Summary
Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.
Abstract
Las células madre mesenquimales (MSC) se han estudiado tradicionalmente por sus propiedades regenerativas, pero más recientemente, sus características inmunorreguladoras han estado a la vanguardia. Interactúan y regulan la actividad de las células inmunes. El enfoque de este estudio es la regulación MSC de la actividad fagocítica de los macrófagos. La fagocitosis de macrófagos (MΦ) es una parte importante de la respuesta del sistema inmune innato a la infección, y los mecanismos a través de los cuales msc modulan esta respuesta están bajo investigación activa. Aquí se presenta un método para estudiar la fagocitosis MΦ de partículas de zymosan no opsonizadas conjugadas a una molécula fluorescente sensible al pH mientras están en coculto con MSC. A medida que aumenta la actividad fagocítica y las partículas de zymosan etiquetadas están encerradas dentro del ambiente ácido del faglisosoma, la intensidad de fluorescencia de la molécula sensible al pH aumenta. Con las longitudes de onda de excitación y emisión apropiadas, la actividad fagocítica se mide utilizando un espectrofotómetro fluorescente y los datos cinéticos se presentan como cambios en las unidades fluorescentes relativas durante un período de 70 minutos. Para apoyar estos datos cuantitativos, el cambio en la actividad fagocítica se visualiza utilizando imágenes dinámicas. Los resultados que utilizan este método demuestran que cuando se está en coculto, msc mejora la fagocitosis MΦ de la zymosan no opsonizada de MΦ tanto naïve como IFN-γ tratada. Estos datos se suman al conocimiento actual de la regulación MSC del sistema inmune innato. Este método se puede aplicar en futuras investigaciones para delinear completamente los mecanismos celulares y moleculares subyacentes.
Introduction
Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras que dan lugar a células de tejido conectivo. Los MSC están presentes en tejidos de mamíferos adultos y se pueden aislar de la médula ósea1. Debido a sus propiedades inmunomoduladoras, estas células son ampliamente estudiadas2. Los primeros estudios se centraron en la regulación MSC de las células T3,4,5,6, pero más recientemente, su regulación de las células macrófagos (MΦ), un componente celular importante de la inmunidad innata, ha recibido una mayor atención7,8,9,10,11,12,13,14 . La importancia de la interacción MSC-MΦ en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria se ve subrayada por el hecho de que el agotamiento de monocitos/macrófagos abroga los efectos terapéuticos de MSC en modelos animales8. Aquí, el foco es la interacción de contacto celular del MSC con MΦ. Los MSC tienen la capacidad de regular el fenotipo de MΦ promoviendo el cambio de respuestas inflamatorias a antiinflamatorias, lo que lleva a actividades de reparación de tejidos8,9,10,11,y se ha hecho mucho para demostrar estos mecanismos reguladores. En otras circunstancias, MSC puede apoyar o exacerbar una respuesta inflamatoria impulsada por MΦ12,13 y mejorar la actividad fagocítica de MΦ14,15. Sin embargo, existe una falta crítica de datos existentes que identifiquen los mecanismos y las condiciones bajo las cuales MSC regula la actividad fagocítica MΦ.
Los MΦ tienen familias de receptores que reconocen patógenos opsonizados (recubiertos de anticuerpos o complemento) o no opsonizados que conducen a la fagocitosis16. La activación y actividad de este último está menos estudiada17. En un ambiente in vitro no inflamatorio, los MSC mejoran la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados13. Sin embargo, el reconocimiento de patógenos no opsonizados por MΦ puede reducirse después de la exposición a un ambiente inflamatorio producido por linfocitos durante una respuesta inmune adaptativa. El IFN-γ, liberado por las células asesinas naturales y los linfocitos efectores, tiene un efecto inhibidor sobre la fagocitosis MΦ de partículas no opsonizadas18. Se desarrolló un modelo de coculto para estudiar los mecanismos de regulación del contacto directo MSC de la fagocitosis MΦ. El objetivo del experimento presentado aquí es determinar si los MSC regulan la fagocitosis MΦ de patógenos no opsonizados después de que MΦ haya sido expuesto al IFN-γ(Figura 1).
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Protocol
NOTA: Todas las técnicas de preparación de medios y cultivo celular se llevan a cabo en condiciones asépticas utilizando un gabinete de bioseguridad con flujo laminar. Todas las etapas de incubación del cultivo descritas se llevan a cabo utilizando una incubadora diseñada para mantener una atmósfera de 37 ° C, 5% de CO2y 95% de humedad.
1. Cultivo celular
- Preparación del medio de crecimiento
- Para MSC y LADMAC, agregue 50 ml de FBS y 5 ml de mezcla de antibióticos / antimicóticos 100x a 500 ml de DMEM de glucosa alta.
- Para el MΦ, añadir 50 ml de FBS, 100 ml de medio de condición LADMAC (preparado siguiendo los pasos de la sección 1.2) y 5 ml de mezcla antibiótica 100x a 500 ml de DMEM de glucosa alta.
NOTA: Las células LADMAC producen el factor estimulante de colonias (CSF-1) necesario para apoyar el crecimiento de las células MΦ.
- Preparación de medio acondicionado LADMAC
- Para sembrar células LADMAC procedentes de material congelado, añadir 19 ml de medio de crecimiento de la sección 1.1 en cada uno de los cinco matraces tratados con cultivo celular T75 cm2 y colocar en la incubadora de cultivo celular durante 15 min para equilibrar a 37 °C.
- Mientras tanto, descongele rápidamente una alícuota de 106 células congeladas incubando en un baño de agua de 37 ° C durante 2-3 min o hasta que se descongele. Agregue las células a 9 ml de medio de crecimiento MSC fresco en un tubo cónico estéril de 15 ml o 50 ml y centrífuga a 125 x g en un rotor de cucharón oscilante durante 5 minutos.
- Aspire o decante el sobrenadante, agregue 5 ml de medio de crecimiento fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para volver a colocar el pellet celular.
- Añadir 1 ml de suspensión celular a cada uno de los cinco matraces T75 cm2 utilizando una pipeta serológica estéril y colocarlos en la incubadora de cultivo celular.
- Cada 2-3 días, agregue 10 ml adicionales de medio durante un período de 7 a 10 días. Luego, recoja las células y el sobrenadante en tubos cónicos estériles de 50 ml utilizando una pipeta serológica estéril y una centrífuga a 125 x g durante 5 min.
- Separe el sobrenadante del pellet celular y filtre estérilmente el sobrenadante utilizando una unidad de filtro de vacío estéril de un solo uso de 0,2 μm.
- Retire el conjunto del aspirador del paquete y conéctelo mediante tubos de vacío a la bomba del aspirador. Vierta el sobrenadante en el compartimento superior y reemplace la cubierta. Encienda la bomba aspiradora para filtrar en el compartimento inferior.
- Preparar las alícuotas pipeteando en tubos cónicos estériles de 50 ml y almacenar a -20 °C.
- Para congelar el pellet celular, vuelva a colocarlo en un medio de congelación a 106 celdas/ml, colóquelo en un recipiente de congelación y luego colóquelos en un congelador de -80 °C. Después de 24 h, transfiera al almacenamiento LN2.
- Propagar células en preparación para el coculto
- Para sembrar células MSC y MΦ de la población congelada, equilibrar 9 ml de medio de crecimiento apropiado preparado en la sección 1.1 en cada una de las cuatro antenas tratadas con cultivo celular de 100 mm para cada tipo de célula y colocar en la incubadora de cultivo celular durante 15 min.
- Mientras tanto, descongele rápidamente las alícuotas de 106 células congeladas incubándolas en un baño de agua de 37 ° C durante 2-3 minutos o hasta que se descongelen. Luego, agregue las células MSC descongeladas a 9 ml de medio de crecimiento MSC fresco y agregue las células MΦ descongeladas a 9 ml de medio de crecimiento MΦ fresco en tubos cónicos estériles de 15 o 50 ml y centrífuga a 125 x g en rotor de cucharón oscilante durante 5 minutos.
- Aspire o decante el sobrenadante y resuspante cada pellet en 4 ml del medio de crecimiento fresco apropiado mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo. Añadir 1 ml de suspensión celular a cada uno de los cuatro platos de 100 mm para cada tipo de célula que se han equilibrado en el paso 1.3.1.
- Devuelva los platos con células a la incubadora. Cambie el medio cada 2-3 días hasta que el 70%-80% sea confluente.
2. Semilla MSC en platos experimentales, Día 1
NOTA: Antes de sembrar el MSC, diseñe el diseño experimental de la placa de 96 pozos para espectrofotometría fluorescente y la diapositiva de cámara para imágenes dinámicas. Para la placa de 96 pozos, flanquee los pozos experimentales con pozos que contienen células, pero no los use en el ensayo. Marque al menos cuatro pozos que se utilizarán para el reactivo en blanco (RBL). Consulte la Tabla 1 para ver una plantilla de ejemplo de 96 pozos y la Tabla 2 para un ejemplo de una plantilla de diapositiva de cámara de 4 pozos. Se recomiendan placas negras o blancas de 96 pozos con fondos transparentes. Un portaobjetos de cámara de vidrio de borosilicato de 1,5 mm es óptimo, pero el número de cámaras se puede ajustar dependiendo del diseño del estudio. En la figura 2se incluye un diagrama de flujo resumido de los métodos siguientes.
- Con una confluencia del 70%-80%, aspire el medio de crecimiento de los cultivos en platos de 100 mm y agregue 5 ml de PBS para aislar el MSC.
- Aspire el PBS, agregue 2 ml de tripsina / EDTA al 0.05% y colóquelo en la incubadora de cultivo durante 3-5 min.
- Después de 3 min, verifique el desprendimiento celular con un microscopio invertido. Si las celdas están separadas, continúe con el siguiente paso; de lo contrario, continúe la incubación durante otros 1-2 minutos. No incubar más de 5-6 min.
- Agregue 5 ml de medio de crecimiento fresco al plato con las células separadas. Enjuague el plato con la mezcla de tripsina / medio y recolecte las células en un tubo cónico limpio y estéril de 50 ml con una pipeta serológica estéril.
- Centrífuga durante 5 min a 125 x g. Aspire el sobrenadante y resuspante el pellet celular en 10 ml de medio de crecimiento fresco mediante el pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo.
- Para contar las células, agregue 10 μL de la suspensión celular a 30 μL de solución de azul de tripano al 0,4% en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Luego, pipetee 10 μL de la mezcla debajo de la cubierta de una cámara de conteo de hemocitómetros.
- Usando un microscopio de campo invertido o brillante, con el objetivo 10x, cuente las células no teñidas (viables) en cuatro de los cuadrados de 1 mm2. Calcule el número de celda utilizando la fórmula: celdas/mL = recuento de celdas/# 1 mm2 cuadrados x factor de dilución x 104.
NOTA: Para este ejemplo, el número de 1 mm2 cuadrados contados es cuatro, y el factor de dilución es 4. - Utilice la ecuación C1V1 = C2V2 para calcular y preparar una suspensión de 1 x10 5 celdas/ml. Prepare 1 ml de suspensión de celda/ml para cada columna de la placa de 96 pozos que se llena y 0,75 ml para cada cámara de la corredera de la cámara de 4 pozos que se llena de acuerdo con el diseño de la placa.
NOTA: C1 = recuento de celdas, V1 = lo que se está calculando, C2 = 1 x10 5, V2 = 5.50 mL. - Determine V1, reste de los 5,50 ml deseados del volumen total para determinar el volumen del medio fresco necesario para preparar la suspensión. Añadir el volumen de celdas (V1) de la suspensión original al volumen de medio fresco para un total de 5,50 mL con 1 x 105 celdas/mL.
- Agregue 100 μL de suspensión de 1 x10 5 celdas/ ml a cada pozo de la placa de 96 pozos de acuerdo con el diseño de la placa utilizando un micropipetador multicanal y 530 μL a cada uno de los pozos de la corredera de la cámara utilizando una micropipeta de acuerdo con el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
NOTA: Para este experimento, los MSC están chapados en las columnas 1, 2, 3 y 6 de la placa de 96 pozos(Tabla 1)y los pozos 1 y 2 de la diapositiva de la cámara de 4 pozos(Tabla 2). Por lo tanto, se preparan al menos 5,50 ml de una suspensión de 1 x10 5 celdas/ml. Los MΦ al 80% de confluencia se tratan con mediadores inflamatorios el mismo día en que se siembran los MSC en las placas experimentales.
3. Activar el MΦ con IFN-γ, Día 1
- Preparar el medio de activación y el stock de IFN-γ.
- Para 200 ml de medio de activación, agregue 40 mg de BSA a 200 ml de DMEM de glucosa alta sin suero y filtro estéril utilizando una unidad de filtro de vacío estéril de un solo uso de 0,2 μm.
- Para preparar BSA/PBS al 0,1%, agregue 20 mg de BSA a 20 ml de PBS. Vórtice para disolver. Utilice un filtro de jeringa estéril de 0,2 μm para filtrar en un tubo cónico limpio y estéril de 50 ml.
- Añadir 1 ml de la solución estéril de BSA/PBS al 0,1% a 100 μg de IFN-γ liofilizado para lograr una solución de 100 μg/ml de stock. Conservar en alícuotas de 50 μL a -20 °C.
- Activar el MΦ con IFN-γ
- Añadir 2,5 μL de 100 μg/mL de material de IFN-γ por cada 1 ml del medio necesario. Por cada plato de 100 mm que se va a activar, preparar 10 ml de medio de activación que contenga IFN-γ a una concentración de 250 ng/ml.
- Aspire el medio de crecimiento de los cultivos MΦ y reemplácelo con 5 ml del medio de activación sin IFN- γ para enjuagar.
- Aspire el medio utilizado para el enjuague y reemplácelo con 10 ml de IFN- γ medio de activación suplementado para el plato experimental y con 10 ml de medio de activación no suplementado para el control. Incubar los cultivos durante 16-24 h.
4. Aislar el MΦ y preparar los co-cultivos, Día 2
- Retire el medio de activación de las células MΦ y reemplácelo con 5 ml de medio de crecimiento fresco. Raspe suavemente con un elevador de células y recoja las células en un tubo cónico de 50 ml.
- Cuente las células utilizando la exclusión azul tripano y la hemocitometría como se describe para MSC en, pasos 2.6-2.7.
- Usando la ecuación en los pasos 2.8-2.9, prepare dos suspensiones separadas de 2 x 105 células / ml, una con células del control y otra con células de los cultivos de MΦ tratados.
NOTA: Prepare 1 ml de suspensión de celda/ml para cada columna de la placa de 96 pozos que se llena y 0,75 ml para cada cámara de la corredera de la cámara de 4 pozos que se llena de acuerdo con el diseño de la placa. - Aspire suavemente el medio desde los pozos experimentales de la placa de 96 pozos que contiene MSC. Utilizando una micropipeta multicanal, agregue 100 μL de las suspensiones de células MΦ tratadas y de control en los pozos experimentales apropiados con y sin MSC de acuerdo con el diseño de la placa. Incubar durante la noche.
- Aspire suavemente el medio desde el portaobjetos de la cámara de 4 pozos que contiene MSC y, utilizando una micropipeta, agregue 530 μL de suspensión de células MΦ a los pozos apropiados de acuerdo con el diseño. Incubar durante la noche.
5. Ensayo de fagocitosis, lectura cinética fluorescente de 96 póyes, día 3
- Establecer los parámetros del ensayo
- El día del ensayo, encienda el lector de placas fluorescentes y ajuste por computadora la temperatura del sistema a 37 ° C.
- Abra el software system Pro y verifique el icono del instrumento en la esquina superior izquierda para determinar si el instrumento está conectado a la computadora. Si el círculo rojo con una línea está visible, haga clic en el icono del instrumento y elija el instrumento en la ventana emergente para realizar la conexión.
- Seleccione Nuevo experimento para acceder a la ventana emergente Ayudante de configuración de placas. En el menú Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar los ajustes de adquisición.
- Seleccione Monocromador en el menú de configuración de la configuración óptica. Seleccione FL (fluorescencia) para el modo de lectura y Kinetic para el tipo de lectura.
- En la misma ventana de configuraciones, en Categoría, haga clic en Longitudes de onday, a continuación, establezca los anchos de banda en 9 nm para la excitación y 15 nm para la emisión.
- Establezca el número de pares de longitud de onda en 1. Establezca las longitudes de onda LM1 a 510 nm para la excitación y a 540 nm para la emisión.
- Continúe por las categorías y seleccione Tipo de placa a continuación. Seleccione la opción que coincida con el tipo de placa que se está utilizando.
NOTA: Es importante que la selección coincida con el tipo de placa. Las alturas de lectura son establecidas por el sistema de acuerdo con la selección. - A continuación, seleccione Área de lectura y resalte el área de la placa de 96 pozos incluida en el diseño experimental.
- Seleccione PMT y Óptica,establezca GANANCIA DE PMT en Alta y Destellos por lectura en 6. Marque la casilla junto a Leer desde abajo si usa una placa de fondo transparente.
- Seleccione Temporización y establezca intervalos de 10 minutos durante un período de 70 minutos.
- Seleccione Agitar, marque la casilla Antes de la primera lectura y establezca en 5 s. Marque la casilla Entre lecturas y establezca 3 s. Ajuste la intensidad de agitación tanto para Bajo como para Lineal.
- Cierre la ventana. Cuando aparezca la ventana Ayudante de configuración de placas, seleccione Configurar el diseño de placas. Resalte los pozos BL del diseño de la placa y haga clic en Plate Blank.
- Resalte cada una de las filas experimentales, haga clic en Agregar,asigne un nombre al grupo y, a continuación, seleccione un color.
- En Opciones de asignación debajo del diseño de la placa, seleccione Seriey, a continuación, defina la serie en la ventana y haga clic en Aceptar. Repita para cada grupo.
- Preparar la suspensión zymosan
- Mientras espera que la temperatura del sistema alcance los 37 °C, resuspenda 1 mg de partículas de zymosan en 5 ml del medio de imágenes de células vivas.
- Agregue 1 ml de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene las partículas y recójalas en un tubo de cultivo de vidrio. Enjuague el vial con 1 ml adicional de solución de imágenes y transfiéralo al mismo tubo de vidrio para asegurarse de que se transfieran todas las partículas. Agregue 3 ml de solución de imagen adicional para lograr una suspensión de partículas de 0,2 mg/ml.
- Vórtice con pulsos rápidos para 30-60 s. Luego, use un sonicador de sonda para sonicar con 60 pulsos rápidos.
NOTA: Es muy importante crear una suspensión homogénea de partículas y no dejar que la suspensión repose demasiado tiempo antes de agregarla a los pozos experimentales. La aglomeración se repite rápidamente. La densidad de partículas por célula puede necesitar ser optimizada dependiendo de la fuente, el tratamiento y la densidad de MΦ utilizada. En los estudios presentados se utilizaron partículas de zymosan conjugadas. Sin embargo, E. coli conjugada y S. aureus también están disponibles.
- Mientras espera que la temperatura del sistema alcance los 37 °C, resuspenda 1 mg de partículas de zymosan en 5 ml del medio de imágenes de células vivas.
- Añadir zymosan y leer el plato
- Aspire el medio de los pozos experimentales y enjuague 1x con 100 μL de la solución de imágenes de células vivas. Enjuague los pozos RBL con la solución de imágenes de células vivas también.
- Aspirar la solución de imágenes de células vivas de pozos experimentales y RBL y sustituirla por 100 μL de la suspensión de partículas de zymosan preparada en la sección 5.2.
- Abra la bandeja de placas del lector fluorescente utilizando la interfaz del panel táctil. Coloca la placa, sin tapa, en la bandeja con el pozo A1 en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde Leer en el menú superior.
- Cuando se complete la lectura, guarde el archivo en la carpeta correspondiente y exporte los datos en un formato de hoja de cálculo haciendo clic en Archivo y seleccionando Exportar.
- Calcule la media ± fluorescencia relativa SEM para cada grupo de réplica en cada punto de tiempo (10 min, 20 min, 30 min, etc.) en la hoja de cálculo(Archivo complementario 1)y transfiera los datos al software de gráficos.
- Utilice un formato de gráfico de líneas para presentar los datos y aplicar ANOVA bidireccional (Time x Treatment/MSC as factors) seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey para determinar las diferencias entre los grupos individuales.
NOTA: Mientras la lectura de la placa de 96 pozos está en curso, prepare la placa de imagen dinámica para la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Asegúrese de que la imagen dinámica proceda con el análisis de un pozo experimental a la vez.
6. Ensayo de fagocitosis, imágenes dinámicas, Día 3
- Encienda el sistema de imágenes y la computadora. Haga doble clic para abrir el software. Seleccione el modo de programa Pro.
- Verifique el área del escenario para asegurarse de que no haya muestras presentes y que nada esté impidiendo el movimiento del escenario. Luego, haga clic en Calibrar ahora.
- En el menú Incubación de la barra lateral de la derecha, marque la casilla situada junto a la Unidad H XL y configúrela a 37 °C.
NOTA: Espere hasta que la etapa incubada esté casi a la temperatura antes de preparar las muestras para la obtención de imágenes. - Enjuagar el primer pozo experimental con 750 μL de medio de imagen y sustituirlo por 400 μL de la suspensión de partículas de zymosan preparada en la sección 5.2. Deje los pozos restantes en el medio de crecimiento.
NOTA: Puede ser necesario volver a ensotrar y sonicar la suspensión de partículas brevemente si se ha asentado durante más de 15 minutos. - Coloque la diapositiva en la etapa incubada del sistema de imágenes. Establezca un temporizador durante 10 minutos.
- Utilice el software de imágenes, seleccione Brightfield en la pestaña Localizar y, a continuación, haga clic en el icono del ocular en la ventana de configuración del sistema a continuación. Con el objetivo 10x en su lugar, use el ocular y la perilla de enfoque para enfocar las células.
- Seleccione la ficha Adquisición, utilice el menú desplegable Experimento y, a continuación, seleccione un conjunto de longitudes de onda que incluya el conjunto de filtros EGFP para acomodar las longitudes de onda de emisión de excitación de 509 nm y 533 nm del colorante sensible al pH.
- Cuando queden ~ 2 minutos en el temporizador, use el software para cambiar el objetivo a 20x haciendo clic en el icono de 20x en el menú de objetivos.
- Haga clic en el menú Canales, seleccione filtros EGFP y use el menú Exposición para establecer el tiempo de exposición en 400 ms para detectar el fluoróforo verde sensible al pH una vez que se ha encerrado en el faglisosoma.
- Haga clic en Live y ajuste el enfoque usando la perilla de enfoque.
- Haga clic en Detener para apagar la luz y marque la casilla junto a la configuración experimental de lapso de tiempo en la parte superior.
- En el menú Estrategia de enfoque, seleccione Enfoque automático de software. En el menú desplegable del menú Enfoque automático, seleccione Ajustes inteligentes y gruesos para reducir el tiempo de exposición a la luz mientras se ejecuta el enfoque automático.
- En el menú Lapso de tiempo, establezca el número deseado de adquisiciones en 30-60 y el tiempo de intervalo en 1 minuto.
- Después de establecer los parámetros de lapso de tiempo y después de 10 minutos de adición de partículas al primer pozo, haga clic en el botón Iniciar experimento para comenzar la adquisición.
- Cuando la adquisición se complete utilizando el primer pozo experimental, repita los pasos 6.4-6.12 para cada uno de los pozos experimentales restantes.
- Guarde todos los archivos del experimento con la fecha y los parámetros del título en la carpeta correspondiente.
- Cierre el software. Vuelva a abrir el software en modo de procesamiento y exporte los archivos en formato MP4 utilizando el menú Exportar.
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Representative Results
Después de calcular la media ± SEM para cada grupo en todos los puntos de tiempo, los datos se presentan en formato de gráfico de líneas con el eje Y como la intensidad fluorescente relativa y el eje X como tiempo. El archivo complementario 1 proporciona un ejemplo de datos sin procesar de una lectura cinética de la placa de 96 pozos en formato de hoja de cálculo.
En este estudio, los resultados óptimos presentados en la Figura 3Ay la Tabla 3 demuestran que 1) el coculto con MSC mejora la actividad fagocítica del macrófago, 2) el tratamiento con IFN-y reduce la actividad del macrófago, y 3) el coculto con MSC rescata parcialmente la actividad fagocítica de MΦ. Las densidades celulares óptimas son críticas en estos estudios, y cuando los MΦ están chapados a una densidad demasiado baja, no se pueden detectar cambios en la intensidad de la fluorescencia(Figura 3B). La Figura 3C representa los datos de un estudio en el que los MΦ se enchazaron a una densidad demasiado alta y la intensidad de fluorescencia se eleva rápidamente en todos los grupos, y no se pueden discernir diferencias. Los videos de imágenes dinámicas confirman que los cambios de intensidad fluorescente son el resultado de la fagocitosis y no de la acidificación del medio. También proporcionan datos cualitativos y una representación visual de la tasa y el alcance de la actividad fagocítica(Figura 4).
Figura 1: Una ilustración que representa la pregunta central de los datos presentados, que es "¿Puede MSC recuperar la actividad fagocítica de IFN-γ MΦ tratado?". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Visión general del flujo de trabajo de ensayode coculto y fagocitosis. Un esquema del flujo de trabajo para el análisis cuantitativo y cualitativo de la actividad de la fagocitosis MΦ en cocultivo con MSC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Datos cuantitativos representativos de la lectura cinética que demostra resultados óptimos y subóptimos. En (A), los datos son representativos de un experimento con densidad óptima de células MΦ, en (B) los datos son representativos de un experimento con densidad celular MΦ demasiado baja subóptima, y en (C), los datos son representativos de un experimento con densidad celular MΦ subóptima demasiado alta. La intensidad relativa de fluorescencia medida en unidades fluorescentes relativas (RFU) se traza en el eje Y, mientras que el tiempo se traza en el eje X. Tenga en cuenta las diferencias en el rango de RFU entre los experimentos óptimos y subóptimos. En A,MSC rescata parcialmente la actividad fagocítica de MΦ en el contexto de la supresión de IFN-γ durante un período de 70 minutos. La RFU se presenta como media ± el SEM, n = 6. El análisis se realizó utilizando la prueba de comparaciones múltiples de Tukey después de un ANOVA bidireccional significativo, efecto de interacción P = 0,0001, efecto de tiempo P = 0,0001 y efecto de tratamiento/MSC P = 0,0001. Los símbolos denotan los resultados de múltiples pruebas de comparación. * = diferencia significativa entre MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = diferencia significativa entre MΦ vs MΦ + IFN-γ, y † = diferencia significativa entre MSC/MΦ vs MΦ. Consulte la Tabla 3 para obtener resultados detallados de las pruebas de comparación múltiple. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4:Videos de imágenes dinámicas que proporcionan confirmación visual del aumento específico de la célula en la fluorescencia de la activación ácida de partículas de zymosan etiquetadas después de la incorporación al faglisosoma MΦ. Los ajustes de lapso de tiempo se adquieran cada 1 minuto durante un período de 30 minutos utilizando un tiempo de exposición de 400 ms y el conjunto de filtros EGFP. (A) MΦ en monocultivo, (B) MΦ en cocultivo con MSC, (C) MΦ tratado con IFN-γ (250 ng/mL) y (D) MΦ tratado con IFN-γ (250 ng/mL) en cocultivo con MSC. Haga clic aquí para descargar este archivo.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Un | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tabla 1: Ejemplo de un diseño de placa de 96 pozos. CBL - Celda en blanco; MSC - sembrado día 1; MΦ+ tratado y MΦ no tratado sembrado día 2; Reactivo RBL en blanco añadido en el día 3 del ensayo.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tabla 2: Ejemplo de un diseño de diapositiva de cámara de 4 pozos. MSC - chapado día 1; MΦ+ tratado y MΦ no tratado chapado día 2.
| Prueba de comparaciones múltiples de Tukey | Diferencia media. | IC del 95,00% de diff. | ¿Por debajo del umbral? | Resumen | Valor de P ajustado |
| 0 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3871 | -9495 a 1754 | No | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 a 6345 | No | Ns | 0.9873 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 a 5548 | No | Ns | >0.9999 |
| 10 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -3466 | -9091 a 2159 | No | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 a 7950 | No | Ns | 0.7062 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 a 6617 | No | Ns | 0.968 |
| 20 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | -1311 | -6936 a 4314 | No | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 a 8940 | No | Ns | 0.422 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 a 8771 | No | Ns | 0.4689 |
| 30 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 384.8 | -5240 a 6010 | No | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 a 7937 | No | Ns | 0.7098 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 a 14350 | Sí | *** | 0.0005 |
| 40 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 2247 | -3377 a 7872 | No | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 a 10537 | No | Ns | 0.1101 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 a 22145 | Sí | **** | <0.0001 |
| 50 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 5657 | 32,12 a 11282 | Sí | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 a 10557 | No | Ns | 0.1079 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 a 24708 | Sí | **** | <0.0001 |
| 60 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 12376 | 6752 a 18001 | Sí | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 a 14986 | Sí | *** | 0.0002 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 a 30373 | Sí | **** | <0.0001 |
| 70 minutos | |||||
| MSC/MΦ vs. MΦ | 13770 | 8145 a 19395 | Sí | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs. MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 a 17612 | Sí | **** | <0.0001 |
| MΦ vs. MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 a 32888 | Sí | **** | <0.0001 |
Tabla 3: Análisis estadístico detallado de los datos presentados en la Figura 3A. Resultados de las pruebas de comparación múltiple de Tukey después de un ANOVA bidireccional significativo de los datos presentados en la Figura 3A.
Archivo complementario 1: Un archivo de hoja de cálculo representativo de datos cinéticos sin procesar de un experimento óptimo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El análisis de la fagocitosis utilizando biopartículas conjugadas a un colorante sensible al pH es una herramienta relativamente nueva que ha demostrado ser ventajosa sobre las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes12,19,20. Con las partículas tradicionales etiquetadas con fluorescentes, solo es factible el análisis de punto final. La detección se realiza con microscopía fluorescente y/o espectrofluorometría después de lavar o apagar partículas que no han sido tomadas por el fagocito. Los datos cuantitativos derivados de la espectrofluorometría tienen el potencial de detectar partículas no envueltas, y el análisis de imágenes para cuantificar solo partículas intracelulares es tedioso y requiere mucho tiempo utilizando sistemas tradicionales de microscopía fluorescente14. Las biopartículas conjugadas con colorantes sensibles al pH fluorescencia solo en un ambiente ácido como el fagolisosoma, y, por lo tanto, los tediosos pasos de lavado y enfriamiento son innecesarios14. Además, las biopartículas etiquetadas sensibles al pH proporcionan la ventaja de proporcionar datos cinéticos que no se adquirirían fácilmente con FITC u otras biopartículas conjugadas con fluoróforos.
Los estudios que utilizan esta nueva herramienta han empleado plataformas de citometría de flujo y/o imágenes para generar una medición cuantitativa y cinética de la actividad de los fagocitos19,20,21. La citometría de flujo es ventajosa si hay una población limitada de fagocitos o si uno está interesado en clasificar para análisis posteriores como los cribados genéticos19. Se sabe que los MSC regulan el fenotipo MΦ a través del contacto directo y a través de factores solubles. Los estudios preliminares han demostrado que el medio condicionado de MSC suprimió la fagocitosis MΦ y, por lo tanto, este protocolo fue diseñado para determinar los cambios en la actividad fagocítica de MΦ mientras estaba en coculto directo con MSC. En estas condiciones, la espectrofluorometría para cuantificar y las imágenes dinámicas para visualizar y confirmar la actividad fagocítica son las más apropiadas.
Fundamental para el éxito de estos métodos es la optimización de las densidades celulares. El MSC debe estar chapado a una densidad que permita un contacto celular óptimo con las células MΦ. MΦ debe sembrarse en mono y cocultivos a una densidad que no solo permita un contacto óptimo, sino que también permita una detección óptima de fluorescencia. Una densidad demasiado baja dará lugar a una baja incorporación en el faglisosoma y cambios pequeños o planos en las unidades fluorescentes relativas(Figura 3B). Si los MΦ se siembran a una densidad demasiado alta, la fagocitosis aumenta rápidamente y la detección de diferencias entre los grupos se enmascara(Figura 3C). La optimización de la concentración de partículas de zymosan etiquetadas con colorantes sensibles al pH por número de células también es crítica. Se deben realizar experimentos preliminares para optimizar las densidades celulares de MSC y MΦ, y el número de partículas por célula MΦ. Además, estos pasos de optimización deben tomarse si se utilizan otras biopartículas etiquetadas, como E. coli o S. aureus.
El medio de imagen apropiado también es crítico. El medio para ambos métodos debe ser un medio tamponado y no debe contener rojo fenol. El rojo fenol silenciará la detección de la emisión fluorescente. Además, cualquier aditivo o condición que pueda acidificar el medio activará prematuramente las partículas etiquetadas e introducirá un fondo elevado. El reactivo en blanco es fundamental para identificar la acidificación potencial del medio.
Estos protocolos no solo se pueden usar para investigar la regulación MSC de la fagocitosis MΦ de una variedad de biopartículas sensibles al pH, sino que el método también se puede aplicar a una variedad de modelos de coculto que incluyen neutrófilos y otros fagocitos. Además, mediante el uso de este modelo, las moléculas y vías sospechosas de estar involucradas en la regulación mediada por contacto celular de la actividad fagocítica de los macrófagos se pueden sondear a través de la regulación descendente mediada por siRNA o CRISPR para validar o refutar los objetivos moleculares sospechosos. Los objetivos potenciales incluyen moléculas de adhesión, receptores fagocíticos y moléculas de integrina.
El trabajo que utiliza estos métodos descubrirá nueva información sobre los mecanismos de señalización subyacentes al aumento de las respuestas fagocíticas de MΦ después de las interacciones de contacto celular con MSC, lo que aumentará nuestra comprensión del papel que desempeña MSC en la regulación de la inmunidad innata. Estudios como estos abordan un área poco estudiada y producirán una imagen completa de la influencia que los MSC tienen en la actividad de los macrófagos, que es necesaria para una comprensión completa de su papel en la inmunidad.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el mecanismo del Instrumento Principal de Investigación de la NSF bajo los números de subvención 1626093 y 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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