 무릎에서 ACL 파열 가능성이 높습니다. 더욱이, 현재 모델은 나이가 많은 (>36 주령) 쥐에서 번식하기가 어려우며, 아마도 성장이 일어날 때 연골의 경직으로 인해 번식하기가 어렵습니다.
어린 쥐에 대한 파괴 부하 임계 값은 결정되지 않았지만 향후 연구에서는 연골에 대한 단백 동화 효과를 관찰하기 위해 최대 하중을 20N 미만으로 유지해야한다고 믿어집니다. 병변 영역의 범위와 국소화는 각 샘플의 연골 세포 퇴행성 부피에 의해 추정 된 바와 같이 현장을 처음 접하는 사람들에게도 비교적 간단했으며, 이는 잠재적으로 상대적으로 좁은 연골 영역에 대한 개입의 후속 평가에 초점을 맞추 었습니다.
조직학적 염색은 병변 영역의 범위가 8주 관찰 기간 동안 비교적 안정적임을 입증하였다. 그러나 Mankin의 점수는 지속적으로 악화되는 반면 매트릭스 염색 및 세포 분포 점수는 영향을받는 영역에서 증가했습니다. 또한, 중간층과 석회화 된 연골 사이에는 명백한 색 편차가 있었는데, 이는 조수 표 위의 연골 만이 관절 간 압박의 영향을 받았다는 것을 보여줍니다.
반대로, 희귀 샘플에서의 경미한 세동을 제외하고, 연골의 완전성은 전체 관찰 기간 동안 대체로 손상되지 않은 상태로 유지되었으며, 이는 진행성 OA 손상 모델10과 다릅니다. 따라서 비수술 모델은 스포츠 부상에서 더 흔한 연골 계면 충돌 유발 국소 병변의 평가에 더 좋을 수 있습니다. 앞으로 현재 모델은 온열요법 및 유산소 관절 운동과 같은 약물 치료 또는 물리 치료가 외상성 연골 손상에 미치는 영향을 평가하는 데 사용될 것입니다. 또한, 주기적 기계적 자극에 반응하는 연골세포 동화작용 및 이화작용도 이 모델을 사용하여 동물에서 생체 내에서 검증될 수 있었습니다.
현재 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 외측 대퇴 과두의 연골 병변 만 조사했습니다. 측면 경골의 병변도 향후 연구에서 평가되어야합니다. 둘째, 현재 프로토콜에서 연구 된 관절 연골의 병변 부분은 보행시 주요 하중지지 영역이 아니었다. 연골의 이질성으로 인해 관절 내 연골의 강성은 현재 연구에서 조사한 부분과 다를 수 있습니다. 따라서 이러한 결과는 참고 자료로만 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 상기 모델은 OA 발달의 중요한 특징인 연골 변성의 어떠한 유의한 진행도 나타내지 않았다. 추가 연구에서는 침습적 수술과 사전 로드된 병변을 결합하여 시공간적 변화를 관찰할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 JSPS KAKENHI 보조금 (번호 JP18H03129 및 JP18K19739)에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
이 연구는 또한 유니스 케네디 슈라이버 국립 아동 건강 및 인간 발달 연구소 (NICHD), 국립 신경 장애 및 뇌졸중 연구소 (NINDS) 및 국립 보건원 (NIBIB)의 지원을받는 재생 재활 연구 및 훈련 연합 (AR3T)의 자금 지원을 받았습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthetic Apparatus for Small Animals | SHINANO MFG CO.,LTD. | SN-487-0T | |
| Autograph AG-X | Shimadzu Corp | N.A. | Precision Universal / Tensile Tester |
| Fluoview FV10i microscope | Olympus Corp | N.A. | A fully automated confocal laser-scanning microscope |
| ISOFLURANE Inhalation Solution | Pfizer Japan Inc. | (01)14987114133400 | |
| LIVE/DEA Viability/Cytotoxicity Kit | Thermo Fisher Scientific Japan Inc | L3224 | A quick and easy two-color assay to determine viability of cells |
| TRAPEZIUM X Software | Shimadzu Corp | N.A. | Data processing software for Autograph AG-X |
References
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