Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

Published: July 6, 2021 doi: 10.3791/62664
Automatic Translation
1
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston

Summary

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız sınırlayıcı adımları ve düşük nüfuslu anahtar ara maddeleri gözlemleyebilir.

Abstract

Ribozom, proteinleri mRNA şablonları boyunca işlemsel olarak bir araya getiren büyük bir ribononcleoprotein kompleksidir. Ribozom çapı, A, P ve E-sahalarında büyük tRNA substratlarını barındırmak için yaklaşık 20 nm'dir. Sonuç olarak, ribozom dinamikleri doğal olarak hızlı bir şekilde fazdan arındırılır. Tek molekül yöntemi, her ribozomları ayrı ayrı algılayabilir ve çok bileşenli sistemlerin karmaşık mekanizmalarını ortaya çıkarmak için gerekli olan inhomogeneous popülasyonları ayırt edebilir. Ribozomal protein L27 ve tRNA'lar arasındaki ribozom dinamiklerini araştırmak için Nikon Ti2 ters mikroskobuna dayanan bir smFRET yönteminin ayrıntılarını rapor ediyoruz. L27, benzersiz Cys 53 pozisyonunda etiketlenmiştir ve L27'den yoksun olarak tasarlanmış bir ribozom haline yeniden inşa edilmiştir. tRNA dirsek bölgesinde etiketlenmiştir. tRNA, uzama döngüsü sırasında ribozom içinde translokasyon öncesi ve sonrası gibi farklı yerlere taşınırken, FRET verimlilikleri ve dinamikleri birden fazla alt nüfus öneren farklılıklar sergiler. Bu alt nüfuslar topluluk yöntemleri ile tespit edilemez. TIRF tabanlı smFRET mikroskop, ev yapımı lazer aydınlatmalı manuel veya motorlu ters mikroskop üzerine inşa edilir. Ribozom örnekleri ultrasantrifüjleme ile saflaştırılarak ev yapımı çok kanallı bir örnek hücreye yüklenir ve daha sonra evanescent lazer alanı ile aydınlatılmıştır. Yansıma lazer noktası, mükemmel odağın geri bildirim kontrolünü elde etmek için kullanılabilir. Floresan sinyalleri motorlu bir filtre kulesi ile ayrılır ve iki dijital CMOS kamera tarafından toplanır. Yoğunluklar NIS-Elements yazılımı aracılığıyla alınır.

Introduction

Ribozom, büyük (50S) ve küçük (30S) bir alt birenin ø 20 nm büyük ribonükleoprotein kompleksidir. mRNA şablonu boyunca uzun peptitleri işlemsel ve işbirliği içinde birleştirir. Ribozom 30S, protein sentezine başlamak içinfMet-tRNA fMet ve mRNA'ya bağlanır ve 50S daha sonra 70S başlatma kompleksini oluşturmak için birleşir. TRNA'lar amino asitleri A-sitesindeki (aminoasil- tRNA bağlama bölgesi) ribozomlara getirirken, uzun peptidil zinciri P-sitesinde (peptidyl- tRNA bağlama bölgesi) tutulur. Ön translokasyon kompleksinde, peptidyl zinciri bir amino asit eklenerek A sahasındaki tRNA'ya aktarılır. Bu arada, P-site tRNA'sı devre dışı bırakılır. Daha sonra, A-, P-tRNA'lar, E-sitenin tRNA çıkış sitesini temsil ettiği translokasyon sonrası kompleksini oluşturmak için P-, E-sitelerine taşınır. Bu durumda, peptidyl-tRNA P bölgesine geri döner. Ribozom mRNA üzerinde yer alırken, uzama döngüsü öncesi ve sonrası konformasyonlar arasında devam eder, her seferinde bir kodon1. Ribozom, bu işlemi verimli ve doğru hale getirmek için farklı fonksiyonel sitelerin son derece koordine edicidir, örneğin alt biralar arası cırcır2, tRNA hibridizasyon dalgalanmaları3, GTPase aktivasyonları4, L1 sap açma-kapama5,vb. Sonuç olarak, ribozomlar hızla fazdan arındırılır, çünkü her molekül kendi hızında hareket eder. Geleneksel yöntemler sadece belirgin ortalama parametreleri ortaya yaratabilir, ancak düşük nüfuslu veya kısa ömürlü türler ortalama etki6' da maskelenecektir. Tek molekül yöntemi, her ribozom ayrı ayrı tespit ederek bu sınırlamayı kırabilir, daha sonra istatistiksel rekonstrüksiyon ile farklı türleri tanımlayabilir7. tRNA-tRNA8, EF-G-L119,L1-tRNA10vb. Ek olarak, sırasıyla büyük ve küçük alt ünlemler etiketlenerek, alt biralar arası cırcır kinetiği ve faktörlerle koordinasyon gözlenir11,12. Bu arada, smFRET yöntemi diğer merkezi biyolojik süreçlerde geniş uygulamalara sahiptir ve çok renkli FRET yöntemleri ortaya13.

Daha önce yeni bir ribozom FRET çifti geliştirildi14,15. Rekombinant ribozomal protein L27 ifade edildi, saflaştırıldı ve etiketlendi ve ribozom içine geri dahil edildi. Bu protein tRNA'larla yakın mesafede etkileşime girdi ve translokasyon sonrası komplekste P bölgesi tRNA'sının stabilizesine yardımcı oldu. tRNA, A-'dan P bölgesine taşındığında, bu protein ile tRNA arasındaki mesafe kısalır ve bu da smFRET sinyali ile ayırt edilebilir. İstatistiksel yöntemler ve mutajensis kullanılarak birden fazla ribozom alt popülasyonu tanımlanmıştır ve bu popülasyonların translokasyon öncesi ancak sonrası komplekste kendiliğinden değişimi ribozomların mRNA'ya geçmeden önce daha esnek ve16, 17,18'indekodlanması sırasında daha sert olduğunu göstermektedir. Bu varyasyonlar ribozom fonksiyonu için gereklidir. Burada, protokol ribozom / tRNA etiketlemesinin ayrıntılarını, ribozom, smFRET örnek hazırlama ve veri toplama / analiz19'a dahil etmelerini açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FRET tespiti için etiketli ribozom ve tRNA hazırlanması

  1. L27 olmadan ribozomları standart protokollere göre E. coli strain IW312'den izole edin20,21. Normal ribozomları E. coli strain MRE600'den çıkarın.
  2. L27'nin rpmA genini C-terminal His-tag ile BL21(DE3)pLysS hücreleri15'tedönüştürülen ve ifade edilen pET-21b (+) plazmid içine klonla. Proteini önceden paketlenmiş bir sepharose sütunu ile arındırın.
  3. L27 etiketlemesi
    1. Oda sıcaklığında (RT) 2-10 kat fazla TCEP (Tris-2-karboksitetil-fosfin) ile 100 μL'de 20-100 μM saflaştırılmış L27'yi 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tampon, çözeltiyi bir nap-5 sütunu kullanarak PBS tamponuna(10mM Na 2 HPO4, 1,8 mM KH 2 PO4, 2,7 mM KCl; 0,137 M NaCl) değiştirin. DMSO'daki 10 kat fazla Cy5-maleimid mono-reaktif boyayı çözeltiye ekleyin ve RT'de karanlıkta 2 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Fazla boyayı çıkarmak için yukarıda belirtilen etiketli protein çözeltisini (500 μL) bir Nap-5 sütununa yükleyin. Proteinin ilk renkli bantta, ardından sırasıyla ikinci bantta serbest boya elutesinde elutes olduğundan emin olun. Elde edilen proteini 1 mL TAM10 tamponunda (20 mM tris-HCl (pH 7.5), 10 mM Mg (OAc)2, 30 mM NH4Cl, 70 mM KCl, 0.5 mM EDTA ve 7 mM BME (2-mercaptoethanol)) olarak toplayın.
  4. Ribozomları L27 ile yeniden inşa edin. Etiketli L27 proteinini TAM10 tamponunda eşit miktarda IW312 ribozom ile karıştırın ve 1 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Ribozomların tüpün dibinde mavi renkli bir pelet oluşturmasına izin vermek için serbest proteini sakkaroz yastığı ultrasantrifüjasyonu (bir gecede 100.000 x g)ile çıkarın.
  5. Daha önce yayınlanan rapora göre tRNAPhe'yi etiketle22. İlk olarak, tRNA'yı (1 mL suda10 A 260) 100 μL NaBH4 (100 mM stok, damla yönünde ekleyerek) 0 °C'de 1 saat boyunca kuluçkaya bırakın. 1/10 hacimli 3 M KAc (pH5.0) ve 2,5x etanol hacmi ekleyerek tRNA'ları üç kez etanol çökeltme yoluyla yayınlanmamış NaBH 4'ten serbest bırakın. Azaltılmış tRNA'yı 1 μL Cy3-NHS boya çözeltisi (10 μL DMSO'da 1 mg) ile 0,1 M sodyum formatında (pH 3,7) minimum hacimde (~20 μL) kuluçkaya yatırın. 37 °C'de 2 saat inkübasyondan sonra, tRNA'yı küçük bir G25 Sephadex sütunu aracılığıyla yayınlanmamış boyadan ayırın ve ardından iki kez etanol çökeltme yoluyla serbest boyayı çıkarın.

