Summary
Présenté ici est un protocole pour quantifier et produire des images dynamiques de la régulation médiée par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) de la phagocytose des macrophages (MΦ) des particules de levure non opsonisées (zymosan) qui sont conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH.
Abstract
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont traditionnellement été étudiées pour leurs propriétés régénératrices, mais plus récemment, leurs caractéristiques immunorégulatrices ont été à l’avant-garde. Ils interagissent avec et régulent l’activité des cellules immunitaires. L’objectif de cette étude est la régulation MSC de l’activité phagocytaire des macrophages. La phagocytose des macrophages (MΦ) est une partie importante de la réponse du système immunitaire inné à l’infection, et les mécanismes par lesquels les CSM modulent cette réponse sont à l’étude active. Présenté ici est une méthode pour étudier la phagocytose MΦ de particules de zymosan non opsonisées conjuguées à une molécule fluorescente sensible au pH en co-culture avec MSC. À mesure que l’activité phagocytaire augmente et que les particules de zymosan marquées sont enfermées dans l’environnement acide du phagolysosome, l’intensité de fluorescence de la molécule sensible au pH augmente. Avec les longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées, l’activité phagocytaire est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre fluorescent et les données cinétiques sont présentées sous forme de changements dans les unités fluorescentes relatives sur une période de 70 minutes. Pour étayer ces données quantitatives, le changement de l’activité phagocytaire est visualisé à l’aide de l’imagerie dynamique. Les résultats utilisant cette méthode démontrent que lorsqu’ils sont en co-culture, les CSM améliorent la phagocytose MΦ du zymosan non opsonisé de MΦ naïf et γ traité par IFN. Ces données s’ajoutent aux connaissances actuelles sur la régulation MSC du système immunitaire inné. Cette méthode peut être appliquée dans de futures recherches pour délimiter complètement les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) sont des cellules progénitives qui donnent naissance à des cellules du tissu conjonctif. Les CSM sont présents dans les tissus des mammifères adultes et peuvent être isolés de la moelle osseuse1. En raison de leurs propriétés immunomodulatrices, ces cellules sont largement étudiées2. Les premières études se sont concentrées sur la régulation MSC des lymphocytes T3,4,5,6 mais plus récemment, leur régulation des cellules macrophages (MΦ), un composant cellulaire majeur de l’immunité innée, a reçu une attention accrue7,8,9,10,11,12,13,14 . L’importance de l’interaction MSC-MΦ dans le traitement des maladies inflammatoires est soulignée par le fait que l’épuisement des monocytes/macrophages abroge les effets thérapeutiques du MSC dans les modèles animaux8. Ici, l’accent est mis sur l’interaction de contact cellulaire du MSC avec MΦ. Les CSM ont la capacité de réguler le phénotype de MΦ en favorisant le passage des réponses inflammatoires aux réponses anti-inflammatoires, conduisant à des activités de réparation tissulaire8,9,10,11, et beaucoup a été fait pour démontrer ces mécanismes de régulation. Dans d’autres circonstances, le MSC peut soutenir ou exacerber une réponse inflammatoire induite par MΦ12,13 et améliorer l’activité phagocytaire MΦ14,15. Cependant, il existe un manque critique de données existantes permettant d’identifier les mécanismes et les conditions dans lesquels les CSM régulent l’activité phagocytaire MΦ.
MΦ ont des familles de récepteurs qui reconnaissent les agents pathogènes opsonisés (anticorps ou enrobés de complément) ou non opsonisés conduisant à la phagocytose16. L’activation et l’activité de ce dernier sont moins bien étudiées17. Dans un environnement in vitro non inflammatoire, les CSM améliorent la phagocytose MΦ des agents pathogènes non opsonisés13. Cependant, la reconnaissance des agents pathogènes non opsonisés par MΦ peut être réduite après une exposition à un environnement inflammatoire produit par les lymphocytes au cours d’une réponse immunitaire adaptative. L’IFN-γ, libéré par les cellules tueuses naturelles et les lymphocytes effecteurs, a un effet inhibiteur sur la phagocytose MΦ des particules non opsonisées18. Un modèle de co-culture a été développé pour étudier les mécanismes de régulation par contact direct msc de la phagocytose MΦ. L’objectif de l’expérience présentée ici est de déterminer si les CSM régulent la phagocytose MΦ des agents pathogènes non opsonisés après que MΦ a été exposé à l’IFN-γ(Figure 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
REMARQUE: Toutes les techniques de préparation du milieu et de culture cellulaire sont effectuées dans des conditions aseptiques à l’aide d’une armoire de biosécurité à flux laminaire. Toutes les étapes d’incubation de culture décrites sont réalisées à l’aide d’un incubateur conçu pour maintenir une atmosphère de 37 °C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité.
1. Culture cellulaire
- Préparation du milieu de croissance
- Pour le MSC et le LADMAC, ajouter 50 mL de FBS et 5 mL de mélange antibiotique/antimycotique 100x à 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose.
- Pour le MΦ, ajouter 50 mL de FBS, 100 mL de milieu de condition LADMAC (préparé selon les étapes de la section 1.2) et 5 mL de mélange antibiotique 100x à 500 mL de DMEM à haute teneur en glucose.
REMARQUE: Les cellules LADMAC produisent un facteur de stimulation des colonies (CSF-1) nécessaire pour soutenir la croissance des cellules MΦ.
- Préparation du milieu conditionné LADMAC
- Pour ensemencer des cellules LADMAC provenant de stocks congelés, ajouter 19 mL de milieu de croissance de la section 1.1 dans chacun des cinq flacons traités par culture cellulaire T75 cm2 et placer dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 15 min pour équilibrer à 37 °C.
- Pendant ce temps, décongelez rapidement une aliquote de 106 cellules congelées en incubant dans un bain-marie à 37 ° C pendant 2-3 minutes ou jusqu’à ce qu’il soit décongelé. Ajouter les cellules à 9 mL de milieu de croissance MSC frais dans un tube conique stérile de 15 mL ou 50 mL et centrifuger à 125 x g dans un rotor à godet oscillant pendant 5 min.
- Aspirer ou décanter le surnageant, ajouter 5 mL de milieu de croissance frais et pipeter doucement de haut en bas pour ressuspender la pastille cellulaire.
- Ajouter 1 mL de suspension cellulaire à chacune des cinq fioles T75 cm2 à l’aide d’une pipette sérologique stérile et les placer dans l’incubateur de culture cellulaire.
- Tous les 2-3 jours, ajoutez 10 mL supplémentaires de milieu sur une période de 7-10 jours. Ensuite, recueillir les cellules et le surnageant dans des tubes coniques stériles de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique stérile et centrifuger à 125 x g pendant 5 min.
- Séparez le surnageant de la pastille cellulaire et filtrez stérilement le surnageant à l’aide d’une unité de filtre à vide stérile à usage unique de 0,2 μm.
- Retirez l’ensemble de l’aspirateur de l’emballage et connectez-le à la pompe de l’aspirateur à l’aide d’un tube à vide. Versez le surnageant dans le compartiment supérieur et remplacez le couvercle. Allumez la pompe de l’aspirateur pour filtrer dans le compartiment inférieur.
- Préparer les aliquotes par pipetage dans des tubes coniques stériles de 50 mL et les conserver à -20 °C.
- Pour congeler la pastille cellulaire, resuspenser dans un milieu de congélation à 106 cellules/mL, placer dans un récipient de congélation, puis les placer dans un congélateur à -80 °C. Après 24 h, transfert vers le stockage LN2.
- Propager des cellules en vue de la co-culture
- Pour ensemencer les cellules MSC et MΦ du stock congelé, équilibrez 9 mL de milieu de croissance approprié préparé à la section 1.1 dans chacune des quatre chambres traitées par culture cellulaire de 100 mm pour chaque type de cellule et placez-les dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 15 min.
- Pendant ce temps, décongelez rapidement les aliquotes de 106 cellules congelées en les incubant dans un bain-marie à 37 ° C pendant 2-3 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient décongelées. Ensuite, ajoutez les cellules MSC décongelées à 9 mL de milieu de croissance MSC frais et ajoutez les cellules MΦ décongelées à 9 mL de milieu de croissance MΦ frais dans des tubes coniques stériles de 15 ou 50 mL et centrifugez à 125 x g dans un rotor de godet oscillant pendant 5 min.
- Aspirer ou décanter le surnageant et resussuspener chaque pastille dans 4 mL du milieu de croissance frais approprié en pipetant doucement de haut en bas. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire à chacune des quatre paraboles de 100 mm pour chaque type de cellule qui ont été équilibrées à l’étape 1.3.1.
- Retournez les plats avec des cellules dans l’incubateur. Changez le milieu tous les 2-3 jours jusqu’à ce que 70% -80% confluent.
2. Semer MSC dans des plats expérimentaux, Jour 1
REMARQUE: Avant d’ensemencer le MSC, concevez la disposition expérimentale de la plaque de 96 puits pour la spectrophotométrie fluorescente et la lame de chambre pour l’imagerie dynamique. Pour la plaque de 96 puits, flanquez les puits expérimentaux de puits contenant des cellules, mais ne les utilisez pas dans le test. Marquez au moins quatre puits à utiliser pour l’ébauche du réactif (RBL). Voir le tableau 1 pour un exemple de modèle de 96 puits et le tableau 2 pour un exemple de modèle de diapositive de chambre à 4 puits. Des plaques noires ou blanches de 96 puits avec des fonds transparents sont recommandées. Une lame de chambre en verre borosilicate de 1,5 mm est optimale, mais le nombre de chambres peut être ajusté en fonction de la conception de l’étude. Un organigramme récapitulatif des méthodes qui suivent est inclus dans la figure 2.
- À une confluence de 70 % à 80 %, aspirer le milieu de croissance des cultures dans des plats de 100 mm et ajouter 5 mL de PBS pour isoler le MSC.
- Aspirer le PBS, ajouter 2 mL de 0,05% de trypsine / EDTA et le placer dans l’incubateur de culture pendant 3-5 min.
- Après 3 min, vérifiez le détachement de la cellule à l’aide d’un microscope inversé. Si les cellules sont détachées, passez à l’étape suivante ; sinon, continuez l’incubation pendant encore 1-2 min. Ne pas incuber plus de 5-6 min.
- Ajouter 5 mL de milieu de croissance frais au plat avec les cellules détachées. Rincez le plat à l’aide du mélange trypsine/milieu et collectez les cellules dans un tube conique propre et stérile de 50 mL à l’aide d’une pipette sérologique stérile.
- Centrifugeuse pendant 5 min à 125 x g. Aspirer le surnageant et resussuspend la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu de croissance frais en pipetant doucement de haut en bas.
- Pour compter les cellules, ajouter 10 μL de la suspension cellulaire à 30 μL de solution de bleu de trypan à 0,4 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Ensuite, pipettez 10 μL du mélange sous le couvercle d’une chambre de comptage hémocytométrique.
- À l’aide d’un microscope à champ inversé ou lumineux, avec l’objectif 10x, comptez les cellules non colorées (viables) dans quatre des carrés de 1 mm2. Calculer le nombre de cellules à l’aide de la formule : cellules/mL = nombre de cellules/# 1 mm2 carrés x facteur de dilution x 104.
REMARQUE: Pour cet exemple, le nombre de 1 mm2 carrés comptés est de quatre et le facteur de dilution est de 4. - Utilisez l’équationC1V1 =C2V2 pour calculer et préparer une suspension de 1 x 105 cellules/mL. Préparer 1 mL de suspension de cellule/mL pour chaque colonne de la plaque de 96 puits à remplir et 0,75 mL pour chaque chambre de la glissière de chambre à 4 puits à remplir selon la conception de la plaque.
REMARQUE: C1 = nombre de cellules, V1 = ce qui est calculé, C2 = 1 x 105, V2 = 5,50 mL. - Déterminer V1, le soustraire des 5,50 mL souhaités du volume total pour déterminer le volume du milieu frais nécessaire à la préparation de la suspension. Ajouter le volume de cellules (V1)de la suspension d’origine au volume de milieu frais pour un total de 5,50 mL avec 1 x 105 cellules/mL.
- Ajouter 100 μL de suspension de 1 x 105 cellules/mL à chaque puits de la plaque de 96 puits selon la conception de la plaque à l’aide d’un micropipetteur multicanal et 530 μL à chacun des puits de la glissière de la chambre à l’aide d’une micropipette selon la conception de la plaque. Incuber pendant la nuit.
REMARQUE: Pour cette expérience, les MSC sont plaqués dans les colonnes 1, 2, 3 et 6 de la plaque de 96 puits (tableau 1) et dans les puits 1 et 2 de la glissière de la chambre à 4 puits (tableau 2). Par conséquent, au moins 5,50 mL d’une suspension de 1 x 105 cellules/mL est préparée. MΦ à 80% de confluence sont traités avec des médiateurs inflammatoires le jour même où les CSM sont ensemencés dans les plaques expérimentales.
3. Activer le MΦ avec IFN-γ, Jour 1
- Préparez le support d’activation et le stock γ IFN.
- Pour 200 mL de milieu d’activation, ajouter 40 mg de BSA à 200 mL de DMEM à haute teneur en glucose sans sérum et filtre stérile à l’aide d’un filtre à vide stérile à usage unique de 0,2 μm.
- Pour préparer 0,1 % de BSA/PBS, ajouter 20 mg de BSA à 20 mL de PBS. Vortex à dissoudre. Utilisez un filtre à seringue stérile de 0,2 μm pour filtrer dans un tube conique propre et stérile de 50 mL.
- Ajouter 1 mL de la solution stérile de BSA/PBS à 0,1 % à 100 μg d’IFN-γ lyophilisée pour obtenir une solution stock de 100 μg/mL. Conserver dans des aliquotes de 50 μL à -20 °C.
- Activer le MΦ avec IFN-γ
- Ajouter 2,5 μL de 100 μg/mL d’IFN-γ stock pour chaque 1 mL du milieu nécessaire. Pour chaque plat de 100 mm à activer, préparer 10 mL de milieu d’activation contenant de l’IFN-γ à une concentration de 250 ng/mL.
- Aspirer le milieu de croissance des cultures MΦ et le remplacer par 5 mL du milieu d’activation sans Γ de rinçage.
- Aspirer le milieu utilisé pour le rinçage et le remplacer par 10 mL d’IFN- γ milieu d’activation complété pour la boîte expérimentale et par 10 mL de milieu d’activation non supplémenté pour le contrôle. Incuber les cultures pendant 16-24 h.
4. Isoler le MΦ et préparer les co-cultures, Jour 2
- Retirez le milieu d’activation des cellules MΦ et remplacez-le par 5 mL de milieu de croissance frais. Grattez doucement avec un élévateur de cellules et collectez les cellules dans un tube conique de 50 mL.
- Comptez les cellules à l’aide de l’exclusion du bleu de trypan et de l’hémocytométrie comme décrit pour le CSM aux étapes 2.6 à 2.7.
- En utilisant l’équation des étapes 2.8-2.9, préparer deux suspensions séparées de 2 x 105 cellules/mL, l’une avec des cellules du témoin et l’autre avec des cellules des cultures MΦ traitées.
REMARQUE: Préparer 1 mL de suspension de cellule / mL pour chaque colonne de la plaque de 96 puits à remplir et 0,75 mL pour chaque chambre de la glissière de chambre à 4 puits à remplir conformément à la conception de la plaque. - Aspirer doucement le milieu des puits expérimentaux de la plaque de 96 puits contenant du MSC. À l’aide d’une micropipette multicanal, ajouter 100 μL des suspensions de cellules MΦ traitées et témoins dans les puits expérimentaux appropriés avec et sans CSM selon la conception de la plaque. Incuber pendant la nuit.
- Aspirer doucement le fluide de la lame de la chambre à 4 puits contenant du MSC et, à l’aide d’une micropipette, ajouter 530 μL de suspension cellulaire MΦ aux puits appropriés selon la conception. Incuber pendant la nuit.
5. Test de phagocytose, lecture cinétique fluorescente de la plaque de 96 puits, Jour 3
- Définir les paramètres du test
- Le jour de l’essai, allumez le lecteur de plaque fluorescente et réglez la température du système à 37 °C.
- Ouvrez le logiciel System Pro et vérifiez l’icône de l’instrument dans le coin supérieur gauche pour déterminer si l’instrument est connecté à l’ordinateur. Si le cercle rouge avec une ligne est visible, cliquez sur l’icône de l’instrument et choisissez l’instrument dans la fenêtre contextuelle pour établir la connexion.
- Sélectionnez Nouvelle expérience pour accéder à la fenêtre contextuelle Plate Set-Up Helper. Dans le menu Aide à la configuration de la plaque, sélectionnez Configurer vos paramètres d’acquisition.
- Sélectionnez Monochromator dans le menu des paramètres de la configuration optique. Sélectionnez FL (fluorescence) pour le mode de lecture et Kinetic pour le type de lecture.
- Dans la même fenêtre de configurations, sous Catégorie, cliquez sur Longueurs d’onde, puis définissez les largeurs de bande sur 9 nm pour l’excitation et 15 nm pour l’émission.
- Définissez le nombre de paires de longueurs d’onde sur 1. Réglez les longueurs d’onde LM1 à 510 nm pour l’excitation et à 540 nm pour l’émission.
- Continuez à travers les catégories et sélectionnez Type de plaque ensuite. Sélectionnez l’option qui correspond au type de plaque utilisé.
REMARQUE: Il est important que la sélection corresponde au type de plaque. Les hauteurs de lecture sont définies par le système en fonction de la sélection. - Ensuite, sélectionnez Zone de lecture et mettez en surbrillance la zone de la plaque de 96 puits incluse dans la conception expérimentale.
- Sélectionnez PMT et Optique, définissez PMT Gain sur Élevé et Flashes par lecture sur 6. Cochez la case en regard de Lire à partir du bas si vous utilisez une plaque à fond clair.
- Sélectionnez Chronométrage et réglez sur des intervalles de 10 minutes sur une période de 70 minutes.
- Sélectionnez Secouer, cochez la case Avant la première lecture et définissez sur 5 s. Cochez la case Entre les lectures et réglez sur 3 s. Réglez l’intensité de la secousse pour les deux sur Faible et Linéaire.
- Fermez la fenêtre. Lorsque la fenêtre Plate Set-Up Helper (Assistant de configuration de la plaque) s’affiche, sélectionnez Configure Your Plate Layout (Configurer la disposition de la plaque). Mettez en surbrillance les puits BL de la conception de la plaque et cliquez sur Plate Blank.
- Mettez en surbrillance chacune des lignes expérimentales, cliquez sur Ajouter, nommez le groupe, puis sélectionnez une couleur.
- Sous Options d’affectation sous la conception de la plaque, sélectionnez Série, puis définissez la série dans la fenêtre et cliquez sur OK. Répétez l’opération pour chaque groupe.
- Préparer la suspension de zymosan
- En attendant que la température du système atteigne 37 °C, resuspensez 1 mg de particules de zymosan dans 5 mL du milieu d’imagerie des cellules vivantes.
- Ajouter 1 mL de milieu d’imagerie de cellules vivantes au flacon contenant les particules et les recueillir dans un tube de culture en verre. Rincez le flacon avec 1 mL supplémentaire de solution d’imagerie et transférez-le dans le même tube de verre pour vous assurer que toutes les particules sont transférées. Ajouter 3 mL de solution d’imagerie supplémentaire pour obtenir une suspension de particules de 0,2 mg/mL.
- Vortex avec impulsions rapides pendant 30-60 s. Ensuite, utilisez un sonicateur à sonde pour soniquer avec 60 impulsions rapides.
REMARQUE: Il est très important de créer une suspension homogène de particules et de ne pas laisser la suspension reposer trop longtemps avant de l’ajouter aux puits expérimentaux. L’agglutination se reproduit rapidement. La densité de particules par cellule peut devoir être optimisée en fonction de la source, du traitement et de la densité de MΦ utilisés. Dans les études présentées, des particules de zymosan conjuguées ont été utilisées. Cependant, E. coli conjugué et S. aureus sont également disponibles.
- En attendant que la température du système atteigne 37 °C, resuspensez 1 mg de particules de zymosan dans 5 mL du milieu d’imagerie des cellules vivantes.
- Ajouter du zymosan et lire la plaque
- Aspirer le milieu des puits expérimentaux et rincer 1x avec 100 μL de la solution d’imagerie de cellules vivantes. Rincez également les puits RBL avec la solution d’imagerie de cellules vivantes.
- Aspirer la solution d’imagerie de cellules vivantes à partir de puits expérimentaux et de RBL et la remplacer par 100 μL de la suspension de particules de zymosan préparée à la section 5.2.
- Ouvrez le plateau du lecteur fluorescent à l’aide de l’interface du pavé tactile. Placez la plaque, sans le couvercle, dans le plateau avec le puits A1 dans le coin supérieur gauche. Fermez le plateau à l’aide du pavé tactile et cliquez sur le bouton vert Lire dans le menu supérieur.
- Une fois la lecture terminée, enregistrez le fichier dans le dossier approprié et exportez les données dans un format de feuille de calcul en cliquant sur Fichier et en sélectionnant Exporter.
- Calculez la fluorescence relative moyenne ± SEM pour chaque groupe répliqué à chaque point temporel (10 min, 20 min, 30 min, etc.) dans la feuille de calcul(fichier supplémentaire 1)et transférez les données vers un logiciel graphique.
- Utilisez un format de graphique linéaire pour présenter les données et appliquer l’ANOVA bidirectionnelle (Time x Treatment/MSC as factors) suivie du test de comparaisons multiples de Tukey pour déterminer les différences entre les groupes individuels.
REMARQUE: Pendant que la lecture de la plaque de 96 puits est en cours, préparez la plaque d’imagerie dynamique pour l’acquisition d’images en accéléré. Assurez-vous que l’imagerie dynamique procède à l’analyse d’un puits expérimental à la fois.
6. Test de phagocytose, imagerie dynamique, Jour 3
- Allumez le système d’imagerie et l’ordinateur. Double-cliquez pour ouvrir le logiciel. Sélectionnez le mode de programme Pro.
- Vérifiez la zone de la scène pour vous assurer qu’aucun échantillon n’est présent et que rien n’entrave le mouvement de la scène. Ensuite, cliquez sur Calibrer maintenant.
- Sous le menu Incubation dans la barre latérale à droite, cochez la case à côté de H Unit XL et réglez-la sur 37 °C.
REMARQUE: Attendez que l’étape incubée soit presque à la température avant de préparer les échantillons pour l’imagerie. - Rincer le premier puits expérimental avec 750 μL de milieu imageur et le remplacer par 400 μL de la suspension de particules de zymosan préparée à la section 5.2. Laissez les puits restants dans le milieu de croissance.
REMARQUE: Il peut être nécessaire de vortexer et de soniquer à nouveau brièvement la suspension de particules si elle s’est stabilisée pendant plus de 15 minutes. - Placez la diapositive sur la scène incubée du système d’imagerie. Réglez une minuterie pendant 10 min.
- Utilisez le logiciel d’imagerie, sélectionnez Brightfield sous l’onglet Localiser, puis cliquez sur l’icône de l’oculaire dans la fenêtre de configuration du système ci-dessous. Avec l’objectif 10x en place, utilisez l’oculaire et le bouton de mise au point pour vous concentrer sur les cellules.
- Sélectionnez l’onglet Acquisition, utilisez le menu déroulant Expérience, puis sélectionnez un ensemble de longueurs d’onde qui inclut un jeu de filtres EGFP pour prendre en charge les longueurs d’onde d’émission d’excitation 509 nm 533 nm du colorant sensible au pH.
- Lorsqu’il reste environ 2 minutes sur la minuterie, utilisez le logiciel pour changer l’objectif en 20x en cliquant sur l’icône 20x dans le menu de l’objectif.
- Cliquez sur le menu Canaux, sélectionnez les filtres EGFP et utilisez le menu Exposition pour régler le temps d’exposition à 400 ms afin de détecter le fluorophore vert sensible au pH une fois qu’il a été enfermé dans le phagolysosome.
- Cliquez sur Live et réglez la mise au point à l’aide du bouton de mise au point.
- Cliquez sur Arrêter pour éteindre la lumière et cochez la case à côté du paramètre expérimental Time-lapse en haut.
- Dans le menu Stratégie de mise au point, sélectionnez Mise au point automatique logicielle. Dans la liste déroulante du menu Mise au point automatique, sélectionnez Paramètres intelligents et grossiers pour réduire le temps d’exposition à la lumière pendant l’exécution de l’autofocus.
- Dans le menu Time-Lapse, définissez le nombre d’acquisitions souhaité sur 30-60 et le temps d’intervalle sur 1 min.
- Une fois les paramètres time-lapse définis et après 10 minutes d’ajout de particules au premier puits, cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour commencer l’acquisition.
- Lorsque l’acquisition est terminée à l’aide du premier puits expérimental, répétez les étapes 6.4 à 6.12 pour chacun des puits expérimentaux restants.
- Enregistrez tous les fichiers d’expérience avec la date et les paramètres du titre dans le dossier approprié.
- Fermez le logiciel. Rouvrez le logiciel en mode Traitement et exportez les fichiers au format MP4 à l’aide du menu Exporter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Après avoir calculé la moyenne ± SEM pour chaque groupe à tous les points temporels, les données sont présentées sous forme de graphique linéaire avec l’axe Y comme intensité fluorescente relative et l’axe X comme temps. Le fichier supplémentaire 1 fournit un exemple de données brutes provenant d’une lecture cinétique de la plaque de 96 puits dans un format de feuille de calcul.
Dans cette étude, les résultats optimaux présentés à la figure 3Aet au tableau 3 démontrent que 1) la co-culture avec le MSC améliore l’activité phagocytaire du macrophage, 2) le traitement IFN-y réduit l’activité du macrophage, et 3) la co-culture avec le MSC sauve partiellement l’activité phagocytaire MΦ. Les densités cellulaires optimales sont critiques dans ces études, et lorsque les MΦ sont plaqués à une densité trop faible, les changements d’intensité de fluorescence ne peuvent pas être détectés (Figure 3B). La figure 3C représente les données d’une étude où les MΦ ont été plaqués à une densité trop élevée et où l’intensité de fluorescence est élevée rapidement dans tous les groupes, et les différences ne peuvent pas être discernées. Les vidéos d’imagerie dynamique confirment que les changements d’intensité fluorescente résultent de la phagocytose et non de l’acidification du milieu. Ils fournissent également des données qualitatives et une représentation visuelle du taux et de l’étendue de l’activité phagocytaire (Figure 4).
Figure 1: Une illustration illustrant la question centrale des données présentées, qui est « Le MSC peut-il récupérer l’activité phagocytaire de l’IFN-γ traité MΦ? ». Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Vue d’ensemble du flux de travail de la co-culture et du test de phagocytose. Un aperçu du flux de travail pour l’analyse quantitative et qualitative de l’activité de phagocytose MΦ en co-culture avec MSC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Données quantitatives représentatives issues de la démonstration cinétique des résultats optimaux et sous-optimaux. Dans (A), les données sont représentatives d’une expérience avec une densité cellulaire MΦ optimale, dans (B) les données sont représentatives d’une expérience avec une densité cellulaire MΦ sous-optimale trop faible, et dans (C), les données sont représentatives d’une expérience avec une densité cellulaire MΦ sous-optimale trop élevée. L’intensité de fluorescence relative mesurée en unités fluorescentes relatives (RFU) est tracée sur l’axe Y, tandis que le temps est tracé sur l’axe X. Notez les différences dans la gamme de RFU entre les expériences optimales et sous-optimales. Dans A,le MSC sauve partiellement l’activité phagocytaire MΦ dans le cadre de la suppression de l’Γ sur une période de 70 minutes. La RFU est présentée comme moyenne ± le SEM, n = 6. L’analyse a été réalisée à l’aide du test de comparaisons multiples de Tukey après une ANOVA bidirectionnelle significative, effet d’interaction P = 0,0001, effet de temps P = 0,0001 et effet traitement / CSM P = 0,0001. Les symboles désignent les résultats de plusieurs tests de comparaison. * = différence significative entre MSC/MΦ + IFN- γ vs MΦ + IFN-γ, Ŧ = différence significative entre MΦ vs MΦ + IFN-γ, et † = différence significative entre MSC/MΦ vs MΦ. Voir le tableau 3 pour les résultats détaillés des tests de comparaison multiples. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4: Vidéos d’imagerie dynamique fournissant une confirmation visuelle de l’augmentation de la fluorescence spécifique à la cellule par activation acide de particules de zymosan marquées après incorporation dans le phagolysosome MΦ. Les réglages time-lapse ont été effectués toutes les 1 min sur une période de 30 minutes en utilisant un temps d’exposition de 400 ms et le jeu de filtres EGFP. (A) MΦ en monoculture, (B) MΦ en co-culture avec MSC, (C) MΦ traité avec IFN-γ (250 ng/mL) et (D) MΦ traité avec IFN-γ (250 ng/mL) en co-culture avec MSC. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| Un | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| B | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| C | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| D | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| E | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| F | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| G | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL | |||||
| H | CBL | MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ | CBL | RBL |
Tableau 1 : Exemple de conception de plaque à 96 puits. CBL - Cellule vide; MSC - jour 1 des semis; MΦ+ traité et MΦ non traité ensemencé jour 2; Blanc de réactif RBL ajouté au jour 3 du test.
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| MSC/MΦ | MSC/MΦ+ | MΦ | MΦ+ |
Tableau 2 : Exemple de conception de glissière de chambre à 4 puits. MSC - plaqué jour 1; MΦ+ traité et MΦ plaqué non traité jour 2.
| Test de comparaisons multiples de Tukey | Diff moyen. | IC de 95,00 % de diff. | En dessous du seuil? | Résumé | Valeur P ajustée |
| 0 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | -3871 | -9495 à 1754 | Non | Ns | 0.2836 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 720.3 | -4904 à 6345 | Non | Ns | 0.9873 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | -77.17 | -5702 à 5548 | Non | Ns | >0,9999 |
| 10 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | -3466 | -9091 à 2159 | Non | Ns | 0.3817 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 2326 | -3299 à 7950 | Non | Ns | 0.7062 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 992 | -4633 à 6617 | Non | Ns | 0.968 |
| 20 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | -1311 | -6936 à 4314 | Non | Ns | 0.9303 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 3315 | -2310 à 8940 | Non | Ns | 0.422 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 3146 | -2478 à 8771 | Non | Ns | 0.4689 |
| 30 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | 384.8 | -5240 à 6010 | Non | Ns | 0.998 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 2313 | -3312 à 7937 | Non | Ns | 0.7098 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 8726 | 3101 à 14350 | Oui | *** | 0.0005 |
| 40 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | 2247 | -3377 à 7872 | Non | Ns | 0.7278 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 4913 | -712,2 à 10537 | Non | Ns | 0.1101 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 16521 | 10896 à 22145 | Oui | **** | <0.0001 |
| 50 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | 5657 | 32,12 à 11282 | Oui | * | 0.0481 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 4932 | -692,9 à 10557 | Non | Ns | 0.1079 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 19083 | 13458 à 24708 | Oui | **** | <0.0001 |
| 60 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | 12376 | 6752 à 18001 | Oui | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 9361 | 3736 à 14986 | Oui | *** | 0.0002 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 24748 | 19123 à 30373 | Oui | **** | <0.0001 |
| 70 minutes | |||||
| MSC/MΦ contre MΦ | 13770 | 8145 à 19395 | Oui | **** | <0.0001 |
| MSC/MΦ + IFN-γ vs MΦ + IFN-γ | 11987 | 6362 à 17612 | Oui | **** | <0.0001 |
| MΦ contre MΦ + IFN-γ | 27264 | 21639 à 32888 | Oui | **** | <0.0001 |
Tableau 3 : Analyse statistique détaillée des données présentées à la figure 3A. Résultats des multiples tests de comparaison de Tukey après une ANOVA bidirectionnelle significative des données présentées à la figure 3A.
Fichier supplémentaire 1 : Un fichier de feuille de calcul représentatif des données cinétiques brutes d’une expérience optimale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L’analyse de la phagocytose à l’aide de bioparticules conjuguées à un colorant sensible au pH est un outil relativement nouveau qui s’est avéré avantageux par rapport aux particules traditionnelles étiquetées par fluorescence12,19,20. Avec les particules traditionnelles étiquetées par fluorescence, seule l’analyse du point final est réalisable. La détection est effectuée par microscopie fluorescente et/ou spectrofluorométrie après lavage ou trempe des particules qui n’ont pas été prises par le phagocyte. Les données quantitatives dérivées de la spectrofluorométrie ont le potentiel de détecter des particules non englouties, et l’analyse d’images pour quantifier uniquement les particules intracellulaires est fastidieuse et prend beaucoup de temps en utilisant les systèmes de microscopie fluorescente traditionnels14. Les bioparticules conjuguées à des colorants sensibles au pH ne fluorescent que dans un environnement acide tel que le phagolysosome, et, par conséquent, les étapes fastidieuses de lavage et de trempe sont inutiles14. De plus, les bioparticules étiquetées sensibles au pH offrent l’avantage de fournir des données cinétiques qui ne seraient pas acquises facilement avec le FITC ou d’autres bioparticules conjuguées au fluorophore.
Les études utilisant ce nouvel outil ont utilisé la cytométrie en flux et/ou des plateformes d’imagerie pour générer une mesure quantitative et cinétique de l’activité phagocytaire19,20,21. La cytométrie en flux est avantageuse s’il existe une population de phagocytes limitée ou si l’on s’intéresse au tri pour des analyses en aval telles que les écrans génétiques19. Les CSM sont connus pour réguler le phénotype MΦ par contact direct et par des facteurs solubles. Des études préliminaires ont montré que le milieu conditionné du CSM supprimait la phagocytose MΦ et, par conséquent, ce protocole a été conçu pour déterminer les changements dans l’activité phagocytaire du MΦ en co-culture directe avec le CSM. Dans ces conditions, la spectrofluorométrie pour quantifier et l’imagerie dynamique pour visualiser et confirmer l’activité phagocytaire sont les plus appropriées.
L’optimisation des densités cellulaires est essentielle au succès de ces méthodes. Le CSM doit être plaqué à une densité qui permet un contact optimal des cellules avec les cellules MΦ. MΦ doit être ensemencé en monocultures et en co-cultures à une densité qui permet non seulement un contact optimal, mais permet également une détection optimale de la fluorescence. Une densité trop faible entraînera une faible incorporation dans le phagolysosome et des changements faibles ou plats dans les unités fluorescentes relatives(figure 3B). Si les MΦ sont ensemencés à une densité trop élevée, la phagocytose augmente rapidement et la détection des différences entre les groupes est masquée (Figure 3C). Il est également essentiel d’optimiser la concentration de particules de zymosan étiquetées au colorant sensible au pH par nombre de cellules. Des expériences préliminaires doivent être effectuées pour optimiser les densités cellulaires de MSC et MΦ, ainsi que le nombre de particules par cellule MΦ. De plus, ces étapes d’optimisation doivent être prises si d’autres bioparticules étiquetées sont utilisées, telles que E. coli ou S. aureus.
Le support d’imagerie approprié est également essentiel. Le milieu pour les deux méthodes doit être un milieu tamponné et ne doit pas contenir de rouge phénolique. Le rouge de phénol désactivera la détection de l’émission fluorescente. En outre, tout additif ou condition qui peut acidifier le milieu activera prématurément les particules étiquetées et introduira un fond élevé. L’ébauche du réactif est essentielle pour identifier l’acidification potentielle du milieu.
Non seulement ces protocoles peuvent être utilisés pour étudier la régulation MSC de la phagocytose MΦ d’une variété de bioparticules sensibles au pH, mais la méthode peut également être appliquée à une variété de modèles de co-culture qui incluent des neutrophiles et d’autres phagocytes. De plus, en utilisant ce modèle, les molécules et les voies soupçonnées d’être impliquées dans la régulation de l’activité phagocytaire des macrophages médiée par contact cellulaire peuvent être sondées via la régulation descendante médiée par siRNA ou CRISPR pour valider ou réfuter les cibles moléculaires suspectées. Les cibles potentielles comprennent les molécules d’adhésion, les récepteurs phagocytaires et les molécules d’intégrine.
Les travaux utilisant ces méthodes permettront de découvrir de nouvelles informations concernant les mécanismes de signalisation sous-jacents à l’augmentation des réponses phagocytaires de MΦ à la suite d’interactions de contact cellulaire avec le MSC, améliorant ainsi notre compréhension du rôle que joue le MSC dans la régulation de l’immunité innée. Des études comme celles-ci portent sur un domaine sous-étudié et donneront une image complète de l’influence des CSM sur l’activité des macrophages, ce qui est nécessaire pour bien comprendre leur rôle dans l’immunité.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le mécanisme de l’instrument de recherche majeur de la NSF sous les numéros de subvention 1626093 et 1919583.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D.
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
