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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Transferência de energia de fluorescência de molécula única é um método que rastreia a dinâmica do tRNA durante a síntese de proteína ribossômica. Ao rastrear ribossomos individuais, são identificadas populações inhomogêneas, que lançam luz sobre mecanismos. Este método pode ser usado para rastrear mudanças conformacionais biológicas em geral para revelar relações de função dinâmica em muitos outros biossistemas complexos. Métodos de molécula única podem observar etapas limitantes sem taxa e intermediários-chave de baixa população, que não são acessíveis por métodos convencionais de conjunto devido ao efeito médio.

Abstract

O ribossomo é um grande complexo de ribonucleoproteína que reúne proteínas processivamente ao longo de modelos de mRNA. O diâmetro do ribossomo é de aproximadamente 20 nm para acomodar substratos de tRNA grandes nos locais A, P e E. Consequentemente, a dinâmica ribossoma é naturalmente desagum rapidamente. O método de molécula única pode detectar cada ribossomo separadamente e distinguir populações inhomogêneas, o que é essencial para revelar os complicados mecanismos dos sistemas multicomponimentos. Relatamos os detalhes de um método smFRET baseado no microscópio invertido Nikon Ti2 para sondar a dinâmica ribossômica entre a proteína ribossômica L27 e tRNAs. O L27 é rotulado em sua posição cys 53 única e reconstituído em um ribossomo que é projetado para falta de L27. O tRNA é rotulado em sua região do cotovelo. À medida que o tRNA se move para diferentes locais dentro do ribossomo durante o ciclo de alongamento, como a pré e pós-translocação, as eficiências e dinâmicas do FRET apresentam diferenças, que sugeriram múltiplas subpopulações. Essas subpopulações não são detectáveis por métodos de conjunto. O microscópio smFRET baseado em TIRF é construído sobre um microscópio invertido manual ou motorizado, com iluminação laser construída em casa. As amostras de ribossomo são purificadas por ultracentrifugação, carregadas em uma célula de amostra multicanal construída em casa e depois iluminadas através de um campo laser evanescente. O ponto laser de reflexão pode ser usado para alcançar o controle de feedback do foco perfeito. Os sinais de fluorescência são separados por uma torre de filtro motorizada e coletados por duas câmeras CMOS digitais. As intensidades são recuperadas através do software NIS-Elements.

Introduction

O ribossomo é um complexo de ribonucleoproteína de 20 nm de grande porte de uma subunidade grande (50S) e uma pequena (30S). Ele monta peptídeos longos ao longo do modelo mRNA de forma processiva e cooperativa. O ribossomo 30S se liga ao fMet-tRNAfMet e mRNA para iniciar a síntese proteica, e o 50S então se junta para formar o complexo de iniciação 70S. Os tRNAs trazem aminoácidos para o ribossomo no local A (local de ligação aminoacyl-tRNA), enquanto a cadeia de peptidyl alongada é mantida no local P (peptidyl-tRNA binding site). No complexo de pré-translocação, a cadeia de peptidyl é transferida para o tRNA no local A com um aminoácido adicionado. Enquanto isso, o tRNA p-site está desativado. Em seguida, os A-, P-tRNAs movem-se para os locais P-, E-para formar o complexo pós-translocação, no qual o E-site representa o local de saída do tRNA. Neste estado, o peptidyl-tRNA volta para o local P. O ciclo de alongamento continua entre as pré e pós-conformações enquanto o ribossomo transloca no mRNA, um codon de cada vez1. O ribossomo é altamente coordenado de diferentes locais funcionais para tornar esse processo eficiente e preciso, como a catraca inter-subunidade2, as flutuações de hibridização do tRNA3,as ativações GTPase4,L1 stalk opening-closing5, etc. Consequentemente, ribossomos rapidamente se desfantemem porque cada molécula se move em seu próprio ritmo. Os métodos convencionais só podem deduzir parâmetros médios aparentes, mas espécies de baixa população ou de curta duração serão mascaradas no efeito médio6. O método de molécula única pode quebrar essa limitação detectando cada ribossomo individualmente, e então identificar diferentes espécies através da reconstrução estatística7. Diferentes sites de rotulagem foram implementados para sondar dinâmicas ribossósmos, como as interações entre tRNA-tRNA8,EF-G-L119,L1-tRNA10,etc. Além disso, rotulando as subunidades grandes e pequenas, respectivamente, cinéticas de catraca inter-subunidade e coordenação com fatores são observadas11,12. Enquanto isso, o método smFRET tem amplas aplicações em outros processos biológicos centrais, e métodos FRET multicolorentes estão surgindo13.

