Summary
في هذه المخطوطة، نقوم بوصف طريقة بسيطة للنمو والتنقية والتكرير لفيروس الهربس البسيط oncolytic للاستخدام قبل السريري.
Abstract
الفيروسات الأورام (OVs)، مثل فيروس الهربس البسيط oncolytic (oHSV)، هي استراتيجية علاج سريعة النمو في مجال العلاج المناعي للسرطان. OVs، بما في ذلك oHSV، تكرار انتقائي في وقتل الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا السليمة / الطبيعية) في حين حفز المناعة المضادة للورم. وبسبب هذه الخصائص الفريدة، يتم استخدام استراتيجيات العلاج القائمة على oHSV بشكل متزايد لعلاج السرطان، قبل السريرية وسريريا، بما في ذلك talimogene laherparevec المعتمدة من إدارة الأغذية والعقاقير (T-Vec). النمو والتنقية والتكرير هي ثلاث تقنيات مختبرية أساسية لأي OVs ، بما في ذلك oHSVs ، قبل أن يمكن استخدامها للدراسات التجريبية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لتضخيم oHSV في خلايا Vero. كما oHSVs تتكاثر، فإنها تنتج تأثير cytopathic (CPE) في خلايا Vero. مرة واحدة 90-100٪ من الخلايا المصابة تظهر CPE، يتم حصادها بلطف، تعامل مع البنزوناز وكلوريد المغنيسيوم (MgCl2)،وتصفيتها، وتعرض للتنقية باستخدام طريقة السكروز التدرج. بعد تنقية، يتم تحديد عدد oHSV المعدية (المعينة كوحدات تشكيل البلاك أو PFUs) من خلال "فحص البلاك" في خلايا Vero. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا لإعداد مخزون oHSV عالي التأر للدراسات المختبرية في زراعة الخلايا وفي التجارب الحيوانية الحية.
Introduction
الفيروسات الأورام (OVs) هي شكل ناشئ وفريد من أشكال العلاج المناعي للسرطان. OVs تكرار انتقائي في وlyse الخلايا السرطانية (تجنيب الخلايا الطبيعية / السليمة)1 في حين حفز مناعة مضادة للورم2. فيروس الهربس البسيط Oncolytic (oHSV) هو واحد من الفيروسات الأكثر دراسة على نطاق واسع بين جميع OVs. هو أبعد على طول في العيادة, مع Talimogene laherparepvec (T-VEC) كونها OV الأولى والوحيدة التي تتلقى موافقة ادارة الاغذية والعقاقير في الولايات المتحدة لعلاج سرطان الجلد المتقدمة3. بالإضافة إلى T-VEC، يتم اختبار العديد من oHSVs الأخرى المعدلة وراثيا قبل السريرية وسريريا في أنواع السرطان المختلفة3،4،5،6،7،8. وقد زادت التكنولوجيا الحيوية المتقدمة الحالية الحمض النووي المؤتلف من جدوى هندسة جديدة oHSVs الترميز لtransgene العلاجية (ق)3،5. يعد وجود نظام فعال لنشر oHSV وتنقية وتأليف التيتر أمرا بالغ الأهمية قبل أن يتم اختبار أي oHSV (تم تطويره حديثا) في المختبر وفي الدراسات الحية. تصف هذه الورقة طريقة بسيطة خطوة بخطوة لنمو oHSV (في خلايا Vero) ، والتنقية (عن طريق طريقة تدرج السكروز) ، والتكييف (بواسطة فحص لوحة oHSV في خلايا Vero) (الشكل 1). ويمكن اعتماده بسهولة في أي إعداد مختبري من المستوى 2 للسلامة البيولوجية (BSL2) لتحقيق مخزون فيروسي عالي الجودة للدراسات ما قبل السريرية.
Vero، وهو خط خلايا الكلى القرد الأخضر الأفريقي، هو خط الخلية الأكثر استخداما لنشر oHSV9،10،11،12،13 كما خلايا فيرو لديها معيبة المضادة للفيروسات الانترفيرون إشارة المسار14. خطوط الخلايا الأخرى مع محفز معطل من جينات الإنترفيرون (STING) الإشارات يمكن أيضا أن تستخدم لنمو oHSV12,13. يستخدم هذا البروتوكول خلايا Vero لنمو oHSV و المقايسة البلاك. بعد الانتشار، يتم حصاد الخلايا المصابة ب oHSV، والتحلل، وتعرض للتنقية، حيث يتم التعامل مع الخلايا المتحللة أولا بنوكلياز البنزونازي لإضعاف الحمض النووي للخلية المضيفة، ومنع تراكم البروتين الحمضي النووي، والحد من لزوجة ليسات الخلية. كما التنشيط السليم للبنزوناز غالبا ما يتطلب ملغ2 +, 1-2 M MgCl2 يستخدم في هذا البروتوكول15. يتم التخلص من حطام الخلية المضيفة من ليسات الخلية المعالجة بالبنزوناز عن طريق الترشيح التسلسلي قبل الطرد المركزي عالي السرعة من السكروز المتدرجة. يساعد وسادة محلول السكروز اللزجة بنسبة 25٪ على ضمان معدل أبطأ لهجرة الفيروس من خلال طبقة السكروز ، تاركا المكونات المرتبطة بالخلية المضيفة في الفائقة ، وبالتالي تحسين تنقية والحد من فقدان الفيروس في بيليه16. ثم يتم titrated oHSV المنقى على خلايا Vero ، ويتم تصور لويحات الفيروسية من قبل Giemsaتلطيخ 17 أو X-gal تلطيخ (لترميز LacZ oHSVs)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1) oHSV النمو
ملاحظة: ضمان موافقة لجنة السلامة البيولوجية المؤسسية قبل العمل مع oHSV. أجريت هذه الدراسة بموجب البروتوكول المعتمد رقم 18007 للجنة. الحفاظ على احتياطات BSL2: تبييض جميع الأنابيب والنصائح والأنابيب وغيرها من المواد التي تتلامس مع الفيروس. رش قفازات مع الكحول isopropyl 70٪ قبل اليدين ترك غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية BSL2. دائما غسل اليدين تماما بالماء الصابون بعد العمل مع فيروس.
- في اليوم -1، البذور منخفضة مرور خلايا Vero في 20 T-150 سم2 قوارير في كثافة 7-8 × 106 خلايا / قارورة في المتوسط الخلية فيرو العادية.
ملاحظة: يتم إعداد Vero Medium عن طريق استكمال متوسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بمصل عجل الجنين المعطل حراريا بنسبة 10٪ (IFCS). - في اليوم 0 (الخلايا هي التقاء 80-90٪)، إضافة oHSV inoculum على خلايا Vero.
- إعداد فيروس inoculum
- استخدام تعدد الإصابات (MOI) من 0.01 (يمكن أن تختلف وزارة الداخلية من 0.01 إلى 0.1 اعتمادا على قدرة النسخ المتماثل للفيروس) لتضخيم الفيروس. استخدام الصيغة (1) لحساب كمية الفيروس (مل) ل20 قوارير.
كمية الفيروس (مل) ل20 قوارير = كمية الفيروس اللازمة (pfu) / titer من مخزون الفيروس (pfu / مل) (1) - استخدام المالحة عالية الجلوكوز Dulbecco الفوسفات العازلة (DPBS) تكملها مع 1٪ IFCS لإعداد inoculum الفيروس (7 مل لكل T-150 سمقارورة 2، أي، ~ 140 مل لمدة 20 قارورة). إضافة الكمية المطلوبة من oHSV إلى 140 مل من محلول DPBS/1٪ IFCS عالي الجلوكوز، دوامة لمدة دقيقة واحدة، والحفاظ على الخليط جاهزا للإضافة إلى خلايا Vero.
- استخدام تعدد الإصابات (MOI) من 0.01 (يمكن أن تختلف وزارة الداخلية من 0.01 إلى 0.1 اعتمادا على قدرة النسخ المتماثل للفيروس) لتضخيم الفيروس. استخدام الصيغة (1) لحساب كمية الفيروس (مل) ل20 قوارير.
- غسل T-150 سم2 قوارير 2x مع DPBS عالية الجلوكوز تكملها مع 1٪ IFCS (10 مل / غسل). أسبير DPBS/1٪ IFCS وإضافة 7 مل من الفيروس inoculum/T-150 سمقارورة 2.
- صخرة بلطف قوارير لمدة 5 دقائق باستخدام الروك قارورة للتوزيع السليم لل inoculum على طبقة أحادية فيرو، ومن ثم احتضان قوارير في 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة. تأكد من أن رف الحاضنة هو المستوى.
- إزالة inoculum وإضافة DMEM تستكمل مع 1٪ IFCS (25 مل / قارورة). احتضان قوارير لمدة 2-4 أيام.
- إعداد فيروس inoculum
- تحقق من القوارير يوميا للحصول على CPE 90-100٪ (انظر الشكل 2).
- حصاد خلايا فيرو المصابة oHSV.
- جمع الثقافة supernatant (~ 20 مل) من كل قارورة (ترك ~ 5 مل في كل قارورة) في 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية أو حاوية وسائل الإعلام.
- استخدام مكشطة الخلية لكشط الخلايا من الجزء السفلي من القوارير بلطف.
ملاحظة: يجب أن تأتي الخلايا بسرعة قبالة قوارير. - إضافة ~ 15 مل من الثقافة supernatant (التي تم جمعها في الخطوة 1.4.1) إلى كل قارورة (الذي يجلب حجم ~ 20 مل في كل قارورة، أي 400 مل لمدة 20 قارورة) وغسل بلطف الجزء السفلي من قوارير عدة مرات باستخدام أنبوب المصلية العقيمة 10 مل.
ملاحظة: لا الأنابيب بقوة. تهدف إلى الحفاظ على جميع الخلايا سليمة. - جمع الخلايا (+ متوسطة) في 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية على الجليد (استخدام 8 أنابيب لعقد 400 مل من الخلايا المحصودة من 20 قوارير).
- تدور الخلايا في 300 غرام لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية و يستنشق supernatant.
- أضف 1.25 مل (50٪) من الفيروسات العازلة (VB) و 1.25 مل (50٪) من الثقافة supernatant (التي تم جمعها في الخطوة 1.4.1) إلى كل أنبوب الطرد المركزي وإعادة تعليق كل بيليه تماما. نقل الخلايا المعلقة من ثمانية أنابيب الطرد المركزي 50 مل إلى أنبوب واحد 50 مل الطرد المركزي المخروطي.
ملاحظة: الرجوع إلى إعداد حل VB في الجدول 1. تصفية تعقيم الحل VB باستخدام عامل تصفية تعقيم الوسائط. استخدام 0.5 مل من VB + 0.5 مل من supernatant لكل T-150 سم2 قارورة لإعادة تعليق، أي، ل20 قارورة (20 مل)، واستخدام 10 مل من VB و 10 مل من الثقافة supernatant. - المفاجئة تجميد الخلايا إعادة تعليق باستخدام الثلج الجاف / 100 ٪ الايثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية.
2) oHSV تنقية
- المفاجئة تجميد (في الثلج الجاف والإيثانول 100٪) / ذوبان (في حمام الماء الدافئ 37 درجة مئوية) الخلايا تليها المياه حمام سونيكيشن لمدة 1 دقيقة لما مجموعه 3 دورات لضمان تحلل السليم للخلايا لإطلاق الفيروس في supernatant.
ملاحظة: تنفيذ سونيكيشن لمدة 1 دقيقة باستخدام 40 كيلوهرتز، 120 V السلطة. إذا لم يكن sonicator غير قادر على ذلك، استخدم sonicator حمام الماء بالموجات فوق الصوتية. خذ 50 ميكرولتر من الكوت للتحمير في القسم 3، مما سيساعد على تحديد أي من الخطوات التالية مسؤولة عن فقدان الفيروس المحتمل أثناء إجراء التطهير. - علاج lysate الخلية مع نواة البنزوناسي (175 وحدة / مل) + 2 م MgCl2 (1 M المخزون = 2 ميكرولتر / مل)، دوامة، واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. ضع الأنبوب على الجليد واؤدي الخطوات التالية عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- بيليه حطام الخلية عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة.
- تدور الخلية lysate في 300 غرام لمدة 10 دقيقة.
- جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من VB, تعيينها على أنها بيليه-1, وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في الخطوة 2.3.5; انظر الشكل 1).
- تدور supernatant (التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.2) مرة أخرى في 500 غرام لمدة 10 دقيقة.
- جمع supernatant في أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (إعادة تعليق بيليه الخلية في 0.5 مل من VB, تعيينها على أنها بيليه-2, وتخزينها في 4 درجة مئوية للاستخدام في الخطوة 2.3.5; انظر الشكل 1).
- الجمع بين بيليه-1 إعادة تعليق (من 2.3.2) والكريه-2 (من 2.3.4) في أنبوب الطرد المركزي 1.7 مل جديدة, دوامة / سونيكاتي (حمام مائي) 2x, وتدور في 400 غرام لمدة 10 دقيقة. جمع supernatant والجمع بين ذلك مع supernatant التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.3.4؛ انظر الشكل 1).
ملاحظة: إجراء سونيكيشن لمدة دقيقة واحدة باستخدام 40 كيلوهرتز، 120 فولت السلطة لمنع تجميع الفيروسية قبل إجراء الترشيح في الخطوة 2.4. خذ 50 ميكرولتر aliquot من العملاق مجتمعة ل titration في القسم 3.
- تصفية supernatant مجتمعة (~ 21 مل، أي 20 مل من 1.4.6، 0.5 مل من 2.3.2، و 0.5 مل من 2.3.4) باستخدام طريقة الترشيح التالية من 3 خطوات.
- رسم 21 مل من supernatant باستخدام حقنة 10 مل (5-7 مل في كل مرة لسهولة المرور من خلال مرشح) وتمريره من خلال عقيمة 5 ميكرومتر بولي فينيلدين difluoride (PVDF) مرشح غشاء وضعت على أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي المخروطي (المسمى أنبوب 1).
- أضف 1 مل من VB إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 50 مل تم إفراغه في 2.4.1 (لجمع الكمية النزرة المتبقية من الفيروس الفائق) ، دوامة ، وتمر عبر نفس فلتر PVDF 5 ميكرومتر الموضوع على TUBE 1 (ليصل المجموع إلى 22 مل من الفيلترات). انتقل إلى الخطوة 2.4.2.
- رسم 22 مل من filtrate من TUBE 1 (كما هو الحال في 2.4.1) وتمريره من خلال معقمة 0.8 ميكرومتر مختلطة السليلوز استر (MCE) مرشح غشاء وضعت على أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (المسمى أنبوب 2).
- إضافة 1 مل من VB إلى TUBE 1 أفرغت في الخطوة 2.4.2، دوامة، وتمريره من خلال نفس 0.8 ميكرومتر MCE مرشح وضعت على TUBE 2 (ليصل المجموع إلى 23 مل من الخيوط). انتقل إلى الخطوة 2.4.3.
- رسم 23 مل من filtrate من TUBE 2 (كما هو الحال في 2.4.1) وتمريره من خلال معقمة 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على أنبوب طرد مركزي مخروطي 50 مل جديدة (المسمى أنبوب 3).
- إضافة 1 مل من VB إلى TUBE 2 أفرغت في الخطوة 2.4.3، دوامة، وتمريره من خلال نفس 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على TUBE 3 (ليصل المجموع إلى 24 مل من الخيوط).
ملاحظة: خذ a 50 ميكرولتر aliquot من filtrate للتمليك في القسم 3.
- إضافة 1 مل من VB إلى TUBE 2 أفرغت في الخطوة 2.4.3، دوامة، وتمريره من خلال نفس 0.45 ميكرومتر PVDF مرشح وضعت على TUBE 3 (ليصل المجموع إلى 24 مل من الخيوط).
- رسم 21 مل من supernatant باستخدام حقنة 10 مل (5-7 مل في كل مرة لسهولة المرور من خلال مرشح) وتمريره من خلال عقيمة 5 ميكرومتر بولي فينيلدين difluoride (PVDF) مرشح غشاء وضعت على أنبوب جديد 50 مل الطرد المركزي المخروطي (المسمى أنبوب 1).
- طرد مركزي عالي السرعة باستخدام طريقة تدرج السكروز
ملاحظة: تم استخدام دوار F13-14x50cy ذو زاوية ثابتة في هذا البروتوكول. يجب أن يكون كل من الدوار والطرد المركزي عند درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل الشروع في الخطوات التالية.- أضف 10 مل من محلول السكروز البارد والمعقم المصفى بنسبة 25٪ (تم إعداده عن طريق إذابة 25 جراما من مسحوق السكروز في 100 مل من محلول الملح المتوازن من Hank) في أنبوب طرد مركزي مخروطي جديد سعة 50 مل.
- ببطء (3 مل / دقيقة) إضافة 24 مل من الفيروس filtrate (التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.4.3.1) على رأس طبقة السكروز. الحرص على الحفاظ على طبقات منفصلة من الفيروس filtrate والحل السكروز.
ملاحظة: يمكن إضافة ما يصل إلى 30 مل من طبقة الفيروسات أكثر من 10 مل من محلول السكروز. - الطرد المركزي أنبوب لمدة 90 دقيقة في 22620 غرام في 4 درجة مئوية.
- إزالة supernatant وطبقة السكروز من أنبوب الطرد المركزي مخروطي 50 مل.
ملاحظة: يجب أن يكون بيليه الفيروس أبيض. خذ 50 ميكرولتر aliquot من supernatant و aliquot 50 ميكرولتر من طبقة السكروز للتمليك في القسم 3.
- إعادة تعليق بيليه في 10٪ الجلسرين / PBS الحل.
- إضافة 1 مل من الجلسرين العقيم 10٪ (مخفف في برنامج تلفزيوني) إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل لتغطية بيليه.
ملاحظة: يمكن أن تختلف كمية الخليط الذي أعيد تعليقه (مثل 0.8-1.2 مل) اعتمادا على حجم الكريات. ومن شأن حجم أصغر إعطاء تركيز أعلى من الفيروس. - ضع أنبوب الطرد المركزي المخروطي سعة 50 مل على الجليد لمدة 2-4 ساعة. خلال هذه الفترة، سونيكاتي / دوامة بيليه كل 15 دقيقة لمدة 30 ثانية للمساعدة في طرد / إعادة تعليق بيليه.
- جمع بيليه إعادة تعليق (1 مل من 10٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني + حجم بيليه سوف تجلب الحجم الإجمالي إلى ~ 1.3 مل) في أنبوب ميكروسينتريف 2 مل. [اختياري: إضافة آخر 0.3 مل من 10٪ الجلسرين / برنامج تلفزيوني إلى نفس أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل لجمع المبلغ المتبقي من بيليه, pipet صعودا وهبوطا, والجمع مع بيليه إعادة تعليق في الخطوة 2.6.3 ليصل إجمالي حجم إلى ~ 1.6 مل.]
- إذا كان التعليق في الخطوة 2.6.3 عكر أو غائم (بسبب حطام الخلية)، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 غرام لمدة 10 دقائق، ونقل الناطور إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد سعة 2 مل، ثم انتقل إلى الخطوة 2.6.4.
- خذ 50 ميكرولتر aliquot لoHSV المعايرة في القسم 3. Aliquot بقية الحل (250 ميكرولتر / aliquot) في أنابيب الطرد الدقيق العقيمة مع قبعات المسمار (مختومة جيدا للتخزين على المدى الطويل)، المفاجئة تجميد، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام (جاهزة للدراسات التجريبية بمجرد تحديد titer oHSV).
ملاحظة: يجب تبييض جميع المواد التي تتلامس مع الفيروس أو معالجتها بالأشعة فوق البنفسجية قبل إزالتها من غطاء محرك السيارة أو التخلص منها.
- إضافة 1 مل من الجلسرين العقيم 10٪ (مخفف في برنامج تلفزيوني) إلى أنبوب الطرد المركزي المخروطي 50 مل لتغطية بيليه.
3. المعايرة oHSV و المقايسة البلاك
- البذور 1.7-1.8 × 105 خلايا Vero / جيدا في لوحة ثقافة الخلايا 6-جيدا في المتوسط الخلية فيرو (DMEM مع 10٪ IFCS؛ انظر الخطوة 1.1).
ملاحظة: تأكد من توزيع الخلايا بشكل متجانس في جميع أنحاء البئر; لا تدور لوحة، والتي يمكن أن تسبب تراكم الخلايا في منتصف الآبار. لمنع الدوامة، هز ببطء لوحة باليد عموديا، ثم أفقيا، ومن ثم وضع بلطف لوحة في الحاضنة. - في اليوم التالي (عندما تصل الخلايا إلى 70-80٪ التقاء)، يستنشق المتوسطة الثقافة، وإضافة 1 مل / بئر من برنامج تلفزيوني عالي الجلوكوز تكملها مع 1٪ IFCS. اترك اللوحة في غطاء محرك السيارة الموروث الخلوي حتى تكتمل الخطوة 3.3.
- تخفيف الفيروس في أنابيب البولي بروبلين 5 مل باستخدام PBS/1٪ IFCS (الشكل 3).
ملاحظة: استخدم aliquot 50 ميكرولتر التي تم جمعها في الخطوة 2.6.4 لتخفيف المسلسل. في أنبوب 1st (10-3 التخفيف)، إضافة 2 ميكرولتر من الفيروس في عام 1998 ميكرولتر من PBS/1٪IFCS، دوامة. في الأنبوبالثاني (10-5 تخفيف)، خذ 10 ميكرولتر من أنبوب 1st في 990 ميكرولتر من PBS/1٪ IFCS، الدوامة. في أنبوب3 rd (10-6 التخفيف)، واتخاذ 100 ميكرولتر من أنبوب 2 في 900 ميكرولتر من PBS/1٪ IFCS، دوامة. مواصلة هذا التخفيف التسلسلي 10 أضعاف حتى10-9 التخفيف. انظر التفاصيل في الشكل 3. - أسبيرات PBS/1٪ IFCS, وإضافة 0.7 مل/ بئر من الفيروس المخفف تسلسليا (بدءا من10-5 إلى 10-9) إلى خلايا Vero.
ملاحظة: لا تدع الخلايا تجف. - صخرة بلطف لوحة على الروك لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (لضمان توزيع متجانسة من inoculum الفيروس).
- احتضان لوحة لمدة 1.5 ساعة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: خلال فترة الحضانة هذه، قم بإعداد 1:1000 تخفيف الغلوبولين المناعي البشري G (IgG) في DMEM المكمل بنسبة 1٪ من IFCS. للحصول على طبق من 6 آبار، قم بإعداد 12.5 مل بحيث يمكن استخدام 2 مل/بئر في الخطوة 3.7. ضبط التخفيف لحساب الاختلافات الكثير في IgG الإنسان. - إزالة الفيروس inoculum من الآبار، وإضافة 2 مل / بئر من 0.1٪ IgG الإنسان (لتحييد oHSV في وسط الثقافة ومنع تشكيل لويحات الثانوية) في DMEM تكملها مع 1٪ IFCS. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام.
ملاحظة: تتشكل اللويحات الواضحة عادة في غضون 3 أيام. - إصلاح وتلطيخ لوحات
- إزالة supernatant، وإصلاح الخلايا في الميثانول النقي (1 مل / جيدا) لمدة 5 دقائق. إزالة الميثانول، والسماح للوحات لتجف الهواء.
- تمييع Giemsa وصمة عار (1:5) مع الماء deionized، وإضافة 1 مل من وصمة عار Giemsa المخفف لكل بئر. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
- إزالة وصمة عار، وشطف مع ماء الصنبور، والسماح للوحات للهواء الجاف.
- عد لويحات باستخدام المجهر تشريح.
- اختياري ل oHSVs مع تعبير lacZ:
- إزالة supernatant، وإصلاح الخلايا مع البرد 0.2٪ غلوتارالدهيد/2٪ بارافورمالديهايد لمدة 5-10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة الحل المثبت، وغسل الخلايا 3x مع برنامج تلفزيوني.
- إضافة محلول X-gal إلى الخلايا (1 مل/جيدا)، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
ملاحظة: يجب إعداد وصمة X-gal طازجة في يوم التلطيخ. التخزين على المدى الطويل قد يؤدي إلى تلاشي اللون. انظر إعداد حل X-gal في الجدول 1. - إزالة وصمة عار X-غال، وغسل لوحة مع ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة.
- مضاد للبقع مع محلول أحمر محايد (1 مل/جيدا) لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: انظر إعداد الحل الأحمر المحايد في الجدول 1. - غسل لوحة مع ماء الصنبور لمدة 1 دقيقة. السماح للوحات للهواء الجاف.
- عد لويحات زرقاء باستخدام المجهر تشريح (الشكل 4).
- حساب titer باستخدام الصيغة (2)
Titer في pfu/mL (وحدات تشكيل البلاك) = عدد لويحات /0.7 مل × عامل تخفيف (2)
ملاحظة: على سبيل المثال، إذا تم العثور على 25 لويحات في10-9 تمييع جيدا، تيتر هو 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL. هذا هو titer oHSV النهائي من aliquots أعدت في الخطوة 2.6.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد عرض موجز للبروتوكول بأكمله في الشكل 1، والذي يمثل الخطوات الحاسمة التي ينطوي عليها نمو وتنقية و titration من oHSV. CPE في خلايا Vero يمكن الكشف عنها في وقت مبكر من 4 ح بعد الإصابة HSV19. يوضح الشكل 2 CPE في خلايا Vero في ثلاث نقاط زمنية مختلفة بعد عدوى oHSV. يتم زيادة مستوى CPE مع مرور الوقت. في هذا البروتوكول، عادة ما يلاحظ 90-100٪ CPE في غضون 48 ساعة من تلقيح oHSV منخفضة MOI (وهو أفضل وقت لحصاد الخلايا للتنقية). ومع ذلك، يمكن أن يستغرق 4 أيام اعتمادا على oHSV MOI تلقيح في الخطوة 1.2 و/أو احتمال النسخ المتماثل oHSV. بعد هذه الفترة ، يمكن أن يتم مسح الخلايا مع CPE ، مما يؤدي إلى إطلاق الفيروس في الفائقة. وبالتالي ، للحصول على تيتر الفيروسية عالية ، فمن الأهمية بمكان لحصاد الخلايا المتضررة CPE عندما تكون سليمة. وثمة عامل هام آخر يساهم في تأليه الفيروس النهائي هو عدد أو حجم قوارير زراعة الأنسجة المستخدمة في تضخيم oHSV. يصور الشكل 3 عملية التخفيف التسلسلي (10-3 إلى 10 -9)من مخزون فيروس معين (تم الحصول عليه في الخطوة 2.6.4) المطلوب لتحديد التيتر بواسطة فحص البلاك. لoHSVs مع التعبير lacZ، يمكن تصور لويحات الفيروسية عن طريق تلطيخ X-غال (الشكل 4). في هذا البروتوكول، استخدمت 20 T-150 سم2 قوارير زراعة الأنسجة، والتي يمكن توقع 1.3-1.6 مل من مخزون oHSV مع تيتر من 1 ×10 10 pfu/mL.
الشكل 1:عرض تخطيطي للخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها نمو oHSV وتنقية، و المقايسة البلاك. الاختصارات: oHSV = فيروس الهربس البسيط oncolytic; CPE = تأثير الاعتلال الخلوي; VB = الفيروسات المخزن المؤقت; HBSS = هانك متوازن الملح الحل; PBS = ملحي عازل بالفوسفات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تأثير Cytopathic في خلايا Vero بعد عدوى oHSV. تم تلقيح خلايا Vero بترميز oHSV ل mCherry (الموضح بالفلورسنة الحمراء) في MOI من 0.01 وتم تصويرها (تكبير 10x) عند 36 و48 و72 ساعة بعد الإصابة بالفيروس. يتم التعرف على CPE عن طريق تقريب الخلايا المصابة oHSV (المشار إليها بالأسهم السوداء). أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. اختصار: oHSV = فيروس الهربس البسيط oncolytic. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:تخفيف تسلسلي لمخزون oHSV لمقاايسات البلاك. انظر أيضا الخطوة 3.3 من البروتوكول. اختصار: oHSV = فيروس الهربس البسيط oncolytic. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4:صورة تمثيلية لويحات X-gal الملطخة عند 72 ساعة بعد عدوى oHSV. غير مخفف (البئر العلوي) ومخفف (1:10؛ أسفل البئر) oHSV المصابة الخلايا الخلايا المضادات الحيوية المضافة إلى خلايا Vero (70-80٪ التقاء)، تليها بروتوكول تلطيخ X-gal الموصوفة في القسم 3.8.5 (باستثناء مكافحة تلطيخ مع الأحمر المحايد). يتم عرض الصور التمثيلية لويحة فيروس ملطخة ب X-gal (من اللوحة اليسرى) في الألواح الوسطى (4x؛ أشرطة المقياس = 1000 ميكرومتر) والحق (10x؛ أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تكوين الحل | |
| إعداد المخزن المؤقت للفيروسات | كم |
| 1 م كلوريد الصوديوم | 15 مل |
| 1 م تريس هيدروكلوريد | 3 مل |
| المياه النقية | 132 مل |
| ضبط درجة الحموضة إلى 6.8 | |
| إعداد حل X-gal (~ 6.5 مل للوحة واحدة من 6 آبار) | |
| 250 مليون فيريسيانيد البوتاسيوم | 130 ميكرولتر |
| 250 مليون فيروكيانيد البوتاسيوم | 130 ميكرولتر |
| 1 م كلوريد المغنيسيوم | 13 ميكرولتر |
| X-غال قبل حل (20 ملغ / مل) في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) | 162.5 ميكرولتر |
| برنامج تلفزيوني | 6064.5 ميكرولتر |
| إعداد حل أحمر محايد للوحة واحدة من 6 آبار | |
| حل أحمر محايد | 100 ميكرولتر |
| ميثانول | 1 مل |
| المياه النقية | 7 مل |
الجدول 1: تكوين الحل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يبدأ البروتوكول بنمو oHSV في خلايا Vero منخفضة المرور. يجب أن يكون التقاء أحادي الطبقة الخلية Vero ~ 80٪ في وقت تلقيح الفيروسات كما يمكن للخلايا المتضخمة تطوير هياكل ليفية ضيقة يمكن أن تقلل من دخول oHSV إلى خلايا Vero20. مرة واحدة لوحظ 90-100٪ CPE، تتم إزالة الطبيعة الثقافية، يتم حصاد الخلايا، وإعادة الإنفاق في VB/supernatant (انظر الخطوة 1.4.6)، المفاجئة المجمدة، وتخزينها في -80 درجة مئوية لتنقية في وقت لاحق. استخدم بلاهو وزملاؤه طريقة مختلفة قليلا لحصاد وتخزين خلايا فيرو المصابة. على سبيل المثال ، يتم تخزين القوارير التي تحتوي على الخلايا ووسائل الإعلام الثقافية (تكملها 1٪ ألبوم مصل البقر وبرنامج تلفزيوني مع البوتاسيوم) في البداية عند -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل ، تليها إحماء بطيء للقوارير في درجة حرارة الغرفة. ثم يتم حصاد الخلايا، مختلطة مع الحليب المعقم، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى تنقية20. في هذه الحالة ، يعمل الحليب العقيم كمثبت ، وقد ثبت أن تأليه مخزون الفيروس أعلى بشكل كبير عندما يتم تخزينه في الحليب / المتوسط العقيم مما هو عليه في المتوسط وحده20. ومع ذلك ، في دراسة أخرى ، لم تظهر المقارنة المباشرة بين مثبتات مختلفة (بما في ذلك الحليب العقيم) المستخدمة لتخزين العديد من فيروسات الهربس عند -80 درجة مئوية أي تأثير كبير على ثدي الفيروس النهائي21. هنا، تم إعادة تعليق بيليه الخلية في VB تشكلت مع المالحة تريس العازلة (درجة الحموضة 6.8) و 10٪ الجلسرين كمثبت التخزين، والذي يعطي عادة تيتر فيروس عالية (كما هو موضح في الخطوة 3.10) للدراسات التجريبية.
ومن الأهمية بمكان إزالة جميع المكونات الخلوية والوسائط ذات الصلة من بيليه إعادة تعليق للحصول على مخزون فيروس عالية الجودة. إزالة الجسيمات غير الفيروسية أمر بالغ الأهمية لتجنب ردود الفعل المناعية المحتملة أثناء تجارب الجسم الحي. وقد وصفت عدة طرق لتنقية الفيروس بما في ذلك الطرد المركزي22، وأساليب مختلفة الانحدار23، والترشيح24، وتقارب الكروماتوغرافيا25. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستند إلى الطرد المركزي عالي السرعة باستخدام طريقة التدرج السكروز، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من أساليب التدرج الأخرى من قبل الآخرين، مثل يوديكسانول11،26، Percoll27، وفيكول - Nycodenz23. هذه الأساليب التدرج فصل الفيروس حسب الكثافة وتتطلب عزل النطاق من التدرج، بدلا من وسادة السكروز حيث يتم بيليه الفيروس. تقدم طريقة تدرج السكروز نهجا لطيفا لفصل الجسيمات الفيروسية لأنها تقلل من خطر تعطيل بروتينات المغلف الفيروسي مع الاحتفاظ بالعدوى الفيروسية. على الرغم من هذه المزايا ، فإن ارتفاع osmolarity من محلول السكروز المركز قد يجفف الجسيمات الفيروسية. لذلك، تم تطوير طريقة التدرج يوديكسانول للتغلب على هذا العيب. ومع ذلك، فإن طريقة التدرج يوديكسانول يتطلب الطرد المركزي للغاية وجمع الفرقة virion. العوامل الأخرى التي تحتاج إلى النظر أثناء تنقية oHSV هي سرعة ووقت الطرد المركزي واختيار العازلة الفيروس المستخدمة لتخزين على المدى الطويل. هذا البروتوكول له القيد الذي لم يتم تأكيد نقاء oHSV; ومع ذلك، تم العثور على عدد كبير من جزيئات الفيروس الوظيفية في مخزون oHSV منقى معين عن طريق المعايرة على خلايا Vero (انظر القسم 3).
oHSV يشكل لويحات على خلايا فيرو (الشكل 4). يمكن التعرف على اللويحات الفيروسية عن طريق تلطيخ Giemsa ، وهي طريقة سهلة ومريحة. Giemsa البقع خلايا فيرو، وترك لويحات الفيروسية شفافة أو فارغة التي يمكن تصورها بسهولة (العين المجردة) وتحسب باستخدام المجهر تشريح. في حين تراكب وسائل الإعلام مع agarose أو ميثيلسليلوز يستخدم عادة أثناء تشكيل البلاك (في الخطوة 3.7) لمنع انتشار الفيروس والالتهابات الثانوية وذيول البلاك28، واستخدام IgG الإنسان لتحييد oHSV في الثقافة الفائقة هو أسهل وأكثر ملاءمة. لoHSVs التعبير عن lacZ، يمكن تصور لويحات من قبل X - غال تلطيخ (الشكل 4) ، في حين يستخدم المجهر الفلورسنت للبروتين الفلوري (أي البروتين الفلوري الأخضر) ، معبرا عن oHSVs18. وتشمل المقايسات الإضافية للكشف عن الخلايا المصابة ب oHSV الهسكيميائية المناعية أو -fluorescence مع الأجسام المضادة الخاصة oHSV29 أو المسح القائم على الليزر من الأجسام المضادة شبه الأشعة تحت الحمراء المفلورة المقترنة oHSV محددة30.
هناك تدابير حاسمة يجب اتباعها لتحقيق مخزون جيد من الفيروسات مثل الحفاظ على العقم لمنع التلوث الميكروبي (البكتيريا أو الخميرة أو العفن) وخلايا Vero السليمة. كما المغلف من oHSV هو20بالحرارة للغاية ، وينبغي التعامل مع المخزون oHSV في cryoprotectant مثل 10 ٪ الجلسرين. وعموما، يمكن استخدام هذا البروتوكول بسهولة وممارستها في بيئة مختبرية، ولكنه قد لا يكون مفيدا لإنتاج الفيروسات على نطاق واسع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
حقوق السحب الخاصة هو المخترع المشارك على براءات الاختراع المتعلقة بفيروسات الهربس البسيط oncolytic، التي تملكها وتديرها جامعة جورجتاون ومستشفى ماساتشوستس العام، والتي تلقت إتاوات من شركة أمجين وActiVec وهو في المجلس الاستشاري العلمي لEG 427. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم الأبحاث في مختبر ساها جزئيا بأموال من إدارة المكافحة (W81XWH-20-1-0702) ومؤسسة دودج جونز-أبيلين. صموئيل د. رابكين وميليسا ر.M همفري كانا مدعومين جزئيا من قبل المعاهد القومية للصحة (R01 CA160762).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J.
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
