Summary
Abbiamo modificato il modello di calo di peso di Marmarou per il pesce zebra adulto per esaminare un'ampia gamma di patologie a seguito di lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) e i meccanismi alla base della successiva rigenerazione neuronale. Questo modello di TBI a forza smussata è scalabile, induce un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola l'eterogeneità delle lesioni osservata nel TBI umano.
Abstract
Le lesioni cerebrali traumatiche da forza contundente (TBI) sono la forma più comune di trauma cranico, che copre una gamma di gravità e si traduce in effetti secondari complessi ed eterogenei. Mentre non esiste un meccanismo per sostituire o rigenerare i neuroni persi a seguito di un TBI negli esseri umani, i pesci zebra possiedono la capacità di rigenerare i neuroni in tutto il corpo, incluso il cervello. Per esaminare l'ampiezza delle patologie esibite nel pesce zebra a seguito di un TBI a forza smussata e per studiare i meccanismi alla base della successiva risposta rigenerativa neuronale, abbiamo modificato il calo di peso del roditore Marmarou comunemente usato per l'uso nel pesce zebra adulto. Il nostro semplice modello di TBI a forza smussata è scalabile, inducendo un TBI lieve, moderato o grave e ricapitola molti dei fenotipi osservati dopo TBI umano, come convulsioni da contatto e post-traumatiche, edema, ematomi subdurali e intracerebrali e disturbi cognitivi, ciascuno visualizzato in modo dipendente dalla gravità della lesione. Le sequele tbi, che iniziano a comparire entro pochi minuti dalla lesione, si attenuano e ritornano a livelli di controllo quasi intatti entro 7 giorni dopo l'infortunio. Il processo rigenerativo inizia già 48 ore dopo l'infortunio (hpi), con il picco di proliferazione cellulare osservato da 60 hpi. Pertanto, il nostro modello TBI a forza smussata del pesce zebra produce patologie TBI con lesioni primarie e secondarie caratteristiche simili al TBI umano, che consente di indagare l'insorgenza e la progressione della malattia, insieme ai meccanismi di rigenerazione neuronale che sono unici per il pesce zebra.
Introduction
Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) sono una crisi sanitaria globale e una delle principali cause di morte e disabilità. Negli Stati Uniti, circa 2,9 milioni di persone sperimentano un TBI ogni anno e tra il 2006-2014 la mortalità dovuta a sequele di TBI o TBI è aumentata di oltre il 50%1. Tuttavia, i TBI variano nella loro eziologia, patologia e presentazione clinica a causa in gran parte del meccanismo di lesione (MOI), che influenza anche le strategie di trattamento e la prognosi prevista2. Sebbene i TBI possano derivare da vari MOI, sono prevalentemente il risultato di un trauma penetrante o con forza contundente. I traumi penetranti rappresentano una piccola percentuale di TBI e generano una lesione grave e focale localizzata nelle regioni cerebrali impalate immediate e circostanti3. Al contrario, i TBI a forza smussata sono più comuni nella popolazione generale, coprono una gamma di gravità (lieve, moderata e grave) e producono una lesione diffusa, eterogenea e globale che colpisce più regioni del cervello1,4,5.
I pesci zebra (Danio rerio) sono stati utilizzati per esaminare una vasta gamma di insulti neurologici che attraversano il sistema nervoso centrale (SNC)6,7,8,9. I pesci zebra possiedono anche, a differenza dei mammiferi, una risposta rigenerativa innata e robusta per riparare i danni al SNC10. Gli attuali modelli di trauma del pesce zebra utilizzano vari metodi di lesione, tra cui penetrazione, escissione, insulto chimico o onde di pressione11,12,13,14,15,16. Tuttavia, ciascuno di questi metodi utilizza un MOI che è raramente sperimentato dalla popolazione umana, non è scalabile in una gamma di gravità delle lesioni e non affronta l'eterogeneità o la gravità dipendente dalle sequele TBI riportate dopo TBI a forza contundente. Questi fattori limitano l'uso del modello zebrafish per comprendere i meccanismi alla base delle patologie associate alla forma più comune di TBI nella popolazione umana (lievi lesioni da forza contundente).
Abbiamo mirato a sviluppare un modello di zebrafish TBI a forza smussata rapido e scalabile che fornisca strade per studiare la patologia della lesione, la progressione della sequela tbi e la risposta rigenerativa innata. Abbiamo modificato la caduta di peso del roditore Comunemente usato Marmarou17 e l'abbiamo applicata al pesce zebra adulto. Questo modello produce una gamma riproducibile di gravità che vanno da lieve, moderata a grave. Questo modello ricapitola anche molteplici aspetti della patologia TBI umana, in modo dipendente dalla gravità, tra cui convulsioni, edema, ematomi subdurali e intracerebrali, morte delle cellule neuronali e deficit cognitivi, come disturbi dell'apprendimento e della memoria. Giorni dopo l'infortunio, patologie e deficit si dissipano, tornando a livelli simili a controlli non danneggiati. Inoltre, questo modello di zebrafish mostra una robusta proliferazione e una risposta di rigenerazione neuronale attraverso il neuroassico per quanto riguarda la gravità delle lesioni.
Qui, forniamo dettagli sulla configurazione e l'induzione del trauma da forza contundente, il punteggio delle convulsioni post-traumatiche, la valutazione delle lesioni vascolari, le istruzioni sulla preparazione delle sezioni cerebrali, gli approcci per quantificare l'edema e le informazioni sulla risposta proliferativa dopo la lesione.
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Protocol
I pesci zebra sono stati allevati e mantenuti nella struttura di Notre Dame Zebrafish nel Freimann Life Sciences Center. I metodi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Notre Dame.
1. Paradigma della lesione cerebrale traumatica
- Aggiungere 1 mL di 2-fenossietanolo a 1 L di acqua di sistema (60 mg di Instant Ocean in 1 L di acqua RO deionizzata).
- Preparare un serbatoio di recupero aerato contenente 2 L di acqua di sistema a temperatura ambiente.
- Selezionare il peso desiderato del cuscinetto a sfere e la lunghezza e il diametro desiderati dei tubi in acciaio/plastica e determinare l'energia e la forza d'impatto.
NOTA: il tubo deve avere un diametro interno che consenta al cuscinetto a sfere di passare senza modificarne il percorso o la velocità di movimento.- Determinare l'energia cinetica all'impatto:
Dove, KE = energia cinetica, m = massa (in kg), g = forza gravitazionale, h = altezza (in m) dal punto di caduta al pesce.
NOTA: Questo fornisce energia cinetica in J. Moltiplicare il valore per 1.000 per determinare mJ. KE si basa su un oggetto accelerante, che si verifica quando il cuscinetto a sfere viene lasciato cadere da una posizione stazionaria. - Genera un lieve TBI (miTBI) utilizzando tubi in acciaio/plastica lunghi 7,62 cm che terminano 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 9,1 cm) e un cuscinetto a sfere da 1,5 g (6,4 mm di diametro). Questi producono un'energia cinetica di 1,33 mJ. Questo danno è stato empiricamente deciso per essere equivalente a un miTBI basato su marcatori TBI fisiopatologici chiave, come lesioni vascolari, formazione di ematoma subdurale / intracerebrale, morte delle cellule neuronali e disturbi cognitivi che hanno ampiamente ricapitolato ciò che è stato riportato nella popolazione umana in modo dipendente dalla gravità.
- Calcola energia cinetica miTBI =
- Generare un TBI moderato (moTBI) utilizzando un tubo di acciaio/plastica lungo 12,7 cm che termina a 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 14,2 cm) e un cuscinetto a sfere da 1,5 g (6,4 mm di diametro) che produce energia cinetica di 2,08 mJ.
- Calcola energia cinetica moTBI =
- Generare un GRAVE TBI (sTBI) utilizzando un tubo in acciaio/plastica lungo 7,62 cm che termina a 1,5 cm sopra la piastra sul cranio del pesce zebra (distanza totale 9,1 cm) e un cuscinetto a sfere da 3,3 g (8,38 mm di diametro) che produce un'energia cinetica di 2,94 mJ.
- Calcola l'energia cinetica sTBI =
- Determinare l'energia cinetica all'impatto:
- Riempi una capsula di Petri con argilla modellante (Figura 1, passaggio 1) e usa uno strumento smussato (cioè il retro di un paio di pinze) per creare una piattaforma rialzata (5 cm x 1,5 cm) con argilla modellante aggiuntiva (Figura 1, passaggio 2).
- Usa una lama di rasoio per dividere la piattaforma rialzata longitudinalmente in due metà approssimativamente uguali (Figura 1, passaggio 3, linea tratteggiata rossa). Formare le due metà in un canale che ospita la lunghezza di un pesce adulto (Figura 1, passaggio 4). Usa argilla aggiuntiva per costruire muri che assicureranno ~ 2/3 del corpo del pesce, lasciando la testa esposta.
- Modellare un piccolo supporto nella regione della testa esposta perpendicolare alle pareti per sostenere la testa per evitare la rotazione o il rinculo della testa in caso di lesione (Figura 1, fase 4).
NOTA: Il canale dovrebbe essere abbastanza profondo da sostenere il pesce in posizione dorsale verso l'alto, ma dovrebbe comunque consentire alla testa di riposare sopra l'argilla circostante. Inoltre, il supporto della testa dovrebbe seguire la curvatura naturale del pesce, sostenendo la mandibola inferiore e le branchie. - Assicurarsi che la perdita di peso non sia ostacolata dai lati del canale (Figura 1, passaggio 4).
- Creare un disco in acciaio di 3 mm di diametro utilizzando un mini foro e un lampeggiante in acciaio da 22 g. Ogni disco può essere utilizzato più volte.
- Anestetizzare un pesce mettendolo in un becher con 50-100 ml di 1:1000 (1 ml / 1 L, 0,1%) 2-fenossietanolo fino a quando non risponde al pizzico di coda.
- Posizionare il pesce, lato dorsale verso l'alto, sullo stampo di argilla all'interno del canale in modo che il corpo sia fissato sui lati e posizionare un disco di acciaio da 3 mm e 22 g sulla testa, centrato sul punto di impatto desiderato (Figura 1, passaggio 5).
- Assicurarsi che il pesce sia allineato nel modo più perpendicolare possibile per evitare che la sua testa si inclini su un lato, il che potrebbe causare un impatto irregolare.
- Fissare il tubo di acciaio/plastica, utilizzando un supporto ad anello standard e un morsetto per braccio, in modo che il fondo del tubo si trovi a 1,5 cm sopra la testa del pesce zebra (Figura 1, passaggio 6). Assicurarsi che il tubo sia dritto.
- Guarda in basso il tubo e assicurati che il tubo sia allineato sopra la piastra di acciaio.
- Far cadere il cuscinetto a sfere (1,5 g per TBI lieve e moderato e 3,3 g per TBI grave) da un'altezza predeterminata (descritta nei passaggi 1.3.3-1.3.5) lungo il tubo sulla piastra di acciaio situata sopra la regione neuroanatomica di interesse desiderata (ad esempio, cervelletto, Figura 1, fase 5) per produrre il TBI a forza smussata per la gravità desiderata della lesione. Posizionare il pesce ferito in una vasca di recupero da monitorare.
NOTA: A seconda della gravità della lesione, possono verificarsi mortalità o convulsioni tonico-cloniche. Se i pesci non rispondono per un periodo di tempo prolungato dopo il TBI, utilizzare una pipetta di trasferimento o una pinza per somministrare un pizzico di coda e valutare una risposta al dolore.
2. Punteggio delle convulsioni post-TBI nel pesce zebra adulto
- Anestetizzare e ferire il pesce secondo il protocollo di lesione delineato nella sezione 1 e posizionare il pesce ferito in un serbatoio di recupero aerato di 2 L di acqua di sistema.
- Osservare il pesce per eventuali segni di convulsioni post-traumatiche che iniziano immediatamente dopo essere stati collocati nella vasca di recupero. Impostare un tempo di osservazione (cioè 1 ora) e registrare tutte le attività convulsive, incluso il punteggio delle convulsioni (descritto di seguito), la durata di ciascun attacco e la percentuale di pesci che hanno avuto convulsioni (Figura 2A).
NOTA: le convulsioni possono verificarsi immediatamente dopo l'infortunio, così come ore o giorni dopo il TBI. Le convulsioni possono persistere a lungo termine e un singolo pesce può avere più convulsioni. Impostare un tempo di osservazione di 1 ora o superiore produrrà una buona rappresentazione della tendenza generale dei tassi di convulsioni. - Segna i pesci usando le linee guida Mussulini18 per i fenotipi di convulsioni del pesce zebra adulto.
NOTA: senza utilizzare il software di tracciamento, è difficile valutare i punteggi delle convulsioni inferiori a 3 in modo imparziale. Pertanto, solo i punteggi di sequestro di 3 o superiori devono essere registrati quando la valutazione viene eseguita senza software.
3. Dissezione cerebrale
- Eutanasia dei pesci in una soluzione 1:500 (2 ml / 1 L, 0,2%) di 2-fenossietanolo, fino a quando i movimenti branchiali cessano e non sono reattivi al pizzicamento delle pinne, all'estremità desiderata.
- Riempi una capsula di Petri con argilla modellante e crea una piccola cavità per sostenere il corpo durante la dissezione.
- Posizionare il pesce, lato dorsale verso l'alto, nello stampo di argilla. Posizionare un perno di dissezione attraverso la linea mediana a metà del corpo del pesce e un secondo perno ~ 5 mm dietro la base della testa.
- Sotto un microscopio ottico sezionante, tagliare senza mezzi termini il nervo ottico con un paio di pinze Dumont #5 e rimuovere gli occhi (Figura 2A).
- Orientare il pesce in modo che l'estremità rostrale sia più lontana quando si guarda attraverso il microscopio (Figura 2B).
NOTA: i seguenti passaggi sono per i destrimani. Gli individui mancini potrebbero preferire eseguire i seguenti passaggi in un orientamento speculare. - Usa la pinza #5 per posizionare lentamente un'estremità della pinza sotto la piastra parietale destra, facendo un'azione deliberata a forbice muovendosi verso l'estremità rostrale e rimuovendo le placche parietali e frontali destre (Figura 2C).
- Tenere la pinza ad un angolo di 45 ° o inferiore per evitare di penetrare nel cervello durante la dissezione.
- Ruotare il pesce di 90° in senso orario. Posiziona un'estremità della pinza #5 sotto la piastra parietale sinistra e usa lo stesso movimento della forbice per rimuovere le placche parietali e frontali sinistre esponendo l'intero aspetto dorsale del cervello (Figura 2D,E).
- Transetto senza mezzi termini la mascella con una pinza #5. Conservare i bulbi olfattivi e non danneggiarli se questa è la regione di interesse.
- Rimuovere l'opercolo destro, il preopercolo, l'interopercolo e il sottoopercolo con una pinza #5 (Figura 2F).
- Resettare senza mezzi termini la muscolatura all'estremità caudale dell'apertura del calvario usando la pinza #5, esponendo il midollo spinale.
- Transettare senza mezzi termini il midollo spinale con una pinza #5. Posizionare con attenzione la pinza sotto il cervello e rimuovere delicatamente il cervello dal calvario.
NOTA: non pizzicare mai il cervello. Usa la pinza per "cullare" il cervello o resecare caudalmente e utilizzare il midollo spinale esposto come punto di pizzico per manovrare il cervello. - Fissare i cervelli rimossi in 9 parti di etanolo al 100% a 1 parte di formaldeide al 37% durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
4. Studi sull'edema nel cervello del pesce zebra
- Anestetizzare e ferire i pesci secondo il protocollo di lesione delineato nella sezione 1 e consentire ai pesci di recuperare in una vasca di recupero fino a quando non iniziano a nuotare liberamente.
- Rimetti il pesce nelle normali condizioni abitative post-infortunio per 1 giorno.
- Eutanasia del pesce in 1:500 2-fenossietanolo, dopo che il tempo è trascorso.
- Sezionare l'intero cervello o la regione di interesse secondo il protocollo delineato nella sezione 3 e posizionare immediatamente il cervello su una piccola barca di pesatura.
NOTA: Prestare attenzione quando si trasferisce il cervello, utilizzando una pinza fine per posizionarlo delicatamente sulla barca di pesatura senza pugnalare o raschiare il cervello, il che potrebbe comportare la perdita di tessuto. - Etichettare (con gruppo di lesioni e numero di cervello) e tarare un'ulteriore piccola barca di asciugatura su una bilancia. Utilizzare una bilancia con la possibilità di misurare un minimo di 0,001 g per ottenere una misurazione accurata.
- Trasferire il cervello alla barca di pesatura asfaltata e registrare il peso bagnato del cervello. Orienta i cervelli in modo che si trovino piatti sulla barca con il lato dorsale rivolto verso l'alto.
- Posizionare la barca di pesatura e il cervello in un forno di ibridazione impostato a 60 °C per 8 ore.
- Dopo l'essiccazione, il cervello può attaccarsi alla barca di pesatura di essiccazione e può essere difficile da rimuovere e trasferire su una nuova barca di piccola pesatura catramata. Evitare di pizzicare il cervello con una pinza, in quanto ciò potrebbe causare danni al cervello secco e perdita di tessuto. Invece, pizzicare insieme le pinze sottili e, a partire dal lato ventrale del cervello, raccogliere in un movimento verso l'alto.
- Determinare il contenuto di acqua di ciascun cervello utilizzando la formula (Figura 4):
5. Etichettatura della proliferazione cellulare attraverso il neuroassi e preparazione del tessuto fisso.
- Preparare 10 mM 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) in 2 mL di ddH2O.
- Anestetizzare da 3 a 4 pesci alla volta in 50-100 ml di 1:1000 (1 ml / 1 L, 0,1%) 2-fenossietanolo fino a quando il pesce non risponde al pizzico della coda, nel punto temporale desiderato dopo l'infortunio (utilizzando il protocollo descritto nella sezione 1).
- Fai un'incisione parziale su una spugna bagnata e posiziona un pesce alla volta nell'apertura, lato ventrale verso l'alto.
- Utilizzare un ago da 30 G per iniettare ~ 40 μL di 10 mM EdU nel corpo del pesce. Riportare il pesce in un serbatoio pieno di acqua di sistema.
NOTA: Le iniezioni ripetute possono essere eseguite in momenti diversi per etichettare un numero maggiore di cellule proliferanti e possono essere necessarie se si desidera un periodo di inseguimento superiore a 1 settimana. - Raccogliere i cervelli come indicato nel paragrafo 3 e metterli come gruppo in una fiala di vetro da 5 ml contenente 2 mL di 9 parti di etanolo al 100% a 1 parte di formaldeide al 37%. Fissa il cervello a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
NOTA: una piattaforma a bilanciere o shaker proibisce al cervello di riposare nella parte inferiore e al telencefalo di cervelli interi di arricciarsi. - Reidratare i cervelli, nello stesso flaconcino di vetro usato per riparare i cervelli, in lavaggi di serie di etanolo discendenti, 75%, 50% e 25%, per 15 minuti ciascuno, seguiti da un lavaggio di 1,5 ore in saccarosio / PBS al 5% su un bilanciere a temperatura ambiente. Conservare il cervello in una fiala di vetro durante la notte in saccarosio al 30% / PBS a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
- Rimuovere i cervelli dal 30% di saccarosio / PBS e trasferirli con una pinza in una piastra a 12 pozzetti (un gruppo di trattamento per pozzetto) con pozzetti riempiti con una soluzione 2: 1 composta da 2 parti di mezzo di congelamento del tessuto e 1 parte di saccarosio al 30% / PBS. Incubare il cervello durante la notte a 4 ° C su una piattaforma a bilanciere.
- Trasferisci i cervelli alla fila successiva di pozzi all'interno dei cervelli sommersi a 12 pozzetti in TFM al 100% per 2-24 ore a 4 °C.
- Utilizzare un mandrino criostato per incorporare il cervello in TFM nell'orientamento desiderato sul ghiaccio secco.
- Eseguire la criosezione (sezioni spesse 16 μm) e raccogliere le sezioni su vetrini caricati positivamente. Asciugare i vetrini su uno scaldafili per 1 ora e poi conservare a -80 °C o continuare con l'immunoistochimica.
- Preparare una barriera idrofobica sul vetrino intorno alle sezioni di tessuto e lasciare asciugare su uno scaldafilo per 20 minuti.
- Lavare brevemente le diapositive in PBS per 5 minuti e poi due volte in PBS-Tween 20 (0,05%) per 10 minuti ciascuna.
- Eseguire il rilevamento EdU utilizzando il kit di proliferazione delle celle EdU e le istruzioni del produttore.
- Analizzare i vetrini e quantificare le cellule fluorescenti marcate edU utilizzando un microscopio epifluorescente o un microscopio confocale. Sarà richiesto un minimo di un obiettivo 40x per distinguere chiaramente le singole cellule.
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Representative Results
La preparazione del carro di induzione delle lesioni consente un mezzo rapido e semplicistico per fornire un TBI a forza smussata scalabile al pesce zebra adulto. La gravità graduale del modello di lesione fornisce diverse metriche facilmente identificabili della lesione di successo, sebbene la lesione vascolare sia una delle patologie più semplici e importanti (Figura 3). Il ceppo di pesce utilizzato durante la lesione può rendere questo indicatore più facile o più difficile da identificare. Quando si utilizzano pesci AB selvatici (WTAB, Figura 3A-D), l'identificazione della lesione vascolare può essere difficile da distinguere tra miTBI o moTBI e pesci di controllo non danneggiati a causa della pigmentazione (Figura 3A-C). Dopo l'infortunio, i pesci miTBI mostrano abrasioni superficiali minime (Figura 3B), mentre i moTBI mostrano emorragie cerebrali limitate (Figura 3C). Mentre l'sTBI può ancora essere impegnativo, l'entità della lesione è spesso evidente (Figura 3D). Al contrario, quando si utilizza pesce albino (Figura 3E-H) o casper (Figura 3I-L), la lesione vascolare è facilmente identificabile. Inoltre, le convulsioni da impatto sono spesso osservate a seguito di lesioni e il tasso di convulsioni tra il gruppo è un'altra metrica rappresentativa della lesione (Tabella 1). I pesci feriti mostreranno convulsioni tonico-cloniche (atassia, ZBC 1.9, flessione, ZBC 1.16, cerchio, ZBC 1.32 e nuoto cavatappi, ZBC 1.37)19 che sono facilmente osservabili dopo l'infortunio, indipendentemente dal ceppo di fondo. Le convulsioni saranno osservate con una prevalenza crescente in relazione alla gravità. Dopo l'infortunio, i miTBI non mostrano comportamenti simili a convulsioni; tuttavia, moTBI mostrerà comportamenti convulsivi (10,66% ± 1,37%, p < 0,0001, Tabella 1) e l'incidenza è ulteriormente elevata nei pesci sTBI (19,93% ± 1,49%, p < 0,0001, Tabella 1).
La rimozione riuscita del cervello è fondamentale per una miriade di ulteriori indagini, come l'edema e la valutazione della proliferazione cellulare. Eseguire dissezioni con la massima cura per evitare di danneggiare le regioni del cervello (il più delle volte con puntura involontaria) e per conservare tutte le regioni (i bulbi olfattivi possono essere facilmente persi). Seguire la procedura di dissezione cerebrale e schematica (sezione 3, Figura 2A-F) consente una rimozione completa del cervello (Figura 2G,H). I ricercatori dovrebbero considerare se la loro analisi richiede l'intero cervello o se una raccolta di regioni cerebrali specifiche può soddisfare le loro esigenze. A seconda della gravità della lesione e del tempo di raccolta, i cervelli possono presentare emorragie subdurali attaccate, tuttavia, queste sono spesso aderenti alla parte inferiore del cranio e perse durante la dissezione. Il gonfiore del cervello è a volte evidente, ma a causa delle differenze anatomiche e delle variazioni delle dimensioni generali, l'edema è il metodo migliore per valutare il gonfiore. Seguendo il protocollo delineato (sezione 4), i cervelli non danneggiati presentano un contenuto di liquidi del 73,11% ± 0,80% e il miTBI, sebbene leggermente elevato, non mostra un aumento significativo dell'edema a 1, 3 o 5 dpi (1 dpi: 76,33% ± 1,32%, p = 0,36, 3 dpi: 75,33 ± 1,37%, p = 0,84, 5 dpi: 74,14 ± 1,50%, p > 0,99, Figura 4). Al contrario, sia moTBI che sTBI avevano un edema significativo di 1 dpi (moTBI: 80,55 ± 0,94%, p < 0,0001, sTBI: 86% ± 1,05%, p < 0,0001) e 3 dpi (moTBI: 78,11 ± 0,93%, p < 0,018, sTBI: 77,77% ± 1,02%, p < 0,036, Figura 4). Tuttavia, il contenuto fluido di moTBI e sTBI è tornato a livelli simili a controlli non danneggiati di 5 dpi (moTBI: 74,42 ± 1,25%, p > 0,99, sTBI: 73,85% ± 1,01%, p > 0,99, Figura 4).
La proliferazione cellulare, a seguito di TBI nel pesce zebra, è una solida valutazione dell'entità della lesione. Mentre la risposta alla proliferazione cellulare è stata studiata in precedenza nel pesce zebra a seguito di altre forme di lesione cerebrale9,12, nella maggior parte dei casi, l'indagine è stata limitata al sito della lesione. Questo TBI a forza smussata si traduce in una robusta risposta di proliferazione che attraversa il neuroassi. In modo dipendente dalla gravità (dati sTBI mostrati), si osserva un aumento dell'etichettatura EdU nelle zone ventricolare e subventricolare del proencefalo (telencefalo, Figura 5B) rispetto ai controlli non danneggiati (Figura 5A). Mentre le sezioni si spostavano caudalmente nel mesencefalo (mesencefalo e diencefalo), i cervelli feriti mostravano un aumento dell'etichettatura EdU nella zona grigia periventricolare (PGZ), dei lobi tettotali ottici (TeO) e degli aspetti dell'ipotalamo anteriore rispetto ai pesci non danneggiati (Figura 5D e Figura 5C, rispettivamente). Nel cervello posteriore, le regioni neurogeniche che sono evidenti nel cervello non danneggiato (Figura 5E,G) mostrano un aumento della proliferazione cellulare dopo l'sTBI (Figura 5F,H).
Per riassumere, una caduta di peso Marmarou modificata applicata al pesce zebra adulto fornisce un TBI con forza contundente lieve, moderata o grave riproducibile e scalabile. Il pesce zebra, in modo dipendente dalla gravità, mostra varie patologie, tra cui convulsioni e lesioni vascolari (cioè ematomi subdurali e intracerebrali). Inoltre, i pesci feriti mostrano un tasso di recupero ridotto (analogo alla perdita di coscienza, ai deficit cognitivi sotto forma di problemi di apprendimento e memoria e alla morte delle cellule neuronali (dati non mostrati). Le patologie osservate, si riprendono rapidamente nell'arco di 4-7 giorni in coincidenza con robusti eventi proliferativi attraverso il neuroassi.
Figura 1: Impostazione dell'apparato di lesioni scalabile. Rappresentazione grafica del setup, del modello e consegna di TBI scalabili al pesce zebra. I passaggi 1-4 forniscono una panoramica didattica dei passaggi per formare lo stampo di supporto che immobilizza il pesce ed espone la testa durante il danno. I passaggi da 5 a 7 forniscono istruzioni su come fornire la lesione con informazioni sugli aspetti da considerare durante la risoluzione dei problemi del modello. La figura è stata creata con BioRender.com. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Rimozione del cranio per la dissezione cerebrale. Schema di un cranio di zebrafish semplificato e la rimozione passo-passo dell'osso (sezioni blu) per esporre il cervello del pesce zebra adulto. (A,B) Gli occhi vengono rimossi senza mezzi termini con una pinza #5 che taglia i nervi ottici. (C) Le pinze sono posizionate nella muscolatura direttamente caudale alle placche parietali (freccia nera) per rimuovere l'osso parietale destro e quindi l'osso frontale destro. (D,E) L'osso parietale sinistro e l'osso frontale sinistro vengono rimossi. (F) L'opercolo destro, il preopercolo, l'interopercolo e il sottoopercolo vengono rimossi, fornendo accesso laterale e dorsale al cervello. (G,H) I cervelli non danneggiati e sTBI sono stati rimossi. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Lesioni vascolari in vari background attraverso le gravità delle lesioni. Vista dorsale di AB, albinob4 e pesci zebra adulti non danneggiati e TBI che mostrano lesioni vascolari. (A-D) I pesci AB selvatici adulti sono fortemente pigmentati e le abrasioni successive al miTBI (B) sono difficili da visualizzare. La lesione vascolare era più evidente nei pesci moTBI (C) e sTBI (D) rispetto ai controlli non danneggiati (A). (E-H) i pesci albini erano meno pigmentati e la visualizzazione del cervello era più distinta. La lesione vascolare a seguito di TBI è stata chiaramente osservata e distinta tra le gravità. (I-L) Il pesce casper ha fornito lo sfondo più adattabile per gli investigatori alle prime armi in quanto la trasparenza ha permesso una facile identificazione delle regioni neuroanatomiche desiderate e una chiara osservazione e delineazione della lesione vascolare mediante la gravità del TBI. Barra della scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Zebrafish sperimenta edema indotto da lesioni a seguito di TBI. I pesci zebra sono stati esposti a diverse gravità di TBI (non danneggiato, miTBI, moTBI e sTBI) e valutati in giorni diversi dopo il danno per il contenuto percentuale di liquidi (edema). Le analisi statistiche sono state eseguite con un Browns-Forsythe e Welch ANOVA seguito da un test post-hoc di confronto multiplo T3 di Dunnett. n = numero totale di singoli pesci. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con il pacchetto software Prism (Graphpad 9.0). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Proliferazione indotta da TBI attraverso il neuroassi. (A-H) Immagini confocali di sezioni cerebrali coronali e sagittali di pesci non danneggiati e sTBI che sono stati iniettati per IP con EdU 12 ore prima della raccolta. L'aumento dell'incorporazione di EdU è stato osservato in più nicchie neurogeniche a seguito di lesioni attraverso il proencefalo (A, B), il mesencefalo (C, D) e il cervello posteriore (E-H). Cervelletto, CCe, Granulostrato, GL, Valvula Cerebelli Mediale, Vam, Strato Molecolare, ML, Optic Tectum, TeO, Zona Grigia Periventricolare, PGZ, Telencefalo e Tel. Tutte le barre della scala sono 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo | N | n | Convulsioni medie (%) ± SEM | p |
| Undam · | 10 | 74 | 0% | |
| miTBI | 10 | 100 | 0% | > 0,99 |
| moTBI | 10 | 184 | 10,66% ± 1,37% | <0,0001 |
| sTBI | 10 | 237 | 19,93% ± 1,49% | <0,0001 |
Tabella 1. Zebrafish mostra convulsioni da impatto dipendenti dalla gravità dopo TBI. Quantificazione delle crisi tonico-cloniche, che è stata registrata come percentuale di un gruppo sperimentale ferito, che sono state osservate entro 1 ora dopo la lesione. Le analisi statistiche sono state eseguite con un ANOVA unidirezionale seguito dal test post-hoc di Tukey. N = numero totale di gruppi sperimentali, n = numero totale di singoli pesci. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il pacchetto software Prism (Graphpad 9.0).
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Discussion
Le indagini sui neurotraumi e sulle sequele associate sono state a lungo incentrate sui modelli tradizionali di roditori non rigenerativi20. Solo di recente gli studi hanno applicato varie forme di danno al SNC a modelli rigenerativi9,11,13,14,21. Sebbene approfonditi, questi modelli sono limitati dal loro uso di un metodo di lesione non comunemente visto nella popolazione umana (traumi penetranti, ablazione chimica, esplosione) e / o la lesione non è scalabile e quindi non affronta completamente l'eterogeneità delle patologie dipendenti dalla gravità osservate nella popolazione umana22,23,24,25 . Qui, forniamo un paradigma di danno che applica la forma più comune di trauma cranico clinicamente rilevante (forza contundente)4 che produce molte delle metriche patologiche stabilite nella diagnosi umana22,23,24,25. Quando applicato al pesce zebra rigenerativo, il modello fornisce strade per studiare la progressione e il recupero delle patologie indotte da lesioni attraverso gravità, come edema o convulsioni post-traumatiche, oltre a chiarire i meccanismi alla base del recupero rigenerativo innato.
Ci sono due caratteristiche chiave del nostro modello nella produzione di un TBI a forza smussata nel pesce zebra. In primo luogo, il nostro modello offre un paradigma di lesione economico e semplice che è rapido, che consente la lesione successiva a un gran numero di individui o lesioni ripetute a un individuo per indagare l'effetto cumulativo del TBI a forza contundente. In secondo luogo, questo modello è facilmente scalabile per esaminare gli effetti di diversi impatti di forza. Modificando la lunghezza del tubo (l'altezza da cui viene lasciato cadere il cuscinetto a sfere) e il peso del cuscinetto a sfere, l'energia erogata al cranio del pesce e la forza d'impatto possono essere facilmente modificate e calcolate. Questa scalabilità della lesione consente molteplici vie di indagine per quanto riguarda la progressione delle sequele TBI dipendenti dalla gravità e i meccanismi rigenerativi della riparazione del SNC.
Con più metriche per accedere all'applicazione di lesioni di successo, un'attenta considerazione dovrebbe ancora essere data al background genetico del pesce da utilizzare. Il casper o il pesce mutante albino sarà favorevole per gli investigatori alle prime armi per posizionare in modo affidabile il pesce sotto l'albero di caduta, il posizionamento del disco d'acciaio sopra il punto di impatto neuroanatomico desiderato e la valutazione della lesione vascolare. Inoltre, un'attenta rimozione del cervello è semplificata dall'accessibilità visiva delle ossa e del cervello nel casper e nei pesci mutanti albini . Tuttavia, i pesci selvatici pigmentati possono essere utilizzati anche se l'identificazione di punti di riferimento e la dissezione di successo possono venire con una pratica notevole. Inoltre, il pesce pigmentato può essere utilizzato quando si produce un insulto moTBI o sTBI, poiché le patologie successive consentono una corretta caratterizzazione della lesione.
Uno dei motivi principali per studiare gli effetti del TBI a forza smussata nel pesce zebra è quello di esaminare la fonte della proliferazione cellulare indotta da lesioni e i meccanismi alla base della rigenerazione neuronale. Livelli di proliferazione costitutiva dello sviluppo e basali sono stati identificati in nicchie neurogeniche attraverso il neuroassizzo zebrafish26,27 e la rigenerazione indotta da lesioni è stata osservata localizzata o adiacente al sito di lesione nel pesce zebra adulto8,12,15. Tuttavia, il nostro modello TBI a forza contundente dimostra che la lesione diffusa provoca anche un evento di proliferazione cellulare dipendente dalla gravità all'interno delle nicchie neurogeniche attraverso il neuroassi. L'identificazione della fonte e dell'estensione della proliferazione cellulare a seguito di TBI consentirà l'applicazione di RNA-Seq monocellulare per identificare i cambiamenti nell'espressione genica nella nicchia proliferativa e testare il ruolo di diverse vie di segnalazione, attraverso l'applicazione di specifici agonisti e antagonisti, nella regolazione di questa risposta di rigenerazione. Questo approccio si è dimostrato utile per chiarire i meccanismi alla base della rigenerazione neuronale nella retina del pesce zebra danneggiato28 e dovrebbe essere ugualmente utile nel cervello dopo TBI.
In conclusione, il nostro modello fornisce un metodo di lesione rapido, semplice ed economico per fornire un TBI a forza smussata scalabile. Questo modello sarà utile per studiare ulteriormente gli effetti del TBI a forza smussata dipendente dalla gravità o ripetuta, oltre a chiarire gli obiettivi terapeutici della regolazione genetica migliorando la protezione neuronale o inducendo la rigenerazione neuronale per il recupero cognitivo funzionale nei vertebrati adulti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio Hyde per le loro discussioni ponderate, i tecnici del Freimann Life Sciences Center per la cura e l'allevamento dei pesci zebra e l'Università di Notre Dame Optical Microscopy Core / NDIIF per l'uso degli strumenti e dei loro servizi. Questo lavoro è stato sostenuto dal Center for Zebrafish Research presso l'Università di Notre Dame, dal Center for Stem Cells and Regenerative Medicine presso l'Università di Notre Dame e da sovvenzioni del National Eye Institute del NIH R01-EY018417 (DRH), del National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (JTH), LTC Neil Hyland Fellowship di Notre Dame (JTH), Sentinels of Freedom Fellowship (JTH) e Pat Tillman Scholarship (JTH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-phenoxyethanol | Sigma Alderich | 77699 | |
| #00 buckshot | Remington | RMS23770 | 3.3g weight for sTBI |
| #3 buckshot | Remington | RMS23776 | 1.5g weight for miTBI/moTBI |
| #5 Dumont forceps | WPI | 14098 | |
| 5-ethynyl-2’-deoxyuridine | Life Technologies | A10044 | EdU |
| 5ml glass vial | VWR | 66011-063 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C10340 | |
| CytoOne 12-well plate | USA Scientific | CC7682-7512 | |
| Instant Ocean | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Super frost postiviely charged slides | VWR | 48311-703 | |
| Super PAP Pen Liquid Blocker | Ted Pella | 22309 | |
| Tissue freezing medium | VWR | 15148-031 |
References
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