Summary
Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.
Abstract
La résolution de l’hétérogénéité conformationnelle de plusieurs états protéiques qui coexistent en solution reste l’un des principaux obstacles à la caractérisation des thérapies protéiques et à la détermination des voies de transition conformationnelle essentielles aux fonctions biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique. La réaction d’échange hydrogène/deutérium (HDX) couplée à une analyse par spectrométrie de masse (MS) descendante fournit un moyen de caractériser les structures et la dynamique d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique au conformateur. Le pouvoir de résolution conformationnelle de cette technique dépend fortement de l’efficacité de la séparation des états protéiques au niveau des protéines intactes et de la minimisation de la teneur protique résiduelle non deutérée pendant les réactions HDX.
Nous décrivons ici une variante basée sur l’électrophorèse capillaire (CE) de l’approche HDX MS qui vise à améliorer la résolution conformationnelle. Dans cette approche, les protéines subissent des réactions HDX tout en migrant à travers une solution d’électrolyte de fond deutérée (BGE) pendant la séparation électrophorétique capillaire. Différents états protéiques ou protéoformes qui coexistent en solution peuvent être séparés efficacement en fonction de leurs différents rapports charge/taille. La différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les molécules de solvant protique minimise le solvant résiduel non deutéré, ce qui entraîne un environnement de deutération presque complet pendant le processus HDX. L’interface microviale CE-MS à écoulement permet une ionisation par électropulvérisation efficace des espèces protéiques éluées après un mélange rapide avec la solution modificateur de trempe et de dénaturation à la sortie du pulvérisateur. L’analyse descendante en ligne de la SEP mesure le niveau global de deutération des espèces protéiques intactes éluées et, par la suite, la deutération de leurs fragments en phase gazeuse. Cet article démontre cette approche dans le HDX différentiel pour les systèmes, y compris les variantes protéiques naturelles coexistant dans le lait.
Introduction
Il est important de distinguer les espèces protéiques dans différents états conformationnels, de liaison ou de modification et de caractériser leurs différences structurelles pour surveiller les voies de transition entre ces espèces impliquées dans des événements biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique, et comprendre les mécanismes sous-jacents à ces événements. Les techniques biophysiques conventionnelles ne fournissent pas une solution complète en raison des limites telles que la résolution insuffisante et la perte d’informations dynamiques dans la solution. L’échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX MS) est une technique qui marque les caractéristiques structurelles et conformationnelles des protéines avec le deutérium (2H) via l’échange entre les atomes d’hydrogène labile des protéines et 2H de la solution 2H2Odélibérément introduite. Les protons impliqués dans la liaison hydrogène ou qui sont séquestrés du solvant à l’intérieur de la protéine ne s’échangent pas facilement1. Ainsi, comme le taux de change sur un site échangeable dépend fortement de son implication dans des structures d’ordre supérieur, les structures protéiques peuvent être révélées à haute résolution spatiale par MS qui sonde l’étendue et le taux d’absorption de 2H en fonction des différentes masses atomiques entre 1H et 2H. Au cours des dernières décennies, HDX MS est devenu une technique remarquablement réussie pour étudier les conformations et la dynamique des protéines2.
Dans l’approche ascendante classique de HDX MS, l’ensemble des espèces protéiques dans différents états de conformation, de liaison ou de modification est protéolysé sans séparation au niveau des protéines intactes, ce qui rend impossible de caractériser des espèces individuelles en analysant les fragments protéolytiques résultants avec des teneurs en deutérium alambiquées. En revanche, dans l’approche descendante, différents états protéiques ou protéoformes qui ont incorporé différentes teneurs en deutérium donnent lieu à de multiples distributions de masses protéiques intactes dans un scan MS. Cela permet de séparer les espèces individuelles par la sélection de masse d’ions correspondant à chaque distribution de masse à l’aide d’un filtre de masse approprié (tel qu’un quadripolaire) et la caractérisation de leurs différences conformationnelles dans l’analyse ultérieure en tandem MS 3,4,5,6. Cependant, l’efficacité de la séparation des états protéiques ou des protéoformes dans cette stratégie est limitée par l’ampleur de la différence dans leurs distributions de masse correspondantes.
L’électrophorèse capillaire (EC) fournit un moyen de séparer les espèces de protéines en fonction de leurs différentes charges et tailles hydrodynamiques dans la phase de solution avec une efficacité élevée7. La combinaison de CE avec HDX offre une séparation supplémentaire des états protéiques ou protéoformes dans la phase de solution. De plus, le petit volume du capillaire CE permet l’utilisation d’une solution entièrement deutérée comme solution d’électrolyte de fond (BGE), c’est-à-dire le tampon de fonctionnement, rendant le capillaire comme un réacteur HDX pour les échantillons de protéines. En raison de la différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les réactifs protiques dans le processus d’électrophorèse, la conduite de HDX pendant l’EC entraîne un environnement de deutération presque complet pour les analytes protéiques avec un contenu résiduel non deutéré minimal, améliorant ainsi la sensibilité de l’analyse structurelle à l’aide de données HDX. En tant que tel, nous avons développé une approche HDX différentielle basée sur CE couplée à une SEP descendante pour caractériser les structures d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique à l’état ou à la protéoforme8.
Cet article décrit les protocoles de cette approche en détaillant les étapes de la préparation du matériel, de la procédure expérimentale et de l’analyse des données. Les facteurs susceptibles d’affecter les performances de la méthode ou la qualité des données sont énumérés dans de brèves notes. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent des données HDX différentielles sur les mélanges de différentes protéines et variantes naturelles de la β-lactoglobuline bovine (β-lg), la principale protéine de lactosérum présente dans le lait9. Nous démontrons l’efficacité de séparation, la reproductibilité et les performances d’étiquetage 2H des deux variantes abondantes de β-lg, c’est-à-dire A et B10,11 lors du HDX basé sur CE et de la caractérisation spécifique à la variante de leurs conformations.
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Protocol
REMARQUE : Utilisez des réactifs de qualité chromatographique liquide à haute performance (CLHP) ou de qualité MS dans la mesure du possible afin de minimiser les contaminants susceptibles d’interférer avec l’analyse de la SEP. Ne touchez pas l’interface CE-MS à mains nues pendant la mesure pour éviter la possibilité d’un choc électrique causé par la tension électrophorétique ou la tension d’électropulvérisation.
1. Préparation du matériel
- Modification du capillaire de silice fondue pour CE
- Préparer une solution d’hydroxypropylcellulose (HPC) à 5 % (p/p) en dissolvant la poudre de HPC (poids moléculaire [MW] : 100 kDa) dans de l’eau en remuant continuellement à température ambiante sur un agitateur magnétique pendant ~12 h ou jusqu’à disparition complète des particules solides12. Retirez toutes les bulles d’air visibles avec un ultrasonateur.
- Monter un capillaire en verre de silice fondu (diamètre intérieur [ID]: 50 μm, diamètre extérieur [OD]: 360 μm) d’environ 85 cm de longueur dans un instrument CE. Rincez le capillaire en infusant continuellement un solvant organique, tel que l’acétone13, à l’aide de l’échantillonneur automatique de CE à une pression de perfusion de 40 psi pendant 10-15 min.
- Remplissez le capillaire nettoyé avec une solution HPC à l’aide de l’échantillonneur automatique à une pression de perfusion de 40 psi (ce qui prend souvent environ 40 minutes). Infuser de l’air dans le capillaire rempli de HPC à 40 psi pour assurer une circulation d’air libre dans le capillaire, indiquée par les bulles d’air éjectées du capillaire lors de l’immersion dans l’eau.
- Cuire le capillaire revêtu de HPC dans un four programmable en température (idéalement le four à colonne à température contrôlée d’un chromatographe en phase gazeuse programmé en température) avec de l’azote gazeux (25 psi) circulant à travers le capillaire, en suivant le programme de température illustré à la figure 1.
- Refroidir le four à température ambiante avant de retirer le capillaire. Utilisez ce capillaire modifié par HPC pour la séparation CE.
Figure 1 : Programme de température recommandée pour la cuisson capillaire. Veuillez cliquer ici pour l’agrandir.
- Solution d’électrolyte de fond (BGE) et solution modificateur8
- Préparer 1 à 10 mL de BGE à la concentration souhaitée (p. ex., 10 mM) en dissolvant la quantité appropriée d’acétate d’ammonium dans 2H2O. Placer 200 aliquotes de BGE dans des flacons de BGE séparés et sceller les flacons avec un parafilm pour minimiser la réaction HDX entre le BGE et la vapeur d’eau dans l’air.
- Préparer 10 mL d’une solution modificateur avec 75 % (v/v) de méthanol et 25 % (v/v) d’eau, avec un pH ajusté à 2,5 % à l’aide d’acide formique.
REMARQUE: Utilisez 2H2O et du méthanol deutéré pour préparer la solution modificateur si les atomes de deutérium dans les chaînes latérales et les amides dorsaux non protégés doivent être conservés pour la détection par MS.
- Dessalage d’échantillons de protéines
- Préparer une solution d’acétate d’ammonium dans de l’eau non deutérée à la concentration souhaitée.
REMARQUE: Une concentration inférieure à 100 mM est recommandée pour éviter un courant électrique élevé pendant l’électrophorèse et l’effet de chauffage Joule qui en résulte. - Si nécessaire, ajuster le pH de la solution d’acétate d’ammonium au niveau souhaité en utilisant de l’acide formique (pour un pH < 6,8) ou de l’hydroxyde d’ammonium (pour un pH > 6,8).
- Remplacer les tampons d’origine de la solution protéique par une solution d’acétate d’ammonium (préparée dans de l’eau non deutérée à la concentration souhaitée; pH ajusté à 7,5 avec de l’hydroxyde d’ammonium) par au moins cinq concentrations séquentielles et étapes de dilution à 4 °C à l’aide d’un filtre centrifuge avec une coupure de MW appropriée.
REMARQUE : Les échantillons de protéines à dessaler peuvent provenir de procédés de production antérieurs (p. ex., purification ou formulation) ou être préparés en dissolvant la poudre de protéine lyophilisée. Les « sels » à éliminer des solutions d’échantillons dans cette étape se réfèrent en général à tous les petits ions ou molécules qui ne sont pas volatils. Bien que ces espèces puissent être séparées efficacement des protéines pendant le processus d’électrophorèse, cette étape est recommandée pour éviter de compromettre la résolution électrophorétique et ainsi minimiser la contamination du spectromètre de masse. Lorsque les analytes protéiques doivent être stabilisés par des sels ou des additifs spécifiques, incluez-les dans le BGE. - Déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis en microvolume.
- Préparer une solution d’acétate d’ammonium dans de l’eau non deutérée à la concentration souhaitée.
2. Fonctionnement de l’analyse HDX MS basée sur CE
REMARQUE: Le spectromètre de masse utilisé dans cette approche doit être équipé d’un analyseur de masse à ultra-haute résolution, tel qu’une résonance cyclotronionnelle à transformée de Fourier (FTICR) ou orbitrap, un filtre de masse, tel qu’un quadripolaire qui permet la sélection en masse d’ions précurseurs pour la fragmentation, et des fonctions de dissociation par transfert d’électrons (ETD) ou de dissociation par capture d’électrons (ECD) pour effectuer une analyse descendante avec des données MS tandem fiables (idéalement des signaux isotopiquement résolus d’ions fragments).
- Optimisation des paramètres CE et MS
- Effectuer une mesure pilote de la SEP à l’aide d’une source d’ionisation par électropulvérisation standard (ESI) en pulvérisant soit l’échantillon préchargé à partir d’un capillaire en verre borosilicate revêtu de métal (le schéma nanoESI « statique ») soit l’échantillon infusé en continu à partir d’un émetteur métallique afin d’optimiser les paramètres MS pour la mesure des protéines intactes (MS1) et de leurs fragments en phase gazeuse (MS2). Fragmenter les espèces protéiques d’intérêt par sélection en masse de l’ensemble de ses ions dans un seul état de charge, suivi de l’ETD ou de l’ECD des ions précurseurs.
REMARQUE: Les paramètres essentiels comprennent les paramètres qui affectent la désolvation, la sélection en masse des ions précurseurs (pour éviter les interférences d’autres espèces) et l’efficacité de la fragmentation. Le centre et la largeur de la fenêtre de sélection de masse doivent être augmentés pour correspondre à la distribution de masse résultante des ions analyte après HDX. Étant donné que la fenêtre d’élution d’une espèce protéique dans CE varie généralement de 0,5 min à 2 min, évaluez l’efficacité de la fragmentation en fonction des scans MS2 accumulés sur une fenêtre de temps comparable. Les valeurs optimales de ces paramètres sont spécifiques aux protéines; les lecteurs sont renvoyés aux rapports publiés précédemment pour des paramètres exemplaires 8,14. - Effectuer une mesure CE pilote à l’aide d’un instrument CE équipé d’un détecteur optique, c’est-à-dire un détecteur à réseau de photodiodes (PDA) ou un détecteur UV pour optimiser les paramètres CE pour la séparation des espèces de protéines et les temps de migration, ce qui équivaut aux temps de réaction HDX.
REMARQUE: Cette étape est facultative en fonction de la disponibilité du détecteur optique de CE. En l’absence d’un détecteur optique, les réglages CE peuvent être optimisés à l’aide de CE-MS à la fin de la section 2.2, en suivant les instructions décrites à la section 2.3. Les paramètres essentiels comprennent les paramètres qui affectent l’efficacité de séparation, les formes de crête indiquées dans les électrophérogrammes et les temps d’élution.
- Effectuer une mesure pilote de la SEP à l’aide d’une source d’ionisation par électropulvérisation standard (ESI) en pulvérisant soit l’échantillon préchargé à partir d’un capillaire en verre borosilicate revêtu de métal (le schéma nanoESI « statique ») soit l’échantillon infusé en continu à partir d’un émetteur métallique afin d’optimiser les paramètres MS pour la mesure des protéines intactes (MS1) et de leurs fragments en phase gazeuse (MS2). Fragmenter les espèces protéiques d’intérêt par sélection en masse de l’ensemble de ses ions dans un seul état de charge, suivi de l’ETD ou de l’ECD des ions précurseurs.
- Pré-conditionnement de la configuration CE-HDX
- Nettoyez l’interface CE-MS microviale à écoulement avec un mélange de 50% de méthanol, 49% d’eau et 1% d’acide formique (v / v) en utilisant les ultrasons pendant au moins 30 minutes à température ambiante.
- Lors du montage du capillaire modifié par HPC sur un instrument CE, rincez le capillaire avec BGE à l’aide de l’échantillonneur automatique pendant 10 minutes et laissez le capillaire rempli de BGE.
- Obtenir une longueur appropriée de tube capillaire en silice fondue non modifiée (ID: 50 μm, OD: 360 μm) comme tuyau de perfusion pour la solution modificateur. Connectez le tuyau modificateur à une seringue en verre étanche aux gaz avec une pointe émoussée à l’aide d’une union et d’un manchon approprié, et rincez le tube avec la solution modificateur à l’aide d’une pompe à perfusion pendant au moins 10 minutes.
- Insérez les sorties des tubes capillaires et modificateurs CE revêtus de HPC, qui ont été chargées avec les solutions correspondantes, dans l’interface CE-MS nettoyée, comme illustré à la figure 2.
- Avancez la seringue pour la perfusion de modificateur manuellement ou avec la pompe à perfusion pour vous assurer que la solution modificateur atteint l’extrémité de l’interface. Montez l’interface CE-MS assemblée sur un boîtier de source nanoESI d’un spectromètre de masse.
Figure 2 : Illustration schématique de la configuration HDX MS basée sur CE. Ce chiffre a été modifié par rapport à8. Abréviations: BGE = solution d’électrolyte de fond; CE = électrophorèse capillaire; MS = spectrométrie de masse; HDX = échange hydrogène/deutérium; ESI = ionisation par électropulvérisation; FTICR = résonance cyclotronionionnelle à transformée de Fourier; ETD = dissociation par transfert d’électrons; ECD = dissociation par capture d’électrons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Séparation CE simultanée, réaction HDX et analyse MS
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser bgE deutéré dans les 1 jour suivant la descellement.- Appliquez une tension de pulvérisation de 3 à 5 kV sur l’interface CE-MS.
- Commencez à infuser la solution modificateur avec la pompe à perfusion à un débit allant de 0,1 à 10 μL/min et assurez une électropulvérisation stable à l’extrémité de l’interface CE-MS.
- Placez le flacon d’échantillon contenant le BGE dans l’échantillonneur automatique et utilisez-le à l’étape 2.3.4 pour acquérir des électrophérogrammes vierges et des spectres de masse vierges.
- Injecter la solution d’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique à 2 psi et pendant une durée appropriée pour permettre l’injection d’une quantité souhaitée de l’échantillon. Estimer le volume d’injection en utilisant la relation entre le volume d’injection et les paramètresd’injection 15 définie par l’équation (1).
(1)
Où Vinj est le volume d’injection, Δp est la pression d’injection, dc est le diamètre intérieur du capillaire, A est la section transversale du capillaire, tinj est la durée de l’injection, η est la viscosité du liquide dans le capillaire et L est la longueur du capillaire. - Commencez la séparation CE en appliquant une tension électrophorétique de 30 kV et une pression d’infusion allant de 0 à 2 psi, et acquérez l’électrophérogramme. Pendant ce temps, commencez l’acquisition des données MS en mode chromatographique où le graphique de courant ionique est acquis en fonction du temps, et les scans MS correspondants ne sont pas automatiquement combinés en un seul spectre.
REMARQUE: Les protéines subissent une réaction spontanée HDX au point de contact des molécules 2H2O dans BGE au cours de leur migration électrophorétique à cette étape. La détection optique pour CE peut être utilisée en plus de la détection MS. Comme la détection sur colonne nécessite l’enlèvement d’une certaine longueur de revêtement en polyimide à l’extrémité de sortie du capillaire de silice fondue, des précautions supplémentaires doivent être prises pour éviter les dommages capillaires lors de l’assemblage de l’interface CE-MS. - Enregistrez l’électrophérogramme vierge et les spectres de masse comme références.
REMARQUE : Les données vides doivent être utilisées pour le dépannage plutôt que pour la soustraction de base. - Placez les flacons d’échantillon contenant les concentrations souhaitées des solutions d’échantillons de protéines dans l’échantillonneur automatique. Acquérir les électrophérogrammes et les spectres de masse pour les échantillons de protéines en suivant les étapes 2.3.4-2.3.5. Recueillir un nombre adéquat de scintigraphies de SP pour obtenir des spectres MS1 des espèces de protéines séparées électrophorétiquement et marquées 2H.
- Effectuer des mesures MS en tandem pour les espèces d’intérêt soit après avoir acquis les spectres MS1 au cours de la même série, soit lors d’une exécution ultérieure distincte.
- Si nécessaire, ajustez les temps de migration/temps de réaction HDX en modifiant la pression de perfusion ou la longueur du capillaire CE. Si le temps de réaction HDX doit être plus court que le temps de migration, utilisez l’approche décrite précédemment8, qui utilise à la fois le BGE deutéré et non deutéré dans le capillaire pendant le processus CE.
- Rincer le capillaire CE avec BGE à une pression de 20 psi pendant au moins 10 min après chaque mesure.
- Une fois les expériences terminées, nettoyez l’interface CE-MS et tous les tubes pour le stockage.
- Acquérir un ensemble de données de l’échantillon « critère d’évaluation » HDX (qui peut être préparé à l’aide des approches décrites précédemment 6,16) avec la SEP en mode perfusion directe.
REMARQUE : cette étape n’est requise que lorsqu’une solution modificateur deutérée est utilisée pour hdX basé sur CE.
(1)3. Analyse des données
- Analyse des données CE
- Utilisez l’un des diagrammes suivants comme électrophérogramme pour déterminer les caractéristiques électrophorétiques, y compris le nombre de pics, les temps de migration et l’efficacité de séparation : (a) absorbance UV par rapport au temps de migration, acquise par le détecteur optique de l’instrument CE (le cas échéant); b) le graphique du courant ionique total (TIC) acquis par les États membres; c) le graphique du courant ionique extrait (EIC/XIC) acquis par les États membres.
REMARQUE: EIC / XIC fournit le rapport signal / bruit optimal (S / N), en général, parmi les formats d’électrophérogrammes susmentionnés. Il est à noter que même en l’absence de biais instrumentaux, alors que l’absorbance UV est proportionnelle à la concentration massique de protéines, le signal MS est proportionnel à la concentration molaire. Par conséquent, il est raisonnable d’observer des différences dans les modèles de pic entre les électrophérogrammes dérivés de l’EC et de la SEP. - Utilisez l’aire sous la courbe (ASC) des pics indiqués dans les électrophérogrammes pour la semi-quantification. Pour les échantillons impliquant des complexes protéiques, utilisez l’approche décrite précédemment17 pour déduire les données de concentration massique des électrophérogrammes TIC/EIC.
- Utilisez l’un des diagrammes suivants comme électrophérogramme pour déterminer les caractéristiques électrophorétiques, y compris le nombre de pics, les temps de migration et l’efficacité de séparation : (a) absorbance UV par rapport au temps de migration, acquise par le détecteur optique de l’instrument CE (le cas échéant); b) le graphique du courant ionique total (TIC) acquis par les États membres; c) le graphique du courant ionique extrait (EIC/XIC) acquis par les États membres.
- Analyse des données sur la SEP
- Obtenez les spectres MS1 et MS2 en combinant les balayages MS1 et MS2 acquis dans les fenêtres d’élution correspondantes, respectivement.
- Déterminez les masses de la protéine intacte (M (protéine intacte)) et des fragments par l’une des deux méthodes suivantes.
- Calculer les masses moyennes des ions donnant naissance aux amas de signaux à résolution isotopique.
- Utilisez le centre des courbes de type gaussien résultant de l’ajustement des enveloppes isotopiques correspondantes6.
- Utilisez des logiciels tels que Biopharma Finder, ProSight18 ou MASH Suite19 pour générer la liste de masse des ions fragments et les identifier.
- Analyse des données HDX
- Déterminer le niveau global de deutération d’une espèce protéique intacte à l’aide de l’équation (2).
(2)
où M (2H) ou M (1H) sont des masses atomiques de 2H ou 1H. L’astérisque indique les données de l’échantillon marqué 2H. - Déterminer la protection cumulative ou la deutération cumulative des amides dorsaux d’un segment spécifique.
- Pour les données acquises avec une solution modificateur deutérée, utilisez les équations (3) et (4) pour déterminer le niveau de protection cumulatif.
(3)
(4)
Où P(Sk(N)) est la protection totale du segment N-terminal couvrant les résidus 1 à k, P(Sm(C)) est la protection totale du segment C-terminal comprenant m résidus, M (2H) ou M (1H) sont des poids atomiques de 2H ou 1H, et M (ci) ou M (zi) sont les poids moléculaires des ions ci ou zi .
REMARQUE : Le double astérisque indique les données de l’exemple hdx « endpoint ». - Pour les données acquises avec une solution modificateur non deutérée, utilisez les équations (5) et (6) pour déterminer le niveau de deutération cumulatif.
(5)
(6)
Où D(Sk(N)) est l’absorption cumulative de deutérium du segment N-terminal couvrant les résidus 1 à k; D(Sm(C)) est l’absorption cumulative de deutérium du segment C-terminal comprenant m résidus.
- Pour les données acquises avec une solution modificateur deutérée, utilisez les équations (3) et (4) pour déterminer le niveau de protection cumulatif.
- Déterminer le niveau de deutération au niveau d’un groupe amide dorsal local
- Pour les données acquises avec une solution modificateur deutérée, utilisez les équations (7), (8), (9), (10) et (11) pour déterminer le niveau de protection local.
pour les données déduites des ions c
(7)
pour les données déduites des z-ions
(8)
Où P(Ri) est la protection d’un amide dorsal au résidu i, et l’indice « total » désigne le nombre total de résidus de la protéine.
Pour les sites de résidus où des ions fragments ultérieurs étaient manquants, attribuez P(Ri) à l’aide des équations (9) et (10).
pour les données déduites des ions c
(9)
pour les données déduites des z-ions
(10)
Ensuite, déterminez le niveau de deutération D(Ri) à un groupe amide dorsal local à l’aide de l’équation (11).
(11) - Pour les données acquises avec une solution modificateur non deutérée, utilisez les équations (12), (13), (14) et (15) pour déterminer le niveau de protection local.
pour les données déduites des ions c
(12)
pour les données déduites des z-ions
(13)
Où D(Ri) est la protection d’un amide dorsal au résidu i, et l’indice « total » désigne le nombre total de résidus de la protéine.
Pour les sites de résidus où des ions fragments ultérieurs étaient manquants, assignez D(Ri) à l’aide des équations (14) et (15).
pour les données déduites des ions c
(14)
pour les données déduites des z-ions
(15)
- Pour les données acquises avec une solution modificateur deutérée, utilisez les équations (7), (8), (9), (10) et (11) pour déterminer le niveau de protection local.
- Déterminer le niveau global de deutération d’une espèce protéique intacte à l’aide de l’équation (2).
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
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Representative Results
La modification de la pression de perfusion de BGE permet d’ajuster à la fois l’efficacité de séparation et le temps de migration, ce qui équivaut au temps de réaction HDX des protéines à séparer (Figure 3). Une pression de perfusion plus faible se traduit par une meilleure séparation des pics CE au détriment de la durée de l’expérience (Figure 3A). Un temps de migration/réaction HDX plus long entraîne un niveau plus élevé de deutération des analytes protéiques (Figure 3B-D). À l’échelle de temps HDX de quelques minutes, la différence de deutération devrait principalement refléter les différentes étendues d’échange sur les sites structurellement protégés plutôt que sur les sites échangeables rapidement. Selon la tendance des fonctions de temps de deutération montrées par l’une ou l’autre espèce de protéine, il est peu probable que la différence de temps de migration soit le principal contributeur à la différence de deutération. En effet, dans le CE-HDX différentiel de l’holo- et de l’apo-myoglobine (Mb)8, l’apo-Mb élué plus tôt montre un niveau de deutération plus élevé que l’holo-Mb, suggérant clairement que la différence conformationnelle est le principal facteur déterminant la différence de deutération mesurée.
La correction de la différence de deutération introduite par la différence de temps de migration peut être effectuée via un ajustement de courbe pour les données du niveau de deutération par rapport au temps HDX (Figure 3D). Les variantes A et B de β-lg ne diffèrent que par deux résidus d’acides aminés dans leur séquence (D64G et V118A)20. Ces variantes ont donné lieu à deux pics suffisamment séparés dans l’électrophérogramme dérivé de l’EIC (figure 4A). Des profils de séparation reproductibles ont été obtenus à partir d’expériences menées par différents opérateurs utilisant différents instruments dans différentes installations (figure 4A). Les distributions de masse distinctes d’ions qui en résultent correspondant à la variante marquée différentiellement 2H (figure 4C) permettent la sélection de masse de chaque variante à l’aide d’un filtre de masse quadripolaire pour l’analyse ultérieure de la MS descendante, sans interférence des ions cation-adduit de l’autre variante.
Les spectres MS en tandem d’ions fragments représentatifs sont illustrés à la figure 5. La liaison disulfure unique et la conformation de β-lg limitent l’efficacité de fragmentation entre Cys82 et Cys176 car une énergie de fragmentation supplémentaire est nécessaire pour cliver les liaisons disulfures qui entourent cette région14, ce qui entraîne un nombre et une abondance relative d’ions z (C-terminal) inférieurs à ceux des ions c (N-terminal) (Figure 5A,B). Ce problème peut être résolu en combinant avec des approches de réduction de disulfure 21,22,23,24. Alors que la plupart des ions fragments produits à partir de β-lg A et β-lg B présentent une absorption similaire de deutérium (Figure 5A,B), les segments plus grands qui couvrent les sites de variation de séquence (représentés par des ions tels que c137) de β-lg A sont deutérés dans des mesures significativement plus importantes que β-lg B (132 vs 119 atomes 2H; Figure 5C). Ces résultats sont en accord avec le profil CE et les résultats de caractérisation par cristallographie de ces variantes. Le profil CE indique une mobilité électrophorétique plus élevée de β-lg B en raison d’une flexibilité structurelle plus faible. Les résultats de la caractérisation par cristallographie de ces variantes indiquent que de petits changements dans la conformation de l’épine dorsale ont lieu à proximité du D64G sur la boucle CD (résidus 61-67)11.
Figure 3 : Analyse HDX MS basée sur CE d’un mélange de myoglobine et d’ubiquitine avec différents temps de réaction HDX. (A) Électrophérogrammes (à base d’EIC) de 2Mb marqués H (rouge) et Ub (bleu) à partir d’un mélange, acquis avec différentes pressions de perfusion BGE. (B) Spectres de masse de 2H marqués [Mb]16+ (rouge) et [Ub]8+ (bleu) acquis avec des temps HDX différents. Sur le dessus se trouvent des spectres de référence d’ions [Mb]16+ et [Ub]8+ non étiquetés (gris). (C) Temps de migration de Mb (rouge) et Ub (bleu) en fonction de la pression de perfusion BGE. (D) Niveau de deutération de Mb (rouge) et Ub (bleu) en fonction du temps de réaction HDX (équivalent au temps de migration). Données acquises avec un système d’électrophorèse capillaire CESI 8000 plus et un spectromètre de masse Q Exactive UHMR. Abréviations: BGE = solution d’électrolyte de fond; CE = électrophorèse capillaire; MS = spectrométrie de masse; HDX = échange hydrogène/deutérium; Mb = myoglobine; Ub = ubiquitine; EIC = courant ionique extrait. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse HDX MS basée sur l’EC d’un mélange naturel de β-lg A et β-lg B provenant de lait bovin. (A) Électrophérogrammes (à base d’EIC) de 2β-lg A marqués H (bleu) et β-lg B (rouge) provenant de lait de bovin, acquis avec différentes pressions de perfusion BGE. Données acquises avec un système CESI 8000 plus CE et un spectromètre de masse Q Exactive UHMR. Sur le dessus se trouve un électrophérogramme provenant d’une mesure effectuée dans une installation différente (gris), avec un système CE d’analyse pharmaceutique PA 800 Plus et un spectromètre de masse Orbitrap Fusion Lumos. (B) Spectres massiques de 2H marqués [β-lg A]14+ (bleu) et [β-lg B]14+ (rouge) acquis avec une pression de perfusion BGE de 1 psi. Sur le dessus sont superposés des spectres de référence d’ions [β-lg A]14+ et [β-lg B]14+ non marqués (gris). Abréviations: BGE = solution d’électrolyte de fond; CE = électrophorèse capillaire; MS = spectrométrie de masse; HDX = échange hydrogène/deutérium; Ig = immunoglobuline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Spectres MS en tandem d’ions fragments représentatifs produits à partir de β-lg A (bleu) et β-lg B (rouge). A) les ions c10 sont abondants et deutérés dans des proportions similaires; B) les ions z29 sont moins abondants et deutérés dans des proportions similaires; (C) les ions c137 couvrent les sites de variation de séquence et sont deutérés à des degrés sensiblement différents dans β-lg A et B. Les emplacements des segments correspondants sont illustrés sous forme de parties orange de la structure cristalline de β-lg B (ID PDB: 5IO5). Abréviations : MS = spectrométrie de masse; Ig = immunoglobuline. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les objectifs du revêtement de la paroi interne du capillaire CE comprennent la minimisation du flux électroosmotique et l’absorption des protéines au cours du processus CE13. Bien que l’écoulement électroosmotique soit bénéfique pour l’analyse CE conventionnelle de petites molécules en raison de sa capacité à conduire des espèces neutres ou chargées de manière opposée au détecteur, il compromet l’efficacité de séparation des espèces de protéines de tailles et de charges nettes similaires en solution. Le revêtement du capillaire avec du HPC minimise le flux électroosmotique causé par les groupes silanol sur la paroi interne du capillaire. De plus, le masquage de ces groupes silanol réduit leur interaction avec les protéines, évitant ainsi que la migration ralentie ou même la rétention complète des protéines dans le capillaire.
Au cours de l’électrophorèse, les analytes, les cations et les anions du BGE subissent une migration électrophorétique. Lors du couplage avec MS, un réservoir du BGE du côté de la tension négative du capillaire CE est remplacé par une interface CE-MS de composition différente. L’application d’une pression qui infuse continuellement du BGE frais dans le capillaire à partir du réservoir du côté de la tension positive à un débit spécifique minimise le gradient de concentration de la teneur en BGE dans tout le capillaire, ce qui est bénéfique pour les performances de séparation.
Le temps de réaction HDX est un paramètre essentiel pour déterminer le taux de change à un site/segment donné et caractériser la dynamique des structures d’ordre supérieur des protéines. Dans un schéma HDX basé sur CE, lorsque le capillaire est rempli de BGE deutéré, le temps de réaction HDX dépend du volume interne du capillaire et de la vitesse de migration des analytes. Bien que le volume interne du capillaire puisse être ajusté en modifiant la longueur ou l’ID du capillaire, l’étendue de l’ajustement à l’aide de cette méthode est limitée par des facteurs tels que la longueur minimale requise pour connecter les instruments CE et MS et la contre-pression supplémentaire et le risque de colmatage causé par la diminution de l’ID.
En revanche, la modification de la pression de perfusion BGE est un moyen pratiquement efficace d’ajuster le temps de réaction HDX sur une large plage. Cependant, il est toujours difficile d’abaisser le temps HDX à des valeurs inférieures à la minute car un débit élevé compromet la désolvation à l’interface ESI. Pour obtenir un temps HDX plus faible, la quantité souhaitée de BGE non deutéré peut être injectée dans le capillaire qui a été rempli de BGE deutéré avant l’injection de l’échantillon. Cela aidera à réduire la longueur de la section BGE deutérée que les protéines analytiques devraient traverser et avec laquelle elles interagissent pendant leur migration. Cette approche permet de réduire le temps HDX effectif à la deuxième échelle8.
La simulation du champ de vitesse et de la distribution de concentration lorsque l’analyte est constamment infusé dans le microvial révèle que le flux CE est efficacement dilué par la solution modificateur au microvial traversant et que la durée de déplacement de l’analyte dans cette région de mélange est à la deuxième échelle en l’absence de flux électroosmotique25 . Bien que le HDX des sites amides de l’épine dorsale structurellement protégés soit « trempé » lors du mélange avec le modificateur acidifié, un tel schéma de mélange entraîne la perte d’étiquettes de deutérium au niveau des atomes d’hydrogène échangeables rapidement (y compris ceux des chaînes latérales) lorsqu’un modificateur non deutéré est utilisé. En conséquence, le 2H2O et le méthanol deutéré devraient être utilisés pour préparer le modificateur dans les mesures qui nécessitent que les étiquettes de deutérium sur les sites échangeables rapides soient conservées pour l’analyse de la SEP.
Les limites du schéma actuel de cette approche HDX MS basée sur CE sont associées à (1) la régulation du temps HDX et (2) l’échange d’hydrogène supplémentaire entre les analytes protéiques et la solution modificateur à l’interface d’écoulement. La détermination du débit effectif est basée sur l’estimation utilisant sa corrélation empirique avec des paramètres tels que la pression de perfusion, les paramètres capillaires et les paramètres de solution (voir étape 2.3.4), Pour cette raison et parce qu’il n’est pas possible de mesurer avec précision le volume interne du capillaire (modifié ou non modifié, fait maison ou commercial), le temps HDX ne peut pas être délibérément réglé avec une grande précision en ajustant les paramètres de fonctionnement. Cependant, le temps HDX résultant expérimentalement peut être mesuré avec précision.
La solution modificateur utilisée dans cette approche comprend un solvant organique, qui facilite la SEP en tandem en déployant les protéines, et de l’acide pour minimiser les réactions d’échange ultérieures en abaissant le pH à 2,5. Comme il n’est pas possible d’éviter d’utiliser des solvants protiques, l’échange entre les protéines et la solution modificateur se produit lors de leur mélange à l’interface CE-MS. Lorsqu’une solution modificateur non deutérée est utilisée, les sites échangeables rapidement perdent leurs étiquettes de deutérium à ce stade, et seuls les sites bien protégés restent marqués, ce qui limite la sensibilité à la comparaison des protéines présentant des différences conformationnelles mineures. Ces effets peuvent être partiellement calibrés en mesurant la protéine entièrement deutérée dans un échantillon de référence.
L’exécution de HDX en CE fournit un moyen de séparer les espèces protéiques en solution pendant hdX afin d’éviter les interférences des ions des espèces voisines dans la caractérisation descendante de la SEP des espèces individuelles et une approche d’initialisation de la réaction HDX. Dans cette réaction HDX, les protéines à devenir complètement deutérées quittent complètement l’environnement non deutéré d’origine en raison de leurs mobilités différentes. Cela contraste avec l’opération de dilution conventionnelle, où une fraction du contenu non deutéré (allant généralement de 1% à 10%) est conservée. Compte tenu des avantages des développements récents de la technique top-down MS, nous prévoyons d’améliorer encore cette approche afin qu’elle puisse être incluse dans la boîte à outils fiable pour la caractérisation différentielle des structures d’ordre supérieur des protéines.
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Disclosures
D. D. Y. Chen est l’un des fondateurs du Knowledge for Health Institute for Biomolecules, qui commercialise l’interface CE-MS microviale à flux continu. D’autres auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Les auteurs ont également reçu le soutien de l’Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Chine; Centre d’innovation collaborative du Jiangsu pour les matériaux fonctionnels biomédicaux; et Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials à l’Université normale de Nanjing, en Chine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R.
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