2. Ribozom komplekslerinin hazırlanması

  1. STANDART YÖNTEMLER15kullanarak IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts ve tRNA sentezlerinin His etiketli proteinlerini eksprese edin ve arındırın.
  2. 37 °C'deTAM 10 tampona 15 dakika boyunca aşağıdaki bileşenleri ekleyerek başlatma karışımını hazırlayın: etiketli ribozomun 1 μM'si; IF1, IF2 ve IF3'ün her biri 1,5 μM; 2 μM biyotinillenmiş mRNA (ilk iki amino asit için kodlama MF); 4 μM şarjlı fMet-tRNAfMet; ve 1 mM GTP.
  3. Aşağıdaki bileşenleri 37 °C'de TAM 10 tamponunda15 dakika boyunca karıştırarak EF-Tu_G karışımını hazırlayın: 4 μM EF-Tu, 0,4 μM EF-Ts, 2 μM EF-G, 4 mM GTP, 4 mM PEP ve 0,02 mg/mL Pyruvate Kinaz.
  4. EF-Tu_NoG G olmadan 2.3.
  5. Aşağıdaki malzemeleri 37 °C'de nükleaz içermeyen suda 15 dakika karıştırarak Phe karışımını hazırlayın: 100 mM Tris (pH 7.5), 20 mM MgAc2, 1 mM EDTA, 4 mM ATP, 7 mM BME, 2 mM Fenilalanin özgü sentez, 2 A260/mL etiketli tRNAPheve 50 μM fenilalanin.
  6. Başlatma, EF-Tu_NoG ve Phe karışımlarını 1:2:2 oranında, 37 °C'de 2 dakika karıştırarak ön translokasyon kompleksini (PRE) hazırlayın. Kuluçkadan sonra, PRE'yi 100.000 x g'dabir gecede 1,1 M sakkaroz yastığı ultrasantrifüjleme ile arındırın.
  7. İnisiyonu, EF-Tu_WG ve Phe karışımlarını 10 dakika boyunca 37 °C'de 1:2:2 oranında karıştırarak translokasyon sonrası kompleksini (POST) hazırlayın. Kuluçkadan sonra, POST'u 100.000 x g'dabir gecede 1,1 M sakkaroz yastığı ultrasantrifüjleme ile arındırın.

3. Örnek slaytların hazırlanması

  1. Altı çift delik (1 mm çapında) içeren mikroskop cam slaytları (75 mm x 25 mm) temizleyin. Her çift, numune odasının bir giriş çıkışını oluşturur. Her giriş çıkış deliği arasındaki mesafenin 13 mm ve iki kanal arasındaki merkezden merkeze mesafenin 6 mm olduğundan emin olun. Cam bir potaya altı slayt yerleştirin.
  2. Potayı asetonla doldurun ve 5 dakika boyunca sonicate edin. Asetonu deşin ve slaytları ultra saf suyla üç kez durulayın. Potayı tekrar su ve 10 M KOH 1 mL ile doldurun. 20 dakika boyunca sonicate.
  3. Slaytları ultra saf suyla üç kez durulayın. Potayı tekrar etanol ve sonikat ile 5 dakika doldurun. Çözücüyü tamamen boşalt. Kaydıraların duman kaputunda kurumasına izin verin.
  4. Mikroskop cam kapak kapaklarını temizleyin (#1,5 kalınlık, 24 x 40 mm). Temizleme adımlarını 3.1-3.3 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin.
  5. Temizlenmiş kaydırakları ve kapakları 300 °C'de 3 saat pişirin. Soğumaları için gece boyunca fırında tutun.
  6. Kapak kapağını aminosilane ile kapla. Kapaklar içeren potada, metanol karışımı (100 mL metanol, 5 mL su, 0,5 mL HAc ve 1 mL aminosilane) dökün. Potayı bir su banyosunda 10 dakika ısıtın, 10 dakika boyunca sonicate edin ve ardından su banyosundaki potayı 10 dakika daha ısıtın. Metanol karışımını demleyin, örtüyü üç pota temiz suda iyice durulayın. Yüzeyleri kuru bir azot akışı ile bir iğneden arındırın.
  7. Kapakları laminar temiz bir kaputta biotin-PEG ile kapla.
    1. PEG çözeltisini yapmak için, 100 mM NaHCO 3 çözeltisinin 200 μL'sinde 98 mg PEG ve 2-3 mgbiyotin-PEG kullanın.
    2. Bir örtü kapağı bir yüzeye düz bir şekilde döşeyin. Üst kenara dikkatlice 60 μL PEG çözeltisi bırakın. Daha sonra, üzerine başka bir kapak kılıfı yerleştirin ve kılcal damar etkisinin çözeltiyi iki kapak arasına yaymasına izin ver. Kabarcık oluşmamasını sağlayın.
    3. İki çift kapak için 3.7.2 adımını yineleyin. Altı parça örtü parçasını biotin ile kaplayın. Daha fazla kapak kılıfı gerekiyorsa, daha fazla PEG çözümü yapmak için PEG ve Biotin PEG miktarını buna göre ayarlayın.
    4. Bu kapakları suyla dolu boş bir uç kutusunda saklayın ve karanlıkta 3 saat kuluçkaya yatırın.
    5. 3 saat sonra kapakları ayırın, art arda üç potada suyla durulayın ve kuru bir azot akışı ile arındırın. Kaplamalı kapakları seramik bir rafa yerleştirin. Yüzeyi kaplama ile işaretleyin.
  8. Numune odalarını birleştirin19.
    1. Cam kaydıraklardaki deliklerden keskin pipet uçlarını sıkıca oturana kadar çekin. Keskin uçları cam yüzeye tamamen düz olana kadar kazıyın. Numune yüklemesi için ucun diğer ucunu yaklaşık 5 mm olacak şekilde kesin.
    2. Üzerinde kanal deseni (25 x 40 mm) olan çift yüzlü bir bant kesin.
    3. Çift yüzlü bandı düz taraftaki cam slaytlara yapıştırın.
    4. Kaplamalı kapak sapını çift yüzlü bant üzerine yapıştırın. Numune odasının sıkı bir mührünü yapmak için üzerine bastırın. Kaplamalı tarafın içe dönük olduğundan emin olun.

4. Tek molekül FRET görüntüleme

  1. Bilgisayarı açın.
  2. Mikroskop anahtarını aç.
  3. Lazer kontrol arayüzünü başlatın ve lazeri açın. Lazeri ısıtmak için lazer kontrol kutusundaki etkinleştir düğmesine basın.
  4. Kameraları açın.
  5. Mikroskopla ilişkili yazılım programını başlatın. Üst deklanşörü kapalı'yı tıklatın ve lambaaçık 'ı tıklatın.
  6. TAM 10_WT tamponuna 10 mL TAM 10 arabelleğe %5 Ara-20 10 μL ekleyerek TAM10'u hazırlayın.
  7. Küçük bir mikrosantrifüj tüpünde 3 mg glikoz oksidaz tartarak deoksi çözeltisini hazırlayın. 45 μL katalaz ekleyin. Katıyı eritmek için vorteks hafifçe. 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüjde 20.000 x g'da döndürün. Üst subayı al.
  8. Suda %30 glikoz çözeltisi ve DMSO'da 200 mM Trolox çözeltisi hazırlayın.
  9. Nükleaz içermeyen suda 0,5 mg/mL streptavidin çözeltisi hazırlayın.
  10. TIRF hedefine bir damla görüntüleme yağı ekleyin.
  11. Örnek odaları hedefe koyun.
  12. Odayı 10 μL streptavidin çözeltisi ile doldurun. 1 dakika bekleyin.
  13. Hazneyi 30 mL TAM10_WT tamponu ile yıkayın ve katlanmış bir filtre kağıdı ile çalıştırılan çözeltiyi toplayın. 1 dakika bekleyin.
  14. Ribozom komplekslerini (PRE veya POST) TAM 10 _WT tampon ile10-50 nMkonsantrasyona seyreltin.
  15. Ribozom örneğinin 20 μL'lik kısmını kanala yükleyin. 2 dakika bekleyin.
  16. Görüntüleme tamponu yapın (50 μL TAM10 tampon artı deoksi, glikoz ve Trolox çözeltilerinin her biri 0,5 μL). Tamponu iyice karıştırın.
  17. Hazneyi görüntüleme tamponunun 30 μL'si ile yıkayın.
  18. Kamerayı 100 ms/kare, 16 bit, 4 x 4 binning kazanacak şekilde ayarlayın.
  19. Üst deklanşörü Açık ve lamba kapalı'yı tıklatın.
  20. Kamera alımını başlatın. Görüntüleri iki ayrı kamerayı ve kaplamayı temsil eden üç pencereye yayın.
  21. Otomatik odakla 'yatıklayın. En iyi odağı bulmak için ince ayar yapın.
  22. Bir yönteme tıklayın. Alan noktalarını, dosya depolama alanını ve döngü numarasını ayarlayın.
  23. Çalıştır'ı tıklatın.
    NOT: Gerçek zamanlı görüntüleme ile yeni bir pencere görüntülenir. Zaman serisi ve görüş alanı serisinin ilerlemesi pencerenin üst kısmında gösterilir.
  24. Görüntü alma işlemi tamamlandıktan sonra açılır pencereyi kapatın.
  25. ND dosyasını (alınan dosya) açın.
  26. RoI / basit yatırım getirisi editörünetıklayın. Daireseçeneğini belirleyin.
  27. Görüntüdeki yatırım getirisini seçin. Tamamlandığında Bitir'e tıklayın.
  28. Verileri bir çizim veya elektronik tablo olarak göstermek için Ölçüm / Zaman Ölçümü'ne tıklayın.
  29. Dışarı Aktar sekmesini açın. Verme parametrelerini ayarlayın.
  30. Yoğunlukları kaydetmek için Dışa Aktar'a tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SmFRET, tRNA translokasyonunu A-'dan P bölgesine ayırt etmek için ribozomları tRNA trafiğinin orta konumuna etiketlemiştir (Şekil 1)15. L27 etiketleme kalıntısından A veya P bölgesi tRNA'sına olan mesafe sırasıyla 52 veya 61 Å'dır ve 0,47 ve 0,65 FRET verimliliğine karşılık gelendir. Görüntü toplamadan sonra donör ve alıcı kanallardan floresan yoğunlukları alınarak zaman aşımı olarak çizilmiştir (Şekil 1). FRET verimliliğikabul ettiğimformülle hesaplandı /( Kabulediyorum+Donör). Ev yapımı bir program, donörün/alıcının tek adımlı ağartmasını tespit etti ve gürültülerden FRET'in hesaplanmasını önlemek için verileri ağartma noktalarından önce taktı. Donör ağartma işleminden sonra, her iki iz de taban çizgisine yaklaştı, çünkü doğrudan alıcıda herhangi bir ekscitasyon gerçekleşemez (Şekil 2A). Kabul eden ağartmadan sonra, daha az reaksiyon yolu uyarım enerjisini dağıttığı için donör yoğunluğu artmıştır (Şekil 2B,C).

Tek tek ribozomların Şekil 2'de gösterilen örneklerde olduğu gibi farklı dalgalanmalar gösterdiği bulunmuştur. Bu dalgalanmalar, L27 17,18'emesafe dalgalanmalarına neden olan tRNA'larınsallananhareketinden kaynaklanmaktadır. Şekil 2'de noktalı çizgiler özgün verilerdir ve katı çizgiler programdan takılan verilerdir. Takılan izler ham veri okumasını değiştirmez, ancak ağartma işleminden sonra zaman atlamalı izleri kesilir. Mavi izler hesaplanan FRET verimlilikleridir. RT'de 5 dakikalık inkübasyondan sonra aynı ribozomları izleyerek, bir dinamik türünün başka bir23'e geçebileceği bulunmuştur. Bu sinyaller çevredeki ribozom tarafından dikte edilen tRNA hareketlerini rapor ettiği için, benzer FRET verimlilikleri çeşitli ribozom alt nüfusları olarak gruplandı.

Şekil 3, PRE kompleksinde çok çeşitli alt nüfusları göstermektedir. Dalgalanan türlerin yaklaşık %70'i (640/951) ve dalgalanmayan türlerin %30'u (311/951) vardır. Bu iki kategori daha ince alt nüfuslar halinde daha fazla gruplandırılabilir. Öte yandan, Şekil 4 tam tersi dinamik dağılımını göstermektedir. POST'ta, alt nüfusların% 65'i dalgalanmamaktadır ve çoğunluğu yüksek FRET verimliliği sergilemektedir. Bu sonuçlar, ribozomların PRE durumunda POST durumundan daha esnek olduğunu göstermektedir, bu da P sitesindeki peptidiyl zincirinin POST durumundaki ribozom dinamiklerini kilitlediği sonucuna varan bir kriyo-EM çalışmasını doğrulamamaktadır. Bununla birlikte, PRE durumunda, peptidyl zinciri A sitesine aktarılır, ribozomların kilidini açar ve5. Sonuçlar, daha fizyolojik koşullar altında yapı çalışması sonucunu destekledi. Kilidi açılmış durum, 30S ve 50S arasındaki cırcır hareketiyle ilişkilidir ve kilitli durum, cırcırsız uygunlukla ilişkilidir.

Subpopülasyon sıralama yöntemi, Şekil 514'tegösterildiği gibi antibiyotik viomisinin inhibisyonunda ribozom konformasyonunu ortaya koymaktadır. Genel FRET verimlilik histogramı, sıralama yapmadan klasik durum olan 0,47'de büyük bir zirve gösterir. Bu durumda, ribozom kilitli ve cırcırsız. Bununla birlikte, alt popülasyonları sıralamak, nüfusun% 60'ının kilidi açılmış PRE kompleksi olarak dalgalı olduğunu ortaya çıkarmıştır. Bu nedenle, viomycin ribozomları cırcırlı durumda hapsetmiş. Bu çalışmanın sonuçları, yayın sırasında (2010) bir x-ışını yapısı sonucuyla çelişti, ancak yakın zamanda başka bir yapı çalışması (2020) tarafından desteklendi.

Figure 1
Şekil 1: Cy3/Cy5'in ribozom ve tRNA üzerindeki etiketleme konumu. L27'nin etiketleme kalıntısı ile A ve P bölgesi tRNA arasındaki mesafeler gösterilir (kırmızı ve mavi yıldızlar sırasıyla Cy5 ve Cy3'ün yaklaşık etiketleme konumlarını gösterir). CY3/Cy5 FRET çiftinden floresan yoğunluklarının bir temsili zaman atlamalı izi gösterilmiştir. Bir program donör/alıcı izlerinde ağartma noktalarını algılar ve bu noktadan önce izlemeyi kesilir. Bu rakam Altuntop, M. E. vd.15.'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Tipik ribozom izleri farklı dinamikleri tarafından sınıflandırılmıştır. (A) Dalgalanmayan bir ribozom izi. (B) Sadece FRET değerlerini 0,6'dan daha düşük örnekleyen dalgalı bir ribozom izi. (C) FRET değerini 0,6'dan daha yüksek örnekleyen dalgalı bir ribozom izi. Efsaneler arsada gösterilir. Donör ve kabul edenin floresan yoğunlukları sırasıyla yeşil ve macentadır. FRET değerleri kabul eden/(Kabuleden+Idonör)olarak hesaplanır ve mavi ile ayrı ayrı çizilir. Orijinal veriler noktalı çizgiler halinde görüntülenir ve ağartma noktaları düz çizgiler halinde görüntülenmeden önce veriler kesilir. Bu rakam Altuntop, M. E. vd.15.'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Pre-complex'in FRET verimlilik histogramları. Üst düzey çizimler, toplam ribozomların FRET histogramını gösterir. İkinci katman çizimler, ribozomların FRET histogramlarını dalgalı (F) ve dalgalanmayan (NF) gruplara ayırır. Üçüncü seviye arsalar, ribozomların FRET histogramlarını, 0,6'lık bir FRET değerinin üstünde veya altında olan dalgalanma gruplarına daha fazla ayrıldığını göstermektedir. Benzer kriterler NF ribozomlarına da uygulanarak 0,6'nın (NF-low, NF-high) altındaki veya üzerindeki stabil FRET durumlarına ayırıldı. Dördüncü katman çizimleri, her alt nüfus için temsili izlemeleri görüntüler. Bu rakam Altuntop, M. E. vd.15.'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: POST-Complex'in FRET verimlilik histogramları. Düzenleme ve gruplandırma Şekil 3'e benzer. Şekil 3'ünaksine, NF-High nüfusu çoğunluktadır. Bu rakam Altuntop, M. E. vd.15.'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: PRE kompleksinin histogramları 100 μM viomycin varlığında. Düzenleme ve gruplandırma Şekil 3'e benzer. Bu rakam Ly, C. T. ve ark.14'ten değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SmFRET arka plan sinyallerine duyarlıdır. İlk olarak, numune odasını% 0.05 ara ile kaplamak ve daha sonra ribozom çözeltisi ile eşzamanlı olarak ribozom çözeltisi ile birlikte ribozomun yüzeye spesifik olmayan bağlanmasını engellemek için eklenebilir. Kabul eden Cy5 emisyonundan floresan görmek için oksijen çöpçü kokteyli (deoksi, glikoz ve Trolox çözeltileri) gereklidir. Bu çözüm olmadan, beyazlatma, yararlı bilgi elde etmek için kabul eden kanalda çok hızlıdır. Ribozom deneyleri için özellikle kritik bir adım, cam yüzeyindeki PEG kaplamasıdır. Ribozom aktivitesi yüzey ortamına duyarlıdır; bu nedenle, elverişsiz yüzey etkilerini korumak için uzun fırçalama polimerleri gereklidir.

Örnek aşama odaklamadan çok uzaksa, otomatik odaklama sistemi çalışmaz. Bu durumda, otomatik odağı kapatın ve yansıyan lazer noktasını gözlemlerken nesnel konumu manuel olarak ayarlayın. Bu, lazer noktası görünür olduğu için ev yapımı toplam iç yansıma aydınlatmasının bir avantajıdır. Amaç odaklanmaya yakın olduğunda, olay ve yansıyan lazer lekeleri yan yana olmalıdır ve yansıtıcı nokta nesnel pozisyonun ayarlanmasında hareket eder. Bu iki nokta yakın olduğunda, otomatik odaklama tekrar çalışır.

SmFRET'in bir sınırlaması çok düşük konsantrasyon aralığıdır. Arka plan gürültüsünü engellemeden sadece 50 nM'ye kadar floresan etiketli substrat yüklenebilir. Yüzeye bağlı numuneler aynı molekül üzerinde uzun süre edinim gerektirse de, zaman çözünürlüğü MS aralığı ile sınırlıdır, difüzyon bazlı konfokal smFRET ise μs aralığının dinamiklerine ulaşabilir24. FRET yönteminin bir diğer sınırlaması, FRET verimliliğinden uzaklıkların hassas bir şekilde hesaplanmasıdır. Farklı boya linkleri ve ortamları nedeniyle Forster mesafesi laboratuvardan laboratuvara değişir. Bu nedenle, mutlak mesafeyi karşılaştırmak sorunlu olabilir25. FRET verimlilik değişimi translokasyon mekanizmasını ortaya açığa çıkarmakla birlikte, ribozomların mRNA26,27üzerindeki tam kapsamını ölçmek için daha doğrudan bir strateji geliştirilmiştir.

Bununla birlikte, FRET değerlerini tek bir deneysel ortamdaki inhomogeneous popülasyonları ayırt etmek için göreceli referanslar olarak kullanmak, geleneksel yöntemlerle erişilemeyen mekanizmayı ve dinamikleri aynı anda bir molekülü ortaya çıkarmak için güçlü bir yöntemdir. Ayrıca, çok renkli FRET ve FRET'in optik tuzakla kombinasyonu gelecekte daha düzenlenmiş ribozom dinamiklerini ortaya çıkacaktır28. Bu gelişmeler, mevcut yöntemlerle elde edilemeyen benzeri görülmemiş hassasiyet (şmesafesinin yer değiştirmesi) ve yeni parametreler (pico-Newton büyüklüğü kuvvetleri gibi) sağlıyor28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Y. Wang çıkar çatışması olmadığını ilan eder.

Acknowledgments

Bu çalışma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01GM111452) ve Welch Vakfı (E-1721) tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aminosilane Laysanbio MPEG-SIL-5000
Biotin-PEG Laysanbio Biotin-PEG-SVA-5000
BL21(DE3)pLysS cells Novagen 71403
Catalase millipore sigma C3515
CS150FNX Micro Ultracentrifuge nuaire
Cy3/C5-maleimide ApexBio A8138/A8140
ECLIPSE Ti2 inverted microscope Nikon
EdgeGARD Laminar Flow Hood Baker
Glucose oxidase millipore sigma G2133
Histrap HP column (Prepacked sepharose column) Cytiva 17524701
Microscope cover slip VWR 48393-230
Microscope glass slides VWR 470235-792
ORCA-Flash4.0 V3 camera Hamamatsu
PEG (5,000) Laysanbio MPEG-SVA-5000
pET-21b (+) plasmid Novagen 69741
Sonicator VWR CPX-952-518R
TCEP Apexbio B6055
Trolox millipore sigma 238813

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ramakrishnan, V. What we have learned from ribosome structures. Biochemical Society Transactions. 36, Pt 4 567-574 (2008).
  2. Frank, J., Agrawal, R. K. A ratchet-like inter-subunit reorganization of the ribosome during translocation. Nature. 406 (6793), 318-322 (2000).
  3. Moazed, D., Noller, H. F. Intermediate states in the movement of transfer RNA in the ribosome. Nature. 342 (6246), 142-148 (1989).
  4. Schmeing, T., et al. The crystal structure of the ribosome bound to EF-Tu and aminoacyl-tRNA. Science. 326 (5953), 688-694 (2009).
  5. Valle, M., et al. Locking and unlocking of ribosomal motions. Cell. 114 (1), 123-134 (2003).
  6. Gromadski, K. B., Rodnina, M. V. Kinetic determinants of high-fidelity tRNA discrimination on the ribosome. Molecular Cell. 13 (2), 191-200 (2004).
  7. Blanchard, S., et al. tRNA dynamics on the ribosome during translation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12893-12898 (2004).
  8. Blanchard, S., et al. tRNA selection and kinetic proofreading in translation. Nature Structural and Molecular Biology. 11 (10), 1008-1014 (2004).
  9. Wang, Y., et al. Single-molecule structural dynamics of ef-g-ribosome interaction during translocation. Biochemistry. 46 (38), 10767-10775 (2007).
  10. Cornish, P., et al. Following the movement of the L1 stalk between three functional states in single ribosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (8), 2571-2576 (2009).
  11. Cornish, P., et al. Spontaneous intersubunit rotation in single ribosomes. Molecular Cell. 30 (5), 578-588 (2008).
  12. Chen, J., et al. Coordinated conformational and compositional dynamics drive ribosome translocation. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (6), 718-727 (2013).
  13. Feng, X. A., Poyton, M. F., Ha, T. Multicolor single-molecule FRET for DNA and RNA processes. Current Opinion in Structural Biology. 70, 26-33 (2021).
  14. Ly, C. T., Altuntop, M. E., Wang, Y. Single-molecule study of viomycin's inhibition mechanism on ribosome translocation. Biochemistry. 49 (45), 9732-9738 (2010).
  15. Altuntop, M. E., Ly, C. T., Wang, Y. Single-molecule study of ribosome hierarchic dynamics at the peptidyl transferase center. Biophysical Journal. 99 (9), 3002-3009 (2010).
  16. Wang, Y., Xiao, M., Li, Y. Heterogeneity of single molecule FRET signals reveals multiple active ribosome subpopulations. Proteins. 82 (1), 1-9 (2014).
  17. Xiao, M., Wang, Y. L27-tRNA interaction revealed by mutagenesis and pH titration. Biophysical Chemistry. 167, 8-15 (2012).
  18. Wang, Y., Xiao, M. Role of the ribosomal protein L27 revealed by single-molecule FRET study. Protein Science. 21 (11), 1696-1704 (2012).
  19. Lin, R., Wang, Y. Automated smFRET microscope for the quantification of label-free DNA oligos. Biomedical Optics Express. 10 (2), 682-693 (2019).
  20. Moazed, D., et al. Interconversion of active and inactive 30 S ribosomal subunits is accompanied by a conformational change in the decoding region of 16 S rRNA. Journal of Molecular Biology. 191 (3), 483-493 (1986).
  21. Wower, I. K., Wower, J., Zimmermann, R. A. Ribosomal protein L27 participates in both 50 S subunit assembly and the peptidyl transferase reaction. Journal of Biological Chemistry. 273 (31), 19847-19852 (1998).
  22. Pan, D., Qin, H., Cooperman, B. S. Synthesis and functional activity of tRNAs labeled with fluorescent hydrazides in the D-loop. RNA. 15 (2), 346-354 (2009).
  23. Yang, H., Xiao, M., Wang, Y. A novel data-driven algorithm to reveal and track the ribosome heterogeneity in single molecule studies. Biophysical Chemistry. 199, 39-45 (2015).
  24. Metskas, L. A., Rhoades, E. Single-molecule FRET of intrinsically disordered proteins. Annual Review of Physical Chemistry. 71, 391-414 (2020).
  25. Hellenkamp, B., et al. Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements-a multi-laboratory benchmark study. Nature Methods. 15 (9), 669-676 (2018).
  26. Tsai, T., et al. High-Efficiency "-1" and "-2" Ribosomal Frameshiftings Revealed by Force Spectroscopy. ACS Chemical Biology. 12 (6), 1629-1635 (2017).
  27. Yin, H., Xu, S., Wang, Y. Dual DNA rulers to study the mechanism of ribosome translocation with single-nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59918 (2019).
  28. Desai, V., et al. Co-temporal force and fluorescence measurements reveal a ribosomal gear shift mechanism of translation regulation by structured mRNAs. Molecular Cell. 75 (5), 1007-1019 (2019).

Tags

Biyokimya Sayı 173
Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, Y. Single Molecule… More

Wang, Y. Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis. J. Vis. Exp. (173), e62664, doi:10.3791/62664 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter