Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة ALS مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخاصة بالمنطقة

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

وصفنا طريقة للتمييز بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الحبل الشوكي التي يسببها الإنسان وثقافتها المشتركة للتسجيل الكهربيفيزيولوجي.

Abstract

توفر الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) أداة قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر. تعد تسجيلات الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) وسيلة لتسجيل إمكانات المجال الكهربائي من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية وتحليل نشاط الشبكة بمرور الوقت. وقد ثبت سابقا أن وجود hiPSC-A المتمايز باستخدام تقنيات لتعزيز النمط الظاهري للخلايا النجمية للحبل الشوكي يحسن النضج والنشاط الفيزيولوجي الكهربي للخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي (MN) عند مقارنتها بتلك المستزرعة بدون hiPSC-A أو في وجود الخلايا النجمية للقوارض. الموصوفة هنا هي طريقة لمشاركة زراعة الحبل الشوكي hiPSC-A مع hiPSC-MN وتسجيل النشاط الكهربي باستخدام تسجيلات MEA. في حين أن بروتوكولات التمايز الموصوفة هنا خاصة بالخلايا النجمية والخلايا العصبية الخاصة إقليميا بالحبل الشوكي ، يمكن تطبيق منصة الاستزراع المشترك على الخلايا النجمية والخلايا العصبية المتباينة بتقنيات خاصة بمصائر أخرى ، بما في ذلك hiPSC-A القشري و hiPSC-N. تهدف هذه البروتوكولات إلى توفير مقايسة فيزيولوجية كهربية للإبلاغ عن تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية وتوفير منصة لاختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في ALS.

Introduction

الخلايا النجمية البشرية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hiPSC-A) والخلايا العصبية (hiPSC-N) هي أدوات قوية لنمذجة الفيزيولوجيا المرضية للتصلب الجانبي الضموري (ALS) في المختبر وتوفر نموذجا متعديا لاستراتيجيات اكتشاف الأدوية1. لقد أثبت الباحثون أن الثقافة المشتركة ل hiPSC-A مع hiPSC-N تعزز النضج المورفولوجي والجزيئي والفيزيولوجي الكهربي والدوائي لكلا النوعين من الخلايا ، مما يولد شبكات عصبية معقدة وتفاعلات الخلايا العصبية النجمية التي تشبه نظيراتها في الجسم الحي 2,3. يمكن لتجارب الاستزراع المشترك المماثلة أن تلخص السمات المميزة لعلم الأحياء المرضي ALS مثل السمية العصبية بوساطة الخلايا النجمية 4,5 وفرط استثارة الخلايا العصبية6. بالإضافة إلى ذلك ، مع التقدم في بروتوكولات التمايز ، يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC) إلى أنواع فرعية عصبية خاصة بالمنطقة ، بما في ذلك hiPSC-A و hiPSC-N 7,8 القشرية والحبل الشوكي. توفر هذه الاستراتيجيات إمكانية نمذجة أمراض الخلايا العصبية الحركية القشرية والشوكية في ALS بالإضافة إلى التأثير النجمي على كليهما. ومع ذلك ، يتطلب هذا وجود اختبار وظيفي قابل للتكرار لتحديد هذه الآثار.

لقد تبين مؤخرا أن تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية (MEA) مناسب بشكل خاص للتوصيف الفيزيولوجي الكهربي للثقافات المشتركة بين الخلايا العصبية والنجمية2. على عكس التحليلات الفيزيولوجية الكهربية أحادية الخلية ، تسجل هذه المصفوفات الكهربية عالية الكثافة بشكل سلبي إمكانات المجال خارج الخلية من مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية دون تعطيل ظروف الثقافة والحفاظ على سلامة أغشية الخلايا. هذه المنصات مفيدة بشكل خاص لتسجيل النشاط الخلوي والشبكي للثقافات بمرور الوقت واستجابة للتلاعب الدوائي. أخيرا ، عندما يكون وجود الخلايا النجمية متغيرا ثقافيا ، يمكن أن توفر تسجيلات MEA رؤى وظيفية حول التفاعلات ثنائية الاتجاه بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية 2,9.

يظهر هنا بروتوكول محسن لتمايز hiPSC إلى hiPSC-A الحبل الشوكي والخلايا العصبية الحركية hiPSC (MN) التي تم التحقق من صحتها مسبقا2. ينتج عن بروتوكول تمايز الحبل الشوكي hiPSC-A باستمرار مزارع الخلايا النجمية ، والتي تكون إيجابية لبروتين S100 المرتبط بالكالسيوم B (S100β) ، والبروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) ، و Homeobox B4 (HOXB4) في ما يصل إلى 80٪ و 50٪ و 90٪ من الخلايا ، على التوالي ، مما يشير إلى نضج مواصفات الحبل الدبقي والشوكي 2,10 . يولد بروتوكول التمايز hiPSC-MN خلايا عصبية إيجابية بنسبة >90٪ ل الكولين أسيتيل ترانسفيراز (ChAT) ، مما يوحي بهوية الخلايا العصبية الحركية ألفاالناضجة 2. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول تقنيات لتوليد الثقافات المشتركة hiPSC-A / MN التي ثبت سابقا أنها تؤدي إلى خلايا عصبية ذات تعقيد مورفولوجي معزز من خلال تحليل شول والفحص المجهري المناعي عند مقارنتها بالثقافات العصبية بدون الخلايا النجمية أو مع الخلايا النجمية للقوارض2. في حين أن هذه الأوصاف خاصة ب hiPSC-A و hiPSC-N للحبل الشوكي ، فإن الميزة الفريدة هي أن الثقافة المستقلة الأولية للخلايا النجمية والخلايا العصبية متبوعة بخطوات للثقافة المشتركة في نقاط زمنية لاحقة يمكن ترجمتها لدراسة آثار تفاعلات الخلايا العصبية والنجمية من مناطق محددة أخرى بالإضافة إلى الخلايا الخاصة بالمرض 7,8 . وأخيرا، يصف البروتوكول كيفية زراعة هذه الثقافات على لوحات MEA بحيث يمكن دراسة النشاط الوظيفي كعامل لتكوين الاستزراع المشترك بمرور الوقت مع القدرة على معالجة التكوين الخلوي وكذلك ظروف الثقافة.

الهدف من هذه البروتوكولات هو توفير اختبار وظيفي للتحقيق في تفاعلات الخلايا العصبية النجمية ، وفحص التغيرات الخاصة بالمرض ، واختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في مجال ALS. يتم توفير تعليمات الفيديو للخطوات الأكثر تحديا في هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد وسائط زراعة الخلية

  1. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا الفردية باستخدام التراكيب المذكورة في الجدول 1.
  2. قم بخلط وتعقيم الوسائط في زجاجات مفلترة سعة 500 مل ، وقم بتخزينها محمية من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.

2. الحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSC) وتمريرها

  1. قم بإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي (المخزنة في القسمة عند -80 درجة مئوية) في ثلاجة 2-8 درجة مئوية طوال الليل.
  2. قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي عند 1: 100 (v / v) في محلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) أو وسط النسور المعدل من Dulbecco (DMEM).
  3. أضف ما يكفي من مصفوفة الغشاء القاعدي لتغطية الجزء السفلي من لوحة زراعة الأنسجة (5 مل للوحة 10 سم ، 2 مل للآبار المفردة من لوحة 6 آبار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة طوال الليل أو في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة.
  4. قم بشفط مصفوفة الغشاء القاعدي المخفف واغسل اللوحة مرة واحدة باستخدام PBS قبل إضافة وسائط الاستزراع وخلايا البذر.
  5. افحص الألواح يوميا لتحديد وتوقع متى تكون جاهزة للمرور. لوحات مرور hiPSC بمجرد أن تصبح غالبية المستعمرات كثيفة بما فيه الكفاية بحيث يعرض مركز المستعمرات مناطق بيضاء متناثرة. لا تدع اللوحات تنضج بعد هذه النقطة. سوف يتسبب في تمايز زائد يؤدي إلى ظهور منطقة صفراء في وسط المستعمرات بسبب تعدد طبقات الخلايا ، أو فرط الخلايا الممدودة عند الحواف ، أو الاكتناز الفضفاض داخل المستعمرات ، أو زيادة موت الخلايا.
  6. في يوم المرور ، ارسم خطوطا شبكية على السطح الخارجي السفلي للألواح بعلامة لتسهيل التغطية الدقيقة للوحة بأكملها.
  7. افصل المستعمرات المتمايزة في غطاء مزرعة باستخدام مجهر تباين الطور (تكبير 10x) يكشط يدويا بطرف ماصة 200 ميكرولتر.
  8. شطف لوحات مرتين مع PBS (5 مل لكل غسلة للوحات 10 سم).
  9. أضف 5 مل من بروتياز تفكك الأنسجة قبل التسخين (جدول المواد) واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ حواف المستعمرات في التقريب (4-7 دقائق) ، ولكن قبل رفع المستعمرات من اللوحة.
  10. يستنشق بعناية البروتياز التفكك. شطف بلطف لوحة مرتين مع برنامج تلفزيوني ، مع الحرص على عدم إزاحة المستعمرات.
  11. أضف 5 مل من وسط hiPSC الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى لوحة الثقافة.
  12. ارفع المستعمرات أثناء تقسيمها إلى مجاميع خلايا أصغر عن طريق خدش اللوحة بأكملها بطرف ماصة سعة 5 مل باستخدام حركة ذهابا وإيابا من أعلى إلى أسفل.
  13. اقلب اللوحة 90 درجة وكرر الخطوة أعلاه.
  14. قم بنسج مجاميع الخلايا برفق عن طريق السحب لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة سعة 5 مل وتحقق من حجم الركام بشكل دوري تحت المجهر حتى تصبح غالبية مجاميع الخلايا حوالي 50-100 خلية.
  15. قم بزرع مجاميع الخلية في ألواح مصفوفة الغشاء القاعدي المطلية مسبقا ، باستخدام وسيط hiPSC إضافي لغسل اللوحة الأصلية. جمع ونقل معظم مجاميع الخلية إلى لوحات جديدة باستخدام ماصة 5 مل.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول بشكل متسق ، فيجب أن تحتوي اللوحة الأصلية على مستعمرات iPSC تغطي حوالي 50٪ من سطح الاستزراع قبل المرور. في هذه الحالة ، يجب أن تكون نسبة الانقسام من لوحة واحدة إلى خمس لوحات جديدة. ومع ذلك ، قد يحتاج هذا إلى تعديل اعتمادا على ظروف النمو ومعدلات النمو الخاصة بخط الخلية.
  16. رج الألواح المصنفة حديثا ذهابا وإيابا لتوزيع الركام بالتساوي.
  17. انقل الألواح إلى حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO2) ، واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.
  18. قم بإجراء تغيير متوسط كامل كل يوم باستخدام 10 مل من وسيط hiPSC. إذا كان هناك حطام خلوي زائد في اليوم التالي للمرور ، اغسله مرة واحدة ب 5 مل من الوسط قبل تغيير الوسائط.
  19. خطط للمرور بعد ذلك عندما تظهر المناطق البيضاء في وسط غالبية مستعمرات iPSC (الخطوة 2.5). سيحدث هذا بعد 4-6 أيام من كل ممر.

3. تجميد hiPSC

  1. قم بتنفيذ الخطوات الأولية كما في الخطوات 2.5-2.14 لمرور hiPSC.
  2. اجمع مجاميع الخلية في أنبوب سعة 15 مل وقم بتدويرها بسرعة 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  3. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط التجميد ، وانقلها إلى أنابيب التبريد باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    ملاحظة: على غرار خطوات المرور ، فإن نسبة الانقسام المعتادة هي لوحة iPSC واحدة إلى خمسة أنابيب تبريد ، اعتمادا على كثافة المستعمرات. استخدم حجما إجماليا قدره 1 مل من وسط التجميد لكل أنبوب تبريد.
  4. ضع أنابيب التبريد في حاوية حفظ مبردة وانقلها إلى -80 درجة مئوية طوال الليل.
  5. نقل الخلايا إلى النيتروجين السائل بعد 24 ساعة.

4. ذوبان hiPSC

  1. قم بتغطية صفيحة 10 سم بمصفوفة الغشاء القاعدي (انظر 2.1-2.3).
  2. قم بإزالة أنبوب التبريد iPSC من النيتروجين السائل وضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 دقيقة ليذوب بسرعة. هز القارورة في الحمام حتى تذوب جزئيا وتحتوي على قطعة صغيرة من الثلج محاطة بالسائل.
  3. انقل مجاميع الخلية من أنبوب التبريد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 1000 ميكرولتر. أضف ما يصل إلى 15 مل من وسط hiPSC المسخن مسبقا لتخفيف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في وسائط التجميد.
  4. جهاز طرد مركزي للأنبوب المخروطي سعة 15 مل عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  5. استنشاق المادة الطافية واستخدم ماصة سعة 5 مل لإعادة تعليق حبيبات الخلية في وسط hiPSC يحتوي على 20 ميكرومتر من مثبط سيرين / ثريونين كيناز المرتبط ب Rho (ROCK-I ، المركب Y-27632) لتجنب المزيد من نسج مجاميع الخلايا.
  6. انقل مجاميع الخلية إلى صفيحة 10 سم مطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي باستخدام ماصة سعة 5 مل.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول باستمرار ، يمكن نقل الخلايا الموجودة في أنبوب تبريد واحد إلى لوحة واحدة مقاس 10 سم.
  7. هز اللوحة لتوزيع الركام بالتساوي.
  8. انقل اللوحة إلى حاضنة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.
  9. قم بإجراء تغيير متوسط كامل في اليوم التالي للذوبان باستخدام 10 مل من وسيط hiPSC بدون ROCK-I.

5. التفريق بين hiPSC في خلايا السلف العصبي في الحبل الشوكي (NPC)