Anteriormente, um novo par de FRET ribossomo foi desenvolvido14,15. A proteína ribossômica recombinante L27 foi expressa, purificada e rotulada, e incorporada de volta ao ribossomo. Essa proteína interagiu com os tRNAs a uma distância próxima e ajudou a estabilizar o tRNA do local P no complexo pós-translocação. Quando o tRNA mudou do A- para o local P, a distância entre essa proteína e o tRNA é encurtada, o que pode ser distinguido pelo sinal smFRET. Múltiplas subpopulações ribossas foram identificadas usando métodos estatísticos e mutagênese, e a troca espontânea dessas populações no complexo pré-, mas não pós-translocação, sugere que o ribossomo é mais flexível antes de seguir em frente ao mRNA, e mais rígido durante a decodificação16,17,18. Essas variações são essenciais para a função ribossosome. Aqui, o protocolo descreve os detalhes da rotulagem/tRNA ribossomo/tRNA, sua incorporação no ribossomo, preparação da amostra smFRET e aquisição/análise de dados19.

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Protocol

1. Preparação de ribossomo rotulado e tRNA para detecção de FRET

  1. Isolar ribossomo sem L27 da cepa E. coli IW312 de acordo com os protocolos padrão20,21. Extrair o ribossomo regular da cepa E. coli MRE600.
  2. Clone o gene rpmA do L27 com c-terminal Sua tag em plasmídeo pET-21b (+) que é transformado e expresso nas células BL21(DE3)pLysS15. Purifique a proteína através de uma coluna de sepharose pré-embalada.
  3. Rotulagem de L27
    1. Incubar 20-100 μM de L27 purificado em 100 μL com excesso de 2-10 vezes de TCEP (Tris-2-carboxyethyl-fosphine) à temperatura ambiente (RT) por 30 minutos. Buffer troca a solução em buffer PBS (10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl), usando uma coluna nap-5. Adicione 10 vezes o excesso de corante mono-reativo Cy5-maleimide no DMSO na solução e incubar na RT no escuro por 2 h.
    2. Carregue a solução de proteína rotulada (500 μL) mencionada acima em uma coluna Nap-5 para remover o excesso de corante. Certifique-se de que a proteína elutes na primeira banda colorida, seguido pelo eluto de corante livre na segunda banda, respectivamente. Coletar a proteína elucida em 1 mL de tampão TAM10 (20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0,5 mM EDTA e 7 mM BME (2-mercaptoethanol)).
  4. Reconstitua o ribossomo com L27. Misture a proteína L27 rotulada com uma quantidade igual de ribossomo IW312 no tampão TAM10 e incubar a 37 °C por 1 h. Remova a proteína livre por ultracentrifugação de almofada de sacarose (100.000 x g, durante a noite) para permitir que o ribossomo forme uma pelota de cor azul na parte inferior do tubo.
  5. Rotule o tRNAPhe de acordo com o relatório publicado anteriormente22. Primeiro, incubar o tRNA (10 A260 em 1 mL de água) com 100 μL de NaBH4 (estoque de 100 mM, adicionando dropwise) a 0 °C por 1 h. Liberte as tRNAs de NaBH4 não redigidas através de precipitação de etanol três vezes adicionando 1/10 de volume de 3 M KAc (pH 5.0) e 2,5x de volume de etanol. Incubar o tRNA reduzido com 1 μL de solução de corante Cy3-NHS (1 mg em 10 μL de DMSO) em um volume mínimo (~20 μL) de 0,1 M de formate de sódio (pH 3.7). Após 2h de incubação a 37 °C, separe o tRNA do corante não redigido através de uma pequena coluna sephadex G25 e, em seguida, remova o corante livre através de precipitação de etanol duas vezes.

