Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Etablering af en elektrofysiologisk platform til modellering af ALS med regionalt specifikke humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter og neuroner

Published: August 26, 2021 doi: 10.3791/62726
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Johns Hopkins University
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en metode til differentiering af rygmarvsinducerede pluripotent-afledte astrocytter og neuroner og deres samkultur til elektrofysiologisk registrering.

Abstract

Humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter (hiPSC-A) og neuroner (hiPSC-N) giver et kraftfuldt værktøj til modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) patofysiologi in vitro. Multi-electrode array (MEA) optagelser er et middel til at registrere elektriske feltpotentialer fra store populationer af neuroner og analysere netværksaktivitet over tid. Det blev tidligere påvist, at tilstedeværelsen af hiPSC-A, der differentieres ved hjælp af teknikker til fremme af en rygmarvsastrocytfænotype, forbedrede modning og elektrofysiologisk aktivitet af regionalt specifikke rygmarvshiPSC-motorneuroner (MN) sammenlignet med dem, der dyrkes uden hiPSC-A eller i nærvær af gnaverastrocytter. Her beskrives en metode til samdyrkning af rygmarvs-hiPSC-A med hiPSC-MN og registrering af elektrofysiologisk aktivitet ved hjælp af MEA-optagelser. Mens differentieringsprotokollerne beskrevet her er specifikke for astrocytter og neuroner, der er regionalt specifikke for rygmarven, kan co-culturing platformen anvendes på astrocytter og neuroner differentieret med teknikker, der er specifikke for andre skæbner, herunder kortikal hiPSC-A og hiPSC-N. Disse protokoller sigter mod at tilvejebringe et elektrofysiologisk assay for at informere om glia-neuroninteraktioner og give en platform til test af lægemidler med terapeutisk potentiale i ALS.

Introduction

Humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter (hiPSC-A) og neuroner (hiPSC-N) er kraftfulde værktøjer til modellering af amyotrofisk lateral sklerose (ALS) patofysiologi in vitro og giver et translationelt paradigme for lægemiddelopdagelsesstrategier1. Forskere har vist, at co-kulturen af hiPSC-A med hiPSC-N forbedrer den morfologiske, molekylære, elektrofysiologiske og farmakologiske modning af begge celletyper, hvilket genererer komplekse neuronale netværk og astrocyt-neuron-interaktioner, der ligner deres in vivo-modstykker 2,3. Lignende co-kultur eksperimenter kan rekapitulere kendetegn ved ALS patobiologi såsom astrocyt-medieret neurotoksicitet 4,5 og neuronal hyper-excitabilitet6. Derudover kan humane inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) med fremskridt inden for differentieringsprotokoller differentieres i regionalt specifikke neurale undertyper, herunder kortikale og rygmarvs-hiPSC-A og hiPSC-N 7,8. Disse strategier giver mulighed for modellering af kortikal og spinal motor neuron patologi i ALS samt den astrocytiske indflydelse på begge. Dette kræver imidlertid, at der er et reproducerbart funktionelt assay til bestemmelse af disse virkninger.

For nylig blev det vist, at multi-electrode array (MEA) optagelse er særligt velegnet til elektrofysiologisk karakterisering af neuron-astrocyt co-kulturer2. I modsætning til enkeltcellede elektrofysiologiske analyser registrerer disse elektrodearrayer med høj densitet passivt ekstracellulære feltpotentialer fra store populationer af neuroner uden at forstyrre dyrkningsforholdene og bevare cellemembranernes integritet. Disse platforme er særligt nyttige til registrering af kulturers cellulære og netværksaktivitet over tid og som reaktion på farmakologisk manipulation. Endelig, når tilstedeværelsen af astrocytter er en kulturvariabel, kan MEA-optagelser give funktionel indsigt i astrocyt-neuron tovejsinteraktioner 2,9.

Her præsenteres en optimeret protokol til differentiering af hiPSC i rygmarv hiPSC-A og hiPSC-motorneuroner (MN), der tidligere er valideret2. Rygmarven hiPSC-A-differentieringsprotokollen resulterer konsekvent i astrocytkulturer, som er positive for S100 calciumbindende protein B (S100β), glialfibrillært surt protein (GFAP) og Homeobox B4 (HOXB4) i op til henholdsvis 80%, 50% og 90% af cellerne, hvilket indikerer en modning af glia- og rygmarvsspecifikation 2,10 . HiPSC-MN-differentieringsprotokollen genererer neuroner, der er >90% positive for cholinacetyltransferase (ChAT), hvilket tyder på en moden alfa-motorisk neuronidentitet2. Derudover beskriver protokollen teknikker til generering af hiPSC-A / MN-cokulturer, der tidligere har vist sig at resultere i neuroner med forbedret morfologisk kompleksitet ved Scholl-analyse og immunofluorescerende mikroskopi sammenlignet med neuronale kulturer uden astrocytter eller med gnaverastrocytter2. Mens disse beskrivelser er specifikke for rygmarv hiPSC-A og hiPSC-N, er en unik fordel, at den oprindelige uafhængige kultur af astrocytter og neuroner efterfulgt af trin til co-kultur på senere tidspunkter kan oversættes til at studere virkningerne af neuron-astrocytinteraktioner fra andre specifikke regioner såvel som sygdomsspecifikke celler 7,8 . Endelig beskriver protokollen, hvordan man dyrker disse kulturer på MEA-plader, så funktionel aktivitet som en faktor for co-kultursammensætning kan studeres over tid med evnen til at manipulere cellulær sammensætning såvel som kulturbetingelser.

Målet med disse protokoller er at tilvejebringe et funktionelt assay til at undersøge astrocyt-neuron-interaktioner, undersøge sygdomsspecifikke ændringer og teste lægemidler med terapeutisk potentiale inden for ALS. Videoinstruktioner leveres til de mest udfordrende trin i denne protokol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse af cellekulturmedier

  1. De enkelte cellekulturmedier fremstilles ved hjælp af sammensætningerne nævnt i tabel 1.
  2. Bland og sterilfiltrer mediet i 500 ml filtrerede flasker, og opbevar beskyttet mod lys ved 4 °C i op til 2 uger.

2. Vedligeholdelse og overførsel af ikke-sammenflydende humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSC)

  1. Optø kældermembranmatrixen (opbevaret i alikvoter ved -80 °C) i et køleskab på 2-8 °C natten over.
  2. Fortynd kældermembranmatrixen ved 1:100 (v / v) i koldt fosfatbufret saltvand (PBS) eller Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM).
  3. Der tilsættes tilstrækkelig kældermembranmatrix til at belægge bunden af vævskulturpladen (5 ml for en 10 cm plade, 2 ml for enkeltbrønde med 6-brøndsplade) og inkuberes ved 37 °C i mindst 30 minutter natten over eller ved stuetemperatur i mindst 1 time.
  4. Opsug den fortyndede kældermembranmatrix og vask pladen en gang med PBS, før du tilføjer dyrkningsmedier og såceller.
  5. Undersøg pladerne dagligt for at bestemme og forudse, hvornår de er klar til at blive passeret. Passageplader af hiPSC, når størstedelen af kolonierne er blevet tilstrækkeligt tætte, så koloniernes centrum viser spredte hvide områder. Lad ikke pladerne modnes forbi dette punkt. Det vil forårsage overskydende differentiering, der fører til udseendet af et gult område i midten af kolonierne på grund af celle flerlag, overflod af aflange celler i kanterne, løs kompakthed inden for kolonier eller øget celledød.
  6. På passagedagen skal du tegne gitterlinjer på pladernes nederste ydre overflade med en markør for at lette nøjagtig dækning af hele pladen.
  7. Fjern differentierede kolonier i en kulturhætte ved hjælp af et fasekontrastmikroskop (10x forstørrelse), skrab manuelt med en 200 μL pipettespids.
  8. Pladerne skylles to gange med PBS (5 ml pr. vask for plader på 10 cm).
  9. Tilsæt 5 ml forvarmet vævsdissociationsprotease (materialetabel) og inkuber cellerne ved 37 °C, indtil koloniernes kanter begynder at runde op (4-7 min), men inden kolonierne løfter sig fra pladen.
  10. Suspirer forsigtigt dissociationsproteasen. Skyl forsigtigt pladen to gange med PBS, og pas på ikke at løsne kolonierne.
  11. Der tilsættes 5 ml forvarmet hiPSC-substrat (tabel 1) til dyrkningspladen.
  12. Løft kolonierne, mens du bryder dem op i mindre celleaggregater ved at ridse hele pladen med spidsen af en 5 ml pipette ved hjælp af en frem og tilbage bevægelse fra top til bund.
  13. Drej pladen 90°, og gentag ovenstående trin.
  14. Triturer celleaggregaterne forsigtigt ved pipettering op og ned med en 5 ml pipette og kontroller størrelsen af aggregaterne periodisk under et mikroskop, indtil størstedelen af celleaggregaterne er ca. 50-100 celler.
  15. Frø celleaggregaterne i de forbelagte kældermembranmatrixplader ved hjælp af et ekstra hiPSC-medium til at vaske den originale plade. De fleste celleaggregater indsamles og overføres til de nye plader ved hjælp af en 5 ml pipette.
    BEMÆRK: Hvis protokollen anvendes konsekvent, skal den originale plade indeholde iPSC-kolonier, der dækker ca. 50% af kulturoverfladen før passage. I dette tilfælde skal splitforholdet være fra en plade til fem nye plader. Dette kan dog være nødvendigt at justere afhængigt af vækstbetingelserne og cellelinjespecifikke væksthastigheder.
  16. Ryst de nysåede plader frem og tilbage for at fordele aggregaterne jævnt.
  17. Pladerne overføres til en inkubator (37 °C og 5 % CO2), og lad dem stå uforstyrret natten over for at muliggøre korrekt cellevedhæftning.
  18. Udfør et komplet medieskift hver dag med 10 ml hiPSC-medium. Hvis der er overskydende celleaffald dagen efter passagen, vaskes en gang med 5 ml af mediet inden medieskift.
  19. Planlæg at passere næste, når hvide områder vises i midten af størstedelen af iPSC-kolonierne (trin 2.5). Dette vil ske 4-6 dage efter hver passage.

3. Frysning af hiPSC

  1. Udfør de indledende trin som i trin 2.5-2.14 for hiPSC-passage.
  2. Saml celleaggregaterne i et 15 ml rør og drej ved 200 x g i 2 minutter.
  3. Supernatanten suges, pelletpen opslæmmes igen i frysemedium og overføres til kryorør med en 5 ml pipette.
    BEMÆRK: I lighed med passagetrinnene er det sædvanlige splitforhold en iPSC-plade til fem kryorør afhængigt af kolonitætheden. Brug et samlet volumen på 1 ml frysemedium til hver kryotube.
  4. Kryotubeerne anbringes i en afkølet kryopræserveringsbeholder og overføres til -80 °C natten over.
  5. Overfør cellerne til flydende nitrogen efter 24 timer.

4. Optøning af hiPSC

  1. Overtræk en 10 cm plade med kældermembranmatrixen (se 2.1-2.3).
  2. Fjern et iPSC-kryorør fra flydende nitrogen og anbring det straks i et 37 °C vandbad i op til 2 minutter for hurtigt at tø det op. Ryst hætteglasset i badet, indtil det er delvist optøet og indeholder et lille stykke is omgivet af væske.
  3. Overfør celleaggregaterne fra kryorøret til et 15 ml konisk rør ved hjælp af en 1000 μL pipette. Der tilsættes op til 15 ml forvarmet hiPSC-substrat for at fortynde dimethylsulfoxid (DMSO) i frysemediet.
  4. Det koniske rør på 15 ml centrifugeres ved 200 x g i 2 min.
  5. Supernatanten suges til syn, og der anvendes en 5 ml pipette til at resuspendere cellepelletten i hiPSC-medium indeholdende 20 μM Rho-associeret spiraldannende protein serin/threoninkinasehæmmer (ROCK-I, forbindelse Y-27632) for at undgå yderligere triturering af celleaggregater.
  6. Overfør celleaggregaterne til en 10 cm plade med membranmembranbelagt 10 cm i kælderen ved hjælp af en 5 ml pipette.
    BEMÆRK: Hvis protokollen anvendes konsekvent, kan celler i et kryorør overføres til en enkelt 10 cm plade.
  7. Ryst pladen for at fordele aggregaterne jævnt.
  8. Overfør pladen til en inkubator og lad den stå uforstyrret natten over for at muliggøre korrekt cellevedhæftning.
  9. Udfør et komplet medieskift dagen efter optøning med 10 ml hiPSC-medium uden ROCK-I.

5. Differentiering af hiPSC i rygmarvsneurale stamceller (NPC)

  1. Sørg for, at kældermembranmatrixbelagte 6-brøndsplader er klar til brug, inden differentieringen påbegyndes.
  2. Start med iPSC, der har været passeret mindst én gang og helst to gange efter optøning og med mindst fire plader på 10 cm (se forklaringen i trin 5.11).
  3. Udfør de indledende trin som i trin 2.5-2.14 for hiPSC-passagen.
  4. Overfør celleaggregaterne fra mindst to 10 cm plader til et 15 ml rør ved hjælp af en 5 ml pipette.
  5. Centrifuger ved 200 x g i 2 min.
  6. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes med 10 ml hiPSC-substrat ved hjælp af en 10 ml pipette, hvorefter der centrifugeres igen ved 200 x g i 2 minutter for at løsne celle-til-celle-adhæsionerne i hvert aggregat.
  7. Supernatanten suges op, og cellepelletsen resuspenderes i 1 ml hiPSC-substrat indeholdende 20 μM ROCK-I ved hjælp af en 1000 μL pipette.
  8. Pipette op og ned med en 1000 μL pipette for at triturere celleaggregaterne. Kontroller størrelsen af aggregaterne under et mikroskop med jævne mellemrum, indtil størstedelen af cellesuspensionen består af enkeltceller eller små aggregater på <10 celler.
  9. Tæl cellerne med et hæmocytometer (foretrukket) eller en automatiseret celletæller og beregn celletætheden i cellesuspensionen.
  10. Plade 3,0 x 10 6 celler i hver brønd i en 6-brønds plade, der er forbelagt med kældermembranmatrix. Brug en 1000 μL pipette til at overføre cellesuspensionen.
    BEMÆRK: Hvis protokollen anvendes konsekvent, svarer dette til et forhold på to 10 cm plader i en enkelt brønd i en 6-brønd / plade.
  11. Gentag trin 5.3-5.10 med et andet parti på to 10 cm plader, og lad slutproduktet blive anbragt i en kældermembranmatrixbelagt brønd med en anden 6-brøndsplade. Brug en 1000 μL pipette til at overføre cellesuspensionen.
    BEMÆRK: Ideel færdiggørelse af rygmarven NPC-protokollen kræver to brønde svarende til fire 10 cm plader. For at lette arbejdsgangen skal du udføre trin 5.3-5.10 med to batcher af to plader, hvor det endelige produkt er to separate 6-brøndsplader og hver med en brønd, der indeholder 3,0 x 106 celler i den.
  12. Det resulterende humane iPSC-monolag opretholdes i hiPSC-medium indeholdende 20 μM ROCK-I, indtil sammenløbet når >90%, typisk den følgende dag, men ikke længere end 3 dage efter den første plettering for at undgå spontan (ukontrolleret) differentiering.
  13. Hvis differentieringen ikke kan påbegyndes dagen efter cellepletteringen, vaskes cellerne én gang med PBS, og mediet skiftes dagligt til et frisk hiPSC-medium indeholdende 20 μM ROCK-I. Hvis det ikke sammenløber >90% inden for 3 dage efter plettering, skal du kassere cellerne og starte protokollen forfra.
  14. Når >90% sammenløb er nået, skal du starte differentiering. Dette er dag in vitro 1 (DIV1) i differentieringsprotokollen.
  15. På DIV 1 kasseres hiPSC-mediet indeholdende 20 μM ROCK-I, og skylles to gange med PBS for at fjerne fostervækstfaktoren (FGF) og transformerende vækstfaktor-beta (TGFβ), der er til stede i stamcellemediet.
  16. Mediet ændres til WiCell-mediet (tabel 1) suppleret med 0,2 μM LDN193189 (LDN) og 10 μM SB431542 (SB) i 48 timer.
  17. På DIV 3 vaskes én gang med PBS og mediet skiftes til WiCell-mediet suppleret med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + retinsyre (RA; 1μM) i 48 timer.
  18. På DIV 5 vaskes én gang med PBS, og mediet ændres til WiCell: NIM-base (Neural induktionsmedium) (tabel 1) (50%:50%, v/v) suppleret med LDN (0,5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) i 48 timer.
  19. På DIV 7 skal du udføre medium udveksling med samme medium som i trin 5.18.
  20. På DIV 8 vaskes en gang med PBS og skifter medium til WiCell:NIM-base (50%:50%) suppleret med RA (1 μM) + puromorfamin (PMN) (1 μM) + Rekombinant human-hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) (10 ng/ml) + Ascorbinsyre (ASAC) (0,4 μg/ml) i 48 timer.
  21. På DIV 10 vaskes én gang med PBS og medium skiftes til NIM-base (100 %) suppleret som nævnt i trin 5.20 i 48 timer.
  22. På DIV 11 eller 12 skal du belægge en 25 cm2 steril kulturkolbe med kældermembranmatrix som forberedelse til passage.
  23. Opsug mediet fra hvert hul i 6-brøndspladen l, og skyl cellerne en gang med PBS.
  24. Tilsæt 2 ml 0,05% trypsin til hvert hul og inkuber ved 37 ° C i 5-15 minutter; Intermitterende rystelse af pladerne kan hjælpe med celleløsning.
  25. Hvis cellerne stadig ikke er suspenderet, løsnes mekanisk ved at skubbe NIM-medier ud fra en 1000 μL pipettespids på cellerne med en cirkulær bevægelse (sørg for at dække hele overfladen) eller ved at skrabe med en celleskraber (foretrækkes ikke).
  26. Overfør cellerne fra 2 huller til et 15 ml rør og tilsæt trypsinhæmmer i passende forhold til den anvendte mængde trypsin ved hjælp af en 5 ml pipette.
  27. Supernatanten centrifugeres ved 200 x g i 2 minutter, opsuges, og opslæmmes derefter igen med 10 ml NIM-base med en 10 ml pipette.
  28. Der centrifugeres igen ved 200 x g i 2 minutter for at løsne celle-til-celle-adhæsionerne.
  29. Efter det andet centrifugeringstrin fjernes supernatanten, og pelletpen opslæmmes igen med 1 ml NIM-substrat (100 %) suppleret med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml) og ROCK-I (20 μM). Ved hjælp af en 1000 μL pipettespids tritureres cellerne op og ned ca. fem gange, indtil der opnås en uklar suspension.
  30. Aggregaterne i dette medium sås igen til kældermembranmatrixbelagt 25 cm 2 steril kulturkolbe, således at det endelige resultat er kombinationen af cellerne fra to brønde i en 6-brøndplade til en enkelt kældermembranmatrixbelagt 25 cm 2 steril kulturkolbe (2: 1 passage). Brug en 1000 μL pipette til at overføre cellesuspensionen.
    BEMÆRK: Cellerne skal være >90% sammenflydende på DIV 13, og der er ikke behov for yderligere trin før dag 14. Hvis cellerne ikke flyder sammen, skal du holde ROCK-I i medierne i yderligere 1 eller 2 dage.
  31. På DIV 14 skal du ændre mediet til friske NIM-medier + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/ml) + ASAC (0,4 μg/ml).
  32. På DIV 15 skal du ændre mediet til NIM: Neural differentieringsmedium (NDM) base (tabel 1) (50%:50%) med RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0,4 μg / ml) + Supplement B (50x) + BDNF (10 ng / ml) + Gliacellelinjeafledt neurotrofisk (GDNF) (10 ng / ml) + insulinlignende vækstfaktor 1 (IGF-1) (10 ng / ml) + ciliær neurotrofisk faktor (CNTF) (10 ng / ml). Skift med friske medier hver anden dag.
  33. På DIV 21 skal du ændre mediet til NDM-basen (100 %) suppleret som i trin 5.32 og skifte med nyt medium hver anden dag.
  34. På DIV 25-30 skal du samle NPC'en og enten fryse dem eller føre dem til en 10 cm plade til terminaldifferentiering.
  35. Skyl T-25-kolben med PBS og tilsæt 0,05% trypsin.
  36. Der inkuberes i 5 minutter ved 37 °C.
  37. Skyl trypsin og cellerne med NDM-basen og overfør til et 15 ml konisk rør. Tilsæt trypsinhæmmeren i passende forhold til trypsin og centrifuger ved 300 x g i 5 minutter.
  38. Resuspender cellepellet med motorneuron eller astrocytdifferentieringsmedium (tabel 1) og brug en 1000 μL pipette til at triturere op og ned for at opnå en enkelt cellesuspension (normalt op til 5 gange).
  39. Cellerne tælles og overføres til en 10 cm plade, der er belagt som beskrevet i punkt 6, ved hjælp af enten differentieringsmedier +Rock-I for at differentiere hiPSC-MN og hiPSC-A.
  40. Alternativt fryses kulturerne ved at resuspenderes i et frysemedium sammensat af 90% NDM-medium med vækstfaktorer (som i trin 5.32-5.33) og 10% DMSO, tritureres på samme måde og overføres derefter til et kryorør. Alikvote 6 x 106 NPC pr. kryotube.

6. Optøning af NPC-kulturer

  1. Overtræk 10 cm plader med polyornithin (PLO) og laminin dagen før optøning af cellerne.
    1. Der tilsættes 5 ml PLO fortyndet til 100 μg/ml i PBS eller destilleret vand (dH2O) til pladerne. Der inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time indtil natten over.
    2. PLO-opløsningen suges og pladerne skylles tre gange med PBS. (PLO er giftigt, hvis det ikke vaskes ordentligt.)
    3. Der tilsættes laminin fortyndet i PBS i en koncentration på 10 μg/ml til de PLO-coatede plader. Der inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time, helst natten over. Efter inkubation aspireres lamininopløsningen uden skylning for at forbedre celleadhæsionen.
      BEMÆRK: Pladerne kan overtrækkes med PLO på forhånd, vaskes tre gange med vand, tørres i en steril hætte og opbevares ved 4 °C.
  2. Der er optøet et NPC-hætteglas (dvs. DIV 25 eller 30) indeholdende 6 x 106 celler/hætteglas for hver 10 cm cellekulturplade.
  3. Fjern NPC-kryorøret fra flydende nitrogen og anbring det straks i et 37 °C vandbad i op til 2 min. Optø hurtigt ved at ryste hætteglasset, indtil der er et lille isstykke omgivet af væske.
  4. Overfør celleaggregater til en 15 ml konisk ved hjælp af en 1000 μL pipette og tilsæt op til 15 ml forvarmet NDM eller Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM) / Hams F21 F12-supplement for at fortynde DMSO.
  5. Centrifuger ved 300 x g i 5 min.
  6. Supernatanten suges op, cellepelleten resuspenderes med enten astrocyt- eller MN-differentieringsmedium (tabel 1) + ROCK-I (20 μM), og der anvendes en 1000 μL pipette til triturering op og ned, indtil der opnås en enkelt cellesuspension (op til 5 gange).
  7. Overfør enkeltcellesuspensionen til en PLO-Laminin-belagt 10 cm plade.
  8. Overfør pladen til en inkubator og lad den stå uforstyrret natten over for at muliggøre korrekt celleadhæsion.

7. Differentiering af rygmarv NPC i motorneuroner

  1. Udfør indledende trin som nævnt i trin 6.1-6.8, hvor det endelige medium er MN-differentieringsmedium + ROCK-I (20 μM).
  2. Dagen efter plettering skal du udføre en komplet udveksling af mediet med MN-differentieringsmedium uden ROCK-I, og skift derefter mediet hver anden dag. I weekenden skal du fodre celler fredag og derefter igen mandag. Skyl cellerne med PBS, når det er nødvendigt for at fjerne cellerester.
  3. Skift mediet med MN-differentieringsmedium + cytosinarabinosid (ARA-C) (0,02 μM) og inkuber i 48 timer, når glia-forpligtede forfædre fremkommer som enkeltprolifererende flade celler under postmitotiske MN-forfædre aggregeret i celleklynger.
    BEMÆRK: Normalt sker dette inden for de første 7 dage efter den første plettering, selvom der kan være variation afhængigt af cellelinjen.
  4. Efter 48 timer aspireres mediet indeholdende ARA-C, kulturerne skylles forsigtigt med PBS tre gange, og substratet skiftes til frisk MN-substrat uden ARA-C.
  5. Efter behandling med ARA-C skal du udføre mellemstore udvekslinger hver anden dag (eller mandag, onsdag og fredag) ved at fjerne det gamle medium med en manuel pipette i stedet for en vakuumaspirator for at forhindre for tidlig løsrivelse af neuronale klynger. Derudover beriges MN-mediet med Laminin 1 μg / ml en gang om ugen for yderligere at forbedre neuronal binding til kulturpladerne.

8. Differentiering af NPC i rygmarvsastrocytter

  1. NPC-kulturer som i afsnit 6 ved hjælp af astrocytdifferentieringsmedium (tabel 1) med tilsætning af føtalt bovint serum (FBS) med et volumen for volumenkoncentration på 1% (NS + 1% FBS) samt ROCK-I (20 μM) til plettering.
    BEMÆRK: Kommercielt tilgængelig serumerstatning (tabel 1) kan erstattes af FBS ved anvendelse af de samme fortyndingsfaktorer.
  2. Dagen efter plettering ændres kulturmediet med NS + 1% FBS-medium uden ROCK-hæmmer, og derefter skiftes mediet hver anden dag. I weekenden skal du fodre celler fredag og derefter igen mandag. Skyl cellerne med PBS, når det er nødvendigt for at fjerne cellerester. Hvis cellerne fortsætter med at dø, skal du supplere medier med ROCK-I (10 μM) for at fremme celleoverlevelse. Vær forsigtig med ikke at bruge ROCK-I for ofte eller for længe i betragtning af potentialet til at vælge udødelige celler.
  3. Lad astrocytterne flyde sammen, før de passerer dem.
    BEMÆRK: Cellestørrelsen øges over tid, så der er ikke noget bestemt nummer til passage. Det typiske passaging ratio er 1:2 eller 1:3. I tilfælde af dårlig overlevelse eller overgang til for mange plader, kombiner to (eller flere efter behov) 10 cm plader til en 10 cm plade for at opretholde sammenløb.
  4. For at passere astrocytstamfaderkulturer skal du vaske pladerne en gang med PBS (for at fjerne FBS), inkubere med 0,05% trypsin i 5 minutter, samle cellerne i NS-medium + 1% FBS (FBS inaktivere trypsin) og derefter centrifugere ved 300 x g i 5 minutter. Supernatanten suges, cellerne resuspenderes i NS-medium + 1 % FBS, og tritureres derefter til en enkeltcellesuspension. Fordel celler i NS + 1% FBS til nye 10 cm plader.
    BEMÆRK: Ud over at udvide astrocytkulturer tjener gentagen passage af plader formålet med at dræbe eventuelle resterende stamceller, der har valgt en neuronal skæbne. Derfor, selvom der ikke er en meget høj mitotisk hastighed, kan plader passeres i forholdet 1: 1, hvis der ser ud til at være neuronal forurening.
  5. Skift belægningen i løbet af differentieringen for at øge udbyttet som følger.
    1. Plade de oprindeligt optøede NPC-kulturer og de første passager efter indledende plettering på PLO / Laminin.
    2. Plade de umodne astrocytter på kældermembranmatrixbelagte plader.
    3. Plade mere modne astrocytter (dvs. efter dag 90) på enten kældermembranmatrix, PLO / Laminin-belagte plader (typisk til co-kultur med neuroner) eller på ubelagte plader.
  6. Frys astrocytforfædrene når som helst i løbet af 60-dages modningsperioden for at synkronisere kulturer eller gemme til senere eksperimenter. Når du tøer op ud over NPC-stadiet, skal du optø astrocytforfædrene på kældermembranmatrixbelagte plader i stedet for PLO / Laminin.
  7. Ved DIV 90 og derefter skal du skifte mediet fra NS + 1% FBS til NS + 5% FBS for at fremme astrocytoverlevelse og mindske deres spredning.

9. Co-kulturering MN og rygmarvsastrocytter i multi-elektrode arrayplader

  1. Differentier og plade motorneuronerne og astrocytterne, når de er klar til brug samme dag og alderen til DIV 60 for motorneuronerne og DIV 90 for astrocytterne.
  2. Overtræk MEA-pladerne dagen før eller på pletteringsdagen som følger, hvis du arbejder med plastplader med 24 brønde (materialetabel).
  3. PLO fortyndes i vand eller PBS til 100 μg/ml.
    1. Der tilsættes 15-20 μL til hvert hul (afhængigt af pipetternes komfortniveau), hvorved der dannes en dråbe i midten af brønden, der dækker elektrodernes område og det omgivende område, men ikke hele brønden.
    2. Pas på ikke at beskadige elektroderne med pipettespidsen. Vær konsistent med volumen fra brønd til brønd for at sikre dækning af det samme overfladeareal i hver brønd.
    3. PLO inkuberes ved 37 °C i mindst 1 time (helst 2 timer).
      BEMÆRK: De små volumener tørrer ud, hvis der ikke er tilstrækkelig fugtighed i pladerne. Tilsæt vand til rummene omkring brønde for at sikre tilstrækkelig fugtighed under belægning og optagelse.
  4. Opsug så meget PLO som muligt ved hjælp af en mikropipettespids af plast. Pas på ikke at røre ved elektroderne. Vask med 250 μL vand tre gange. Hvis du bruger en vakuumaspirator til vask, må du ikke lade spidsen være i nærheden af elektrodearrayet. Efter den tredje vask fjernes så meget vand som muligt ved hjælp af en pipettespids efter behov. Lad overfladen tørre under cellekulturhætten med låget fjernet.
  5. Når pladens overflader er tørre, tilsættes laminin fortyndet til 10 μg/ml i PBS. Brug 15-20 μL til at dække hvert elektrodearray. Tilsæt vand til fugtighedsrummet, sæt låget på igen, og sæt pladen tilbage til 37 °C inkubation i mindst 2 timer indtil natten over.
  6. På pletteringsdagen skylles MN- og astrocytkulturerne en gang med PBS og tilsættes trypsin 0,05% ved 37 °C for at løfte celler (5 min). Opsaml i et 15 ml konisk rør indeholdende trypsinhæmmer og vask plader med medium eller base for at sikre, at alle cellerne opsamles. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter, og opslæmmes igen med en 1000 μL pipette for at generere 1 ml af en enkeltcellesuspension. Når MN og astrocytter suspenderes igen, skiftes til cokulturmediet (tabel 1) med tilsætning af 20 μM ROCK-I.
  7. Tæl MN og astrocytterne parallelt ved hjælp af et hæmocytometer. Mens du tæller og foretager beregninger, skal du dække cellesuspensionerne og placere dem i et isoporstativ ved 4 ° C.
  8. Beregn det volumen, der kræves for at resuspendere kulturerne til en koncentration på 5 x 10 4 celler pr. 5 μL for motorneuroner og 2,5 x 104 celler pr. 5 μL for astrocytter. Centrifuger 1 ml cellesuspensionerne ved 300 x g i 5 minutter og resuspender i det beregnede volumen.
  9. Antallet af ønskede huller, der skal podes, beregnes, og multipliceres med 5 μL af hver cellesuspension. Kombiner det nødvendige volumen neuron- og astrocytsuspensioner i forholdet 1:1 og bland ved pipettering, indtil det er grundigt kombineret (normalt to gange), men undgå at være for aggressivt.
  10. Laminin fjernes fra hvert hul på MEA-pladen ved hjælp af en pipettespids. Der overføres 10 μL af den endelige kombinerede cellesuspension til hvert hul, hvorved der dannes en lille dråbe, der dækker elektrodearrayet, for at tilvejebringe en celletæthed på 5 x 10 4 MN og 2,5 x 104 astrocytter pr. hul.
    BEMÆRK: Høj celletæthed i den kombinerede suspension kræver hyppig resuspension mellem hullerne under såningstrinnet for at sikre nøjagtige og konsistente celletal.
  11. Sæt pladerne tilbage i inkubatoren i 20-30 min. Pas på ikke at forstyrre celledråben og lad cellerne danne indledende vedhæftede filer på pladerne.
  12. Efter 20-30 minutter tilsættes varme co-kulturmedier + ROCK-I til hver brønd ved at pipettere 250 μL ned på væggen i hver brønd efterfulgt af yderligere 250 μL ned ad væggen i den samme brønd på den modsatte side. Sæt pladen tilbage til inkubatoren.
  13. Undersøg pladerne dagen efter såning (Co-kultur dag 1). Hvis der er signifikant celleaffald eller døde celler, udskiftes mediet med et frisk co-kulturmedium indeholdende ROCK-I. Ellers ændres mediet på andendagen efter såning (Co-Culture Day 2) til co-kulturmediet uden ROCK-I. Udfør halvmellemstore udvekslinger (aspirer 50% og tilsæt 60% af det endelige volumen for at tage højde for fordampning) to gange om ugen.
  14. Hvis der anvendes MEA-systemer med enkeltbrønd 30 mm glasplader (materialetabel), kan pladeforberedelsen tage 2 eller flere dage. Følg nedenstående trin for at udføre dette.
  15. Løft cellerne og celleresterne fra de tidligere MEA-kulturer med 0,05% trypsin i 5-15 min.
  16. Aspirer trypsin og skyl tre gange med vand.
  17. Steriliser ved at tilsætte 70% ethanol og inkuber i emhætten i 10 min. Opsug ethanolen, og skyl derefter med vand tre gange.
  18. Påfør 1% anionisk vaskemiddel med proteaseenzym i vand. Dæk pladerne med et låg og pakk med termoplastisk film og aluminiumsfolie, og lad dem derefter stå på en vippe ved stuetemperatur natten over.
  19. Opsug vaskemidlet, og skyl derefter tre gange med vand.
  20. Hvis du planlægger at opbevare pladerne, skal du tilføje et tilstrækkeligt volumen vand. Dæk pladerne med et låg og pakk dem med termoplastisk film og aluminiumsfolie, og lad dem stå i køleskabet indtil næste brug.
  21. Hvis du planlægger at belægge, skal du lade overfladen tørre under cellekulturhætten.
  22. Hvis der er behov for ekstra sterilisering (f.eks. tidligere infektion eller ikke-nylig brug), skal MEA-pladerne kun udsættes for ultraviolet (UV) lys under emhætten i 30-60 minutter.
    BEMÆRK: Undgå hyppigt UV-lys forhindrer beskadigelse af elektroderne. Brug af UV-lys, når plader har serum på, vil resultere i ikke-funktionelle elektroder, hvorfor det kun bør bruges på rensede plader.
  23. Når pladerne er helt tørre, skal du fortsætte med plasmarensning i 1 minut for at oplade glasoverfladen på MEA-plader og forbedre belægningseffektiviteten. Plasmarensning mindst en gang hver 4.-5. cyklus af MEA-pladerensningspletteringscyklusser.
    1. Som et alternativ, når plasmarensning ikke er mulig eller ikke berettiget, tilsættes et tilstrækkeligt volumen FBS-holdigt medium til at dække MEA-pladernes overflade og returnere dem til inkubatoren natten over.
  24. Brug PLO/Laminin-belægning som beskrevet ovenfor i afsnit 6. Der tilsættes PLO-opløsning (100 μg i PBS) umiddelbart efter plasmarensning eller opsugning og skylning af det FBS-holdige medium.
  25. Pladerne celle som ovenfor ved følgende tætheder: 1 x 10 5 hiPSC-A/plade og 5 x 105 hiPSC-MN/plade.

10. Optagelse af multielektrodearray

  1. Udtræk råspændingsdataene ved en 12,5 kHz samplingfrekvens ved hjælp af et Butterworth-filter med et 200 Hz højpas- og 3 kHz lavpasfilter. Indstil spikegenkendelse som øjeblikkelige tidspunkter for spændinger ≥6 standardafvigelser fra baseline. Identificer bursts som en aktivitet med >5 pigge på 100 ms. Definer netværksaktivitet, når over 35 % af de samlede aktive elektroder affyres inden for 100 ms med mindst 50 spidser pr. netværksburst.
  2. Start optagelsen så hurtigt som muligt efter Co-Culture (CC) dag 1.
    BEMÆRK: Elektrisk aktivitet vil sjældent blive noteret før CC dag 3.
  3. Pladeparallelkulturer ved lignende tætheder og replikerer i de relevante dyrkningsplader eller dæksedler til biokemiske assays, immunocytokemi (ICC) eller qPCR.
  4. Udfør optagelser med temperaturen indstillet til 37 °C ad CO2 ved 5 %. Overfør pladerne til maskinen, og lad dem ekvilibrere i mindst 5 minutter før optagelse.
  5. Registrer baselineaktivitet enten hver anden dag eller ugentligt, over 1-15 minutter afhængigt af det eksperimentelle design. Optag ikke i mindst 1 time efter en medium udveksling, og vent ideelt set i 24 timer efter hver medieudveksling.
  6. For at undgå kontaminering skal mediet (dvs. halv middeludskiftning som i trin 9.14) udskiftes efter enhver optagelse, hvor låget på den sterile plade skal åbnes uden for den sterile hætte (dvs. påføring af lægemiddelforbindelser). Udfør komplette medieudvekslinger og vaske for at vaske stoffer ud, hvis pladerne fortsat vil blive brugt ud over lægemiddelbehandling.
  7. Til analyseformål skal der anvendes mindst tre tekniske og biologiske replikater for hver tilstand. Ekspres elektrofysiologiske data som middel til n ≥ 3 replikaterer.

11. Farmakologiske assays på multielektrodearray

  1. Brug en anden kombination af co-kulturer afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål: ALS neuroner med kontrol astrocytter, kontrol neuroner med ALS astrocytter, ALS neuroner og astrocytter, kontrol neuroner og astrocytter.
  2. Når du undersøger forbigående elektrofysiologiske virkninger af forbindelser rettet mod enten neuroner eller astrocytter, skal du registrere baselineaktivitet i mindst 1 minut med pladelåg fjernet, men maskinlåg lukket.
  3. Åbn låget til maskinen manuelt uden at stoppe den elektrofysiologiske registrering, og udskift 25 μL medium med det relevante lægemiddelkøretøj (normalt frisk medium) ved hjælp af en multikanalpipette ved behandling af flere huller. Luk låget manuelt.
  4. Optag i yderligere 1 minut (eller mere, hvis der er betydelige køretøjsinducerede ændringer, som kulturen skal komme sig over).
  5. Åbn låget manuelt igen, og udskift 25 μL medium med det pågældende lægemiddel i det samme køretøj. Luk låget til maskinen, og fortsæt optagelsen.
    BEMÆRK: Varigheden af optagelsen og mængden af indgivne lægemidler/køretøjer kan variere eller skal optimeres afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål.
  6. Til analyseformål skal det sikres, at tilføjelsen af køretøjet ikke fremkalder væsentlige ændringer i elektrofysiologiske parametre. Beregn procentvise ændringer i aktiviteten efter lægemidlet sammenlignet med efter køretøjstilsætning, og sammenlign mellem forholdene.
  7. For at undersøge elektrofysiologiske effekter i længderetningen, såsom kandidatsygdomsmodificerende lægemidler, skal du registrere baselineaktiviteten beskrevet i trin 11.2. Til dette formål skal du enten bruge det co-kulturmedium, der indeholder det eller de pågældende stoffer i det relevante køretøj, eller det medium, der kun indeholder køretøjet.
  8. Til analyseformål sammenlignes tidspunktsoptagelserne fra ALS eller kontrolcokulturer i længderetningen behandlet med lægemidler til hinanden og kontrolbetingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rygmarvsmønsterprotokollen til generering af hiPSC-MN og rygmarvs-hiPSC-A er skitseret i figur 1. I denne protokol vedligeholdes og passeres hiPSC'er som ikke-sammenflydende kolonier (figur 2A). Neurogenese initieres (neural induktion) gennem dobbelt SMAD-hæmning ved tilsætning af LDN193189 og SB431542, der inaktiverer henholdsvis knoglemorfogenetisk protein (BMP) og de transformerende vækstfaktor-beta (TGF-β) veje. En monolagsbaseret metode anvendes til dette trin, hvor hiPSC er belagt på en klæbende matrix, dvs. kældermembranmatrix, for at generere en neuroepitellignende 2D-kultur. Morfologisk er neural induktion præget af overgangen fra iPSC med store kerner og rund form til neuroepitelceller (stamceller), der er tæt komprimeret, med en stor cytoplasma og cylindrisk form. Disse celler deler sig vandret såvel som lodret og genererer et flerlags epitel (figur 2B, i).

Præferencen for en 2D, i modsætning til en 3D-strategi (dvs. embryoid kropsbaseret), er afhængig af litteraturbevis 11,12, der tyder på, at førstnævnte kan fremme rygmarvsmønster ved at introducere celle-ekstrinsiske miljømæssige signaler13. Neuroepitelceller er derefter tidsmæssigt og rumligt mønstret for at generere regionsspecifikke, dvs. rygmarv, neurale stamceller (NPC) (figur 1). To vigtige morfogener anvendes til dette formål: retinsyre, som bestemmer kaudalisering, og purmorphamin, en pindsvinsignalagonist, der forårsager ventral specifikation. I deres fravær ville NPC's celle-iboende regionale identitet være rostral og dorsal14,15,16.

Fra DIV 15 til DIV 25-DIV 30 forstærkes den regionale identitet af disse NPC ved at supplere medier med morfogener. Samtidig genererer den tidlige eksponering for neuronale vækstfaktorer og et gliogent cytokin, såsom ciliær neurotrofisk faktor (CNTF), en blandet population af NPC (figur 2B, ii). Morfologisk er disse celler mindre komprimerede end neuroepitelceller, der viser få korte processer, arrangeret i et monolag efter forstyrrelse af det søjleformede epitel efter passaging ved DIV 12. Ved nærmere syn er nogle af disse celler aflange, mens andre viser flere processer, hvilket indikerer tidlig forpligtelse til henholdsvis en glial vs. neuronal skæbne.

Neuroner vil opstå spontant fra denne blandede population, medmindre den gliogene switch aktiveres (figur 1 og figur 2B, iii). Tilsætningen af Notch pathway inhibitor, Compound E, vil forbedre lavere MN differentiering17. Rygmarvsidentiteten af disse celler understøttes af høje niveauer af ChAT-ekspression (figur 2C,i). Derudover har det tidligere vistsig 2, at en subpopulation af disse motorneuroner også er ISL1+.

Astrocytdifferentiering induceres af den gliogene switch gennem aktivering af JAK / STAT-vej (figur 1 og figur 2B, iv). CNTF og sandsynligvis andre cytokiner indeholdt i føtalt bovint serum tjener dette formål i den foreslåede protokol. Tid er også en væsentlig faktor, da gliogenese spontant følger efter neuronogenese på grund af celle-iboende spor. Efter DIV 90 viser hiPSC-A en moden fænotype som angivet ved S100β og GFAP-ekspression 2,11, mens deres rygmarvsregionale identitet understøttes af >90% ekspression af HOXB4 (figur 2C, ii)2,11,14.

Metoden til co-kultivering af hiPSC-MN og hiPSC-A er kendt for samtidig plettering af disse celleundertyper i modsætning til teknikker, hvor neuroner er serielt belagt på toppen af astrocytkulturer. I disse samtidige co-kulturer vil celler omarrangere spontant, med astrocytter, der skaber et fodringslag i bunden og neuroner, der forbinder i netværk øverst (figur 2C, iii). Denne strategi har tidligere vist, at2 giver mulighed for en mere ensartet fordeling af neuroner end andre samkulturstrategier, hvor disse celletyper har tendens til at klynge sig.

Human iPSC-MN belægges alene eller i samkultur med hiPSC-A på en MEA-plade med 24 brønde (n = 12 pr. tilstand), hvor hvert hul indeholder 16 elektroder (figur 3A). Fasekontrastbilleder af enten mono- eller cokulturer og rasterdiagrammer af spidsaktivitet fra to repræsentative brønde vises (figur 3B,C). Human iPSC-A forbedrer den elektrofysiologiske modning af hiPSC-MN, som vist ved signifikant højere grader af spiking og bursting aktivitet i co-kulturerne (figur 3D). Dette er parallelt med virkningerne af hiPSC-A på den morfologiske og molekylære modning af hiPSC-MN, der tidligere er blevet påvist2.

Nogle af de tekniske udfordringer i denne protokol er beskrevet i videoinstruktionerne, hvor teknikkerne til plettering og optagelse ved hjælp af MEA-platforme samt repræsentative optagelser fra disse kulturer vises.

Figure 1
Figur 1: Protokol for frembringelse af rygmarvshit hiPSC-MN og hiPSC-A og deres samkultur . (A) Tidslinje for differentieringsprotokollen med detaljerede oplysninger om kritiske faser. I indsatsen skal du fokusere på 30-dages protokollen til generering af rygmarvs-NPC med daglige handlinger (E-udvekslingsmedium, P-passage eller ingen handling), cellekulturbase og kosttilskud (for yderligere oplysninger om sammensætningen, se tabel 1 og materialetabel). (B) Afstamninger og forpligtelse til celleskæbne er skematisk repræsenteret. Cokulturer dannes, når modne hiPSC-MN (dvs. DIV 60) og hiPSC-A (dvs. DIV 90) blandes og belægges samtidigt. (Illustration oprettet med BioRender). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Morfologiske ændringer under rygmarvsdifferentieringsprotokollen. (A) Fasekontrastmikroskopbilleder af hiPSC. Panelerne (i) (lavere effekt, 10x) og (ii) (højere effekt, 20x) viser normal hiPSC, panelerne (iii) (10x) og (iv) (20x) viser en differentieret hiPSC-koloni. Skalastænger = 200 μm og 50 μm. (B) Repræsentative fasekontrastmikroskopbilleder af neuroepitelceller ved DIV 5 (i), NPC'er ved DIV 21 (ii) og modne DIV 60 motorneuroner (iii) og DIV 90 astrocytter (iv). Skalastænger = 100 μm og 50 μm (C) Repræsentative immuncytokemiske billeder på 40x olie af hiPSC-MN (i), hiPSC-A (ii) og deres co-kultur (iii). Modning og regionsspecifikke markører blev målrettet. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Multielektrode array-optagelse af hiPSC-MN. A) Varmekort over gennemsnitlig spidsningsaktivitet fra en enkelt MEA-plade (n = 24 huller) ved DIV 18 efter plettering. Brønde i række A og B (n = 12 brønde / tekniske replikater) repræsenterer kulturer af hiPSC-MN alene, mens brønde i række C og D (n = 12 brønde) er co-kulturer af hiPSC-MN / hiPSC-A. (B) Repræsentative fasekontrastbilleder af hiPSC-MN alene (MN) og i samkultur med hiPSC-A (MN+SCA) på MEA-plader. Neuroner aggregeres i store celleklynger, når de dyrkes alene, mens co-kulturen af hiPSC-MN med hiPSC-A resulterer i jævnt fordelte monolag. Skalabjælke = 50 μm. (C) Repræsentativt rasterplot af spidsaktivitet over 120 s optagetid fra en enkelt brønd med hiPSC-MN alene og hiPSC-MN i samkultur med hiPSC-A. Network burst-aktivitet på tværs af alle elektroder fremhæves med en lilla boks. (D) Kvantificering og sammenligning af spiking og bursting aktivitet mellem neuroner alene og neuroner i co-kultur med astrocytter fra MEA-pladen vist i panel A. (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1. Klik her for at downloade denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hidtil har hiPSC- og MEA-baserede metoder til elektrofysiologiske optagelser af astrocyt-neuron-cokulturer fundet begrænset anvendelse inden for ALS6 og stadig ikke i fuldt menneskelige platforme, i modsætning til deres mere udbredte anvendelse til in vitro-modellering af epilepsi9. Denne platform har imidlertid potentialet til at behandle patofysiologisk relevante spørgsmål i ALS-forskning, såsom mekanismerne for neuronal hyperexcitabilitet, astrocytbidrag til neurotoksicitet eller netværksaktivitetens rolle i sygdommens progression. Derudover giver denne platform mulighed for indsamling af potentielle elektrofysiologiske data i over 9 måneder in vitro og giver derfor en tilgang til testning af forbindelser med terapeutisk potentiale2.

Protokoller til generering af hiPSC-N og hiPSC-A, der findes i litteraturen, adskiller sig meget i forhold til medieforhold, timing af kulturer, udbytte og modningsprofiler, blandt andre faktorer. En stor fordel ved den foreslåede platform er, at astrocytter og neuroner differentieres separat og dyrkes sammen på senere tidspunkter ved samtidig plettering af de to celletyper. Efter optimering af celletætheder og timing kan denne metode oversættes til også at blive brugt med celletyper, der stammer fra andre protokoller, herunder andre regionsspecifikke celler.

Afgørende for den foreslåede platform er den regionale specifikation af motorneuroner og astrocytter. Mens den foreslåede protokol er rygmarvsspecifik i sin evne til at generere ChAT+ MN og HOXB4+ astrocytter, kan veletablerede differentieringsteknikker anvendes til at generere hiPSC-afledte neuroner og astrocytter, der viser kortikale identiteter, såsom CTIP2+ lag V kortikale motorneuroner18 og OTX2+ forhjerneastrocytter14 . Således har den foreslåede platform potentialet til at modellere neurale kredsløb i cortex og rygmarven såvel som deres forbindelser.

Flere systemer er tilgængelige til MEA-optagelse. MEA-plader med 24 brønde plast med 16 elektroder pr. brønd med CO2 og temperaturregulering blev foretrukket til undersøgelsen. Denne platform er især velegnet til screening med høj kapacitet i modsætning til systemer baseret på enkeltbrøndsoptagelser. Hovedbegrænsningen ved plastplader er, at overfladen kan være mere modtagelig for nedbrydning ved gentagne anvendelser. Systemer baseret på MEA-glasplader har den fordel, at de kan genbruges flere gange efter passende behandlinger som beskrevet ovenfor (op til 20 gange) uden væsentligt tab af dataregistreringskvalitet. Disse behandlinger og belægningsmetoderne er imidlertid mere tidskrævende og teknisk udfordrende i betragtning af den hydrofobe overflade af disse plader.

En af de største hindringer for iPSC- og MEA-baserede metoder til elektrofysiologisk registrering er variabiliteten og reproducerbarheden af eksperimentelle fund. Tidligere undersøgelser viser, at MEA-aktivitet af neuroner er afhængig af modning, der påvirkes af flere faktorer, herunder, men ikke begrænset til, passende differentieringsteknikker, der anvendes til generering af både astrocytter og neuroner, celletæthed af neuroner, forholdet mellem astrocytter og neuroner gennem differentiering og modning, sekvens af astrocyt- og neuron-cokulturer2 . Standardisering af disse variabler som foreslået i denne protokol er en måde at sikre reproducerbarhed på. Valget af multiwell MEA-systemer, der genererer data med høj kapacitet, vil tage højde for eksperimentel variabilitet. Hvis en kulturs elektrofysiologiske aktivitet er mindre end forventet på et givet tidspunkt, er det vigtigt at bestemme, at vellykket differentiering har fundet sted, og søsterkulturer, der kan analyseres immunocytokemisk eller biokemisk, er nyttige. I betragtning af at et meget lille volumen celler podes oprindeligt, kan små pipetteringsfejl resultere i relativt store ændringer i celleantal og derfor densitet. Brug af MEA-plader, der giver mulighed for direkte visualisering og vurdering af celletæthed, er også vigtig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette manuskript blev understøttet af følgende: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Vi takker Dr. Raha Dastgheyb og Dr. Norman Haughey for at levere MEA-platformen og dataanalysesoftwaren, som vi har brugt til at validere den beskrevne elektrofysiologiske platform. Vi vil gerne takke Khalil Rust for deres hjælp med protokoldemonstration og filmoptagelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 cm sterile culture plates Falcon 353003
25 cm2 sterile culture flasks Falcon 353136
2-Mercaptoethanol (β-ME) Thermofisher 21985023 Working concentration 110 µM
500 mL 0.2 µm CA Filter System Corning 430769
5 mL pipette Falcon 357543
6 well sterile culture plates Falcon 3046
Amphotericine B Gibco 15290018 Working concentration 2.0 μg/mL
Anionic detergent with protease enzyme - Terg-A-Zyme Sigma-Aldrich Z273287 Working concentration 1% m/v
Ascorbic acid (ASAC) Sigma A4403 Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL).
Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) Axion OPT-24
Axion Edge MEA platform Axion Maestro Edge
Basement Membrane matrix - Matrigel Corning 354277 Details in the protocol
Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) Zeiss 415510-1100-000 Primo Vert
Bicuculline Sigma Aldrich 14340 Working concentration10 μM
Ciliary neurotrophic factor (CNTF) Peprotech 450-13 Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
CO2 tanks and regulator for Axion Edge AirGas/Harris 9296NC
Compound E Abcam ab142164 Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM).
Cyanquixaline  (CNQX) Sigma Aldrich C239 Working concentration 50 μM
Dihydrokainic acid (DHK) Tocris 111 Working concentration 50 μM and 300 μM
DMEM/F12 Thermofisher 113300 Working concentration 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement Thermofisher A1517001 Combine 10 mL of Essential 8 (10x)  supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x)
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermofisher 16140071 Working concentration 1x
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) Peprotech 450-10 Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Hemocytometer Election Microscopy Sciences 63510-20
Heparin Millipore-sigma H3149-100KU Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL).
Humidity controlled Cell culture incubator ThermoFisher 370 set to 37 ºC, 5 % CO2
Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) R&D systems 291-G1-200 Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Kainc acid Abcam ab144490 Working concentration 5 μM
Knockout Serum Replacement (KSR) Thermofisher 10828 Working concentration 1x
Laminin Thermofisher 23017-015 Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media)
LDN193189 Stemgent 04-0074 Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution
L-Glutamine Thermofisher 25030 Working concentration 100x
MEA glass plates MultiChannel Systems 60MEA200/30iR-Ti-gr
Multichannel Pipet P200 Gilson PJ22224
Neurobasal Thermofisher 21103049 Working concentration 1x
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermofisher 11140050 Working concentration 100x
Pencillin/Streptomycin Thermofisher 15140122 Working concentration 100x
Polyornithine (PLO) Sigma-Aldrich P3655 Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL)
Potassium chloride (KCl) NA NA Working concentration100 mM
Purmorphamine (PMN) Millipore-Sigma 540223 Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM).
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) Peprotech 450-02 Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL).
Retinoic acid (RA) Sigma R2625 Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM).
ROCK-I nhibitor Peprotech 1293823 Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM).
SB431542 Sigma S4317 Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM)
Sterile cell culture hoods Baker Company SG-600
Supplement B - B27 Supplement Thermofisher 21985023 Working concentration 50x
Supplement N - N2 Supplement Thermofisher 17502048 Working concentration 100x
Table top cell culture centrifuge ThermoFisher 75004261 Sorvall Legend X1R
Thermoplastic film - Parafilm PARAFILM P7793
Tissue dissociation protease - Dispase StemCell Technologies 7923 Working concentration 1x
Trypsin Inhibitor Sigma T6522-1G Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL).
Trypsin-EDTA (0.05%) Thermofisher 2530054 Working concentration 1x
Waterbath ThermoFisher 2332 Isotemp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

Tags

Neurovidenskab udgave 174 multielektrode array ekstracellulær optagelse screening analyse rygmarv glia motor neuron amyotrofisk lateral sklerose hiPSC motor neuron sygdom sygdomsmodellering
Etablering af en elektrofysiologisk platform til modellering af ALS med regionalt specifikke humane pluripotente stamcelleafledte astrocytter og neuroner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A.,… More

Taga, A., Habela, C. W., Johns, A., Liu, S., O'Brien, M., Maragakis, N. J. Establishment of an Electrophysiological Platform for Modeling ALS with Regionally-Specific Human Pluripotent Stem Cell-Derived Astrocytes and Neurons. J. Vis. Exp. (174), e62726, doi:10.3791/62726 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter