Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62728
Automatic Translation
1, 1
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Summary

В исследовании описывается протокол создания больших (мкг-мг) количеств ДНК для кампаний скрининга белка из синтетических фрагментов генов без клонирования или использования живых клеток. Минимальный шаблон ферментативно переваривается и циркулируется, а затем усиливается с помощью изотермического усиления скользящего круга. Реакции бесклеточной экспрессии могут быть выполнены с неочищенным продуктом.

Abstract

Этот протокол описывает разработку минимального шаблона ДНК и этапы ферментативной амплификации, что позволяет быстро создавать прототипы анализируемых белков менее чем за 24 ч с использованием бесклеточной экспрессии. После получения ДНК от поставщика фрагмент гена амплифицируется ПЦР, разрезается, циркуляризируется и криобанкируется. Небольшое количество хранимой ДНК затем разбавляют и значительно амплируют (до 106 х)с помощью изотермической амплификации скользящего круга (RCA). RCA может давать микрограммовые количества минимального шаблона экспрессии из пикограммных уровней исходного материала (уровни mg, если используется весь исходный синтетический фрагмент). В этой работе начальное количество 20 пг привело к 4 мкг конечного продукта. Полученный продукт RCA (конкатемер минимального шаблона) может быть добавлен непосредственно в бесклеточную реакцию без этапов очистки. Поскольку этот метод полностью основан на ПЦР, он может обеспечить будущие высокопроизводительные усилия по скринингу в сочетании с автоматизированными системами обработки жидкостей.

Introduction

Бесклеточная экспрессия генов (CFE) стала мощным инструментом со многими приложениями. Такие приложения включают обнаружение заболеваний1,2,3,4,5,6,обнаружение микроэлементов и малых молекул7,8,9,10,11,12,биопроизводство13,14,15,16,17 ,18, образование19,20,21, производство сложных белков17,22,23,24,25,26,27, и вариантскрининга 23,28,29,30,31,32 ,33. Это связано с открытой природой бесклеточных систем и гибкостью, которую они предоставляют. Многие замечательные обзорные статьи предлагают историческое образование и будущие перспективы технологии34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44.

Типичная бесклетовая реакция состоит из трех основных компонентов: клеточного экстракта, энергетического микса и генетического шаблона. Экстракт активных клеток содержит все необходимые механизмы для транскрипции и трансляции (TXTL) и может быть обработан различными способами36. Гликолитические промежуточные продукты, электролиты, аминокислоты и кофакторы в энергетическом балансе поддерживают процесс TXTL. Он является основным источником изменчивости в бесклеточных экспериментах45 и может быть получен многими способами34,46. Подготовка генетического шаблона показала меньше улучшений, поскольку традиционные методы клонирования приводят к плазмидам с отличными характеристиками экспрессии. Недостатком этих традиционных методов является время обработки и количество биологических знаний, необходимых для их создания и распространения. Недавние усилия по оптимизации привели к простым 24-часовым рабочим процессам для подготовки экстракта клеток47,48, которые могут выполняться параллельно с подготовкой энергетического баланса49,50. Однако традиционное клонирование добавляет несколько дней к временной шкале прототипирования CFE(таблица 1)23. Быстро амплифицированные продукты ПЦР из коммерческого фрагмента гена могут быть использованы непосредственно51,но это ограничивает количество экспериментов по прототипированию, так как производится только 1 мкг ДНК, что соответствует примерно пяти реакциям (традиционные объемы 15 мкл). С этими дополнительными этапами циркуляризации и изотермической амплификации возможны количества ДНК, превышающие миллиграммы (~ 5000 реакций на 1 мг). Это резко увеличивает количество тестов, которые могут быть сделаны при высокопроизводительном скрининге белков или комбинаторных ферментных сетей (бесклеточная метаболическая инженерия); это также позволяет эффективно сохранять библиотеку линейных шаблонов в виде ДНК высокой концентрации. Кроме того, для прототипирования большего количества белка, необходимого для применения в материаловедении (белковые волокна и гидрогели), потребуется увеличение количества шаблона. Некоторые ограничения линейных шаблонов можно преодолеть, используя выдержку из BL21 DE3 Star или используя недавно открытые методы защиты линейных шаблонов от деградации52,53,54. Однако это не касается наличия ограниченных запасов ДНК, производимой поставщиками для амплификации ПЦР, или вопроса о биологическом опыте и оборудовании, необходимом для клонирования.

