Summary
Este es un método para aislar las células linfoides uterinas de ratones preñados y no preñados. Este método se puede utilizar para múltiples aplicaciones posteriores, como fenotipado FACS, clasificación celular, ensayos funcionales, ARN-seq y proteómica. El protocolo aquí demuestra cómo fenotipar el grupo 1 de las células linfoides innatas uterinas mediante citometría de flujo.
Abstract
Aquí se describe un método simple para aislar y fenotipar células linfoides innatas uterinas del grupo 1 de ratón (g1 uILCs) del útero embarazada individual mediante citometría de flujo. El protocolo describe cómo configurar el apareamiento del tiempo para obtener múltiples presas síncronas, la digestión mecánica y enzimática del útero embarazada, la tinción de suspensiones unicelulares y una estrategia FACS para fenotipar y discriminar a los uILC g1. Aunque este método inevitablemente pierde la información espacial de la distribución celular dentro del tejido, el protocolo se ha aplicado con éxito para determinar la heterogeneidad de uILC, su respuesta a los factores maternos y fetales que afectan el embarazo, su perfil de expresión génica y sus funciones.
Introduction
Aquí se describe un método simple para obtener un alto rendimiento de linfocitos innatos uterinos del útero embarazada individual. Este método preserva la expresión de la superficie proteica y la funcionalidad de los linfocitos innatos uterinos y es adecuado para aplicaciones posteriores como fenotipado FACS, RNAseq, proteómica o ensayos funcionales. Aquí, la atención se centra en el fenotipado de los uILCs del grupo 1 por citometría de flujo.
El útero está compuesto por tres capas: el endometrio, el miometrio y el perimetrio (Figura 1). El endometrio es la mucosa, que recubre la luz del útero. La progesterona, producida por el cuerpo lúteo, convierte el endometrio en decidua. El miometrio está compuesto por dos capas de músculo liso que forman la pared uterina. El perimetrio es la serosa que envuelve el útero y lo conecta con el peritoneo a través del ligamento ancho llamado mesometrio. En una sección transversal del útero, la parte opuesta a la luz se llama lado mesometrial, mientras que la parte cercana a la luz se llama lado antimesometrial. Una variedad de leucocitos maternos pueblan el endometrio y la decidua, incluyendo varios tipos de células, donde las células inmunes innatas representan la gran mayoría de las células. Las células linfoides innatas (ILC), los macrófagos, las células dendríticas (DC), así como los linfocitos T CD4+ y CD8+, las células T reguladoras (Tregs) y las células B raras, pueden desempeñar un papel importante en la regulación del entorno uterino a lo largo del embarazo1,2. Las ILC en el útero se encuentran no solo en la mucosa, sino también en el miometrio en ratones. Incluyendo los tres grupos de ILC, el útero es de hecho el órgano más densamente poblado por ILC del grupo 1. Con la transformación estructural de los tejidos uterinos a lo largo de la gestación, el número y la proporción de leucocitos uterinos también cambian (ver Figura 2A para un ejemplo de variaciones en el porcentaje de subconjuntos uILC del grupo 1)3,4.
Cuando se hace referencia a los ratones en este documento, se refiere a la cepa C57BL / 6 de ratones de laboratorio consanguíneos. Los ratones de raza avanzada (por ejemplo, ratones NMRI) se utilizan a menudo en la investigación reproductiva debido a su alta tasa reproductiva. Sin embargo, el uso de cepas consanguíneas es necesario para generar resultados consistentes, y el fondo genético favorito del inmunólogo es C57BL / 6, también conocido como B6.
Aproximadamente el 30% de los leucocitos uterinos en las madres B6 a mitad de la gestación son células g1 uILCs, que se definen por citometría de flujo como células CD45+CD3-CD19-NK1.1+NKp46+ viables (Figura 2B): células NK proangiogénicas residentes en tejido (trNK), IFN-g productoras de NK convencional (cNK) y uILC14,5. El porcentaje de células uNK es aún mayor en humanos, alcanzando alrededor del 70% en el primer trimestre6. Hay más similitudes que diferencias entre uNK humano y ratón y uILC7,8. Aunque es importante tener en cuenta las diferencias, es útil integrar la información disponible sobre las dos especies. Cuando se combina la información obtenida de la investigación de la uILC en humanos y roedores de laboratorio, queda claro que las células NK ayudan en cambios homeostáticos esenciales para la biología del útero, incluyendo el mantenimiento de la integridad arterial9 y la remodelación de la arteria espiral10, así como la invasión de trofoblastos11,12. También desempeñan funciones específicas en la defensa contra patógenos13,14. En ratones y ratas, además de llenar la decidua alrededor del sitio de implantación, las células NK se acumulan entre las dos capas musculares del miometrio de las presas en una estructura transitoria conocida como el Agregado Linfoide Mesometrial del embarazo (MLAp)15 (Figura 1B), también conocida en el pasado como la glándula auricular, cuya función aún no se ha descubierto.
Aquí se describe un protocolo detallado del método utilizado en el laboratorio para aislar linfocitos del útero de ratones preñados utilizando una combinación de desagregación mecánica y digestión enzimática. Como todo el útero se utiliza en el método, los linfocitos aislados del útero durante la gestación son una mezcla de células deciduales y miometriales. Es posible una disección adicional de la decidua de la pared uterina y su MLAp, y se ha descrito antes16. El método descrito aquí fue desarrollado para obtener linfocitos uterinos preservando al mismo tiempo la expresión de la superficie de la proteína, la funcionalidad celular y la viabilidad. El resultado es una suspensión de una sola célula con un mínimo de residuos celulares y un rendimiento que generalmente oscila entre 1 y 5 millones de células a mediados de la gestación (10,5 días) para un útero embarazada. Las aplicaciones de este método abarcan el fenotipado por citometría de flujo, la clasificación celular para estudios transcriptómicos o proteómicos posteriores, estudios funcionales como la producción intracelular de citoquinas, la degranulación, ELISPOT o ensayos citotóxicos. El protocolo presentado aquí se centra en la identificación de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para otros tipos de células, como otras ILC, células T, células B, DC o macrófagos con modificaciones menores del panel de anticuerpos utilizado para el análisis DE FACS. El protocolo también se puede utilizar para aislar células de otros tejidos y para úteros no embarazadas agrupados.
Protocol
Todos los experimentos con animales descritos en este documento se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 bajo PP2363781 emitida por el Ministerio del Interior del Reino Unido. El protocolo a continuación consta de varias secciones que comienzan con la cría de ratones y terminan con la tinción para el análisis FACS. La figura 3 refleja los principales pasos del protocolo. Los materiales utilizados en el protocolo se enumeran en la Tabla de materiales.
1. Cría general de ratones, apareamiento y disección
- Mantenga a los ratones hembra de 7-14 semanas de edad bajo condiciones específicas libres de patógenos (SPF) y alojados en grupo (típicamente 4-6 hembras según el tamaño de la jaula y el peso del animal), durante 10-14 días para desencadenar el efecto Lee-Boot, lo que resulta en la sincronización del estro17.
- Mantenga a los machos de semental en condiciones de FPS, en una sola casa y descansados durante al menos 48 h entre cada apareamiento (tiempo para la regeneración de los espermatozoides). Es preferible usar machos de sementales experimentados de 3-4 meses de edad, ya que generalmente son más eficientes que los jóvenes.
- Para aumentar la probabilidad de que las hembras queden embarazadas, introduzca la ropa de cama sucia de la jaula de un macho en la jaula de la hembra 3 días antes del apareamiento. Esto desencadena el efecto Whitten18 por la exposición a feromonas de orina masculinas, y da como resultado un estro sincronizado, así como una mayor receptividad para el apareamiento.
- En el día 0 (D0), configure los ratones para el apareamiento usando un macho de semental por cada dos hembras; considere una tasa de enchufe de aproximadamente 20% -25%.
NOTA: El apareamiento probablemente ocurrirá por la noche, ya que los ratones son animales nocturnos. - En la mañana siguiente al apareamiento (D0.5), compruebe la presencia de un tapón vaginal, que es un indicador de cópula (Figura 4). El tapón vaginal es un agregado de la eyaculación masculina y generalmente persiste hasta 8-24 h después del apareamiento. Revise los enchufes temprano en la mañana.
- Consolide las hembras enchufadas en una nueva jaula y asigne. Devolver a los machos a sus jaulas para descansar.
- En D9.5 o 10.5 después del apareamiento, prepare tubos de 5 ml con 1 ml de HBSS estéril 1x (con Mg2+ y Ca2+) para la recolección de tejido y colóquelos en hielo.
- Proceder a la eutanasia animal por luxación cervical, seguida de exsanguinación para confirmar la muerte.
- Trabaje en un ambiente estéril si la aplicación aguas abajo lo requiere. Inmediatamente después de la eutanasia, limpie el cuerpo del ratón con etanol al 70% y proceda a la disección debajo de un gabinete de flujo laminar con instrumentos estériles.
- Diseccionar el útero embarazada libre de grasa mesometrial (Figura 5) y colocar todo el útero en una sonda de 5 ml preparada y debidamente etiquetada. Mantenga los tubos en hielo.
2. Digestión mecánica y enzimática del útero
- Para preparar la solución de digestión enzimática, mezcle 3 ml por útero de HBSS 1x estéril con 30 μg/ml de DNAse y 0,1 unidad Wünsch (WU)/mL de Liberase DH o 0,52 WU/mL de Liberase TM. Coloque la solución en un baño de agua a 37 °C.
NOTA: Se pueden utilizar tanto Liberase TM como Liberase DH. La elección de uno sobre el otro debe guiarse por su efecto potencial sobre los epítopos reconocidos por los anticuerpos utilizados para el posterior análisis de citometría de flujo.
PRECAUCIÓN: Si usa enzimas liofilizadas, trabaje bajo el capó. - Preparar 20 mL de 5 mM de EDTA en PBS (sin Ca2+/Mg2+). Coloque la mitad de la solución a 37 °C en un baño de agua y la otra mitad en hielo.
- Debajo de un gabinete de flujo laminar, retire suavemente la grasa que rodea el útero embarazada con instrumentos estériles en una placa de Petri estéril. No permita que el tejido se seque.
- Diseccionar cada sitio de implantación con instrumentos estériles para extraer los fetos (estructura translúcida en forma de caballito de mar, de alrededor de 1 mm de longitud) (Figura 6A). Descarta los fetos.
- Devuelva el útero a su colección original de tubo de 5 ml y exprima el tejido usando tijeras directamente en el tubo de 5 ml y el medio de recolección. Mantenga los tubos en hielo todo el tiempo entre los procedimientos.
- Coloque los tubos de 5 ml que contienen el tejido picado en un baño de agua a 37 °C.
- Agregue 3 ml de mezcla de digestión enzimática caliente a cada muestra para que el volumen total de líquido en el tubo sea de 4 ml (1 ml de medio de recolección con el útero picado y 3 ml de solución de digestión enzimática). Incubar los tubos de 5 ml durante 30 min a 37 °C con agitación para mejorar la actividad de digestión enzimática.
- Vórtice los tubos de 5 ml y colóquelos sobre hielo para inhibir la acción de las enzimas. Luego, posteriormente, transfiera el contenido a tubos de centrífuga de 15 ml debidamente etiquetados.
- Enjuague todo de los tubos de 5 ml en los tubos de centrífuga de 15 ml con 10 ml de solución helada de EDTA PBS de 5 ml.
- Centrifugar los tubos centrífugos de 15 ml que contienen los tejidos digeridos durante 10 min a 400 x g.
- Deseche el sobrenadante, mueva suavemente el pellet y luego vuelva a suspenderlo en 10 ml de solución de EDTA PBS tibia (37 °C) de 5 mM.
- Incubar las muestras en los tubos centrífugos de 15 ml a 37 °C con agitación durante 15 min para eliminar el medio de digestión sobrante y reducir la aglomeración celular.
- Vórtice las muestras en alto durante 10 s para facilitar aún más la disociación tisular.
3. Procesamiento del útero en una suspensión de una sola célula
- Usando el émbolo de una jeringa estéril de 1 ml, fuerce el tejido digerido a través de un colador de 70 μm sobre un tubo de centrífuga de 50 ml debidamente etiquetado y estéril para eliminar los grupos celulares y el tejido no disociado.
- Lave el colador varias veces con un total de 10 ml de PBS frío para recoger todas las células.
- Gire el tubo centrífugo de 50 ml durante 10 minutos a 400 x g.
NOTA: Realice los pasos adicionales utilizando la Opción A o la Opción B. La Opción A permite un mejor enriquecimiento de los linfocitos con menos desechos y contaminación de células estromales que la Opción B. Sin embargo, la opción B da un mayor rendimiento de células inmunes debido a una menor pérdida celular y menos variabilidad del rendimiento celular entre muestras. La opción B también es más fácil de realizar técnicamente. Por lo tanto, dependiendo de la preferencia, continúe con la Opción A o la Opción B.- Los pasos para la opción A son los siguientes.
- Etiquete un tubo de centrífuga estéril de 15 ml por muestra que contenga 5 ml de Percoll isotónico al 80% (v/v) diluido en PBS.
- Después del centrifugado, deseche el sobrenadante del tubo centrífugo de 50 ml. Use un pipet boy para resuspendir cada pellet en 8 ml de Percoll isotónico al 40% (v / v) en PBS.
- Use un pipet boy a baja velocidad para superponer cuidadosamente el pellet resuspendido en la solución de Percoll al 40% sobre la solución de Percoll al 80%. Pipeta lenta y continuamente; mantenga el tubo de 15 ml en un ángulo de 45° (Figura 6B).
- Sin perturbar la superposición, centrífuga los tubos de centrífuga de 15 ml durante 20 min a 850 x g, a temperatura ambiente (aceleración media y rotura mínima).
- Retire cuidadosamente los tubos de la centrífuga sin perturbar las capas de Percoll (Figura 6C).
- Sin perturbar el anillo de leucocitos en la interfaz de las dos soluciones de Percoll, use una pipeta Pasteur estéril para descartar todos, excepto aproximadamente 0.5-1 ml de la capa superior de Percoll.
- Mientras intenta succionar una cantidad mínima de solución de Percoll (hasta 4-5 ml en total), recoja cuidadosamente el anillo de leucocitos y transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml marcado.
- Rellene cada muestra con 10 ml de medio RMPI-1640 estéril suplementado con un 10% de FBS inactivado por calor.
- Centrifugar durante 5 min a 500 x g a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y proceda a la lisis de glóbulos rojos.
- Los pasos para la opción B son los siguientes.
- Etiquete un tubo de centrífuga estéril de 15 ml por muestra.
- Después del centrifugado, deseche el sobrenadante del tubo centrífugo de 50 ml. Use un pipet boy para resuspendir cada pellet con 8 mL de Percoll isotónico al 35% (v /v) en medio RPMI-1640.
- Transfiera las muestras a tubos centrífugos de 15 ml.
- Centrifugar las muestras a 940 x g durante 10 min a temperatura ambiente con aceleración media y rotura mínima.
- Aspire el sobrenadante con cuidado usando un aspirador o un niño pipeta (no invirtiendo el tubo).
- Resuspender el pellet en 14 ml de medio RPMI-1640 suplementado con FBS inactivado por calor al 10% y luego centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante por aspiración y proceda a la lisis de glóbulos rojos.
- Los pasos para la opción A son los siguientes.
4.Lisis de glóbulos rojos
- Para lisar los glóbulos rojos, vuelva a suspender las muestras en 3 ml de 1 solución de lisado de glóbulos rojos e incube durante 3 minutos a temperatura ambiente.
- Agregue 10 ml de PBS en las muestras para detener la reacción.
- Centrifugar los tubos a 400 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
- Agregue 10 ml de PBS y repita el paso 4.3.
- Resuspender cada pellet en 1 ml de medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FBS inactivado por calor.
- Pase las muestras a través de coladores de células estériles de 70 μm.
- Realice el recuento de células utilizando azul tripano y una cámara Neubauer según las instrucciones del fabricante.
- Ajuste la concentración de la suspensión celular a 1-2 millones de células en 100 μL de PBS o medio.
5. Estrategia y controles de diseño de paneles
NOTA: El panel descrito en este documento es adecuado para la discriminación de células uILC1, trNK y cNK y fue diseñado para ser utilizado en un BD LSRFortessa de 5 láseres. Se pueden hacer modificaciones menores para estudiar diferentes poblaciones celulares y usar fluorocromos alternativos. Se recomienda comprobar la configuración del instrumento, utilizando anticuerpos titulados para una separación óptima, consultando el índice de brillo del fabricante y utilizando los colorantes más brillantes para antígenos de baja expresión como NKp46, y siguiendo las pautas generales19. Se recomienda incluir un control de fluorescencia menos uno (FMO) para NKp46.
6. Tinción de células linfoides innatas para el fenotipado FACS
- Transfiera 1-2 millones de células por pozo a una placa redonda de 96 pocillos.
- Gire la placa a 400 x g durante 3 min a 4 °C y deseche el sobrenadante colocándolo en un fregadero.
- Resuspend los gránulos celulares en 100 μL de PBS (libre de proteínas y azidas) utilizando una pipeta multicanal.
NOTA: Asegúrese de que el PBS no contenga azida de sodio, ni Tris, ni proteínas para el paso siguiente. - Repita el paso 6.2.
- Resuspend células en 50 μL de colorante de viabilidad fijable diluido en PBS (libre de proteínas y azidas) (1:1.000). Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos en la oscuridad.
NOTA: Asegúrese de que el PBS no contenga azida de sodio, ni Tris, ni proteínas como FBS o BSA, ya que esto puede resultar en una disminución de la intensidad de tinción de las células muertas y / o un aumento de la tinción de fondo para las células vivas.
PRECAUCIÓN: Si el tinte de viabilidad está en polvo, úselo debajo del capó. - Agregue 150 μL de PBS, resuspenda las celdas con una pipeta multicanal y, a continuación, repita el paso 6.2.
- Resuspend las células en 25 μL de FACS Buffer (PBS suplementado con 1% de BSA o 2% de FBS) que contiene reactivo de bloqueo del receptor Fc. Incubar las células durante 5 min a 4 °C.
- Añadir 25 μL de un cóctel de anticuerpos de superficie.
NOTA: Siempre titule los anticuerpos y optimice el panel de anticuerpos antes del experimento. - Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad.
- Agregue 150 μL de tampón FACS a cada pocillo, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.
- Repita el paso 6.10.
NOTA: Realice otros pasos con la opción A o la opción B. Utilice la opción A para teñir las celdas con marcadores de superficie. Utilice la opción B para estudiar los marcadores intracelulares mediante citometría de flujo.- Los pasos para la opción A son los siguientes.
- Resuspendir las muestras en 100 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) por pozo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
PRECAUCIÓN: Use PFA debajo del capó. Consulte la hoja de seguridad para desechar los desechos u objetos de PFA que hayan entrado en contacto con PFA (por ejemplo, pipetas) de forma segura. - Repita el paso 6.2, dos veces.
PRECAUCIÓN: No lo descarte introduciendo en el fregadero aquí, ya que contiene PFA. Aspire con una pipeta y deseche los residuos según la hoja de seguridad. - Resuspend las muestras en 200 μL de PBS.
- Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados y recargue con 100 μL de PBS. Mantenga los tubos en hielo o en un refrigerador hasta que se procesen con el análisis FACS. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo en un plazo de 24 h.
- Resuspendir las muestras en 100 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) por pozo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.
- Los pasos para la opción B son los siguientes.
- Resuspender las muestras en 100 μL de solución de fijación/permeabilización por pocillo (que contiene paraformaldehído) e incubar durante 20 min a 4 °C.
PRECAUCIÓN: Use PFA debajo del capó. Consulte la hoja de seguridad para desechar los desechos u objetos de PFA que hayan entrado en contacto con PFA (por ejemplo, pipetas) de forma segura. - Repita el paso 6.2.
PRECAUCIÓN: No lo descarte introduciendo en el fregadero aquí, ya que contiene PFA. Aspire con una pipeta y deseche los residuos según la hoja de seguridad. - Agregue 200 μL de 1 tampón de permeabilización / lavado, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.
- Repita el paso 6.11.2.3.
- Resuspend las células fijas y permeabilizadas en 50 μL de 1x tampón de permeabilización/lavado que contiene mezcla de anticuerpos para la tinción intracelular.
- Incubar las muestras a 4 °C durante 30 min en la oscuridad.
- Agregue 200 μL de 1 solución de permeabilización / lavado, mezcle bien y luego repita el paso 6.2.
- Repita el paso 6.11.2.7.
- Resuspend las muestras en 200 μL de PBS.
- Transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados y recargue con 100 μL de PBS. Mantenga los tubos en hielo o en un refrigerador hasta que se procesen con el análisis FACS. Adquirir las muestras en un citómetro de flujo en un plazo de 24 h.
NOTA: Después de realizar este protocolo, la suspensión de células deciduales está lista para el análisis FACS. Se recomienda registrar tantos eventos como sea posible por muestra; se deben obtener al menos 1.000-3.000 eventos de una población parental para lograr resultados confiables.
- Resuspender las muestras en 100 μL de solución de fijación/permeabilización por pocillo (que contiene paraformaldehído) e incubar durante 20 min a 4 °C.
- Los pasos para la opción A son los siguientes.
Representative Results
Los principales pasos del método que se describen para obtener una suspensión unicelular de leucocitos uterinos se resumen en la Figura 3. En la Figura 2B se demuestra la estrategia básica de gating FACS utilizada para la identificación de tres subconjuntos de ILC g1 en ratones B6: células uILC1 (CD49a+Eomes-), trNK (CD49a+Eomes+) y cNK (CD49a-Eomes+). Se puede realizar un análisis adicional de estas poblaciones para estudiar varios marcadores superficiales e intracelulares de las ILC g1. Como ejemplo, la coexpresión de los receptores IFN-ɣ y auto-MHC se puede evaluar en células uILC1, trNK y cNK después de la estimulación con anticuerpos anti-NK1.1 (Figura 7).
Dependiendo de la pregunta de investigación, tanto el protocolo (Figura 3) como el panel de anticuerpos se pueden adaptar. Es importante destacar que se recomienda utilizar anticuerpos anti-NK1.1 y anti-NKp46 en un panel FACS para g1 ILC gating (Figura 2B y Tabla 1). Cabe señalar que las ILC g1 obtenidas de sangre, bazo o hígado tienen una mayor expresión de NKp46 en su superficie que la contraparte uterina (Figura 8). La tinción superficial para NK1.1 proporciona una mejor separación y permite que las ILC g1 uterinas se cierren fácilmente (Figura 8). Mientras que NKp46 se expresa por todas las cepas de ratón, el antígeno NKR-P1C reconocido por el anticuerpo anti-NK1.1 PK136 solo se expresa en algunas cepas de ratón, incluidas C57BL / 6 (es decir, B6), FVB / N y NZB, pero no en AKR, BALB / c, CBA / J, C3H, DBA / 1, DBA / 2, NOD, SJL o 129. Además, si el investigador tiene la intención de estudiar los receptores cruciales de células NK, como los receptores MHC Ly49, es importante estar al tanto de las variaciones alélicas en las cepas de ratones de laboratorio, que recapitulan la alta variabilidad de los receptores similares a la inmunoglobulina de células asesinas humanas (KIR). Además, si las células van a ser estimuladas con NK1.1 para un ensayo funcional, como se describe en Kim, S. et al.20, podría ser deseable teñir las células con anti-NKp46 en lugar de anti-NK1.1, ya que el antígeno NKR-P1C puede estar ocupado por el anti-NK1.1 de reticulación o una regulación descendente del receptor puede seguir la estimulación. La ocupación del receptor o la regulación a la baja pueden impedir la tinción con el mismo anticuerpo utilizado para estimular.
Un problema común con la disociación enzimática del tejido es la alteración de los epítopos superficiales en las células por enzimas utilizadas para un medio de digestión. Por ejemplo, la tinción para el receptor MHC CD94:NKG2A es deficiente si se utiliza Liberase TM. Sin embargo, la digestión con Liberase DH preserva el reconocimiento de NKG2A por clon de anticuerpos 16A11 (Figura 9). Se recomienda verificar la influencia de las enzimas en todos los epítopos en el panel FACS. Para ello, utilizar la suspensión de esplenocitos de ratón obtenidos por disociación mecánica (pasando todo el bazo a través de un colador de 70 μm). La muestra se divide en dos o más partes seguidas de la incubación con un medio con o sin enzima(s).
Como se mencionó anteriormente, las células derivadas de la sangre están presentes en muestras disociadas de tejido. Si es necesario, los contaminantes sanguíneos pueden excluirse utilizando un método de tinción intravascular desarrollado en el laboratorio Masopust21. La Figura 10 demuestra que alrededor del 6,5% de las ILC g1 presentes en muestras de tejido uterino en el día de gestación 8,5 son derivadas de la sangre. Los anticuerpos anti-CD45 utilizados para la tinción intravascular se pueden conjugar con un fluorocromo utilizado para un canal de descarga; esto excluirá los contaminantes de la sangre sin usar un canal de fluorescencia adicional. Los problemas más comunes y sus soluciones se presentan en la Tabla 2.
Figura 1: Sección transversal de un útero de ratón. (A) Sección transversal del útero de ratón (no embarazada) que indica una variedad de leucocitos maternos que pueblan el útero. (B) Sección transversal del útero de ratón (día de gestación 8.5). (C) Sección transversal del útero de ratón (día de gestación 13.5). (D) Comparación de la formación de placenta de ratón versus humana desde la etapa de blastocisto en adelante. Imágenes creadas con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Subpoblaciones de iLC1 g1 uterino. (A) Porcentajes de cNK uterino, ILC1 y trNK en ratones durante la vida temprana y el embarazo. W - semanas, gd - día de gestación. Gráfico modificado de Filipovic, I. et al.4. (B) Estrategia de gating para analizar subconjuntos de ILC del grupo 1 uterino por citometría de flujo. Los linfocitos se aislaron de los tejidos uterinos en el día de gestación 10.5. La digestión tisular se realizó utilizando un medio de digestión que contenía Liberase TM. Las células fueron cerradas en función de su capacidad para dispersar la luz. Los dobletes se excluyeron utilizando una gráfica FSC-A versus FSC-H, y solo se analizaron más a fondo las células viables CD45 + CD3-CD19. Dentro de las células viables CD45+CD3-CD19-, la puerta ILC del grupo 1 se identificó como células NK1.1+ NKp46+. Dentro de las ILC del grupo 1, se pueden identificar tres subconjuntos: células NK convencionales CD49a-Eomes+ (cNK), células NK residentes en tejido CD49a+Eomes+ (trNK) y CD49a+Eomes-uILC1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Una guía visual para los pasos principales del protocolo. (1) Diseccionar el útero embarazada libre de grasa mesometrial. (2) Extraer los fetos; devolver el útero a la sonda de 5 ml y picar el tejido. Continúe con el paso de digestión enzimática: agregue 3 ml de mezcla de digestión enzimática caliente a cada muestra. Incubar los tubos de 5 ml durante 30 min a 37 °C con agitación. (3) (i) Después de la digestión, enjuague todo de los tubos de 5 ml en tubos de 15 ml utilizando 10 ml de solución helada de 5 mM de EDTA PBS. ii) Tubos de centrifugación de 15 ml que contengan tejidos digeridos durante 10 min a 400 x g. iii) Desechar el sobrenadante; Mueva suavemente el pellet y vuelva a suspenderlo en 10 ml de solución de EDTA PBS tibia (37 °C) de 5 mM. iv) Incubar muestras en los tubos de 15 ml a 37 °C con agitación, durante 15 min. (4) Utilizando el émbolo de una jeringa estéril de 1 ml, forzar el tejido digerido a través de un colador de 70 μm sobre un tubo de 50 ml debidamente etiquetado y estéril, y girar durante 10 min a 400 x g. (5) Después del centrifugado, proceda con la opción A (representada aquí en los diagramas) o B. Opción A: deseche el sobrenadante del tubo de 50 ml y, utilizando un pipet boy, resuspenda cada pellet en 8 mL de Percoll isotónico al 40% (v/v) en PBS. (6) (i) Opción A continuación: Usando un pipet boy a baja velocidad, superponga cuidadosamente el pellet resuspendido en solución de Percoll al 40% sobre la solución de Percoll al 5 mL de Percoll al 80%. Pipeta lenta y continuamente; mantenga el tubo de 15 ml en un ángulo de 45°. (ii) Sin perturbar la superposición, centrifugar los tubos de 15 ml a 850 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente, con aceleración media y rotura lenta. (7) Después del centrifugado, mientras intenta succionar una cantidad mínima de solución de Percoll (hasta 4-5 ml en total), recoja cuidadosamente el anillo de leucocitos. (8) Realizar pasos de lisis de glóbulos rojos. (9) Contar la célula usando azul tripano y una cámara de Neubauer. (10) Transfiera 1-2 millones de células por pozo a una placa de fondo redondo de 96 pocillos. (11) Proceder con la tinción de colorantes y anticuerpos de viabilidad. (12) Por último, transfiera las muestras a tubos FACS etiquetados. Mantenga los tubos en hielo o en un refrigerador hasta que se procesen con el análisis FACS dentro de las 24 h. Imágenes creadas con BioRender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tapón vaginal (A) y ausencia de él (B) en hembras C57BL/6 a los 0,5 días después del apareamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Disección para extraer el útero de un ratón preñado. (A) La presa se fija con agujas en una tabla blanda para limpiar el cuerpo con etanol al 70%. Se realizan dos incisiones verticales, como lo indican las líneas punteadas azules. (B) La piel se levanta para exponer los órganos internos. Las asas intestinales se mueven suavemente hacia arriba para visualizar el útero. (C) El útero se muestrea cortando en tres puntos: junto a los ovarios y en el cuello uterino, como lo indican las dos líneas punteadas azules y la flecha azul, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Preparación de la suspensión unicelular. (A) Extracción mecánica de embriones de su sitio de implantación. B) Superposición de gradiente de Percoll; la capa superior contiene la suspensión unicelular en el 40% de Percoll y la capa inferior en el 80% de Percoll. (C) Formación de anillos de linfocitos después de la centrifugación del gradiente de percol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Análisis FACS representativo del ensayo funcional con ILC del grupo 1. Detección intracelular de IFN-ɣ y CD107a de superficie en ILC del grupo 1 que expresan receptores NK para auto-MHC (Ly49C, Ly49I y NKG2A) en comparación con aquellos que no lo hacen, después de reticular NK1.1 con anticuerpos unidos a placas. Las células se aislaron de los tejidos uterinos en el día de gestación 9.5. La digestión tisular se realizó utilizando un medio de digestión que contenía Liberase DH. Se muestran los valores brutos de los cuatro cuadrantes (esquinas), así como el porcentaje relativo de respondedores entre las células que expresan receptores para sí mismas y los respondedores que no tienen autorreceptores (números en negrita). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Tinción de linfocitos esplénicos y uterinos con anticuerpos anti-NKp46 y anti-NK1.1. (A) Las suspensiones celulares obtenidas del bazo de ratón y (B) del útero en el día de gestación 10.5 se separaron en dos; una parte estaba teñida con NKp46-APC (rojo) y la otra con NK1.1-APC (azul). Tenga en cuenta que la tinción NKp46 de los linfocitos uterinos no separa las células NKp46+ y NKp46- tan claramente como los linfocitos esplénicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9: Disminución de la IMF NKG2A (clon de anticuerpos: 16A11) por incubación con medio de digestión. La suspensión celular de los esplenocitos de ratón C56BL/6 se dividió en tres partes. Una parte se incubó en el medio de digestión Liberase DH (HBSS que contiene 0,13 WU/mL Liberase DH y 30 μg/mL de DNAse), y otra parte se incubó con el medio de digestión Liberase TM (HBSS que contiene 0,52 WU/mL Liberase TM y 30 μg/mL de DNAse). La tercera parte se trató con HBSS limpio durante 30 min a 37 °C. La expresión del marcador NKG2A en las ILC g1 se evaluó mediante citometría de flujo. Gráfico tomado de Shreeve N. El papel de la inhibición uterina de células NK en el embarazo (Tesis); Supervisor: Colucci F, 2020. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10: Tinción intravital con anticuerpos anti-CD45 para la exclusión de ILC g1 derivadas de la sangre. Un ratón de presa C57BL/6 en el día de gestación 8,5 fue sacrificado 3 min después de la inyección intravenosa con 3 μg de CD45-AF647. El útero, la sangre total y el timo fueron cosechados y procesados para el análisis DE FACS. El eje X muestra la señal de la tinción intravenosa con CD45-AF647, y el eje Y muestra la señal de CD45-BUV395 teñido in vitro . Los porcentajes de subpoblaciones se muestran en cuadrantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Anticuerpo / Colorante | Clon | Fluorocromo | Láser | |
| 1 (Canal de volcado) | Zombie Violeta Tinte de viabilidad fijable | Violeta | ||
| CD19 | 1D3 | BV421 | ||
| CD3 | 145-2C11 | BV421 | ||
| 2 | CD45 | 30-F11 | FITC | Azul |
| 3 | NK1.1 | PK136 | BV605 | Violeta |
| 4 | NKp46 | 29A1.4 | APC | Rojo |
| 5 | CD49a | Ha31/8 | BUV395 | Ultravioleta |
| 6 | EOMES | Dan11mag | PEI | Verde |
Tabla 1: Un ejemplo de panel FACS para citómetro convencional de 5 láseres.
| Problema | Posible causa | Sugerencia |
| El anillo celular no es visible en la interfaz de dos soluciones de percoll | Estratificación deficiente de la solución de percoll o mezcla de dos capas durante el manejo de la muestra | Tenga especial cuidado de no romper el cojín de percolín del 80% durante la superposición. Preste atención durante el manejo de la muestra: no moleste la interfaz percoll |
| Bajo número de leucocitos (por ejemplo, cuando se usa un útero no embarazada) | La interfaz se puede ver incluso cuando el número de celda en la interfaz es muy bajo. Incluso si el anillo no es visible, recolecte líquido entre el 40% y el 80% de las soluciones de percoll, ya que aún podría haber suficientes células para su posterior procesamiento. | |
| Lisis incompleta de glóbulos rojos | Las células no se resuspendieron correctamente en el tampón de lisado | Celdas de pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper los grupos y resuspendir completamente las celdas en el búfer de lisado |
| La solución de lisado es fría | Equilibrar la solución de lisado a temperatura ambiente antes de su uso | |
| Prolongar el tiempo de incubación con la solución de lisado hasta 15min | ||
| El paso de lisis de glóbulos rojos se puede repetir | ||
| Bajo rendimiento celular | Mala digestión enzimática | Compruebe si las enzimas no están desactualizadas y se han almacenado de acuerdo con sus manuales |
| Pérdida de células durante los pasos de lavado | Inspeccione el pellet celular después de cada paso de lavado: el pellet opaco en la parte inferior del pozo después del centrifugado. El uso de placas de fondo en V en lugar de placas de fondo en U, centrífuga de rotor oscilante, un tiempo de centrifugación más largo puede reducir la pérdida de células | |
| La muestra de tejido contiene un bajo número de linfocitos (por ejemplo, cuando se usa un útero no embarazada) | Agrupa varios úteros para obtener suficientes eventos para el análisis. Considere la posibilidad de utilizar la opción B del protocolo para el aislamiento celular | |
| Alta variabilidad del número absoluto de leucocitos obtenidos de ratones del mismo grupo | Recolección inconsistente de células en la interfaz de soluciones de percoll al 40% y 80% | Asegúrese de recolectar la fracción de celda entera en la interfaz percoll. Considere la posibilidad de utilizar la opción B del protocolo para el aislamiento celular |
| No es capaz de detectar subpoblaciones/marcadores de linfocitos esperados o IMF inusualmente baja para algunos marcadores de superficie celular | La digestión enzimática afecta la expresión superficial de algunos epítopos o su degradación | Optimizar la digestión enzimática cambiando: enzima (por ejemplo, a diferentes tipos de liberasa o colagenasa) y/o duración de la incubación y/o concentración enzimática |
| Alto ruido de fondo en el citómetro de flujo | Alta proporción de desechos celulares o contaminación por glóbulos rojos | Ajuste el parámetro de umbral FSC. Considere la posibilidad de utilizar la opción A del protocolo para el aislamiento celular |
Tabla 2: Guía de solución de problemas.
Discussion
El método contiene varios pasos críticos que se analizan a continuación. El primer paso crítico es obtener embarazos sincrónicos múltiples a medida que la frecuencia relativa de las poblaciones de leucocitos cambia a lo largo del embarazo. Tener múltiples presas en el mismo día gestacional permite repeticiones biológicas en los mismos experimentos o agrupar linfocitos de presas individuales para obtener un mayor número requerido para aplicaciones aguas abajo. El apareamiento cronometrado permite al investigador identificar la concepción dentro de un período de 24 horas. Aunque los ratones viven alrededor de 2,5 años, estarán en edad reproductiva de 4-7 semanas hasta los 6-8 meses de edad. Como los ratones más jóvenes generalmente producen cachorros más pequeños, los ratones hembra generalmente no se aparean hasta que tienen entre 6 y 8 semanas, y los ratones machos hasta que tienen entre 8 y 10 semanas. Dado que el estro dura aproximadamente 15 h en ratones y ocurre cada 4-5 días, la tasa de apareamiento típica (revelada por un tapón vaginal, ver Figura 4) es de alrededor del 25%. Por lo tanto, es importante utilizar ratones en celo y planificar números suficientes para obtener el número requerido de presas para un experimento determinado. La fase del ciclo del estro se puede determinar mediante citología de frotis vaginal22. La velocidad de tapón se puede mejorar descansando los machos 48 h antes del apareamiento y aprovechando el efecto Whitten18. Alternativamente, se puede administrar suero de yegua embarazada, que imita el efecto de la hormona endógena estimulante del folículo, induciendo la maduración de los ovocitos y, 42-50 h más tarde, gonadotropina coriónica humana, que imita el efecto de la hormona luteinizante endógena, induciendo la ovulación. Este tratamiento hormonal evita el requerimiento de estro y hace que prácticamente todas las hembras tratadas sean receptivas.
Un segundo paso crítico es garantizar la calidad de la tinción FACS. Los anticuerpos utilizados en la citometría de flujo siempre deben ser titulados y utilizados a la concentración óptima, y es necesario comprobar que la digestión enzimática no escinde epítopos antigénicos cruciales. Para evaluar si una enzima escinde un epítopo, se podrían teñir dos fracciones de la misma muestra en paralelo, una sometida a digestión enzimática y la otra mecánica. Del mismo modo, el uso de controles adecuados y tinciones individuales es crucial para obtener datos fiables. Para eventos raros, las cuentas se pueden usar para generar muestras de tinción única. Se recomienda no usar perlas para establecer voltajes, sino más bien una población de células que contengan linfocitos y otros leucocitos, como los esplenocitos. Si se usan perlas, es necesario valorar los anticuerpos para la tinción de perlas, por lo que la intensidad de fluorescencia de las perlas teñidas será comparable a la intensidad de fluorescencia de las células. En caso de dificultad para separar las células positivas de las negativas para un marcador en particular, también se puede utilizar un control FMO para facilitar la apertura de un marcador específico. En el caso de los marcadores intracelulares, se debe utilizar un control de isotipo, ya que la tinción intracelular podría dar lugar a anticuerpos residuales no unidos, que aún pueden estar presentes dentro de las células después de los pasos de lavado y, por lo tanto, aumentar la señal de fondo. Se recomienda ejecutar las muestras dentro de las 24 h posteriores a la fijación de las células para obtener los mejores resultados en fenotipado mediante análisis FACS, ya que la autofluorescencia aumenta significativamente con el tiempo y la intensidad de fluorescencia de algunos anticuerpos puede disminuir con el tiempo.
Otro factor crucial a considerar es la aplicación posterior de la suspensión unicelular obtenida con el protocolo. Para los ensayos funcionales, es esencial trabajar en condiciones estériles. Del mismo modo, para estudios ómicos posteriores, es importante trabajar en estériles y libres de RNasa, DNasa y proteasa.
El protocolo presentado aquí se centra en el fenotipado de ILC del grupo 1, pero se puede adaptar para fenotipar otros tipos de células modificando el panel de anticuerpos. Se recomienda que todos los anticuerpos se prueben contra la suspensión celular digerida y no digerida para detectar la pérdida/alteración de los epítopos superficiales mediante el tratamiento enzimático. Del mismo modo, se pueden usar diferentes enzimas para digerir el tejido y aumentar el rendimiento celular, pero su efecto sobre epítopos antigénicos cruciales debe estudiarse cuidadosamente. Mientras que NKp46 es un buen marcador para las células NK esplénicas y funciona en todas las cepas de ratones de laboratorio, la expresión de NKp46 en células uNK en ratones C57BL/6 es considerablemente menor que en células NK del bazo. Es mejor manchar tanto para NK1.1 como para NKp46 simultáneamente. Si se van a comparar varios órganos directamente, se recomienda tratar todas las muestras por igual, incluso si la digestión enzimática no es necesaria para tejidos como el bazo o la médula ósea. Aunque el método presentado aquí es aplicable al útero no embarazada, el aislamiento del anillo de linfocitos por un gradiente de Percoll de dos fases será un desafío, y el rendimiento de las células aisladas puede ser demasiado bajo para un análisis FACS confiable y, por lo tanto, requerirá agrupar células aisladas del útero de ratones individuales no preñados23.
Existen limitaciones al protocolo a considerar para la interpretación de los datos. Como es el caso de todos los tejidos, los linfocitos circulantes provenientes de la sangre se aislarán junto con las células residentes en el tejido. Si la exclusión de los linfocitos circulantes es esencial para la interpretación de los datos, se puede realizar una tinción intravital para etiquetar las células circulantes. Además, una segunda limitación del protocolo es que algunas células se perderán, ya que no todas las células se pueden extraer del tejido. Los problemas más comunes y su solución de problemas se presentan en la Tabla 2.
Históricamente, el estudio de las células en los tejidos se ha basado en el examen histológico de las secciones de tejido. La excelente reseña de Sandra Peel24 resume el trabajo realizado a lo largo de más de 100 años hasta finales de los años 80. Las descripciones de células más tarde conocidas como células uNK aparecen en manuscritos publicados más de medio siglo antes de que se descubrieran los linfocitos. Por lo tanto, antes del descubrimiento de las células NK en 1975, y las células uNK se han indicado como células de glucógeno materno o células granuladas de la glándula auricular. Anne Croy ha hecho importantes contribuciones en el campo25 y amablemente enseñó al equipo la disección que había optimizado3, y que se utiliza actualmente. Aunque es fundamental para describir la morfología y la ubicación tisular de las células uNK, el examen histológico clásico se limita a la detección de solo unos pocos marcadores en las células de interés. En 2008 se describió un método basado en citometría de flujo para detectar simultáneamente múltiples marcadores en linfocitos uterinos26. Este es esencialmente el método que se ha descrito en este artículo. Tecnologías más recientes como la transcriptómica espacial y la obtención de imágenes por citometría de masas combinan el poder de la histología y la citometría de flujo, permitiendo tanto la detección simultánea de múltiples genes o proteínas, respectivamente, como la preservación de la arquitectura tisular normal.
Las aplicaciones del método descrito aquí son múltiples e incluyen fenotipado FACS, ensayo funcional (como ELISPOT, degranulación o ensayos citotóxicos), clasificación celular y transcriptómica o proteómica posterior. Otras aplicaciones que podrían desarrollarse en base a este método incluyen el cultivo y la expansión de células NK deciduales después de la clasificación o enriquecimiento celular por agotamiento negativo. Actualmente, no existe un protocolo para cultivar y expandir las células uNK de ratón y preservar su viabilidad y funcionalidad durante un período prolongado, de manera similar a las células NK humanas que se pueden cultivar y expandir durante 7-14 días mediante la adición de IL-2 o una combinación de IL-12 e IL-15. La optimización de dicho método para células uNK de ratón proporcionaría más flexibilidad al realizar ensayos funcionales y permitiría probar múltiples condiciones con un número de células más alto. Por otro lado, se sabe que las condiciones de cultivo modifican el fenotipo único de los linfocitos y potencialmente su función también.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar ni conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del equipo que han ayudado a desarrollar este método, incluidos Jean-Marc Doisne, Norman Shreeve, Iva Filipovic y Anita Qualls. Esta investigación fue financiada por el Fideicomiso Wellcome [Número de subvención 200841/Z/16/Z] y el Consejo de Investigación Médica (MR/P001092/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del Manuscrito Aceptado por el Autor que surja de esta presentación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70 µm cell strainers | Falcon | 352350 | |
| BSA | Sigma | A9647-100G | |
| CD19 antibody | BD | 562701 | |
| CD3 antibody | BD | 562600 | |
| CD45 antibody | BioLegend | 103108 | |
| CD49a antibody | BD | 740262 | |
| DNase I | Roche (Sigma) | 10104159001 | |
| EOMES antibody | eBioscience | 12-4875-82 | |
| Fc block Trustain fcx | BioLegend | 101320 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10217-106 | |
| Fix/Perm buffer (part of BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit) | BD | 554714 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Gibco | 14025092 | |
| Liberase DH | Roche (Sigma) | 5401089001 | |
| Lysis buffer Pharmlyse | BD | 555899 | |
| NK1.1 antibody | BioLegend | 108739 | |
| NKp46 antibody | BioLegend | 137608 | |
| Paraformaldehyde 16% Solution (methanol-free) | Agar Scientific | AGR1026 | |
| PBS 10x | Gibco | 14030-048 | |
| PBS 1x (no Ca2+ or Mg2+) | Thermo Scientific | 14190144 | |
| Percoll | VWR international | 17-0891-01 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| Pre-Separation filters | Miltenyi | 130-095-823 | |
| RMPI-1640 medium + GlutaMAX | Gibco | 61870-010 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Scientific | 15575020 | |
| Zombie Violet Fixable Viability dye | BioLegend | 423113 |
References
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