2. Preparação dos complexos ribossomos

  1. Expresse e purifique as proteínas marcadas por Ele de IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts e sínteses de tRNA usando os métodos padrão15.
  2. Prepare o mix de iniciação adicionando os seguintes ingredientes no tampão TAM10 a 37 °C por 15 min: 1 μM do ribossomo rotulado; 1,5 μM cada um de IF1, IF2 e IF3; 2 μM biotinilado mRNA (codificação MF para os dois primeiros aminoácidos); 4 μM de fMet-tRNAfMetcarregado ; e 1 mM GTP.
  3. Prepare a mistura EF-Tu_G mistura misturando os seguintes ingredientes no tampão TAM10 a 37 °C para 15 min: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP e 0,02 mg/mL de Pyruate Kinase.
  4. Prepare a mistura EF-Tu_NoG semelhante ao passo 2.3 sem EF-G.
  5. Prepare a mistura phe mistura misturando os seguintes ingredientes em água sem nuclease a 37 °C para 15 min: 100 mM Tris (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, ATP de 4 mM, 7 mM BME, 2 mM de síntese específica de fenilalanina, 2 A260/mL de tRNAPhee 50 μM fenilalanina.
  6. Prepare o complexo de pré-translocação (PRE) misturando as misturas de iniciação, EF-Tu_NoG e Eps na proporção de 1:2:2, a 37 °C por 2 min. Após a incubação, purifique o PRE por 1,1 M de ultracentrifugação de almofada de sacarose durante a noite a 100.000 x g.
  7. Prepare o complexo pós-translocação (POST) misturando as misturas de iniciação, EF-Tu_WG e Eps na proporção de 1:2:2, a 37 °C por 10 min. Após a incubação, purifique o POST por 1,1 M de ultracentrifugação de almofada de sacarose durante a noite a 100.000 x g.

3. Preparação de slides de amostra

  1. Limpe as lâminas de vidro do microscópio (75 mm x 25 mm) contendo seis pares de orifícios (1 mm de diâmetro). Cada par forma uma saída de entrada da câmara de amostra. Certifique-se de que a distância entre cada orifício de saída de entrada seja de 13 mm e que a distância centro-centro entre dois canais seja de 6 mm. Coloque seis slides em um cadinho de vidro.
  2. Encha o cadinho com acetona e sonice-os por 5 minutos. Decante a acetona e enxágue os slides três vezes com água ultrapurada. Encha o cadinho novamente com água e 1 mL de 10 M KOH. Sonicate por 20 min.
  3. Enxágüe os slides três vezes com água ultrapura. Encha o cadinho novamente com etanol e sonicate por 5 minutos. Decante o solvente completamente. Deixe os slides secarem no capô da fumaça.
  4. Limpe as tampas de vidro do microscópio (nº 1,5 de espessura, 24 x 40 mm). Realize as etapas de limpeza conforme descrito nas etapas 3.1-3.3.
  5. Asse os slides limpos e as tampas a 300 °C por 3h. Mantenha-os no forno durante a noite para esfriar.
  6. Cubra com aminosilano. No cadinho contendo tampas, despeje na mistura de metanol (100 mL de metanol, 5 mL de água, 0,5 mL de HAc e 1 mL de aminosilano). Aqueça o cadinho em um banho de água por 10 minutos, sonicar por 10 minutos, e depois aqueça o cadinho no banho de água por mais 10 minutos. Decante a mistura de metanol, enxágue bem o deslizamento em três cadinhos de água limpa. Purgue as superfícies com um fluxo de nitrogênio seco através de uma agulha.
  7. Cubra as tampas com biotin-PEG em um capô limpo laminar.
    1. Para fazer a solução PEG, utilize 98 mg de PEG e 2-3 mgs de biotina-PEG em 200 μL de 100 mM NaHCO3 solução.
    2. Coloque uma mancha plana sobre uma superfície. Solte cuidadosamente 60 μL de solução PEG na borda superior. Em seguida, coloque outra mancha em cima dela, deixando o efeito capilar espalhar a solução entre as duas tampas. Certifique-se de que não se forme bolhas.
    3. Repita o passo 3.7.2 para mais dois pares de tampas. Cubra seis peças de tampas com biotina. Se forem necessárias mais deslizamentos de cobertura, ajuste a quantidade de PEG e Biotin PEG de acordo para fazer mais solução PEG.
    4. Guarde essas tampas em uma caixa de gorjeta vazia cheia de água e incubar por 3h no escuro.
    5. Depois de 3h, separe as tampas, enxágue com água em três cadinhos consecutivos e purga com um fluxo de nitrogênio seco. Coloque as tampas revestidas em um rack de cerâmica. Marque a superfície com revestimento.
  8. Monte as câmaras de amostra19.
    1. Puxe pontas afiadas de pipeta através dos orifícios nas lâminas de vidro até que elas se encaixem firmemente. Raspe as pontas afiadas até que ela esteja completamente plana para a superfície de vidro. Corte a outra extremidade da ponta para ser aproximadamente 5 mm para carregamento amostral.
    2. Corte uma fita de cara dupla com o padrão do canal nele (25 x 40 mm).
    3. Coloque a fita de cara dupla nas lâminas de vidro do lado plano.
    4. Coloque a tampa revestida na fita de cara dupla. Pressione-o para fazer um selo apertado da câmara de amostra. Certifique-se de que o lado revestido está voltado para dentro.

4. Imagem FRET de molécula única

  1. Ligue o computador.
  2. Ligue o interruptor do microscópio.
  3. Inicie a interface de controle a laser e ligue o laser. Pressione o botão de habilitação na caixa de controle a laser para aquecer o laser.
  4. Ligue as câmeras.
  5. Inicie o programa de software associado ao microscópio. Clique no obturador superior desligado e clique na lâmpada Em.
  6. Prepare o buffer TAM10_WT adicionando 10 μL de 5% Tween-20 em 1 mL de buffer TAM10.
  7. Prepare a solução de desoxi pesando 3 mg de glicose oxidase em um pequeno tubo de microcentrifuuge. Adicione 45 μL de catalase. Vórtice suavemente para dissolver o sólido. Gire a 20.000 x g em uma microcentrifuagem por 1 min. Pegue o supernatante.
  8. Prepare 30% de solução de glicose em água e solução Trolox de 200 mM em DMSO.
  9. Prepare 0,5 mg/mL de solução streptavidin em água sem nuclease.
  10. Adicione uma gota de óleo de imagem ao objetivo da TIRF.
  11. Coloque as câmaras de amostra no objetivo.
  12. Encha a câmara com 10 μL de solução streptavidin. Espere por 1 min.
  13. Lave a câmara com 30 mL de TAM10_WT buffer e colete a solução run-through com um papel filtro dobrado. Espere por 1 min.
  14. Diluir os complexos ribossomos (PRE ou POST) para concentração de 10-50 nM com tampão TAM10_WT.
  15. Carregue 20 μL da amostra de ribossomo no canal. Espere por 2 min.
  16. Faça o tampão de imagem (50 μL de tampão TAM10 mais 0,5 μL cada uma das soluções de desoxi, glicose e Trolox). Misture bem o tampão.
  17. Lave a câmara com 30 μL do tampão de imagem.
  18. Defina a câmera para adquirir 100 ms/quadro, 16 bits, 4 x 4 binning.
  19. Clique no obturador superior ligado e na lâmpada desligado.
  20. Inicie a aquisição da câmera. Espalhe as imagens em três janelas representando duas câmeras individuais e a sobreposição.
  21. Clique em Foco automático. Ajuste fino para encontrar o melhor foco.
  22. Clique em um método. Defina os pontos de campo, o armazenamento do arquivo e o número do loop.
  23. Clique em Executar.
    NOTA: Uma nova janela aparece com imagens em tempo real. O progresso da série de tempo e da série de campo de visão são mostrados no topo da janela.
  24. Uma vez que a aquisição da imagem esteja concluída, feche a janela pop-up.
  25. Abra o arquivo ND (arquivo adquirido).
  26. Clique no ROI/ simples editor de ROI. Escolha a opção Círculo.
  27. Selecione o ROI na imagem. Clique em Terminar quando estiver completo.
  28. Clique em Medição/Medição de Tempo para mostrar os dados como um plot ou como uma planilha.
  29. Abra a guia Exportação. Defina os parâmetros de exportação.
  30. Clique em Exportar para salvar as intensidades.

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Representative Results

O smFRET tinha o ribossomo rotulado na posição média do tráfego tRNA, para distinguir a translocação de tRNA do A- para o local P (Figura 1)15. A distância do resíduo de rotulagem L27 para o tRNA A ou P-local é de 52 ou 61 Å, respectivamente, correspondendo à eficiência do FRET de 0,47 e 0,65. Após a coleta de imagens, intensidades de fluorescência dos canais doador e aceitador foram recuperadas e traçadas como lapsos de tempo(Figura 1). A eficiência do FRET foi calculada pela fórmula que euaceito/(Aceitor+douo doador). Um programa caseiro detectou o branqueamento de etapa única do doador/aceitador e instalou os dados antes dos pontos de branqueamento para evitar o cálculo do FRET dos ruídos. Após o branqueamento do doador, ambos os traços se aproximaram da linha de base porque nenhuma excitação pode ocorrer diretamente no aceitador (Figura 2A). Após o branqueamento do aceitador, a intensidade do doador aumentou porque menos vias de reação dissipam a energia de excitação (Figuras 2B,C).

Verificou-se que os ribossomos individuais apresentam flutuações diferentes, como nos exemplos mostrados na Figura 2. Essas flutuações se devem ao movimento oscilante das tRNAs, que causa flutuações de distância para o L2717,18. Na Figura 2,as linhas pontilhadas são os dados originais, e linhas sólidas são os dados ajustados do programa. Os traços instalados não alteram a leitura de dados brutos, mas truncam os traços de lapso de tempo após o branqueamento. Os traços azuis são as eficiências calculadas do FRET. Ao rastrear exatamente os mesmos ribossomos após a incubação de 5 min na RT, descobriu-se que um tipo de dinâmica pode mudar para outro23. Como esses sinais relatam os movimentos do tRNA ditados pelo ribossomo circundante, eficiências semelhantes do FRET foram agrupadas em várias subpopulações ribossas.

A Figura 3 apresenta subpopulações muito diversas no complexo PRE. Existem aproximadamente 70% (640/951) de espécies flutuantes e 30% (311/951) de espécies não flutuantes. Essas duas categorias podem ser agrupadas em subpopulações mais finas. Por outro lado, a Figura 4 mostra a distribuição da dinâmica oposta. No POST, 65% das subpopulações não são flutuantes, e a maioria delas apresentou alta eficiência de FRET. Esses resultados indicam que o ribossomo é mais flexível no estado PRE do que o estado POST, o que corrobora um estudo crio-EM que concluiu que a cadeia de peptidyl no local P bloqueia a dinâmica do ribossomo no estado POST. No entanto, no estado PRE, a cadeia de peptidyl é transferida para o local A, desbloqueando o ribossomo e promovendo5. Os resultados apoiaram a conclusão do estudo da estrutura em condições mais fisiológicas. O estado desbloqueado está correlacionado com o movimento de catraca entre os 30S e 50S, e o estado bloqueado está correlacionado com a conformação não catraca.

O método de classificação da subpopulação revela a conformação ribossa após a inibição pelo antibiótico viomicina, conforme mostrado na Figura 514. O histograma de eficiência do FRET mostra um grande pico de 0,47, o estado clássico, sem classificação. Neste estado, o ribossomo está trancado e sem catraca. No entanto, a triagem das subpopulações revelou que 60% da população está flutuando como o complexo PRE desbloqueado. Portanto, a viomicina prendeu o ribossomo no estado catraca. Os resultados deste estudo contradizem um resultado de estrutura de raio-x no momento da publicação (2010), mas foram apoiados recentemente por outro estudo de estrutura (2020).

Figure 1
Figura 1: A posição de rotulagem do Cy3/Cy5 no ribossomo e no tRNA. As distâncias entre o resíduo de rotulagem de L27 para o tRNA A e P-local são mostradas (as estrelas vermelha e azul mostram os locais de rotulagem aproximados do Cy5 e Cy3, respectivamente). Um traço de lapso de tempo representativo das intensidades de fluorescência do par CY3/Cy5 FRET é mostrado. Um programa detecta pontos de branqueamento nos traços de doador/aceitador e trunca o traço antes desse ponto. Este número foi modificado a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Os traços típicos de ribossomos foram classificados por suas diferentes dinâmicas. (A) Um traço ribossomo não flutuante. (B) Um traço ribossomo flutuante que só amostra valores de FRET inferiores a 0,6. (C) Um traço ribossomo flutuante que amostra valor DE FRET superior a 0,6. As lendas são mostradas na trama. As intensidades de fluorescência do doador e do aceitador são verdes e magentas, respectivamente. Os valores de FRET são calculados comoaceitodor/(Aceitodor +Eudoador) e plotados separadamente em azul. Os dados originais são exibidos em linhas pontilhadas e os dados truncados antes que os pontos de branqueamento sejam exibidos em linhas sólidas. Este número foi modificado a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Histogramas de eficiência FRET do Pré-complexo. As tramas de primeira linha mostram o histograma FRET dos ribossomos totais. As tramas de segundo nível mostram os histogramas FRET dos ribossomos separados em grupos flutuantes (F) e não flutuantes (NF). As tramas de terceiro nível mostram os histogramas FRET dos ribossomos ainda mais separados em grupos de flutuações que estavam acima ou abaixo de um valor FRET de 0,6. Critérios semelhantes foram aplicados aos ribossomos NF para separá-los em estados fret estáveis abaixo ou acima de 0,6 (NF-baixo, NF-high). As parcelas de quarto nível exibem os traços representativos para cada subpopulação. Este número foi modificado a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Histogramas de eficiência FRET de PÓS-Complexo. O arranjo e o agrupamento são semelhantes à Figura 3. Ao contrário da Figura 3,a população nf-alta é a maioria. Este número foi modificado a partir de Altuntop, M. E. et al.15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Histogramas do complexo PRE na presença de 100 μM viomicina. O arranjo e o agrupamento são semelhantes à Figura 3. Este valor foi modificado de Ly, C. T. et al.14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O SmFRET é sensível aos sinais de fundo. Primeiro, é necessário revestir a câmara de amostra com 0,05% de interpolação e, em seguida, ser adicionado simultaneamente com a solução ribossosome para bloquear a ligação não específica do ribossomo à superfície. Para ver fluorescência da emissão de Cy5 aceitante, o coquetel de catadores de oxigênio (soluções de desoxi, glicose e Trolox) é essencial. Sem essa solução, o branqueamento é muito rápido no canal de aceitação para obter informações úteis. Outro passo crítico para experimentos ribossos, especificamente, é o revestimento PEG na superfície do vidro. A atividade ribossosomea é sensível ao ambiente superficial; portanto, polímeros de escovação longa são essenciais para proteger efeitos de superfície desfavoráveis.

Se o estágio amostral estiver muito longe do foco, o sistema de foco automático não funcionará. Se isso acontecer, desligue o foco automático e ajuste manualmente a posição objetiva enquanto observa o ponto laser refletido. Esta é uma vantagem de uma iluminação de reflexão interna total construída em casa porque o ponto laser é visível. Quando o objetivo está próximo do foco, o incidente e os pontos laser refletidos devem estar lado a lado, e o ponto refletido se move com o ajuste da posição objetiva. Quando esses dois pontos estiverem próximos, o foco automático funcionará novamente.

Uma limitação do smFRET é a faixa de concentração muito baixa. Apenas até 50 nM de substratos fluorescentes rotulados podem ser carregados sem causar inibição do ruído de fundo. Embora as amostras ligadas à superfície possam exigir aquisição de longa data na mesma molécula, a resolução de tempo é limitada à faixa ms, enquanto o smFRET confocal baseado em difusão pode alcançar a dinâmica da faixaμs 24. Outra limitação do método FRET é o cálculo preciso da distância da eficiência do FRET. Devido a diferentes elos de corante e ambientes, a distância forster varia de laboratório para laboratório. Portanto, comparar a distância absoluta pode ser problemático25. Embora a mudança de eficiência do FRET revele o mecanismo de translocação, uma estratégia mais direta foi desenvolvida para medir a cobertura exata do ribossomo no mRNA26,27.

No entanto, usar os valores de FRET como referências relativas para distinguir populações inhomogêneas dentro de um cenário experimental é um método poderoso para revelar mecanismo e dinâmica de uma molécula de cada vez, que não é acessível com métodos convencionais. Além disso, o FRET multicolorido e a combinação de FRET com uma armadilha óptica revelarão dinâmicas ribossósmas mais orquestradas no futuro28. Esses desenvolvimentos estão fornecendo sensibilidade sem precedentes (deslocamento de distância Å) e novos parâmetros (como forças de magnitude pico-Newton) que não são alcançáveis com os métodos existentes28.

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Disclosures

Wang declara que não há conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde dos EUA (R01GM111452) e pela Fundação Welch (E-1721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Bioquímica Edição 173
Estudo de transferência de energia de fluorescência única da síntese de proteína ribossa
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Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

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