  1. تأكد من أن الألواح ذات 6 آبار المطلية بمصفوفة غشاء الطابق السفلي جاهزة للاستخدام قبل بدء التمايز.
  2. ابدأ ب iPSC التي تم تمريرها مرة واحدة على الأقل ويفضل مرتين بعد الذوبان وبأربع لوحات على الأقل 10 سم (انظر الشرح في الخطوة 5.11).
  3. قم بتنفيذ الخطوات الأولية كما في الخطوات 2.5-2.14 لمرور hiPSC.
  4. انقل مجاميع الخلية من لوحين على الأقل مقاس 10 سم إلى أنبوب سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 5 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة.
  6. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية ب 10 مل من وسيط hiPSC باستخدام ماصة سعة 10 مل ، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة دقيقتين لتخفيف الالتصاقات من خلية إلى خلية في كل مجموعة.
  7. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسط hiPSC الذي يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
  8. ماصة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لسحن مجاميع الخلية. تحقق من حجم الركام تحت المجهر بشكل دوري حتى تتكون غالبية معلق الخلية من خلايا مفردة أو مجاميع صغيرة من <10 خلايا.
  9. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم (المفضل) أو عداد الخلايا الآلي وحساب كثافة الخلية في تعليق الخلية.
  10. لوحة 3.0 × 106 خلايا في كل بئر من لوحة 6 آبار مغلفة مسبقا بمصفوفة غشاء قاعدي. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: إذا تم تطبيق البروتوكول باستمرار ، فهذا يتوافق مع نسبة لوحين 10 سم في بئر واحد من 6 بئر / لوحة.
  11. كرر الخطوات 5.3-5.10 مع دفعة ثانية من لوحين 10 سم وقم بطلاء المنتج النهائي في مصفوفة غشاء قاعدي مطلية ببئر للوحة ثانية ذات 6 آبار. استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: يتطلب الإكمال المثالي لبروتوكول الحبل الشوكي NPC بئرين يساوي أربع لوحات 10 سم. لسهولة سير العمل ، أكمل الخطوات 5.3- 5.10 بدفعتين من لوحين ، كل منهما المنتج النهائي عبارة عن لوحين منفصلين من 6 آبار ولكل منهما بئر واحد يحتوي على 3.0 × 106 خلايا.
  12. حافظ على طبقة iPSC أحادية البشرية الناتجة في وسط hiPSC يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I حتى يصل الالتقاء إلى >90٪ ، عادة في اليوم التالي ولكن ليس أكثر من 3 أيام بعد الطلاء الأولي لتجنب التمايز التلقائي (غير المنضبط).
  13. إذا تعذر بدء التمايز في اليوم التالي لطلاء الخلية ، اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسائط يوميا إلى وسيط hiPSC جديد يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I. إذا لم يلتقطى >90٪ في غضون 3 أيام من الطلاء ، فتخلص من الخلايا وابدأ البروتوكول من جديد.
  14. بمجرد الوصول إلى التقاء >90٪ ، ابدأ التمايز. هذا هو اليوم في المختبر 1 (DIV1) من بروتوكول التمايز.
  15. في DIV 1 ، تخلص من وسيط hiPSC الذي يحتوي على 20 ميكرومتر ROCK-I واشطفه مرتين باستخدام PBS لإزالة عامل نمو الجنين (FGF) وتحويل عامل النمو بيتا (TGFβ) الموجود في وسط الخلايا الجذعية.
  16. قم بتغيير الوسيط إلى وسيط WiCell (الجدول 1) المكمل ب 0.2 ميكرومتر من LDN193189 (LDN) و 10 ميكرومتر من SB431542 (SB) لمدة 48 ساعة.
  17. في DIV 3 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسيط إلى وسيط WiCell المكمل ب LDN (0.5 ميكرومتر) + SB (10 ميكرومتر) + حمض الريتينويك (RA؛ 1μM) لمدة 48 ساعة.
  18. في DIV 5 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسائط إلى WiCell: قاعدة وسيط الحث العصبي (NIM) (الجدول 1) (50٪: 50٪ ، v / v) مكملة ب LDN (0.5 ميكرومتر) + SB (10 ميكرومتر) + RA (1 ميكرومتر) لمدة 48 ساعة.
  19. في DIV 7 ، قم بإجراء تبادل متوسط بنفس الوسيط كما في الخطوة 5.18.
  20. في DIV 8 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير الوسيط إلى WiCell: قاعدة NIM (50٪: 50٪) مكملة ب RA (1 ميكرومتر) + بورومورفامين (PMN) (1 ميكرومتر) + عامل التغذية العصبية المؤتلف المشتق من الدماغ البشري (BDNF) (10 نانوغرام / مل) + حمض الأسكوربيك (ASAC) (0.4 ميكروغرام / مل) لمدة 48 ساعة.
  21. في DIV 10 ، اغسل مرة واحدة باستخدام PBS وقم بتغيير المتوسط إلى قاعدة NIM (100٪) مكملة كما هو مذكور في الخطوة 5.20 لمدة 48 ساعة.
  22. في DIV 11 أو 12 ، قم بتغطية قارورة ثقافة معقمة مقاس 25 سم2 بمصفوفة غشاء قاعدي استعدادا للمرور.
  23. استنشاق الوسط من كل بئر من لوحة 6 آبار l وشطف الخلايا مرة واحدة مع PBS.
  24. أضف 2 مل من 0.05٪ تربسين إلى كل بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5-15 دقيقة ؛ قد يساعد هز الألواح بشكل متقطع في انفصال الخلية.
  25. إذا كانت الخلايا لا تزال غير معلقة ، فقم بفصلها ميكانيكيا عن طريق إخراج وسائط NIM من طرف ماصة 1000 ميكرولتر على الخلايا بحركة دائرية (تأكد من تغطية السطح بالكامل) ، أو عن طريق الكشط باستخدام مكشطة الخلية (غير مفضل).
  26. نقل الخلايا من 2 بئر إلى أنبوب 15 مل وإضافة مثبطات التربسين بنسبة مناسبة إلى كمية التربسين المستخدمة باستخدام ماصة 5 مل.
  27. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة دقيقتين ، واستنشاق المادة الطافية ، ثم إعادة تعليقها باستخدام 10 مل من قاعدة NIM باستخدام ماصة 10 مل.
  28. جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 200 × جم لمدة 2 دقيقة لتخفيف الالتصاقات من خلية إلى خلية.
  29. بعد خطوة الطرد المركزي الثانية ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام 1 مل من متوسط NIM (100٪) المكمل ب RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل) و ROCK-I (20 ميكرومتر). باستخدام طرف ماصة 1000 ميكرولتر ، قم بنسف الخلايا لأعلى ولأسفل خمس مرات تقريبا حتى يتم الحصول على تعليق غائم.
  30. إعادة زرع الركام في هذا الوسط إلى مصفوفة الغشاء القاعدي المغلفة 25 سم 2 دورق ثقافة معقمة بحيث تكون النتيجة النهائية هي اتحاد الخلايا من بئرين من صفيحة بئر 6 إلى دورق ثقافة معقم بغشاء قاعدي واحد مغطى بمصفوفة 25 سم 2 (ممر2: 1). استخدم ماصة 1000 ميكرولتر لنقل تعليق الخلية.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا متقاربة بنسبة >90٪ في DIV 13 ، ولا يلزم اتخاذ خطوات أخرى حتى اليوم 14. إذا لم تكن الخلايا متقاربة ، فاحتفظ ب ROCK-I في الوسائط لمدة 1 أو 2 أيام إضافية.
  31. في DIV 14 ، قم بتغيير الوسائط المتوسطة إلى وسائط NIM جديدة + RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل).
  32. في DIV 15 ، قم بتغيير الوسيط إلى NIM: قاعدة وسيط التمايز العصبي (NDM) (الجدول 1) (50٪: 50٪) مع RA (1 ميكرومتر) + PMN (1 ميكرومتر) + ASAC (0.4 ميكروغرام / مل) + الملحق B (50x) + BDNF (10 نانوغرام / مل) + التغذية العصبية المشتقة من خط الخلايا الدبقية (GDNF) (10 نانوغرام / مل) + عامل النمو الشبيه بالأنسولين 1 (IGF-1) (10 نانوغرام / مل) + عامل التغذية العصبية الهدبي (CNTF) (10 نانوغرام / مل). التغيير مع وسائل الإعلام الجديدة كل يوم.
  33. في DIV 21 ، قم بتغيير الوسيط إلى قاعدة NDM (100٪) المكملة كما في الخطوة 5.32 ، وقم بالتغيير باستخدام وسيط جديد كل يوم.
  34. في DIV 25-30 ، اجمع NPC وقم إما بتجميدها أو تمريرها إلى لوحة 10 سم للتمايز النهائي.
  35. شطف قارورة T-25 مع PBS وإضافة 0.05 ٪ التربسين.
  36. احتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  37. شطف التربسين والخلايا مع قاعدة NDM ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف مثبط التربسين بنسبة مناسبة إلى التربسين وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  38. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام الخلايا العصبية الحركية أو وسط تمايز الخلايا النجمية (الجدول 1) واستخدم ماصة 1000 ميكرولتر للسحن لأعلى ولأسفل للحصول على تعليق خلية واحدة (عادة ما يصل إلى 5 مرات).
  39. عد الخلايا وانقلها إلى صفيحة مطلية بطول 10 سم كما هو موضح في القسم 6 ، باستخدام إما وسائط التمايز + Rock-I ، للتمييز بين hiPSC-MN و hiPSC-A.
  40. بدلا من ذلك ، قم بتجميد الثقافات عن طريق إعادة التعليق في وسط تجميد يتكون من 90٪ وسط NDM مع عوامل نمو (كما في الخطوات 5.32-5.33) و 10٪ DMSO ، وسحن بالمثل ، ثم انقله إلى أنبوب التبريد. القسمة 6 × 106 NPC لكل أنبوب تبريد.

6. ذوبان ثقافات NPC

  1. قم بتغطية ألواح 10 سم بالبولي أورنيثين (PLO) واللامينين في اليوم السابق لإذابة الخلايا.
    1. أضف 5 مل من PLO المخفف إلى 100 ميكروغرام / مل في PBS أو الماء المقطر (dH2O) إلى الأطباق. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة حتى ليلة وضحاها.
    2. نضح محلول PLO وشطف الألواح ثلاث مرات باستخدام PBS. (PLO سامة إذا لم يتم غسلها بشكل صحيح.)
    3. أضف laminin المخفف في PBS إلى تركيز 10 ميكروغرام / مل إلى الألواح المطلية ب PLO. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة ، ويفضل بين عشية وضحاها. بعد الحضانة ، استنشاق محلول laminin دون شطف لتعزيز التصاق الخلايا.
      ملاحظة: يمكن طلاء الألواح ب PLO مسبقا ، وغسلها ثلاث مرات بالماء ، وتجفيفها في غطاء معقم ، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  2. قم بإذابة قارورة واحدة من NPC (أي DIV 25 أو 30) تحتوي على 6 × 106 خلايا / قارورة لكل لوحة زراعة خلايا 10 سم.
  3. قم بإزالة أنبوب التبريد NPC من النيتروجين السائل وضعه على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 دقيقة. قم بإذابة الثلج بسرعة عن طريق هز القارورة حتى تكون هناك قطعة ثلج صغيرة محاطة بالسائل.
  4. نقل مجاميع الخلايا إلى مخروطي 15 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر وإضافة ما يصل إلى 15 مل من NDM الذي تم تسخينه مسبقا أو وسيط النسور المعدل من Dulbecco (DMEM) / ملحق F21 F12 من Ham لتخفيف DMSO.
  5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية إما باستخدام وسيط تمايز الخلايا النجمية أو MN (الجدول 1) + ROCK-I (20 ميكرومتر) واستخدم ماصة 1000 ميكرولتر للسحن لأعلى ولأسفل حتى يتم الحصول على تعليق خلية واحدة (حتى 5 مرات).
  7. انقل التعليق أحادي الخلية إلى صفيحة 10 سم مطلية ب PLO-Laminin.
  8. انقل اللوحة إلى حاضنة واتركها دون إزعاج طوال الليل للسماح بالالتصاق السليم للخلايا.

7. التفريق بين الحبل الشوكي NPC إلى الخلايا العصبية الحركية

  1. نفذ الخطوات الأولية كما هو مذكور في الخطوات 6.1-6.8 ، مع كون الوسيط النهائي هو وسيط التمايز MN + ROCK-I (20 ميكرومتر).
  2. في اليوم التالي للطلاء ، قم بإجراء تبادل كامل للوسيط مع وسيط تمايز MN بدون ROCK-I ، ثم قم بتغيير الوسائط كل يوم. خلال عطلة نهاية الأسبوع ، قم بتغذية الخلايا يوم الجمعة ثم مرة أخرى يوم الاثنين. شطف الخلايا مع PBS عند الحاجة لإزالة حطام الخلية.
  3. قم بتغيير الوسط باستخدام وسط تمايز MN + سيتوزين أرابينوسيد (ARA-C) (0.02 ميكرومتر) واحتضان لمدة 48 ساعة عندما تظهر الأسلاف الدبقية الملتزمة كخلايا مسطحة مفردة تتكاثر تحت أسلاف MN بعد الانقسام المجمعة في مجموعات الخلايا.
    ملاحظة: عادة ، يحدث هذا خلال أول 7 أيام بعد الطلاء الأولي ، على الرغم من أنه قد يكون هناك تباين اعتمادا على خط الخلية.
  4. بعد 48 ساعة ، استنشق الوسط الذي يحتوي على ARA-C ، وشطف الثقافات برفق باستخدام PBS ثلاث مرات ، وقم بتغيير الوسط إلى وسط MN طازج بدون ARA-C.
  5. بعد العلاج باستخدام ARA-C ، قم بإجراء عمليات تبادل متوسطة كل يوم (أو الاثنين والأربعاء والجمعة) عن طريق إزالة الوسيط القديم باستخدام ماصة يدوية بدلا من شفاط فراغ لمنع الانفصال المبكر للمجموعات العصبية. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإثراء وسط MN ب Laminin 1 ميكروغرام / مل مرة واحدة في الأسبوع لزيادة تعزيز الارتباط العصبي بألواح الثقافة.

8. التفريق بين NPC والخلايا النجمية في الحبل الشوكي

  1. ذوبان ثقافات NPC كما في القسم 6 ، باستخدام وسط تمايز الخلايا النجمية (الجدول 1) مع إضافة مصل الأبقار الجنينية (FBS) بحجم تركيز الحجم 1٪ (NS + 1٪ FBS) وكذلك ROCK-I (20 ميكرومتر) للطلاء.
    ملاحظة: يمكن استبدال السيروم المتوفر تجاريا (الجدول 1) ب FBS باستخدام نفس عوامل التخفيف.
  2. في اليوم التالي للطلاء ، قم بتغيير وسيط الاستزراع باستخدام NS + 1٪ FBS بدون مثبط ROCK ، ثم قم بتغيير الوسيط كل يوم. خلال عطلات نهاية الأسبوع ، قم بتغذية الخلايا يوم الجمعة ثم مرة أخرى يوم الاثنين. شطف الخلايا مع PBS عند الحاجة لإزالة حطام الخلية. إذا استمرت الخلايا في الموت ، فقم بتكملة الوسائط باستخدام ROCK-I (10 ميكرومتر) لتعزيز بقاء الخلية. كن حذرا من عدم استخدام ROCK-I كثيرا أو لفترة طويلة جدا ، نظرا لإمكانية اختيار الخلايا الخالدة.
  3. اسمح للخلايا النجمية أن تصبح متقاربة قبل تمريرها.
    ملاحظة: سيزداد حجم الخلية بمرور الوقت ، لذلك لا يوجد رقم محدد للمرور. نسبة النجاح النموذجية هي 1: 2 أو 1: 3. في حالة ضعف البقاء على قيد الحياة أو الانتقال إلى عدد كبير جدا من الأطباق ، ادمج لوحين (أو أكثر ، حسب الحاجة) بطول 10 سم مع لوحة واحدة مقاس 10 سم للحفاظ على التقاء.
  4. لتمرير مزارع السلف النجمي ، اغسل الألواح مرة واحدة باستخدام PBS (لإزالة FBS) ، واحتضان 0.05٪ تربسين لمدة 5 دقائق ، واجمع الخلايا في NS medium + 1٪ FBS (FBS سوف يعطل التربسين) ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. استنشاق المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في NS المتوسطة + 1 ٪ FBS ، ثم سحن إلى تعليق خلية واحدة. توزيع الخلايا في NS + 1٪ FBS على لوحات جديدة 10 سم.
    ملاحظة: بالإضافة إلى توسيع ثقافات الخلايا النجمية ، فإن التمرير المتكرر للصفائح يخدم غرض قتل أي خلايا سلفية متبقية اختارت مصيرا عصبيا. لذلك ، حتى لو لم يكن هناك معدل انقسامي مرتفع للغاية ، يمكن تمرير الألواح بنسبة 1: 1 إذا بدا أن هناك تلوثا عصبيا.
  5. تغيير الطلاء على مدار التمايز لتعزيز العائد على النحو التالي.
    1. قم بلوحة ثقافات NPC المذابة في البداية والممرات الأولى بعد الطلاء الأولي على PLO / Laminin.
    2. لوحة الخلايا النجمية غير الناضجة على لوحات مغلفة مصفوفة الغشاء القاعدي.
    3. صفيحة الخلايا النجمية الأكثر نضجا (أي بعد اليوم 90) إما على مصفوفة الغشاء القاعدي ، أو الألواح المطلية ب PLO / Laminin (عادة للثقافة المشتركة مع الخلايا العصبية) ، أو على لوحات غير مطلية.
  6. قم بتجميد أسلاف الخلايا النجمية في أي وقت خلال فترة النضج البالغة 60 يوما لمزامنة الثقافات أو حفظها للتجارب اللاحقة. عند الذوبان بعد مرحلة NPC ، قم بإذابة أسلاف الخلايا النجمية على الألواح المطلية بمصفوفة الغشاء القاعدي بدلا من PLO / Laminin.
  7. في DIV 90 وما بعده ، قم بتبديل الوسيط من NS + 1٪ FBS إلى NS + 5٪ FBS لتعزيز بقاء الخلايا النجمية وتقليل انتشارها.

9. الاستزراع المشترك MN والخلايا النجمية للحبل الشوكي في لوحات صفيف متعددة الأقطاب الكهربائية

  1. قم بتمييز ولوحة الخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية عندما تكون جاهزة للاستخدام في نفس اليوم وعمرها إلى DIV 60 للخلايا العصبية الحركية و DIV 90 للخلايا النجمية.
  2. قم بتغطية ألواح MEA في اليوم السابق أو في يوم الطلاء على النحو التالي إذا كنت تعمل بألواح بلاستيكية ذات 24 بئرا (جدول المواد).
  3. تمييع PLO في الماء أو PBS إلى 100 ميكروغرام / مل.
    1. أضف 15-20 ميكرولتر إلى كل بئر (يعتمد على مستوى راحة الماصة) ، مما يشكل قطرة في مركز البئر تغطي منطقة الأقطاب الكهربائية والمنطقة المحيطة بها ولكن ليس كامل البئر.
    2. احرص على عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة. كن متسقا مع الحجم من بئر إلى بئر لضمان تغطية نفس مساحة السطح في كل بئر.
    3. احتضان PLO عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة (يفضل 2 ساعة).
      ملاحظة: سوف تجف الأحجام الصغيرة إذا لم تكن هناك رطوبة كافية في الألواح. أضف الماء إلى المقصورات المحيطة بالآبار لضمان رطوبة كافية طوال فترة الطلاء والتسجيلات.
  4. نضح أكبر قدر ممكن من PLO باستخدام طرف ماصة بلاستيكية. احرص على عدم لمس الأقطاب الكهربائية. يغسل مع 250 ميكرولتر من الماء ثلاث مرات. في حالة استخدام شفاط فراغ للغسيل ، لا تسمح للطرف بالقرب من مجموعة القطب. بعد الغسيل الثالث ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الماء ، باستخدام طرف ماصة حسب الضرورة. دع السطح يجف تحت غطاء زراعة الخلية مع إزالة الغطاء.
  5. بمجرد أن تجف أسطح الألواح ، أضف Laminin المخفف إلى 10 ميكروغرام / مل في PBS. استخدم 15-20 ميكرولتر لتغطية كل مجموعة قطب كهربائي. أضف الماء إلى حجرات الرطوبة ، واستبدل الغطاء ، وأعد اللوحة إلى حضانة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة حتى ليلة وضحاها.
  6. في يوم الطلاء ، اشطف مزارع MN والخلايا النجمية مرة واحدة باستخدام PBS وأضف التربسين 0.05٪ عند 37 درجة مئوية لرفع الخلايا (5 دقائق). اجمعها في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على مثبط التربسين وغسل الألواح ذات الوسط أو القاعدة لضمان جمع جميع الخلايا. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وإعادة تعليقه باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لتوليد 1 مل من تعليق خلية واحدة. عند إعادة تعليق MN والخلايا النجمية ، قم بالتبديل إلى وسيط الاستزراع المشترك (الجدول 1) ، مع إضافة 20 ميكرومتر ROCK-I.
  7. عد MN والخلايا النجمية بالتوازي باستخدام مقياس الدم. أثناء العد وإجراء العمليات الحسابية ، قم بتغطية معلقات الخلية وضعها في رف الستايروفوم عند 4 درجات مئوية.
  8. احسب الحجم المطلوب لإعادة تعليق المزارع إلى تركيز 5 × 10 4 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا العصبية الحركية و 2.5 × 104 خلايا لكل 5 ميكرولتر للخلايا النجمية. قم بالطرد المركزي لمعلقات الخلايا سعة 1 مل عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها في الحجم المحسوب.
  9. احسب عدد الآبار المرغوبة المراد بذرها واضربها في 5 ميكرولتر من كل تعليق خلوي. اجمع الحجم المطلوب من معلقات الخلايا العصبية والخلايا النجمية بنسبة 1: 1 واخلطها عن طريق السحب حتى تمتزج تماما (عادة مرتين) ، ولكن تجنب أن تكون عدوانيا جدا.
  10. قم بإزالة Laminin من كل بئر من لوحة MEA باستخدام طرف ماصة. انقل 10 ميكرولتر من معلق الخلية المدمج النهائي إلى كل بئر ، مكونا قطرة صغيرة تغطي مجموعة الأقطاب الكهربائية لتوفير كثافة خلية تبلغ 5 × 10 4 MN و 2.5 × 104 خلايا نجمية لكل بئر.
    ملاحظة: تتطلب الكثافة العالية للخلايا في التعليق المشترك إعادة تعليق متكررة بين الآبار أثناء خطوة البذر لضمان عدد خلايا دقيق ومتسق.
  11. أعد اللوحات إلى الحاضنة لمدة 20-30 دقيقة. احرص على عدم إزعاج قطرة الخلية والسماح للخلايا بتكوين مرفقات أولية على الألواح.
  12. بعد 20-30 دقيقة ، أضف وسائط الاستزراع المشترك الدافئة + ROCK-I إلى كل بئر عن طريق سحب 250 ميكرولتر لأسفل على جدار كل بئر ، متبوعا ب 250 ميكرولتر إضافية أسفل جدار نفس البئر على الجانب الآخر. أعد اللوحة إلى الحاضنة.
  13. افحص الأطباق في اليوم التالي للبذر (يوم الاستزراع المشترك 1). إذا كان هناك حطام خلوي كبير أو خلايا ميتة ، فاستبدل الوسط بوسط زراعة مشترك جديد يحتوي على ROCK-I. خلاف ذلك ، قم بتغيير الوسيط في اليوم الثاني بعد البذر (يوم الاستزراع المشترك 2) إلى وسيط الاستزراع المشترك بدون ROCK-I. قم بإجراء تبادلات نصف متوسطة (نضح 50٪ وإضافة 60٪ من الحجم النهائي لحساب التبخر) مرتين في الأسبوع.
  14. في حالة استخدام أنظمة MEA مع ألواح زجاجية أحادية البئر مقاس 30 مم (جدول المواد) ، فقد يستغرق إعداد اللوحة 2 يوما أو أكثر. اتبع الخطوات أدناه لتنفيذ ذلك.
  15. ارفع الخلايا وحطام الخلايا من مزارع MEA السابقة باستخدام 0.05٪ تربسين لمدة 5-15 دقيقة.
  16. نضح التربسين وشطف ثلاث مرات بالماء.
  17. تعقيم بإضافة 70 ٪ من الإيثانول واحتضان في غطاء المحرك لمدة 10 دقائق. نضح الإيثانول ، ثم شطف بالماء ثلاث مرات.
  18. ضع 1٪ منظف أنيوني مع إنزيم البروتياز في الماء. قم بتغطية الألواح بغطاء ولفها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم ، ثم اتركها على الروك في درجة حرارة الغرفة طوال الليل.
  19. نضح المنظف ، ثم اشطفه ثلاث مرات بالماء.
  20. إذا كنت تخطط لتخزين الألواح ، أضف كمية كافية من الماء. قم بتغطية الألواح بغطاء ولفها بغشاء لدن بالحرارة ورقائق الألومنيوم ، واتركها في الثلاجة حتى الاستخدام التالي.
  21. إذا كنت تخطط للطلاء ، اترك السطح يجف تحت غطاء زراعة الخلية.
  22. إذا كانت هناك حاجة إلى تعقيم إضافي (على سبيل المثال ، عدوى سابقة أو استخدام غير حديث) ، في هذه المرحلة فقط ، قم بتعريض ألواح MEA للأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت الغطاء لمدة 30-60 دقيقة.
    ملاحظة: تجنب الأشعة فوق البنفسجية المتكررة سيمنع تلف الأقطاب الكهربائية. سيؤدي استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية عندما تحتوي الألواح على مصل عليها إلى أقطاب كهربائية غير وظيفية ، ولهذا السبب يجب استخدامه فقط على الألواح النظيفة.
  23. عندما تجف الألواح تماما ، تابع تنظيف البلازما لمدة 1 دقيقة لشحن السطح الزجاجي لألواح MEA وتعزيز فعالية الطلاء. تنظيف البلازما مرة واحدة على الأقل كل 4-5 دورات من دورات طلاء وتنظيف الألواح MEA.
    1. كبديل ، عندما يكون تنظيف البلازما غير ممكن أو غير مبرر ، أضف كمية كافية من الوسط المحتوي على FBS لتغطية سطح ألواح MEA وإعادتها إلى الحاضنة طوال الليل.
  24. استخدم طلاء PLO / Laminin كما هو موضح أعلاه في القسم 6. أضف محلول PLO (100 ميكروغرام في PBS) مباشرة بعد تنظيف البلازما أو استنشاق وشطف الوسط المحتوي على FBS.
  25. قم بصفيحة الخلايا على النحو الوارد أعلاه بالكثافات التالية: 1 × 10 5 hiPSC-A / لوحة و5 × 105 hiPSC-MN / لوحة.

10. تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية

  1. استخرج بيانات الجهد الخام بتردد أخذ عينات 12.5 كيلو هرتز ، باستخدام مرشح Butterworth مع مرشح تمرير عالي 200 هرتز ومرشح تمرير منخفض 3 كيلو هرتز. قم بتعيين التعرف على الارتفاع كنقاط زمنية فورية للجهد ≥6 انحرافات معيارية عن خط الأساس. حدد الرشقات النارية كنشاط مع >5 طفرات في 100 مللي ثانية. حدد نشاط الشبكة عندما يتم تشغيل أكثر من 35٪ من إجمالي الأقطاب الكهربائية النشطة في غضون 100 مللي ثانية بحد أدنى 50 طفلا لكل انفجار شبكة.
  2. ابدأ التسجيل في أقرب وقت ممكن بعد يوم الثقافة المشتركة (CC) 1.
    ملاحظة: نادرا ما يتم ملاحظة النشاط الكهربائي قبل CC Day 3.
  3. مزارع الصفائح المتوازية بكثافات مماثلة وتتكرر في ألواح الاستزراع المناسبة أو أغطية المقايسات البيوكيميائية أو الكيمياء المناعية (ICC) أو qPCR.
  4. قم بإجراء التسجيلات مع ضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية وCO 2 بنسبة 5٪. انقل اللوحات إلى الجهاز واسمح لها بالتوازن لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
  5. سجل نشاط خط الأساس إما كل يومين أو أسبوعيا ، على مدار 1-15 دقيقة اعتمادا على التصميم التجريبي. لا تسجل لمدة 1 ساعة على الأقل بعد تبادل متوسط ، وانتظر بشكل مثالي لمدة 24 ساعة بعد كل تبادل وسائط.
  6. لمنع التلوث ، قم بتغيير الوسيط (أي نصف التبادل المتوسط كما في الخطوة 9.14) بعد أي تسجيل يجب فيه فتح غطاء اللوحة المعقمة خارج الغطاء المعقم (أي تطبيق مركبات الدواء). قم بإجراء عمليات تبادل متوسطة كاملة وغسالات لغسل الأدوية إذا استمر استخدام الأطباق بعد العلاج بالعقاقير.
  7. لأغراض التحليل ، استخدم ما لا يقل عن ثلاث نسخ مكررة تقنية وبيولوجية لكل حالة. التعبير عن البيانات الكهربية كوسيلة لتكرار n ≥ 3.

11. المقايسات الدوائية على مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية

  1. استخدم مجموعة مختلفة من الثقافات المشتركة اعتمادا على السؤال التجريبي: الخلايا العصبية ALS مع الخلايا النجمية الضابطة ، الخلايا العصبية الضابطة مع الخلايا النجمية ALS ، الخلايا العصبية ALS والخلايا النجمية ، الخلايا العصبية الضابطة والخلايا النجمية.
  2. عند التحقيق في التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية العابرة للمركبات التي تستهدف الخلايا العصبية أو الخلايا النجمية ، سجل نشاط خط الأساس لمدة لا تقل عن 1 دقيقة مع إزالة غطاء اللوحة ولكن غطاء الماكينة مغلق.
  3. افتح الغطاء يدويا للجهاز دون إيقاف التسجيل الفيزيولوجي الكهربي وتبادل 25 ميكرولتر من الوسط مع مركبة الدواء المناسبة (عادة ما تكون وسيطة جديدة) باستخدام ماصة متعددة القنوات في حالة معالجة آبار متعددة. أغلق الغطاء يدويا.
  4. سجل لمدة 1 دقيقة إضافية (أو أكثر إذا كانت هناك تغييرات كبيرة ناجمة عن السيارة تحتاج الثقافة إلى التعافي منها).
  5. افتح الغطاء يدويا مرة أخرى واستبدل 25 ميكرولتر من الوسط مع الدواء محل الاهتمام في نفس السيارة. أغلق غطاء الجهاز وتابع التسجيل.
    ملاحظة: قد تختلف مدة التسجيل وحجم الدواء / السيارة التي يتم إعطاؤها أو تحتاج إلى تحسين اعتمادا على السؤال التجريبي.
  6. لأغراض التحليل ، تأكد من أن إضافة السيارة لا تثير تغييرات كبيرة في المعلمات الكهربية. حساب النسبة المئوية للتغيرات في النشاط بعد الدواء مقارنة بعد إضافة السيارة والمقارنة بين الظروف.
  7. للتحقيق في التأثيرات الفيزيولوجية الكهربية الطولية ، مثل الأدوية المرشحة المعدلة للمرض ، سجل نشاط خط الأساس الموضح في الخطوة 11.2. لهذا ، استخدم إما وسيط الاستزراع المشترك الذي يحتوي على الدواء (الأدوية) ذات الأهمية في السيارة المناسبة أو الوسيط الذي يحتوي على السيارة فقط.
  8. لأغراض التحليل ، قارن تسجيلات النقطة الزمنية من ALS أو الثقافات المشتركة للتحكم التي تمت معالجتها طوليا بالأدوية مع بعضها البعض وظروف التحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم توضيح بروتوكول نمط الحبل الشوكي لتوليد hiPSC-MN و hiPSC-A في الحبل الشوكي في الشكل 1. في هذا البروتوكول ، يتم الحفاظ على hiPSCs وتمريرها كمستعمرات غير متقاربة (الشكل 2 أ). يبدأ تكوين الخلايا العصبية (الحث العصبي) من خلال تثبيط SMAD المزدوج عن طريق إضافة LDN193189 و SB431542 ، مما يؤدي إلى تعطيل البروتين المورفولوجي العظمي (BMP) ومسارات عامل النمو المحول بيتا (TGF-β) ، على التوالي. يتم استخدام طريقة قائمة على الطبقة الأحادية لهذه الخطوة حيث يتم طلاء hiPSC على مصفوفة ملتصقة ، أي مصفوفة الغشاء القاعدي ، لتوليد ثقافة 2D تشبه الظهارة العصبية. من الناحية الشكلية ، يتميز الحث العصبي بالانتقال من iPSC مع نوى كبيرة وشكل دائري إلى خلايا عصبية (جذعية) مضغوطة بإحكام ، مع سيتوبلازم كبير وشكل أسطواني. سوف تنقسم هذه الخلايا أفقيا وعموديا ، مما يولد ظهارة متعددة الطبقات (الشكل 2B ، i).

يعتمد تفضيل 2D ، على عكس الإستراتيجية ثلاثية الأبعاد (أي القائمة على الجسم الجنيني) ، على أدلة الأدبيات11،12 التي تشير إلى أن الأولى قد تعزز نمط الحبل الشوكي من خلال إدخال إشارات بيئية خارجية للخلايا13. ثم يتم تشكيل الخلايا الظهارية العصبية زمانيا ومكانيا لتوليد خلايا سلفية عصبية خاصة بالمنطقة ، أي الحبل الشوكي والخلايا السلفية العصبية (NPC) (الشكل 1). يتم استخدام اثنين من المورفوجينات الرئيسية لهذا الغرض: حمض الريتينويك ، الذي يحدد الذيلية ، والبورمورفامين ، وهو ناهض إشارات القنفذ ، والذي يسبب المواصفات البطنية. في غيابهم ، ستكون الهوية الإقليمية الجوهرية للخلية ل NPC هي المنضدة والظهرية14،15،16.

من DIV 15 إلى DIV 25-DIV 30 ، يتم تعزيز الهوية الإقليمية لهذه NPC من خلال استكمال الوسائط بالمورفوجينات. في الوقت نفسه ، فإن التعرض المبكر لعوامل نمو الخلايا العصبية والسيتوكين الدبقي مثل عامل التغذية العصبية الهدبية (CNTF) يولد مجموعة مختلطة من NPC (الشكل 2B ، ii). من الناحية الشكلية ، تكون هذه الخلايا أقل ضغطا من الخلايا الظهارية العصبية ، حيث تعرض عددا قليلا من العمليات القصيرة ، مرتبة في طبقة أحادية بعد تعطيل الظهارة العمودية بعد مرورها في DIV 12. عند النظر عن كثب ، فإن بعض هذه الخلايا ممدودة ، بينما يعرض البعض الآخر عمليات متعددة ، مما يشير إلى الالتزام المبكر تجاه مصير الخلايا العصبية مقابل المصير العصبي ، على التوالي.

ستخرج الخلايا العصبية تلقائيا من هذه المجموعة المختلطة ما لم يتم تنشيط المفتاح الدبقي (الشكل 1 والشكل 2B ، iii). ستؤدي إضافة مثبط مسار الشق ، المركب E ، إلى تعزيز تمايز MNالمنخفض 17. يتم دعم هوية الحبل الشوكي لهذه الخلايا بمستويات عالية من تعبير ChAT (الشكل 2C ، i). بالإضافة إلى ذلك ، فقد تبين سابقا2 أن مجموعة فرعية من هذه الخلايا العصبية الحركية هي أيضا ISL1 +.

يتم تحفيز تمايز الخلايا النجمية عن طريق التبديل الدبقي من خلال تنشيط مسار JAK / STAT (الشكل 1 والشكل 2B ، iv). يخدم CNTF والسيتوكينات الأخرى المحتملة الموجودة في مصل الأبقار الجنينية هذا الغرض في البروتوكول المقترح. الوقت هو عامل أساسي أيضا ، لأن التولد الدبقي سيتبع تلقائيا بعد تكوين الخلايا العصبية بسبب القرائن الجوهرية للخلية. بعد DIV 90 ، يعرض hiPSC-A نمطا ظاهريا ناضجا كما هو موضح في تعبير S100β و GFAP 2،11 ، في حين أن هويتهم الإقليمية للحبل الشوكي مدعومة بتعبير >90٪ من HOXB4 (الشكل 2C ، ii)2،11،14.

تتميز طريقة الاستزراع المشترك hiPSC-MN و hiPSC-A بالطلاء المتزامن لهذه الأنواع الفرعية من الخلايا على عكس التقنيات التي يتم فيها طلاء الخلايا العصبية بشكل متسلسل على قمة مزارع الخلايا النجمية. في هذه الثقافات المشتركة المتزامنة ، ستعيد الخلايا ترتيبها تلقائيا ، حيث تخلق الخلايا النجمية طبقة تغذية في الأسفل وتتصل الخلايا العصبية في الشبكات في الأعلى (الشكل 2C ، iii). أظهرت هذه الاستراتيجية سابقا2 للسماح بتوزيع أكثر اتساقا للخلايا العصبية من استراتيجيات الاستزراع المشترك الأخرى ، حيث تميل هذه الأنواع من الخلايا إلى التجمع.

يتم طلاء iPSC-MN البشري بمفرده أو في ثقافة مشتركة مع hiPSC-A على لوحة MEA ذات 24 بئرا (ن = 12 لكل حالة) ، حيث يحتوي كل بئر على 16 قطبا كهربائيا (الشكل 3 أ). يتم عرض صور تباين الطور إما للثقافات الأحادية أو المشتركة والمخططات النقطية لنشاط الارتفاع من بئرين تمثيليين (الشكل 3B ، C). يعزز iPSC-A البشري النضج الكهربي ل hiPSC-MN ، كما هو موضح بدرجات أعلى بكثير من نشاط الارتفاع والانفجار في الثقافات المشتركة (الشكل 3D). هذا يوازي تأثيرات hiPSC-A على النضج المورفولوجي والجزيئي ل hiPSC-MN الذي تم إثباته سابقا2.

يتم تفصيل بعض التحديات التقنية لهذا البروتوكول في تعليمات الفيديو ، حيث يتم عرض تقنيات الطلاء والتسجيل باستخدام منصات MEA بالإضافة إلى التسجيلات التمثيلية من هذه الثقافات.

Figure 1
الشكل 1: بروتوكول لتوليد الحبل الشوكي hiPSC-MN و hiPSC-A وثقافتهما المشتركة . (أ) الجدول الزمني لبروتوكول التمايز الذي يفصل المراحل الحرجة. في الإدراج ، ركز على بروتوكول 30 يوما لتوليد NPC للحبل الشوكي ، مع الإجراءات اليومية (وسيط التبادل E ، أو مرور P ، أو عدم الإجراء) ، وقاعدة زراعة الخلايا ، والمكملات (للحصول على معلومات إضافية حول التكوين ، انظر الجدول 1 وجدول المواد). (ب) يتم تمثيل الأنساب والالتزام بمصير الخلية بشكل تخطيطي. يتم إنشاء الثقافات المشتركة عندما يتم خلط hiPSC-MN الناضج (أي DIV 60) و hiPSC-A (أي DIV 90) ومطليه في وقت واحد. (رسم توضيحي تم إنشاؤه باستخدام BioRender). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: التغيرات المورفولوجية أثناء بروتوكول تمايز الحبل الشوكي. (أ) صور مجهر تباين الطور ل hiPSC. تظهر اللوحات (i) (طاقة أقل ، 10x) و (ii) (طاقة أعلى ، 20x) hiPSC طبيعي ، تظهر اللوحات (iii) (10x) و (iv) (20x) مستعمرة hiPSC متباينة. قضبان المقياس = 200 ميكرومتر و 50 ميكرومتر. (ب) صور مجهر تباين الطور التمثيلي للخلايا الظهارية العصبية في DIV 5 (i) ، و NPCs في DIV 21 (ii) ، والخلايا العصبية الحركية الناضجة DIV 60 (iii) و DIV 90 الخلايا النجمية (iv). قضبان المقياس = 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر (C) صور الكيمياء المناعية التمثيلية على 40x زيت hiPSC-MN (i) و hiPSC-A (ii) وثقافتهم المشتركة (iii). تم استهداف علامات النضج والعلامات الخاصة بالمنطقة. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: تسجيل صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية ل hiPSC-MN. (أ) خريطة حرارية لمتوسط نشاط الارتفاع من لوحة MEA واحدة (ن = 24 بئرا) عند DIV 18 بعد الطلاء. تمثل الآبار الموجودة في الصفين A و B (n = 12 بئرا / تكرارات تقنية) مزارع hiPSC-MN وحدها ، بينما تمثل الآبار الموجودة في الصفين C و D (n = 12 بئرا) مزارع مشتركة ل hiPSC-MN / hiPSC-A. (ب) صور تمثيلية لتباين الطور ل hiPSC-MN وحدها (MN) وفي الاستزراع المشترك مع hiPSC-A (MN + SCA) على لوحات MEA. تتجمع الخلايا العصبية في مجموعات خلايا كبيرة عند زراعتها بمفردها ، في حين أن الثقافة المشتركة ل hiPSC-MN مع hiPSC-A تؤدي إلى طبقات أحادية موزعة بالتساوي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (C) مخطط نقطي تمثيلي لنشاط الارتفاع على مدى 120 ثانية وقت تسجيل من بئر واحد مع hiPSC-MN وحده و hiPSC-MN في الاستزراع المشترك مع hiPSC-A. يتم تمييز نشاط انفجار الشبكة عبر جميع الأقطاب الكهربائية بصندوق أرجواني. (د) القياس الكمي ومقارنة نشاط الارتفاع والانفجار بين الخلايا العصبية وحدها والخلايا العصبية في الثقافة المشتركة مع الخلايا النجمية من لوحة MEA الموضحة في اللوحة A. (*** p < 0.001 ، **** p < 0.0001). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حتى الآن ، وجدت الطرق القائمة على hiPSC و MEA للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية للمزارع المشتركة بين الخلايا العصبية النجمية تطبيقا محدودا في مجال ALS6 ولا تزال غير موجودة في المنصات البشرية بالكامل ، على عكس استخدامها الأكثر انتشارا للنمذجة المختبرية للصرع9. ومع ذلك ، فإن هذه المنصة لديها القدرة على معالجة الأسئلة ذات الصلة من الناحية الفيزيولوجية المرضية في أبحاث ALS ، مثل آليات فرط الاستثارة العصبية ، أو مساهمة الخلايا النجمية في السمية العصبية ، أو دور نشاط الشبكة في تطور المرض. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه المنصة بجمع البيانات الفيزيولوجية الكهربية المحتملة لأكثر من 9 أشهر في المختبر ، وبالتالي ، توفر نهجا لاختبار المركبات ذات الإمكانات العلاجية2.

تختلف بروتوكولات توليد hiPSC-N و hiPSC-A الموجودة في الأدبيات اختلافا كبيرا فيما يتعلق بظروف الوسائط ، وتوقيت الثقافات ، والمحصول ، وملامح النضج ، من بين عوامل أخرى. تتمثل الميزة الرئيسية للمنصة المقترحة في أن الخلايا النجمية والخلايا العصبية يتم تمييزها بشكل منفصل وزراعتها معا في نقاط زمنية لاحقة عن طريق طلاء نوعي الخلايا في وقت واحد. بعد تحسين كثافة الخلايا وتوقيتها ، يمكن ترجمة هذه الطريقة لاستخدامها مع أنواع الخلايا المشتقة من بروتوكولات أخرى أيضا ، بما في ذلك الخلايا الأخرى الخاصة بالمنطقة.

أهم ما في المنصة المقترحة هو المواصفات الإقليمية للخلايا العصبية الحركية والخلايا النجمية. في حين أن البروتوكول المقترح خاص بالحبل الشوكي في قدرته على توليد الخلايا النجمية ChAT + MN و HOXB4 + ، يمكن استخدام تقنيات التمايز الراسخة لتوليد الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC والخلايا النجمية التي تعرض هويات قشرية ، مثل الخلايا العصبية الحركية القشرية CTIP2 + طبقة V 18 والخلايا النجمية للدماغ الأماميOTX2 + 14 . وبالتالي ، فإن المنصة المقترحة لديها القدرة على نمذجة الدوائر العصبية للقشرة والحبل الشوكي ، وكذلك اتصالاتها.

تتوفر أنظمة متعددة لتسجيل MEA. تم تفضيل لوحات MEA البلاستيكية ذات 24 بئرا مع 16 قطبا كهربائيا لكل بئر مع CO2 والتحكم في درجة الحرارة للدراسة. هذه المنصة مناسبة بشكل خاص للفحص عالي الإنتاجية بدلا من الأنظمة القائمة على تسجيلات البئر المفردة. القيد الرئيسي للألواح البلاستيكية هو أن السطح قد يكون أكثر عرضة للتدهور على الاستخدامات المتكررة. تتميز الأنظمة القائمة على لوحات MEA الزجاجية بميزة كونها قابلة لإعادة الاستخدام عدة مرات بعد المعالجات المناسبة كما هو موضح أعلاه (حتى 20 مرة) ، دون خسارة كبيرة في جودة تسجيل البيانات. ومع ذلك ، فإن هذه العلاجات وطرق الطلاء تستغرق وقتا أطول وتمثل تحديا تقنيا ، نظرا للسطح الكارهة للماء لهذه الألواح.

تتمثل إحدى العقبات الرئيسية للطرق القائمة على iPSC و MEA للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي في تباين النتائج التجريبية وإمكانية استنساخها. تظهر الدراسات السابقة أن نشاط الخلايا العصبية MEA يعتمد على النضج الذي يتأثر بعوامل متعددة ، بما في ذلك ، على سبيل المثال لا الحصر ، تقنيات التمايز المناسبة المستخدمة في توليد كل من الخلايا النجمية والخلايا العصبية ، وكثافة الخلايا العصبية ، ونسبة الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية خلال التمايز والنضج ، وتسلسل الخلايا النجمية والثقافات العصبية المشتركة2 . يعد توحيد هذه المتغيرات على النحو المقترح في هذا البروتوكول إحدى الطرق لضمان قابلية الاستنساخ. إن اختيار أنظمة MEA متعددة الآبار التي تولد بيانات عالية الإنتاجية سيأخذ في الاعتبار التباين التجريبي. إذا كان النشاط الفيزيولوجي الكهربي للثقافة أقل مما هو متوقع في نقطة زمنية معينة ، فمن المهم تحديد حدوث تمايز ناجح وأن الثقافات الشقيقة التي يمكن تحليلها كيميائيا مناعيا أو كيميائيا حيويا مفيدة. بالنظر إلى أن حجما صغيرا جدا من الخلايا يتم بذره في البداية ، يمكن أن تؤدي أخطاء السحب الصغيرة إلى تغييرات كبيرة نسبيا في أعداد الخلايا ، وبالتالي الكثافة. من المهم أيضا استخدام لوحات MEA التي تسمح بالتصور المباشر وتقييم كثافة الخلايا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذه المخطوطة بما يلي: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH / NINDS (CWH) ، 2020 جائزة التطوير الوظيفي للعلماء السريريين لمؤسسة دوريس ديوك الخيرية (CWH). 1R01NS117604-01NIH / NINDS (NJM) ، DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM) ، 2019 MSCRFD 5122 (NJM). نشكر الدكتورة رها دستغيب والدكتور نورمان هوغي على توفير منصة MEA وبرامج تحليل البيانات التي استخدمناها للتحقق من صحة منصة الفيزيولوجيا الكهربية الموصوفة. نود أن نشكر خليل روست على مساعدتهم في عرض البروتوكول والتصوير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 174 ، مجموعة متعددة الأقطاب الكهربائية ، التسجيل خارج الخلية ، الفحص ، الفحص ، الحبل الشوكي ، الخلايا الدبقية ، الخلايا العصبية الحركية ، التصلب الجانبي الضموري ، hiPSC ، مرض الخلايا العصبية الحركية ، نمذجة المرض
إنشاء منصة فيزيولوجية كهربية لنمذجة ALS مع الخلايا النجمية والخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الخاصة بالمنطقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter