Summary
Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.
Abstract
Å løse konformasjonell heterogenitet av flere proteintilstander som sameksisterer i løsning, er fortsatt en av de viktigste hindringene i karakteriseringen av proteinterapeutikk og bestemmelse av konformasjonsovergangsveiene som er kritiske for biologiske funksjoner, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium utveksling (HDX) reaksjon kombinert med ovenfra og ned massespektrometrisk (MS) analyse gir et middel til å karakterisere protein høyere orden strukturer og dynamikk på en konform-spesifikk måte. Konformasjonsløsningskraften til denne teknikken er svært avhengig av effektiviteten ved å skille proteintilstander på intakt proteinnivå og minimere det gjenværende ikke-deutererte protiske innholdet under HDX-reaksjonene.
Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-basert variant av HDX MS-tilnærmingen som tar sikte på å forbedre konformasjonsoppløsningen. I denne tilnærmingen gjennomgår proteiner HDX-reaksjoner mens de migrerer gjennom en deutert bakgrunnselektrolyttløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk separasjon. Ulike proteintilstander eller proteoformer som sameksisterer i oppløsning, kan effektivt separeres basert på deres forskjellige forhold mellom ladning og størrelse. Forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske løsningsmiddelmolekyler minimerer det gjenværende ikke-deutererte løsningsmidlet, noe som resulterer i et nesten komplett deuteringsmiljø under HDX-prosessen. Det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet muliggjør effektiv elektrosprayionisering av de eluterte proteinartene etter en rask blanding med slukke- og denatureringsmodifikatorløsningen ved utløpet av sprøyten. Den elektroniske ovenfra-og-ned MS-analysen måler det globale deuteringsnivået til de rømte intakte proteinartene, og deretter deutering av gassfasefragmentene. Dette dokumentet demonstrerer denne tilnærmingen i differensial HDX for systemer, inkludert de naturlige proteinvariantene som sameksisterer i melk.
Introduction
Å skille proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander og karakterisere deres strukturelle forskjeller er viktig for å overvåke overgangsveiene mellom disse artene som er involvert i biologiske hendelser, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse, og forstå mekanismene som ligger til grunn for disse hendelsene. Konvensjonelle biofysiske teknikker gir ikke en komplett løsning på grunn av begrensningene som utilstrekkelig oppløsning og tap av dynamisk informasjon i løsningen. Hydrogen/deuteriumutveksling kombinert med massespektrometri (HDX MS) er en teknikk som merker de strukturelle og konformasjonsmessige egenskapene til proteiner med deuterium (2H) via utvekslingen mellom labile hydrogenatomer av proteiner og 2H fra den bevisst introduserte 2H2O-løsningen. Protoner involvert i hydrogenbinding eller som er beslaglagt fra løsningsmidlet i proteininteriøret, utveksles ikke lett1. Dermed, ettersom valutakursen på et utvekslingssted er svært avhengig av sitt engasjement i høyere ordens strukturer, kan proteinstrukturene avsløres ved høy romlig oppløsning av MS som undersøker omfanget og hastigheten på 2H-opptak basert på de forskjellige atommassene mellom 1H og 2H. I løpet av de siste tiårene har HDX MS blitt en fremragende vellykket teknikk for å studere proteinkonformasjoner og dynamikk2.
I den klassiske nedenfra-og-opp-tilnærmingen til HDX MS er ensemblet av proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander proteolysert uten separasjon på intakt proteinnivå, noe som gjør det umulig å karakterisere individuelle arter ved å analysere de resulterende proteolytiske fragmentene med innviklet deuteriuminnhold. I motsetning, i ovenfra og ned-tilnærmingen, gir forskjellige proteintilstander eller proteoformer som har innlemmet forskjellig deuteriuminnhold, opphav til flere distribusjoner av intakte proteinmasser i en MS-skanning. Dette gjør at individuelle arter kan skilles ved massevalg av ioner som tilsvarer hver massefordeling ved hjelp av et riktig massefilter (for eksempel en quadrupole) og karakteriseringen av deres konformasjonsforskjeller i den påfølgende tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av å skille proteintilstander eller proteoformer i denne strategien er imidlertid begrenset av omfanget av forskjell i deres tilsvarende massefordelinger.
Kapillær elektroforese (CE) gir et middel til å skille proteinarter basert på deres forskjellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i løsningsfasen med høy effektivitet7. Kombinere CE med HDX tilbyr ytterligere separasjon av proteintilstander eller proteoformer i løsningsfasen. I tillegg tillater det lille volumet av CE-kapillæren utnyttelse av en fullt deutert løsning som bakgrunnselektrolyttløsning (BGE), det vil si løpebufferen, som gjengir kapillæren som en HDX-reaktor for proteinprøver. På grunn av forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprosessen, resulterer det i et nesten komplett deuteringsmiljø for proteinanalyttene med minimalt gjenværende ikke-deutert innhold, og dermed forbedrer følsomheten til strukturanalysen ved hjelp av HDX-data. Som sådan utviklet vi en CE-basert differensial HDX-tilnærming kombinert med ovenfra og ned MS for å karakterisere protein høyere orden strukturer på en tilstands- eller proteoform-spesifikk måte8.
Dette dokumentet beskriver protokoller for denne tilnærmingen ved å detaljere trinnene for materialforberedelse, eksperimentell prosedyre og dataanalyse. Faktorer som kan påvirke metodeytelsen eller datakvaliteten, vises i korte merknader. De representative resultatene som presenteres her inkluderer differensial HDX-data av blandinger av forskjellige proteiner og naturlige varianter av storfe β-lactoglobulin (β-lg), det store myseproteinet som finnes i melk9. Vi demonstrerer separasjonseffektivitet, reproduserbarhet og 2H-merkingsytelse av de to rikelige variantene av β-lg, det vil si A og B10,11 under CE-basert HDX og variantspesifikk karakterisering av deres konformasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Bruk hplc-grade (high-performance liquid chromatography) eller MS-reagenser når det er mulig for å minimere forurensningene som kan forstyrre MS-analysen. Ikke berør CE-MS-grensesnittet med bare hender under målingen for å unngå muligheten for elektrisk støt forårsaket av enten elektroforetisk spenning eller elektrosprayspenning.
1. Materialforberedelse
- Modifikasjon av smeltet silika kapillær for CE
- Forbered en 5% (w / w) hydroksypropylcellulose (HPC) løsning ved å oppløse HPC-pulver (molekylvekt [MW]: 100 kDa) i vann med kontinuerlig omrøring ved romtemperatur på en magnetisk omrører i ~ 12 timer eller til fullstendig forsvinning av faste partikler12. Fjern eventuelle synlige luftbobler med en ultralydator.
- Monter en smeltet silikaglasskapillær (indre diameter [ID]: 50 μm, ytre diameter [OD]: 360 μm) på ca. 85 cm lengde i et CE-instrument. Skyll kapillæren ved kontinuerlig å infundere et organisk løsningsmiddel, for eksempel aceton13, ved hjelp av autosampleren til CE ved et infusjonstrykk på 40 psi i 10-15 min.
- Fyll den rensede kapillæren med HPC-oppløsning ved hjelp av autosampleren ved et infusjonstrykk på 40 psi (som ofte tar ~ 40 min). Tilsett luft i den HPC-fylte kapillæren ved 40 psi for å sikre fri luftstrøm i kapillæren, indikert av luftboblene som kastes ut av kapillæren ved nedsenking i vann.
- Stek den HPC-belagte kapillæren i en temperaturprogrammerbar ovn (ideelt sett den temperaturkontrollerte søyleovnen til en temperaturprogrammert gasskromatografi) med nitrogengass (25 psi) som strømmer gjennom kapillæren, etter temperaturprogrammet vist i figur 1.
- Avkjøl ovnen til romtemperatur før du tar kapillæren ut. Bruk denne HPC-modifiserte kapillæren for CE-separasjon.
Figur 1: Et anbefalt temperaturprogram for kapillærbaking. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Bakgrunnselektrolytt (BGE) løsning og modifikatorløsning8
- Forbered 1-10 ml BGE ved ønsket konsentrasjon (f.eks. 10 mM) ved å oppløse riktig mengde ammoniumacetat i 2H2O. Plasser 200 μL-aliquots av BGE i separate BGE-hetteglass og forsegle hetteglassene med parafilm for å minimere HDX-reaksjonen mellom BGE og vanndamp i luften.
- Forbered 10 ml modifikatorløsning med 75 % (v/v) metanol og 25 % (v/v) vann, med pH justert til 2,5 ved hjelp av maursyre.
MERK: Bruk 2H2O og deutert metanol for å klargjøre modifikatorløsningen hvis deuteriumatomer i sidekjettingene og ubeskyttede ryggradskjeder skal beholdes for deteksjon av MS.
- Avsalting av proteinprøver
- Forbered en ammoniumacetatoppløsning i ikke-deutert vann ved ønsket konsentrasjon.
MERK: En konsentrasjon som er mindre enn 100 mM anbefales for å unngå høy elektrisk strøm under elektroforese og den resulterende Joule-oppvarmingseffekten. - Juster om nødvendig pH i ammoniumacetatoppløsningen til ønsket nivå ved hjelp av maursyre (for pH < 6,8) eller ammoniumhydroksid (for pH > 6,8).
- Erstatt de opprinnelige bufferne i proteinoppløsningen med en ammoniumacetatoppløsning (fremstilt i ikke-deutert vann ved ønsket konsentrasjon; pH justert til 7,5 med ammoniumhydroksid) gjennom minst fem sekvensielle konsentrasjoner og fortynningstrinn ved 4 °C ved hjelp av et sentrifugalfilter med riktig MW-avskjæring.
MERK: Proteinprøvene som skal avsaltes kan enten være fra tidligere produksjonsprosedyrer (f.eks. rensing eller formulering) eller fremstilles ved å oppløse det lyofiliserte pulveret av protein. "Saltene" som skal fjernes fra prøveløsningene i dette trinnet, refererer generelt til alle små ioner eller molekyler som ikke er flyktige. Selv om disse artene effektivt kan skilles fra proteiner under elektroforeseprosessen, anbefales dette trinnet for å unngå å kompromittere den elektroforetiske oppløsningen og dermed minimere forurensningen av massespektrometeret. Når proteinanalytter skal stabiliseres av spesifikke salter eller tilsetningsstoffer, ta dem med i BGE. - Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av et mikrovolum UV-Vis spektrofotometer.
- Forbered en ammoniumacetatoppløsning i ikke-deutert vann ved ønsket konsentrasjon.
2. Drift av CE-basert HDX MS-analyse
MERK: Massespektrometeret som brukes i denne tilnærmingen, bør være utstyrt med en masseanalysator med ultrahøy oppløsning, for eksempel en Fourier-transform ion cyclotron resonans (FTICR) eller orbitrap, et massefilter, for eksempel en quadrupole som tillater massevalg av forløperioner for fragmentering, og elektronoverføringsdissosiasjon (ETD) eller elektronfangstdissosiasjonsfunksjoner (ECD) for å utføre ovenfra-og-ned-analyse med pålitelige tandem MS-data (ideelt isotopisk løste signaler av fragmentioner).
- Optimalisering av CE- og MS-innstillinger
- Utfør en PILOT MS-måling ved hjelp av en standard elektrosprayioniseringskilde (ESI) ved å sprøyte enten den forhåndslastede prøven fra en metallbelagt borosilikatglasskapillær (den "statiske" nanoESI-ordningen) eller den kontinuerlig tilsatte prøven fra en metallemitter for å optimalisere MS-innstillingene for måling av intakte proteiner (MS1) og deres gassfasefragmenter (MS2). Fragmenter proteinartene av interesse ved massevalg av ensemblet av ionene i en enkelt ladetilstand, etterfulgt av ETD eller ECD av forløperionene.
MERK: De essensielle innstillingene inkluderer parametrene som påvirker desolvasjon, massevalg av forløperioner (for å unngå forstyrrelser fra andre arter) og fragmenteringseffektivitet. Både midten og bredden på massevalgsvinduet bør økes for å matche den resulterende massefordelingen av analyttionene etter HDX. Fordi elutionvinduet til en proteinart i CE vanligvis varierer fra 0,5 min til 2 min, kan du vurdere fragmenteringseffektiviteten basert på MS2-skanninger akkumulert over et sammenlignbart tidsvindu. De optimale verdiene til disse parametrene er proteinspesifikke; lesere refereres til tidligere publiserte rapporter for eksemplariske innstillinger 8,14. - Utfør en pilot CE-måling ved hjelp av et CE-instrument utstyrt med en optisk detektor, det vil si en fotodiode array (PDA) detektor eller en UV-detektor for å optimalisere CE-innstillingene for separasjon av proteinarter og migrasjonstider, noe som tilsvarer HDX-reaksjonstidene.
MERK: Dette trinnet er valgfritt avhengig av tilgjengeligheten til den optiske detektoren til CE. I mangel av en optisk detektor kan CE-innstillingene optimaliseres ved hjelp av CE-MS når pkt. 2.2 er fullført, i henhold til instruksjonene som er beskrevet i avsnitt 2.3. De viktigste innstillingene inkluderer parametere som påvirker separasjonseffektivitet, toppformer vist i elektroferogrammer og elutiontider.
- Utfør en PILOT MS-måling ved hjelp av en standard elektrosprayioniseringskilde (ESI) ved å sprøyte enten den forhåndslastede prøven fra en metallbelagt borosilikatglasskapillær (den "statiske" nanoESI-ordningen) eller den kontinuerlig tilsatte prøven fra en metallemitter for å optimalisere MS-innstillingene for måling av intakte proteiner (MS1) og deres gassfasefragmenter (MS2). Fragmenter proteinartene av interesse ved massevalg av ensemblet av ionene i en enkelt ladetilstand, etterfulgt av ETD eller ECD av forløperionene.
- Forhåndskondisjonering av CE-HDX-oppsettet
- Rengjør det gjennomstrømnings mikroviale CE-MS-grensesnittet med en blanding av 50% metanol, 49% vann og 1% maursyre (v / v) ved hjelp av ultralydbehandling i minst 30 minutter ved romtemperatur.
- Når hpc-modifisert kapillær monteres på et CE-instrument, skyll kapillæren med BGE ved hjelp av autosampleren i 10 minutter og la kapillæren være fylt med BGE.
- Få en riktig lengde på umodifisert smeltet silika kapillærrør (ID: 50 μm, OD: 360 μm) som infusjonsrør for modifikatoroppløsningen. Koble modifikatorslangen til en gasstett glasssprøyte med en stump spiss ved hjelp av en kobling og riktig hylse, og skyll slangen med modifikatoroppløsningen ved hjelp av en infusjonspumpe i minst 10 minutter.
- Sett inn uttakene til HPC-belagt CE-kapillær- og modifikatorrør, som er lastet med tilsvarende løsninger, i det rensede CE-MS-grensesnittet, som vist i figur 2.
- Før sprøyten til modifikatorinfusjonen enten manuelt eller med infusjonspumpen for å sikre at modifikatoroppløsningen når spissen av grensesnittet. Monter det monterte CE-MS-grensesnittet på et nanoESI-kildehus av et massespektrometer.
Figur 2: Skjematisk illustrasjon av det CE-baserte HDX MS-oppsettet. Dette tallet er endret fra8. Forkortelser: BGE = bakgrunnselektrolyttløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium utveksling; ESI = elektrosprayionisering; FTICR = Fourier-transform ion cyclotron resonans; ETD = elektronoverføring dissosiasjon; ECD = elektronfangst dissosiasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Samtidig CE-separasjon, HDX-reaksjon og MS-analyse
MERK: Deuterated BGE anbefales å brukes innen 1 dag etter forsegling.- Påfør en sprayspenning på 3-5 kV på CE-MS-grensesnittet.
- Begynn å infundere modifikatorløsningen med infusjonspumpen med en strømningshastighet fra 0,1 til 10 μL/min, og sørg for en stabil elektrospray på spissen av CE-MS-grensesnittet.
- Plasser prøveteget som inneholder BGE i autosampleren, og bruk det i trinn 2.3.4 for å skaffe tomme elektroferogrammer og blank massespektra.
- Injiser prøveløsningen ved hjelp av autosampleren ved 2 psi og i riktig varighet for å tillate injeksjon av ønsket mengde av prøven. Beregn injeksjonsvolumet ved hjelp av forholdet mellom injeksjonsvolum og injeksjonsparametere15 definert av ligning (1).
(1)
Der Vinj er injeksjonsvolumet, er Δp injeksjonstrykket, dc er kapillærens indre diameter, A er tverrsnittet av kapillæren, tinj er varigheten av injeksjonen, η er viskositeten til væsken i kapillæren, og L er lengden på kapillæren. - Start CE-separasjonen ved å bruke en elektroforetisk spenning på 30 kV og infusjonstrykk fra 0 til 2 psi, og skaff elektropherogrammet. I mellomtiden starter du innsamlingen av MS-dataene i kromatografisk modus der igangstrømsgrafen er anskaffet som en tidsfunksjon, og de tilsvarende MS-skanningene kombineres ikke automatisk til et enkelt spektrum.
MERK: Proteiner gjennomgår spontan HDX-reaksjon ved kontakt med 2H2 O-molekyleri BGE under deres elektroforetiske migrasjon i dette trinnet. Den optiske gjenkjenningen for CE kan brukes i tillegg til MS-deteksjonen. Ettersom deteksjon på kolonnen krever fjerning av en viss lengde av polyimidbelegg ved utløpsenden av den smeltede silikakapillæren, bør det utvises ekstra forsiktighet for å unngå kapillær skade under montering av CE-MS-grensesnittet. - Lagre det tomme elektropherogrammet og massespektraet som referanser.
MERK: Tomme data skal brukes til feilsøking i stedet for grunnleggende subtraksjon. - Plasser prøvehylsene som inneholder de ønskede konsentrasjonene av proteinprøveløsningene i autosampleren. Anskaffe elektroferogrammer og massespektra for proteinprøvene ved å følge trinn 2.3.4-2.3.5. Samle et tilstrekkelig antall MS-skanninger for å oppnå MS1-spektra av de elektroforeskilte og 2H-merkede proteinarter.
- Utfør tandem MS-målinger for arter av interesse enten etter å ha anskaffet MS1-spektraet i samme løp eller i et påfølgende, separat løp.
- Juster om nødvendig migrasjonstidene/HDX-reaksjonstidene ved å endre infusjonstrykket eller lengden på CE-kapillæren. Hvis HDX-reaksjonstiden må være kortere enn migreringstiden, bruker du fremgangsmåten som er beskrevet tidligere8, som bruker både deuterert og ikke-deutert BGE i kapillæren under CE-prosessen.
- Skyll CE-kapillæren med BGE med et trykk på 20 psi i minst 10 minutter etter hver måling.
- Når eksperimentene er fullført, rengjør CE-MS-grensesnittet og alle slangene for lagring.
- Skaff deg et datasett av HDX-eksemplet for "endepunkt" (som kan utarbeides ved hjelp av tilnærminger beskrevet tidligere 6,16) med MS i direkte infusjonsmodus.
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig når en deutert modifikatorløsning brukes til CE-basert HDX.
(1)3. Dataanalyse
- Analyse av CE-data
- Bruk en av følgende plott som elektroferogram for å bestemme de elektroforetiske egenskapene, inkludert antall topper, migrasjonstider og separasjonseffektivitet: (a) UV-absorbans vs. migrasjonstid, anskaffet av den optiske detektoren til CE-instrumentet (når tilgjengelig); (b) den totale ionstrømsgrafen (TIC) som er anskaffet av MS; (c) den ekstraherte ionstrømsgrafen (EIC/XIC) som er anskaffet av MS.
MERK: EIC/XIC gir det optimale signal-/støyforholdet (S/N), generelt, blant de nevnte formatene av elektroferogrammer. Det er bemerkelsesverdig at selv i fravær av instrumentelle fordommer, mens UV-absorbans er proporsjonal med massekonsentrasjonen av protein, er MS-signalet proporsjonalt med molarkonsentrasjonen. Derfor er det rimelig å observere forskjeller i toppmønstre mellom CE- og MS-avledede elektroferogrammer. - Bruk området under kurven (AUC) til toppene som vises i elektroferogrammene for halvmengder. For prøver som involverer proteinkomplekser, bruk tilnærmingen som er beskrevet tidligere17 for å utlede massekonsentrasjonsdataene fra TIC / EIC-elektroferogrammer.
- Bruk en av følgende plott som elektroferogram for å bestemme de elektroforetiske egenskapene, inkludert antall topper, migrasjonstider og separasjonseffektivitet: (a) UV-absorbans vs. migrasjonstid, anskaffet av den optiske detektoren til CE-instrumentet (når tilgjengelig); (b) den totale ionstrømsgrafen (TIC) som er anskaffet av MS; (c) den ekstraherte ionstrømsgrafen (EIC/XIC) som er anskaffet av MS.
- Analyse av MS-data
- Skaff deg MS1- og MS2-spektraet ved å kombinere MS1- og MS2-skanningene som er anskaffet i henholdsvis de tilsvarende elutionvinduene.
- Bestem massene av det intakte proteinet (M (intakt protein)) og fragmenter ved en av følgende to metoder.
- Beregn de gjennomsnittlige massene av ionene som gir opphav til de isotopisk løste signalklyngene.
- Bruk midten av de gaussiske kurvene som følge av monteringen av de tilsvarende isotopiske konvoluttene6.
- Bruk programvare som Biopharma Finder, ProSight18 eller MASH Suite19 til å generere masselisten over fragmentionene og identifisere dem.
- Analyse av HDX-data
- Bestem det totale deuterasjonsnivået til en intakt proteinart ved hjelp av ligning (2).
(2)
der M (2H) eller M (1H) er atomvekter på 2H eller 1H. Stjernen angir data fra den toH-merkede prøven. - Bestem den kumulative beskyttelsen eller kumulativ deutering av ryggrads-amider i et bestemt segment.
- For data som er samlet inn med en deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (3) og (4) til å bestemme det kumulative beskyttelsesnivået.
(3)
(4)
Der P(Sk(N)) er den totale beskyttelsen av N-terminalsegmentet som spenner over rester 1 til k, P(Sm(C)) er den totale beskyttelsen av C-terminalsegmentet som består av m rester, M (2H) eller M (1H) er atomvekter på 2H eller 1H, og M (ci) eller M (zi) er molekylvektene til ci eller zi ioner.
MERK: Dobbel stjerne indikerer data fra HDX-eksemplet for "endepunkt". - For data som er samlet inn med en ikke-deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (5) og (6) til å bestemme det kumulative deuterasjonsnivået.
(5)
(6)
Der D(Sk(N)) er det kumulative deuteriumopptaket til N-terminalsegmentet som spenner over rester 1 til k; D(Sm(C)) er det kumulative deuteriumopptaket til C-terminalsegmentet som består av m rester.
- For data som er samlet inn med en deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (3) og (4) til å bestemme det kumulative beskyttelsesnivået.
- Bestemme deuterasjonsnivået i en lokal ryggrad midt i gruppen
- For data som er samlet inn med en deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (7), (8), (9), (10) og (11) til å bestemme det lokale beskyttelsesnivået.
for data utledet fra c-ioner
(7)
for data utledet fra z-ioner
(8)
Der P(Ri) er beskyttelsen av en ryggrad midt i rester i, og senket "total" betegner det totale resttallet av proteinet.
For rester der påfølgende fragmentioner manglet, tilordner du P(Ri) ved hjelp av ligninger (9) og (10).
for data utledet fra c-ioner
(9)
for data utledet fra z-ioner
(10)
Deretter bestemmer du deuterasjonsnivået D(Ri) ved en lokal ryggrad midt i gruppen ved hjelp av ligning (11).
(11) - For data som er samlet inn med en ikke-deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (12), (13), (14) og (15) til å bestemme det lokale beskyttelsesnivået.
for data utledet fra c-ioner
(12)
for data utledet fra z-ioner
(13)
Der D(Ri) er beskyttelsen av en ryggrad midt i rester i, og senket "total" betegner det totale resttallet av proteinet.
For reststeder der påfølgende fragmentioner manglet, tilordner du D(Ri) ved hjelp av ligninger (14) og (15).
for data utledet fra c-ioner
(14)
for data utledet fra z-ioner
(15)
- For data som er samlet inn med en deutert modifikatorløsning, bruker du ligninger (7), (8), (9), (10) og (11) til å bestemme det lokale beskyttelsesnivået.
- Bestem det totale deuterasjonsnivået til en intakt proteinart ved hjelp av ligning (2).
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(15)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endring av infusjonstrykket til BGE gjør det mulig å justere både separasjonseffektivitet og migrasjonstid, noe som tilsvarer HDX-reaksjonstiden til proteinene som skal separeres (figur 3). Et lavere infusjonstrykk resulterer i bedre separasjon av CE-topper på bekostning av eksperimentets varighet (figur 3A). En lengre migrerings-/HDX-reaksjonstid resulterer i et høyere nivå av deutering av proteinanalyttene (figur 3B-D). På HDX-tidsskalaen for minutter bør deuterasjonsforskjellen først og fremst gjenspeile de forskjellige utvekslingsområdene på de strukturelt beskyttede stedene i stedet for de raskt utskiftbare stedene. Ifølge trenden med deuteringstidsfunksjonene vist av en av proteinarter, er migrasjonstidsforskjellen usannsynlig å være den viktigste bidragsyteren til deuterasjonsforskjellen. Faktisk, i differensial CE-HDX av holo- og apo-myoglobin (Mb)8, viser den tidligere rømte apo-Mb et høyere deuterasjonsnivå enn holo-Mb, noe som tydelig tyder på at konformasjonsforskjellen er den primære faktoren som bestemmer den målte deuterasjonsforskjellen.
Korrigering for deuteringsforskjellen som ble introdusert av migrasjonstidsforskjellen, kan gjøres via kurvetilpasning for dataene i deuterasjonsnivået vs. HDX-tid (figur 3D). Variantene A og B av β-lg varierer med bare to aminosyrerester i sekvensen (D64G og V118A)20. Disse variantene ga opphav til to tilstrekkelig separerte topper i det EIC-avledede elektroferogrammet (figur 4A). Reproduserbare separasjonsprofiler ble hentet fra eksperimenter utført av ulike operatører ved hjelp av ulike instrumenter på forskjellige anlegg (figur 4A). De resulterende distinkte massefordelingene av ioner som tilsvarer den differensialt 2H-merkede varianten (figur 4C), tillater massevalg av hver variant ved hjelp av et quadrupole massefilter for den påfølgende ovenfra-og-ned MS-analysen, uten forstyrrelser fra kation-adductionene til den andre varianten.
Tandem MS-spektra av representative fragmentioner er vist i figur 5. Den unike disulfidkoblingen og konformasjonen av β-lg begrenser fragmenteringseffektiviteten mellom Cys82 og Cys176 fordi ytterligere fragmenteringsenergi er nødvendig for å holde de disulfidbindingene som omslutter denne region14, noe som resulterer i et lavere antall og relativ overflod av z-ioner (C-terminal) enn c-ioner (N-terminal) (figur 5A, B). Dette problemet kan løses ved å kombinere med disulfidreduksjonsmetoder 21,22,23,24. Mens de fleste fragmentionene produsert fra β-lg A og β-lg B viser en lignende grad av deuteriumopptak (figur 5A, B), blir større segmenter som dekker sekvensvariasjonsstedene (representert av ioner som c137) fra β-lg A deuterated i betydelig større grad enn β-lg B (132 vs. 119 2H atomer; Figur 5C). Disse resultatene er i samsvar med CE-profilen og krystallografikarakteriseringsresultatene av disse variantene. CE-profilen indikerer høyere elektroforetisk mobilitet av β-lg B på grunn av lavere strukturell fleksibilitet. Krystallografikarakteriseringsresultatene av disse variantene indikerer at små endringer i ryggradskonformasjon finner sted i nærheten av D64G på sløyfe-CD (rester 61-67)11.
Figur 3: CE-basert HDX MS-analyse av en blanding av myoglobin og ubiquitin med forskjellige HDX-reaksjonstider. (A) Elektroferogrammer (EIC-basert) av 2H-merkede Mb (rød) og Ub (blå) fra en blanding, anskaffet med forskjellige BGE-infusjonstrykk. (B) Massespektra av 2H-merkede [Mb]16+ (rød) og [Ub]8+ (blå) ervervet med forskjellige HDX-tider. Overlaid på toppen er referansespektra av umerkede [Mb]16+ og [Ub]8+ ioner (grå). (C) Migrasjonstid for Mb (rød) og Ub (blå) som funksjon av BGE infusjonstrykk. (D) Deuteration nivå av Mb (rød) og Ub (blå) som en funksjon av HDX reaksjonstid (tilsvarer migrasjonstiden). Data innhentet med et CESI 8000 pluss kapillær elektroforesesystem og et Q Exactive UHMR-massespektrometer. Forkortelser: BGE = bakgrunnselektrolyttløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium utveksling; Mb = myoglobin; Ub = ubiquitin; EIC = ekstrahert ionstrøm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: CE-basert HDX MS-analyse av en naturlig blanding av β-lg A og β-lg B fra storfemelk. (A) Elektroferogrammer (EIC-basert) av 2H-merkede β-lg A (blå) og β-lg B (rød) fra storfemelk, anskaffet med forskjellige BGE-infusjonstrykk. Data innhentet med et CESI 8000 pluss CE-system og et Q Exactive UHMR Mass Spectrometer. Overlaid på toppen er et elektroferogram fra en måling utført på et annet anlegg (grått), med et PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE-system og et Orbitrap Fusion Lumos massespektrometer. (B) Massespektra av 2H-merket [β-lg A]14+ (blå) og [β-lg B]14+ (rød) ervervet med BGE infusjonstrykk på 1 psi. Overlaid på toppen er referansespektra av unlabeled [β-lg A]14+ og [β-lg B]14+ ioner (grå). Forkortelser: BGE = bakgrunnselektrolyttløsning; CE = kapillær elektroforese; MS = massespektrometri; HDX = hydrogen/deuterium utveksling; Ig = immunglobulin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Tandem MS spektra av representative fragmentioner produsert fra β-lg A (blå) og β-lg B (rød). (A) c10 ioner er rikelig og deutert i lignende grad; (B) z29 ioner er mindre rikelig og deutert i lignende grad; (C) c137-ioner dekker sekvensvariasjonsstedene og deuteres i betydelig forskjellige omfang i β-lg A og B. Plasseringene til de tilsvarende segmentene er illustrert som oransjefargede deler av krystallstrukturen til β-lg B (PDB ID: 5IO5). Forkortelser: MS = massespektrometri; Ig = immunglobulin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målene med å belegge den indre veggen til CE-kapillæren inkluderer minimering av elektroosmotisk strømning og proteinabsorpsjon under CE-prosessen13. Selv om elektroosmotisk strømning er gunstig for konvensjonell CE-analyse av små molekyler på grunn av dens evne til å drive nøytrale eller motsatt ladede arter til detektoren, kompromitterer den separasjonseffektiviteten til proteinarter med lignende størrelser og netto kostnader i løsningen. Belegg kapillæren med HPC minimerer den elektroosmotiske strømmen forårsaket av silanolgruppene på kapillærens indre vegg. I tillegg reduserer maskering av disse silanolgruppene deres interaksjon med proteiner, unngår redusert migrasjon eller til og med fullstendig oppbevaring av proteiner i kapillæren.
Under elektroforesen gjennomgår både analyttene og kasjonene og anionene fra BGE elektroforetisk migrasjon. Ved kobling med MS erstattes et reservoar av BGE på den negative spenningssiden av CE-kapillæren med et CE-MS-grensesnitt med en annen sammensetning. Påføring av et trykk som kontinuerlig tilfører fersk BGE i kapillæren fra reservoaret på den positive spenningssiden ved en bestemt strømningshastighet minimerer konsentrasjonsgradienten til BGE-innholdet gjennom kapillæren, noe som er gunstig for separasjonsytelsen.
HDX-reaksjonstid er en viktig parameter for å bestemme valutakursen på et gitt sted / segment og karakterisering av dynamikken i høyere ordens strukturer av proteiner. I en CE-basert HDX-ordning, når kapillæren er fylt med deutert BGE, er HDX-reaksjonstiden avhengig av det indre volumet av kapillæren og migreringshastigheten til analyttene. Selv om det indre volumet av kapillæren kan justeres ved å endre lengden eller ID-en til kapillæren, er omfanget av justeringen ved hjelp av denne metoden begrenset av faktorer som den minimale lengden som kreves for tilkobling av CE- og MS-instrumentene og ekstra backpressure og risiko for tilstopping forårsaket av den reduserte IDen.
Derimot er endring av BGE-infusjonstrykket en praktisk effektiv måte å justere HDX-reaksjonstiden over et bredt spekter. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å senke HDX-tiden til verdier på sub-min fordi en høy strømningshastighet kompromitterer desolvasjonen ved ESI-grensesnittet. For å oppnå en lavere HDX-tid kan ønsket mengde ikke-deutert BGE injiseres i kapillæren som er fylt med deuterert BGE før prøveinjeksjon. Dette vil bidra til å redusere lengden på den deutererte BGE-delen som analyttproteinene skal passere gjennom og samhandle med under overføringen. Denne tilnærmingen gjør det mulig å redusere den effektive HDX-tiden til den andre skalaen8.
Simulering av hastighetsfeltet og konsentrasjonsfordelingen når analytten hele tiden infunderes i mikrovialen, avslører at CE-strømmen effektivt fortynnes av modifikatorløsningen ved gjennomstrømningsmikrovialen, og at reisevarigheten til analytten i denne blanderegionen er på den andre skalaen i fravær av elektroosmotisk strømning25 . Selv om HDX av den strukturelt beskyttede ryggraden blant steder er "slokket" ved blanding med den sure modifikatoren, resulterer en slik blandingsordning i tap av deuteriumetiketter ved de raskt utskiftbare hydrogenatomer (inkludert de ved sidekjedene) når en ikke-deutert modifikator brukes. Følgelig bør 2H2O og deutert metanol brukes til å forberede modifikatoren i målinger som krever at deuteriumetikettene på de raskt utskiftbare stedene beholdes for MS-analyse.
Begrensningene i den nåværende ordningen med denne CE-baserte HDX MS-tilnærmingen er forbundet med (1) HDX-tidsreguleringen og (2) ytterligere hydrogenutveksling mellom proteinanalyttene og modifikatorløsningen ved gjennomstrømningsgrensesnittet. Bestemmelsen av den effektive strømningshastigheten er basert på estimering ved hjelp av den empiriske korrelasjonen med parametere som infusjonstrykk, kapillære parametere og løsningsparametere (se trinn 2.3.4), På grunn av dette og fordi det ikke er mulig å måle det indre volumet av kapillæren nøyaktig (enten modifisert eller umodifisert, hjemmelaget eller kommersiell), kan HDX-tiden ikke bevisst settes med høy nøyaktighet ved å justere operasjonsparametrene. Den eksperimentelt resulterende HDX-tiden kan imidlertid måles nøyaktig.
Modifikatorløsningen som brukes i denne tilnærmingen inkluderer et organisk løsningsmiddel, som letter tandem MS ved å utfolde proteinene, og syre for å minimere ytterligere utvekslingsreaksjoner ved å senke pH til 2,5. Fordi det ikke er mulig å unngå å bruke protiske løsningsmidler, oppstår utveksling mellom proteiner og modifikatorløsningen ved blanding ved CE-MS-grensesnittet. Når en ikke-deutert modifikatorløsning brukes, mister raskt utskiftbare steder sine deuteriumetiketter på dette stadiet, og bare godt beskyttede steder forblir merket, noe som begrenser følsomheten ved å sammenligne proteiner med mindre konformasjonsforskjeller. Slike effekter kan delvis kalibreres ved å måle det fullstendig deutererte proteinet i en referanseprøve.
Å utføre HDX i CE gir et middel til å skille proteinarter i oppløsning under HDX for å unngå forstyrrelser fra ioner av nærliggende arter i ovenfra og ned MS-karakterisering av individuelle arter og en tilnærming til initialisering av HDX-reaksjonen. I denne HDX-reaksjonen forlater proteinene som skal deuteres helt det opprinnelige ikke-deutererte miljøet på grunn av deres forskjellige mobiliteter. Dette står i kontrast til den konvensjonelle fortynningsoperasjonen, der en brøkdel av ikke-deutert innhold (vanligvis fra 1% til 10%) beholdes. Tatt i betraktning fordelene ved den nylige utviklingen av ovenfra og ned MS-teknikken, forventer vi å forbedre denne tilnærmingen ytterligere slik at den kan inkluderes i den pålitelige verktøykassen for differensialkarakterisering av proteinstrukturer med høyere rekkefølge.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
D. D. Y. Chen er en av grunnleggerne av Knowledge for Health Institute for Biomolecules, som kommersialiserer det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet. Andre forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Forfatterne fikk også støtte fra Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu samarbeidsinnovasjonssenter for biomedisinske funksjonelle materialer; og Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials ved Nanjing Normal University, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochemistry. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochemistry. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R.
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