В этой работе представлен протокол, явно предназначенный для увеличения количества шаблона экспрессии, который может быть получен из небольших количеств фрагментов генов, продуцируемых поставщиком (обычно 500-1000 нг лиофилизированного порошка). Описанный способ не требует навыков, необходимых для выполнения традиционного клонирования в плазмидах или преобразования и распространения в живых клетках. Получив фрагмент гена по почте, пользователь может создать достаточно шаблонов для многих бесклеточных реакций, используя изотермическую амплификацию скользящего круга (RCA)(Рисунок 1)23. Хотя количество ДНК, полученное от поставщика, может быть достаточным для ограниченных усилий по скринингу, оно быстро истощается, а повторная покупка фрагментов генов занимает много времени и стоит дорого. Метод также особенно хорошо подходит для генов, которые токсичны и трудно клонируются у кишечной палочки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Проектирование фрагмента гена

ПРИМЕЧАНИЕ: Фрагмент гена должен иметь все необходимые генетические элементы для транскрипции/трансляции, включая промотор, сайт связывания рибосом (RBS), стартовый кодон, интересующий ген и терминатор. Хотя терминатор не нужен для шаблона линейного выражения (LET), он будет важен, если пользователь решит вставить последовательность в плазмиду. Эти последовательности были взяты из плазмиды55 pJL1-sfGFP (подарок от лаборатории Майкла Джуэтта), которая использует промоутер T7. В дополнение к этим необходимым генетическим элементам, к участку разреза фермента рестрикции добавляют шесть пар оснований перед промотором (5' сайт разреза) и еще шесть пар оснований после терминатора (3' сайт разреза), в этом случае с использованием HindIII (можно использовать другие ферменты рестрикции, но полезно стандартизировать последовательности с одним ферментом ограничения высокой точности, чтобы уменьшить количество, необходимое для хранения в библиотеке). Грунтовочные участки добавляют десять пар оснований вверх по течению от 5-футового участка разреза и десять пар оснований ниже по течению от 3-футового участка разреза, в этом случае с использованием стандартизированных последовательностей грунтовки M13 (грунтовки являются недорогими запасными элементами). Сайт фермента рестрикции и используемые праймеры находятся на усмотрении пользователя. Тем не менее, пользователь должен убедиться, что последовательности не присутствуют больше нигде в шаблоне (не хотите создавать нежелательные сокращения или сайты инициации усиления). Последовательности шаблонов, используемых в этой работе, подробно описаны в дополнительном материале. Эти шаги используются для изменения на основе этого базового шаблона.

  1. Определите желаемый ген для экспрессии и получите аминокислотную последовательность или генетическую последовательность, если она была экспрессирована в E. coli.
  2. Если это аминокислотная последовательность, выполните оптимизацию кодона для E. coli, используя один из многих стандартных инструментовпоставщика 56. При использовании шаблона, представленного в дополнении, убедитесь, что оптимизированная последовательность не имеет сайтов ограничения HindIII (AAGCTT). В случае, если это так, продолжайте оптимизировать последовательность до тех пор, пока больше не будет сайта HindIII.
  3. Скопируйте последовательность и вставьте ее в предоставленный шаблон для дополнительной последовательности #1, где указан интересующий ген. При выражении sfGFP используйте дополнительную последовательность #1 как есть. Если экспрессируется субтилизин, используйте дополнительную последовательность No 2 как есть.
  4. Закажите минимальный шаблон и необходимые праймеры из предпочтительной службы синтеза ДНК.

2. Повторное использование фрагмента гена и праймеров

ПРИМЕЧАНИЕ: После получения фрагмента гена следуйте протоколам производителя для повторного суспендирования или используйте это простое руководство для создания запаса ДНК.

  1. Центрифугируйте трубку (300 х г в течение 5 с) для сбора гранул ДНК на дне.
  2. Добавьте двойную дистиллированную воду (ddH2O), чтобы получить окончательную концентрацию 10 нг/мкл шаблона ДНК.
  3. Вихрь раствора на средней установке в течение 5-10 с.
  4. Растворить всю гранулу путем инкубации при 50 °C в течение 20 мин.
  5. Ненадолго вихрь снова
  6. Центрифугу при 300 х г в течение 5 с собирают раствор на дне трубки.
  7. Хранить при -20 °C или использовать в ПЦР.
  8. Подготовьте запас праймера объемом 100 мкМ, повторно разместив праймеры в воде без нуклеаз. Чтобы определить количество воды для добавления, умножьте количество наномолей лиофилизированной грунтовки на 10. Например, если трубка содержит 45 нМ лиофилизированного праймера, добавьте 450 мкл ddH2Oи вихрь раствора.
  9. Храните стандартные растворы грунтовки при -20 °C или продолжайте выполнять усиление.

3. Амплиация фрагмента гена с помощью ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: Решите, какой набор ПЦР подходит для интересующего гена. Меньшие гены (<1000 кб) могут быть более поддающимися более дешевой полимеразе Taq, в то время как более крупные гены (≥1000 кб) могут извлечь выгоду из полимеразы высокой точности для уменьшения ошибок. Важно отметить, что эта начальная амплификация ПЦР не является необходимой, если пользователь не заинтересован в сохранении исходного фрагмента гена (она обеспечивает множественные попытки циркуляризации и позволяет проводить сравнительные исследования продукта LET и RCA). Также важно отметить, что этот амплифицированный ПЦР LET может быть использован непосредственно в реакциях; однако, как упоминалось во введении, это позволило бы лишь ограниченное число реакций, если бы дальнейшие этапы усиления были проигнорированы. Пищеварение и лигирование могут быть выполнены на повторно суспендированном фрагменте гена непосредственно57 (если кто-то уверен, им не понадобится больше LET для выполнения дополнительных циркуляризации запасов). Если это так, пропустите раздел 3 и перейдите к разделу 4. Для выполнения ПЦР выполните следующие действия.

  1. Используйте запасы 100 мкМ из шага 2.8 для создания рабочих решений 10 мкМ. Многие протоколы наборов ПЦР требуют 10 мкМ растворов праймеров.
  2. Запрограммируйте тепловой циклер на проведение реакции в соответствии с протоколами производителя комплекта. Различные комплекты требуют немного различных параметров цикличности. Для комплекта, указанного в Таблице материалов,условия составляют 94 °C для 30 с начальной денатурации; 30 циклов 94 °C для 30 с денатурации, 45 °C для 30 с отжига грунтовки и 68 °C для 60 с расширения; с окончательным удлинением при 68 °C в течение 5 мин; и, наконец, бессрочное удержание при температуре 10 °C.
    1. Убедитесь, что выбрано правильное время удлинения (переменное в зависимости от длины амплодируемого гена). Имеют время удлинения 1 мин на каждые 1000 бп.
    2. Убедитесь, что введена правильная температура отжига грунтовок. Используйте онлайн-калькулятор Tm, который использует обе грунтовки в качестве входных данных для определения наилучшей температуры отжига58. Температура отжига 45 °C достаточна при использовании грунтовок M13.
    3. При определении количества циклов обращайтесь к протоколу производителя, но 30 циклов чаще всего приводят к достаточному усилению.
  3. При выполнении ПЦР оттаивают и вихревые дНТП. Используйте буфер ПЦР, входящий в комплект.
  4. В одной ПЦР-трубке объедините все компоненты комплекта в соответствии с протоколом производителя. Чтобы обеспечить успешную амплификацию, добавьте 1 мкл ресуспендированного запаса ДНК (шаг 2.6).
  5. Мягко гомогенизируйте смесь путем вихря на среде установки в течение 5-10 с. В качестве альтернативы, пипетка вдвое меньше объема вверх и вниз в 10-20 раз до вихря.
  6. Выполните реакцию ПЦР.
  7. Если протокол ПЦР не включал заключительную стадию охлаждения, дайте реакции остыть в течение 5 мин при 10 °C перед удалением, чтобы привести конденсацию в нижнюю часть трубки.
  8. Очистите реакцию с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями поставщика.
    1. В пробирке объемом 1,5 мл добавьте буфер связывания ДНК и образец ПЦР в соотношении 5:1 соответственно.
    2. Перенесите эту смесь в спиновую колонну и центрифугу при 16 000 х г в течение 1 мин. Отбросьте сквозной поток.
    3. Добавьте в колонку 200 мкл буфера промывки ДНК и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин.
    4. Центрифугу в течение 1 мин при 16 000 х г и отбросьте проточную.
    5. Повторите шаги 2.8.3 и 2.8.4 без 1-минутной стадии инкубации.
    6. Центрифуга на дополнительные 1-2 мин при 16 000 х г для удаления оставшегося буфера.
    7. Элюируют ДНК в 46 мкл ddH2O.
  9. Количественно оцените очищенную ДНК с помощью спектрофотометра.
  10. Сохраните очищенную ДНК при -20 °C или перейдите к следующему шагу.

4. Переваривание и циркуляризация

ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая амплификация может быть достигнута путем циркуляризации ДНК, за которой следует RCA. Переварите ДНК, чтобы подготовить шаблон к циркуляризации. Это удалит последовательности праймеров и создаст липкие концы как на 5', так и на 3' концах шаблона. Прикрепите эти концы с помощью реакции перевязки.

  1. В пробирке ПЦР соедините 5 мкл необходимого буфера, 20 ЕД HindIII и 45 мкл очищенной ДНК со стадии 3.8.
  2. Аккуратно гомогенизируйте эту смесь пипеткой.
  3. Инкубировать смесь в термоциклере в течение 15 мин при 37 °C.
  4. Нагревать инактивировать HindIII путем инкубации в течение 20 мин при 80 °C.
  5. Дайте реакции остыть до 10 °C перед удалением, чтобы вызвать конденсацию на дно трубки.
  6. Добавьте 5 мкл буфера Т4-лигазы и 800 ЕД Т4-лигазы к вновь переваренной ДНК.
    1. При желании используйте Т7-лигазу.
  7. Аккуратно гомогенизируйте эту смесь пипеткой.
  8. Инкубируют смесь в течение 1 ч при 25 °C для проведения реакции циркуляризации.
  9. Очистите реакцию с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями поставщика. Используйте тот же протокол, описанный в шаге 3.8.
  10. Количественно оцените ДНК с помощью спектрофотометра. Ожидаемые значения ~ 20 нг/мкл.
  11. Хранить при температуре -20 °C или перейти к следующему шагу.

5. Изотермическое усиление подвижного круга

ПРИМЕЧАНИЕ: Усиление по подвижному кругу (RCA) может быть выполнено с использованием коммерческого комплекта или с индивидуально приобретенными компонентами. Следование протоколу производителя обеспечит успешное усиление. Наборы обычно содержат буфер образца, реакционный буфер и полимеразу, вытесняющую нити, такую как полимераза φ29. Несколько реакционных трубок могут быть объединены для получения большого количества ДНК для бесклеточной экспрессии (4 мкг из 20 пг исходного материала). Следующий протокол работает эффективно.

  1. В одной пробирке соедините 20 мкл буфера образца, 20 мкл реакционного буфера, 0,8 мкл фермента и 1 мкл шаблона круговой экспрессии (CET) со стадии 4.9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет иметь общую массу ДНК ~ 20 нг, но RCA может работать с количествами пикограммы, что позволяет разбавлять CET и экстремальную ферментативную амплификацию, если есть значительная потребность в материале при скрининге с высокой пропускной способностью.
  2. Гомогенизируйте смесь пипеткой и аликвотой 10 мкл смеси в четыре отдельные пробирки.
  3. Инкубировать при 30 °C в течение 4-18 ч.
  4. Нагревают инактивируют фермент путем инкубации при 65 °C в течение 10 мин. Уменьшите температуру до 12 °C в течение 5 мин, чтобы стимулировать конденсацию в нижней части трубки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проще всего объединить все температурные ступени в автоматизированном протоколе на тепловом цикле.
  5. Разбавляют полученным раствором, добавляя в каждую пробирку по 15 мкл ddH2O.
  6. Соедините все трубки и добавьте непосредственно к бесклеточной реакции.
  7. При желании используйте набор для очистки ПЦР для очистки продукта и элюляции его в 36 мкл ddH2Oдля количественной оценки. Убедитесь, что концентрация шаблона составляет ~100 нг/мкл.

6. Бесклеточная реакция

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните бесклеточную экспрессию, объединив энергетический буфер, извлечение и шаблон RCA. Типичная бесклеточная реакция с использованием энергетического буфера PANOx-SP состоит из 1,2 мМ АТФ, 0,85 мМ каждого GMP, UMP и CMP, 30 мМ фосфоенолпирувата, 130 мМ глутамата калия, 10 мМ глутамата аммония, 12 мМ глутамата магния, 1,5 мМ спермидина, 1 мМ путресцина, 34 мкг/мл фолиевой кислоты, 171 мкг/мл смеси ТРНК E. coli, 2 мМ каждая из 20 немаркированных аминокислот, 0,33 мМ NAD, 0,27 мМ коэнзима А (CoA), 4 мМ оксалата калия, 57 мМ буфера HEPES-KOH (рН 7,5), 0,24% объема экстракта E. coli и переменных количеств ДНК23,49. Объем реакции может варьироваться, но реакции 15 мкл могут сэкономить на использовании реагентов и достаточно малы для использования в 384 черностенной микропластине49,50.

  1. При экспрессии флуоресцентного белка, такого как sfGFP, подготовьте считыватель пластин для чтения при желаемом возбуждении/выбросе, температуре и перемешивании.
  2. При использовании плиты из 384 скважин аликвотирует 60 мклH2Oв скважины, граничащие с пустой пробной скважиной, для поддержания влажности и уменьшения эффекта кромки.
  3. Добавьте различные необходимые компоненты в пробирку для каждого образца. Добавьте достаточно, чтобы выполнить трипликаты. Реплики внутри пластины могут помочь определить причины изменчивости.
    1. Добавьте экстракт, энергетический буфер, а затем ДНК.
    2. Разбавить до конечного желаемого объема с ddH2O.
  4. Тщательно перемешайте этот раствор, пипетируя половину объема раствора вверх и вниз 10-20 раз.
  5. Перенесите реакционную смесь в 15 мкл аликвот в нужные лунки в микротитерной пластине.
  6. Запечатайте пластину бесцветной уплотнительной пленкой для поддержания влажности и предотвращения испарения.
  7. Поместите герметичную пластину в считыватель пластин и дайте реакции завершиться.
    1. Если экспрессируется белок, который не имеет возможности контролироваться вживую, используйте другой аппарат с контролируемой температурой, такой как термоблок, для инкубации пластины.

7. Субтилизиновый анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспрессируется ген субтилизина BPN' (SBT(n)) в дополнительной последовательности No 2,следуйте этому протоколу для анализа активности.

  1. Приготовьте 10 мкМ запасного раствора N-сукцинил-ала-ала-про-Фе п-нитроанилида в диметилформамиде (ДМФ).
  2. Установите пластинчатый считыватель для измерения поглощения при 410 нм каждые 20 с в течение 10 мин при сохранении температуры 25 °C.
  3. В плоском дне бесцветная 96-луночная пластина, аликвота 94 мкл ddH2Oи 1 мкл N-сукцинил-ала-ала-про-фе п-нитроанилида со стадии 7.1.
  4. Добавьте 5 мкл готовой бесклеточной реакции со стадии 6.7 и прочитайте с помощью пластинчатого считывателя, установленного в протоколе, описанном на этапе 7.2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Экспрессия sfGFP из шаблонов RCA была сопоставима с экспрессией плазмиды pJL1 при использовании только 0,30 мкл неочищенной RCA-ДНК в реакции 15 мкл(рисунок 2A). Фактически, удвоение и утроение количества шаблона, по-видимому, не приносит никакой пользы в экстракте BL21 DE3 Star, предполагая уже насыщенные уровни шаблона на уровне 0,30 мкл за реакцию. И наоборот, по-видимому, увеличение количества шаблона RCA при добавлении к экстракту клетки, полученному из штамма SHuffle(рисунок 2B)28. Для некоторых белков результаты можно наблюдать очень быстро, что сжимает весь рабочий процесс (амплификация и анализ) до менее чем 24 ч. Однако некоторые белки требуют более низкой температуры или имеют более медленное время сворачивания, что увеличит время до получения результатов, но повлияет на рабочий процесс, представленный здесь. Это можно наблюдать при экспрессии субтилизина (SBT(n)), когда анализ после 4 ч экспрессии не был достаточно длинным для созревания SBT(n)(рисунок 3A,пример неудачного результата). Если позволить реакции продолжаться до 16 ч, это может привести к обнаруживаемым уровням SBT(n)(рисунок 3B). Это улучшение может зависеть от температуры, как это наблюдалось в литературе, где были исследованы оптимизированные температурные условия59,60.

Figure 1
Рисунок 1:Репрезентативная схема минимального генетического шаблона и процесса, которому он подвергается после начального этапа амплификации ПЦР. Шаблоны перевариваются с помощью HindIII, циркуляризируются Т4-лигазой и далее усиливаются полимеразой φ29 для создания больших конкатемеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Результаты бесклеточных реакций с неочищенными 5 нМ плазмиды (pJL1), 5 нМ линейного шаблона (LET) и изменяющимися концентрациями неочищенной RCA. RCA #1, #2 и #3 содержали 0,3 мкл, 0,6 мкл и 0,9 мкл (соответственно) неочищенного продукта RCA в реакции 15 мкл, инкубированной при 30 °C (n = 3). Полосы ошибок представляют ± 1 SD от среднего значения. Ось Y — это флуоресценция, а ось X — это время, прошедшее во время реакции. Кинетика выражения sfGFP представлена в(A)BL21 DE3 Star и(B)T7 SHuffle. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Бесклеточные реакции с 5 нМ SBT(n) LET и изменяющимися концентрациями неочищенного продукта RCA. RCA ng и pg соответствуют концентрации ДНК, используемой для выполнения амплификации по скользящему кругу. Неочищенный продукт RCA использовали в реакции 15 мкл, инкубированной при 30 °C (n = 3). Полосы ошибок представляют ± 1 SD от среднего значения. Ось Y — это поглощение при 410 нм, а ось X — это количество времени, прошедшее в анализе. Реакции проводились в течение(A)4 ч и(B)16 ч. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Метод клонирования
ПЦР 2 -4 ч
Плазмидное сбраживание 35 мин
Лигатура 1 ч
Преобразование 2 ч
Ночная инкубация 16 ч
Секвенирование 24 - 48 ч
Подготовка глицерина 16 ч
Рост и очищение 16 ч
Общее время 46 - 72 ч
Метод RCA
ПЦР 2 - 4 ч
Пищеварение 35 мин
Лигатура 1 ч
РКА 4 - 18 ч
ДОВСЕ 4 - 16 ч
Общее время 12 - 40 ч

Таблица 1: Сравнение временной шкалы между упрощенным традиционным протоколом клонирования и протоколом RCA, рассматриваемым в настоящем документе.

Дополнительный файл: дополнительный файл перечисляет последовательности. Последовательность No 1 — sfGFP (999 пар оснований), а последовательность No 2 — субтилизин BPN' (1344 bp). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Интересующим геном может быть любой желаемый белок, но лучше всего начать с флуоресцентного белка в качестве удобного репортера для считывания в режиме реального времени или конечной точки на считывателе пластин для новых пользователей этого метода. Для новых белковых последовательностей скопируйте аминокислотную последовательность нужного белка и вставьте ее в нужный инструмент оптимизации кодона61,62. Обычно в инструменте оптимизации кодонов много доступных организмов и штаммов E. coli, но выбор общего варианта Escherichia coli будет подходящим. После оптимизации дважды проверьте ген, чтобы убедиться, что ранее выбранный участок разреза и последовательности праймера отсутствуют. Если это так, последовательность может быть оптимизирована до тех пор, пока последовательности больше не будут присутствовать. В некоторых ситуациях может потребоваться замена участков разреза HindIII другим сайтом ограничения, если повторная оптимизация последовательно приводит к внутреннему сайту разреза HindIII. Лучше всего использовать один и тот же участок разреза как можно чаще, чтобы поддерживать стандартизированный процесс и снизить стоимость хранения нескольких ферментов рестрикции под рукой.

Перед началом амплификации выберите комплект ПЦР, который лучше всего подходит для LET. LET с <1000 парами оснований может быть усилен простой полимеразой Taq, в то время как LET с ≥ 1000 парами оснований может потребовать полимеразы63с более высокой точностью. Настройте протокол усиления в соответствии с производителем комплекта и температурой отжига нужных грунтовок. Температура отжига имеет решающее значение для успешного усиления. Общее эмпирическое правило заключается в выборе температуры отжига, которая на 5 ° C ниже, чем Tm грунтовок. Существуют бесплатные онлайн-инструменты, которые обеспечат оптимизированную температуру отжига на основе последовательности грунтовок58. Использование правильной температуры отжига имеет решающее значение для получения высококачественного шаблона ДНК.

Бесклеточная экспрессия генов в последние годы пережила ренессанс из-за ее скорости, простоты и полезности для прототипирования синтетической биологии. В этой работе изложен метод увеличения скорости и легкости при тестировании большой библиотеки новых, функциональных белков. В то время как традиционные методы клонирования могут занимать дни или недели, этот протокол может быть выполнен менее чем за 24 ч. В таблице 1 показаны типичные временные диапазоны как для традиционного клонирования, так и для протокола RCA. Обратите внимание, что протокол клонирования был упрощен, а некоторые необязательные шаги были исключены, такие как изоляция геля. В таблице 1 также упоминаются только общие протоколы переваривания ограничений; существует множество других методов клонирования, но они требуют аналогичного количества времени. Верхний диапазон этого протокола ферментативного усиления требует меньше времени, чем нижний диапазон метода клонирования, особенно при рассмотрении 8-часового рабочего дня. Во многом это связано с удалением ночных инкубаций и отсутствием подтверждения последовательности. Протокол RCA полностью основан на ПЦР и RCA, которые требуют менее специализированных навыков, чем традиционные методы клонирования, трансформации и культивирования клеток. Этот метод делает бесклеточную экспрессию доступной для лабораторий, которые не имеют предыдущего опыта клонирования или доступа к капиталу, необходимому для преобразования и выращивания клеток. Этот метод также хорошо подходит для проектов, ориентированных на цитотоксические белки, где клонирование и распространение генов с традиционным клонированием затруднено из-за токсичности в живой клетке. Этот протокол RCA также способен амплифицировать очень небольшие количества круговой ДНК (пикограммы ДНК) до уровней, необходимых для CFE. На рисунке 3Bциркуляризированный шаблон SBT(n) был разбавлен до 20 нг/мкл и 20 пг/ул до RCA. Хотя наблюдаемые скорости деградации были разными, обе реакции приводили к одинаковому количеству деградации субстрата в течение 10 мин. Предлагаемый метод не предназначен для замены клонирования; Распространение плазмид может производить количество ДНК для нетоксичных генов, которые не могут быть сопоставлены. Скорее, это удобный инструмент прототипирования на этапе массового библиотечного скрининга (ферментативные этапы поддаются автоматизации со стандартным обработчиком жидкости), который поможет определить, какие последовательности должны быть клонированы для архивирования и дальнейшего распространения.

При разработке бесклеточной реакции существует большая гибкость, но есть некоторые факторы, которые необходимо учитывать для обеспечения успеха. Меньшие реакции имеют большее отношение площади поверхности к объему, что отлично подходит для газообмена, но реакция должна полностью покрыть дно скважины для точных флуоресцентных измерений. Температура реакции также может изменяться в зависимости от интересующегогена 59. Существует несколько вариантов для пользователей, когда дело доходит до выбора энергетического буфера34,46. Некоторые рецепты стоят дороже других, но решение остается за пользователем. Существует также много потенциальных источников экстракта E. coli 36. Пользователи должны ознакомиться с протоколами производства экстрактов и решить, какой из них лучше всего подходит для их целей28,48,50,64,65,66,67.

При использовании RCA для усиления шаблонов для бесклеточной экспрессии выбор бактериального штамма очень важен. Профиль выражения, как правило, лучше, чем у LETs. Популярная деформация BL21 DE3 Star хорошо справляется с этим, причем RCA работает примерно в 1,4 раза лучше, чем LET, а плазмида pJL1 работает примерно в 1,2 раза лучше, чем лучшая концентрация RCA(рисунок 2A). С другой стороны, некоторые штаммы демонстрируют деградацию шаблона и плохо работают из-за наличия нативных нуклеаз23,28. В этом случае, похоже, что штамм SHuffle выигрывает от увеличенного шаблона RCA. Предыдущая литература показала, что экстракт SHuffle плохо работает с продуктами ПЦР, но самая высокая концентрация неочищенного продукта RCA, используемого в этом исследовании, превзошла плазмиду pJL1(рисунок 2B). Экспрессия функционального SBT(n)(рисунок 3)является примером цитотоксического белка, который удобно производится бесклеточным, но трудно прототипируется в живых клетках из-за токсичности (не может клонировать этот шаблон экспрессии в плазмиде и распространяться в E. coli). В отличие от sfGFP, активность SBT(n) не может наблюдаться только через 4 ч выражения(рисунок 3A). Сигнал обнаруживается через 16 ч экспрессии и созревания(рисунок 3B). Неочищенная ДНК, используемая в этих примерах, была получена из 100 мкл, что представляло собой четыре 10 мкл реакций RCA, разбавленных и объединенных. Этот один запас может поддерживать 333 бесклеточные реакции, если использовать только 0,30 мкл на реакцию.

Совместимость шаблонов RCA с CFE нуждается в дальнейшем изучении с различными выдержками. Потенциальные осложнения с линейными продуктами могут быть облегчены путем добавления коротких олигов, содержащих последовательность E. coli chi или белок GamS52,53. Литература предполагает, что добавление олиго ци может обеспечить большую защиту линейных шаблонов, чем белокGamS 53. При использовании экстракта, который, как известно, обеспечивает низкую доходность из линейных шаблонов, пользователь должен проанализировать стоимость каждого защитного средства и использовать тот, который наилучшим образом соответствует их целям. Другим ограничением является невозможность преобразования концентраций шаблона RCA в молярность из-за природы результирующего конкатемера. Это означает, что можно добавить одинаковое количество минимальных шаблонов на основе массы, но они будут иметь различную длину конкатемера, что может повлиять на уровни выражений. Авторы не обнаружили, что это является проблемой при скрининге / прототипировании, поскольку усредненные уровни экспрессии из каждой скважины одинаковы (низкая дисперсия), но могут быть проблемой при выражении в меньших объемах (например, микрокапли).

Бесклеточная экспрессия генов может быть использована в качестве важного инструмента в прототипировании белка и рабочих процессах проектирования-сборки-тестирования. Тем не менее, большинство рабочих процессов бесклеточной экспрессии по-прежнему полагаются на традиционные плазмиды в качестве генетического шаблона. Это замедляет процесс и удерживает бесклеточную экспрессию от использования в полной мере для целей скрининга / прототипирования. Амплификация шаблонов и последующее выполнение RCA могут быстро производить достаточно генетических шаблонов для многих реакций, производя достаточно белка для последующей характеристики и функционального тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Найджел Руэль входит в научно-консультативный совет BigHat Biosciences Inc., компании, которая использует бесклеточные системы для разработки антител.

Acknowledgments

Авторы признают, что NIH 1R35GM138265-01 и NSF 2029532 для частичной поддержки этого проекта.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), Oxford, England. (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of "difficult-to-express" proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. Addgene: pJL1. , Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021).
  56. IDT Codon Optimization Tool. , Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021).
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. New England Biolabs Tm Calculator. , Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021).
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Tags

Биоинженерия выпуск 172
Быстрые ферментативные методы амплификации минимальных линейных шаблонов для прототипирования белка с использованием бесклеточных систем
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid,… More

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter