Summary
Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.
Abstract
La expresión génica libre de células ofrece el poder de la biología sin las complicaciones de un organismo vivo. Aunque existen muchos de estos sistemas de expresión génica, la mayoría son bastante caros de comprar y / o requieren equipos especiales y experiencia finamente perfeccionada para producir de manera efectiva. Este protocolo describe un método para producir lisado libre de células bacterianas que admite altos niveles de expresión génica, utilizando solo equipos de laboratorio estándar y requiriendo un procesamiento mínimo. El método utiliza una cepa de Escherichia coli que produce una endolisina que no afecta el crecimiento, pero que lisa eficientemente un pellet celular cosechado después de un simple ciclo de congelación-descongelación. El único procesamiento adicional requerido es una breve incubación seguida de centrifugación para limpiar el autolisado de desechos celulares. Los circuitos genéticos dinámicos se pueden lograr a través de la expresión heteróloga de la proteasa ClpX en las células antes de la recolección. Una cepa de E. coli que carece del gen lacZ se puede utilizar para aplicaciones de biodetección de alta sensibilidad y libre de células utilizando una lectura colorimétrica o fluorescente. Todo el protocolo requiere tan solo 8-9 horas, con solo 1-2 horas de trabajo práctico desde la inoculación hasta la finalización. Al reducir el costo y el tiempo para obtener lisado libre de células, este método debería aumentar la asequibilidad de la expresión génica libre de células para diversas aplicaciones.
Introduction
La expresión génica en lisados libres de células tiene varias ventajas sobre el uso de células vivas1,2,3,4. Los lisados pueden modificarse bioquímicamente fácilmente y usarse en condiciones que podrían ser perjudiciales o imposibles de lograr en células vivas. Los circuitos de expresión génica no tienen que competir con los procesos biológicos del huésped, y probar nuevos circuitos genéticos es tan simple como agregar ADN. Por estas razones, la expresión génica libre de células ha encontrado diversas aplicaciones, desde biosensores5,6 hasta la rápida creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos7,8 y el desarrollo de células artificiales9. La mayoría de la expresión génica libre de células utiliza lisados celulares que han sido altamente procesados, generalmente requieren protocolos largos y complejos, equipos especializados y / o pasos sensibles que pueden conducir a una variación significativa entre los usuarios y los lotes10,11.
Este documento describe un método simple y eficiente para producir lisado libre de células que requiere un procesamiento y experiencia mínimos(Figura 1A)12. El método se basa en células de E. coli que están diseñadas para lisarse después de un simple ciclo de congelación-descongelación. Las células expresan una endolisina del fago lambda que degrada la pared celular. A medida que las células crecen, esta endolisina permanece en el citoplasma, secuestrada de la pared celular. Sin embargo, un simple ciclo de congelación-descongelación interrumpe la membrana citoplasmática, liberando la endolisina en el periplasma, donde degrada la pared celular, lo que resulta en una rápida lisis celular. El protocolo se puede completar con solo unas pocas horas de trabajo práctico y solo requiere un congelador, una centrífuga capaz de 30,000 × g (para obtener resultados óptimos; se pueden usar velocidades más bajas con más cuidado para no molestar el pellet), un mezclador de vórtice y una solución tampón simple. El lisado funcional puede incluso producirse mediante la liofilización de las células y su rehidratación in situ. Sin embargo, este método produce lisados con menor actividad, presumiblemente debido a los restos celulares restantes.
Los lisados son altamente activos para la expresión génica libre de células, y se pueden mejorar de varias maneras dependiendo del uso final. La tasa de síntesis de proteínas se puede aumentar aún más concentrando el lisado utilizando concentradores de espín estándar. El ADN lineal se puede proteger de la degradación mediante la adición de proteína GamS purificada. La degradación de proteínas, necesaria para una dinámica de circuitos más compleja como la oscilación, se puede lograr coexpresando un hexámero ClpX en la cepa productora de autolisato13. Finalmente, las lecturas visuales basadas en LacZ se habilitan mediante el uso de una tensión de autolisado que carece de lacZ. En general, este método produce lisado libre de células altamente activo que es adecuado para una amplia gama de aplicaciones.
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Protocol
1. Prepare medios y búferes.
- Preparar el medio 2xYTPG.
- Mezcle 62 g de polvo de 2xYT, 5,99 g de fosfato de potasio monobásico, 13,93 g de fosfato de potasio dibásico y agua desionizada a 2 L.
- Autoclave en ciclo líquido con un tiempo de exposición de 30 min14.
- A 400 ml de medios 2xYTP de 1.1.2, agregue 7.2 g de D-glucosa (dextrosa) y mezcle hasta que se disuelva.
- Filtro-esterilizar a través de un filtro de 0,2 μm.
- Prepare el búfer de S30A.
- Mezcle Tris-HCl (pH 7.7, concentración final de 50 mM), glutamato de potasio (60 mM final) y glutamato de magnesio (14 mM final).
- Ajuste el pH a 7,7 usando 10 M KOH.
- Preparar la Solución 1 (consulte la Tabla 1).
- Resuspend ácido 4-(2-hidroxietil)-1- piperazinatanosulfónico (HEPES) en 2 ml de agua.
- Ajuste el pH a 8.0 usando KOH.
- Agregue todos los demás componentes de la Tabla 1.
- Ajuste el pH a 7.6 usando 10 M KOH. Filtro-esterilización.
- Preparar la solución de premezcla 2.5x (ver Tabla 2).
- Mezclar todos los componentes de la Tabla 2.
- Ajuste el pH a 7.5 usando KOH.
- Alícuota y congelación a -80 °C.
NOTA: Una reacción de 20 μL utiliza 8,9 μL de premezcla.
2. Preparar las celdas.
- Rayar las células autolisadas en placas de agar LB que contienen 50 μg/ml de ampicilina utilizando un bucle inocular y crecer a 37 °C (ver Nota 1).
- Elija una sola colonia en un cultivo iniciador de LB / medio de ampicilina usando una punta de pipeta y crezca a 37 ° C durante la noche.
- Inocular 400 mL de medio 2xYTPG que contenga 50 μg/ml de ampicilina con 400 μL de cultivo iniciador, y crecer a 37 °C en un matraz Erlenmeyer de 1 L, agitando a 300 rpm.
- Mida periódicamente la densidad óptica del cultivo a 600 nm (OD600)utilizando un espectrofotómetro para leer una cubeta óptica con una longitud de trayectoria de 1 cm. Cuando el OD600 exceda 1, comience a diluir el cultivo 5 veces antes de las mediciones para asegurarse de que las mediciones permanezcan dentro del rango lineal de un espectrofotómetro de laboratorio típico. Continuar cultivando las células hasta que el cultivo diluido de 5 veces alcance OD600 de 0.3 (correspondiente a un cultivo OD600 de 1.5).
3. Preparar el lisado.
- Prepare el tampón S30A suplementado con ditiotreitol (TDT) de 2 mM. Mezclar 3 ml de tampón S30A con 6 μL de solución madre de TDT a 1 M. Colocar sobre hielo para su uso en el paso 3.7.
- Cosechar las células centrifugando a 1800 × g durante 15 min a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante vertiéndolo y usando una pipeta para eliminar cualquier líquido restante.
- Resuspend el pellet en 45 ml de tampón S30A frío (4-10 °C) utilizando un mezclador de vórtice.
- Pese un tubo centrífugo vacío de 50 ml, transfiera las células a él y repita los pasos 3.2-3.3 para lavar las células.
- Pesar el pellet, restando el peso de un tubo vacío de 50 mL. Asegúrese de aspirar cuidadosamente cualquier sobrenadante restante para garantizar una medición precisa del peso del pellet.
NOTA: Un rendimiento típico es de ~ 1.3 g de pellet celular de 400 ml de cultivo de producción. - Agregue 2 volúmenes de tampón S30A frío suplementado con 2 mM de ditiotreitol, es decir, 2 ml de tampón por cada 1 g de gránulo celular, y resuspenda las células mediante una mezcla vigorosa de vórtice.
- Congelar las células. Coloque el tubo de 50 ml que contiene las células en un congelador de -20 °C o -80 °C hasta que el pellet esté completamente congelado.
NOTA: El paso de congelación es un buen punto de parada para el día. - Descongele las celdas en un baño de agua a temperatura ambiente.
- Vórtice vigorosamente durante 2-3 min.
- Incubar a 37 °C durante 45 min con agitación a 300 rpm.
- Limpie la muestra de desechos celulares pesados centrifugando en tubos de centrífuga transparentes a 30.000 × g durante 45 min a 4 °C.
NOTA: Si no se dispone de una centrífuga capaz de 30.000 x g, centrífuga durante 45 min a 21.000 × gy tenga precaución adicional en el paso 3.13, ya que el pellet será menos compacto. - Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un nuevo tubo con una pipeta, evitando molestar el pellet tanto como sea posible. Si el sobrenadante transferido está contaminado con material del pellet, repita el paso anterior.
- Transfiera el sobrenadante a tubos de centrífuga de 1,5 ml y centrífuga una vez más a 21.000 × g (o la velocidad máxima de una centrífuga de mesa) durante 5 minutos.
- Alicuar el autolisado desaclarado en los volúmenes deseados, evitando cuidadosamente cualquier pellet restante, y congelar a -80 ° C o usar inmediatamente.
NOTA: Una sola reacción de 20 μL utiliza 8 μL de autolisato.
4. Expresión génica libre de células
NOTA: El autolisado ya está listo para cualquier uso final deseado. El siguiente es un ejemplo de protocolo estándar para la expresión génica libre de células.
- Para una reacción de 20 μL, mezclar sobre hielo 8 μL de autolizado y 8,9 μL de premezcla. Ver NOTA al final de la sección de protocolo con respecto a la optimización de las concentraciones de glutamato de magnesio y PEG 8000.
- Añadir ADN (por ejemplo, pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 a una concentración final de 8 nM), cualquier otro reactivo y agua a 20 μL.
- Coloque la reacción en una microplaca de 384 pocillos y mida el curso del tiempo de fluorescencia y / o los puntos finales utilizando un lector de placas. Para la proteína verde fluorescente (GFP), utilice una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
5. Modificaciones del protocolo
Nota : las siguientes modificaciones del protocolo le permiten servir a otras aplicaciones.
- Expresión génica libre de células utilizando plantillas lineales de ADN
- Realice los pasos de la sección 4, complementando la reacción con 2,2 μM de proteína GamS purificada (expresada y purificada como se describe12)antes de la adición del ADN lineal.
- Expresión génica libre de células que incorpora degradación de proteínas
- En el paso 2.1, utilice células autolizadas que contengan el plásmido pACYC-FLAG-dN6-His (consulte la Tabla de materiales). En todos los medios de crecimiento, además, se incluyen 34 μg/ml de cloranfenicol.
- En el paso 2.3, incluir 40 μM de isopropilo β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) en el medio de crecimiento para inducir la expresión del plásmido.
- Repita los pasos 3.2-3.4 (lavado) dos veces adicionales (para un total de tres lavados) para garantizar la eliminación completa del cloranfenicol, que es un inhibidor de la traducción. Para los dos primeros lavados (paso 3.4), sustituya el tampón S30A por solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4).
- En el paso 4.2, complemente con un ATP adicional de 3 mM (agregado de una solución madre de 100 mM ATP en agua, pH 7.2) y 4.5 mM de glutamato de magnesio (utilizando una solución madre de 1 M en agua) (concentraciones finales) para compensar el alto uso de ATP por ClpXP, así como la quelación de magnesio por el ATP adicional.
- Expresión génica libre de células utilizando lecturas basadas en LacZ (incluyendo colorimétricas)
- En el paso 2.1, utilice celdas de autolisado que no expresen LacZ de forma nativa (consulte la Tabla de materiales).
- Alternativamente, prepare el lisado directamente de las células liofilizadas.
- Realice todos los pasos de 1.1 a 3.7.
- Mezclar 8 μL de suspensión celular con 8,9 μL de premezcla.
- Agregue ADN plásmido (si lo desea), otros reactivos personalizados y agua para alcanzar un volumen final de 20 μL.
- Transfiera la reacción a una microplaca de 384 pocillos y séquela con liofilización.
NOTA: Las muestras liofilizadas se pueden almacenar hasta por una semana y posiblemente más. - Para comenzar la reacción, rehidrate con 18 μL de agua desionizada suplementada con cualquier ADN deseado u otros reactivos.
- Siga la dinámica de fluorescencia en un lector de placas.
NOTA 1: Las células de autolisado están diseñadas para lisarse en un ciclo de congelación-descongelación, por lo que es particularmente importante usar crioprotector al hacer existencias congeladas. Congelamos las existencias en un 24% en peso/vol de glicerol y las almacenamos a -80 °C.
NOTA 2: Los iones de magnesio y PEG 8000 son críticos para el rendimiento del lisado. La premezcla base 2.5x, basada en datos publicados anteriormente, contiene 6 mM de glutamato de magnesio y 4.8% en peso / vol PEG 8000, que se convierten en 2.4 mM y 1.9%, respectivamente, en la reacción final. El autolizado preparado con el protocolo aquí generalmente funciona mejor con un Mg-glutamato adicional de 5 mM y 1.5% PEG 8000 en la reacción final. Sin embargo, esto se puede optimizar en el rango de un glutamato adicional de 0-10 mM Mg y un 0-3% adicional de PEG 8000 (en comparación con la premezcla base). Para preparar la premezcla con los 5 mM Mg-glutamato adicionales recomendados y 1,5% PEG 8000 (concentraciones finales), mezcle 380 μL de premezcla con 4,75 μL de glutamato de magnesio a 1 M y 36,1 μL de PEG 8000 al 40% de peso/volumen.
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Representative Results
Los resultados representativos se pueden observar mediante el uso de autolisado para expresar GFP a partir de un plásmido que expresa constitutivamente, aquí pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, y registrando un curso de tiempo de fluorescencia de GFP en un lector de placas (Figura 1B). Una serie de dilución de ADN plásmido encontró una fuerte expresión incluso a 1 nM de ADN. En comparación con un lisado disponible comercialmente, el autolisato puede producir un mayor rendimiento total y lograr una mayor tasa de producción máxima, calculada como la derivada temporal del curso de tiempo GFP(Figura 1C,D). Para obtener resultados adicionales utilizando este método, véase Didovyk et al.12. Este protocolo tiene relativamente pocos puntos de falla; sin embargo, se podrían obtener resultados subóptimos si el autolizado no está suficientemente limpio de restos celulares. Los resultados óptimos también pueden requerir la optimización de las concentraciones de PEG-8000 y Mg2+ para cada lote de lisado (ver Nota 2).
Figura 1: Resultados representativos. (A) Representación visual del protocolo. (B) Ejemplo de curso temporal de expresión de GFP a partir de pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 en un autolizado de congelación-descongelación. Producción máxima de GFP(C)y tasa máxima de producción(D)de autolisato preparado en 2 laboratorios diferentes por 2 investigadores diferentes, utilizando una centrífuga de 30.000 x g (azul y naranja) o una centrífuga de 20.000 x g (púrpura), en comparación con un lisado de referencia comercial (naranja, MYtxtl-70-960M de MYcroarray). Todas las barras de error son un error absoluto medio de dos réplicas técnicas. Esta cifra ha sido modificada a partir de 12. Derechos de autor 2017 American Chemical Society. Abreviatura: GFP = proteína fluorescente verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Solución 1: Agregue agua a 4 ml en total | |
| Nombre | Peso (mg) |
| 3-PGA | 386.4 |
| ATP | 52 |
| campamento | 13.8 |
| CoA | 11.2 |
| CTP | 28.4 |
| Ácido folínico | 1.9 |
| GTP | 47.6 |
| HEPES | 667.2 |
| NAD | 12.3 |
| Espermidina | 8.1 |
| ARNt | 11.2 |
| UTP | 29.5 |
Tabla 1: Solución 1. Componentes de la solución 1.
| Premezcla 2.5x | |
| Reactivo | Volumen (μL) |
| Mezcla de aminoácidos que contiene 24 mM cada uno, excepto la leucina que está a 20 mM | 2500 |
| ditiotreitol (TDT) a 100 mM | 100 |
| Glutamato de magnesio a 1 M | 25 |
| PEG-8000 al 40% en peso/vol | 500 |
| Glutamato de potasio a 2 M | 303 |
| Solución 1 (véase el cuadro 1) | 714.3 |
Tabla 2: Premezcla. Componentes de la solución de premezcla.
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Discussion
El protocolo descrito aquí produce lisado bacteriano altamente activo para la expresión génica libre de células. La clave es utilizar células portadoras del plásmido pAD-LyseR, que expresa el fago lambda endolisina citosólicamente. Estas células se potencian para lisarse a sí mismas tras la permeabilización de la membrana interna, permitiendo el acceso de la endolisina a la pared celular, lo que el método logra a través de un simple ciclo de congelación-descongelación. Debido a que las células se lisan efectivamente, el producto se conoce como autolisado. Después de que las células se han lisado, los únicos pasos restantes son la incubación y la centrifugación para limpiar el autolisado de los desechos celulares.
En comparación con otros métodos para producir lisado bacteriano, este enfoque es notablemente simple y rápido, pero no sacrifica la calidad del lisado. El protocolo se puede completar en 8-9 h después de inocular el cultivo de producción, con solo 1-2 horas de trabajo práctico. El único equipo recomendado que no es del todo estándar para los laboratorios de biología molecular es una centrífuga capaz de alcanzar los 30.000 × g. Sin embargo, el autolisado de calidad comparable se puede producir incluso con una centrífuga de menor velocidad(Figura 1C,D); el usuario solo tendría que tener más cuidado al eliminar el lisado del pellet, tal vez dejando un poco más de líquido para garantizar muestras limpias. Esta simplicidad no es simplemente una cuestión de conveniencia; los protocolos menos complicados tienden a producir resultados más reproducibles, con menos variación cuando se realizan con diferentes manos. La modificación presentada en el paso 5.4, en el que las células se liofilizan junto con todos los demás reactivos, presenta un protocolo aún más simple, aunque con rendimientos de producción de proteínas reducidos. En particular, en esta modificación, se omiten los pasos de centrifugación para limpiar el lisado de los desechos celulares, lo que reduce aún más el trabajo de procesamiento; sin embargo, los restos restantes reducen la expresión del lisado12.
En los últimos años, se han publicado muchos enfoques para producir lisado libre de células, resumidos recientemente por Cole et al.15. Estos estudios han explorado varias estrategias para el tipo de célula, las condiciones de crecimiento, las metodologías de lisis y el posprocesamiento. La mayoría de los otros métodos para la lisis han requerido equipo especializado, como una prensa francesa, homogeneizador, batidor de cuentas o sonicador. Fujiwara y Doi omitieron este equipo en favor de un ciclo de congelación-descongelación similar al descrito aquí, excepto que hicieron que las células fueran susceptibles a la lisis al tratarlas con lisozima en lugar de expresar una endolisina16. Aunque este es un protocolo más o menos tan simple como el descrito aquí, las células tratadas con lisozima deben lavarse mientras están en su estado frágil sin interrumpirlas prematuramente, lo que podría requerir delicadeza experimental e introducir una fuente de variabilidad.
Además del lisado, la expresión génica libre de células requiere una solución de premezcla que contenga fuentes de energía, MONÓmeros de ARN y proteínas, y otras moléculas pequeñas. La receta de premezcla fue descrita y optimizada previamente17,con algunas modificaciones. La premezcla utilizada aquí contenía concentraciones aproximadamente 4 veces más altas de aminoácidos, así como glutamato de magnesio adicional y PEG 8000 correspondientes a concentraciones de reacción final de 7.5 mM y 3.5% peso / volumen, respectivamente. Los resultados óptimos pueden requerir ajustar las concentraciones suplementarias de glutamato de magnesio y PEG 8000 para cada nuevo lote de lisado, aunque las concentraciones anteriores produjeron consistentemente buenos resultados (ver Nota 2). Las aplicaciones únicas pueden requerir la reoptimización de estas concentraciones, por ejemplo, cuando se utiliza lisado suplementado con ClpX13.
Una cepa estándar de E. coli para producir lisado libre de células es BL21-Gold (DE3). Un derivado de estas células que contiene el plásmido de autólisis pAD-LyseR se ha depositado en un depósito de cepas y plásmidos (ver la Tabla de Materiales). También están disponibles un derivado que carece de lacZ genómica para reducir drásticamente el fondo de los circuitos que utilizan la salida basada en LacZ y un plásmido de expresión pAD-GamS que se utilizará para la purificación de la proteína GamS que puede proteger el ADN lineal de la degradación. Estas cepas celulares y plásmidos deberían ser útiles para una variedad de aplicaciones en la expresión génica libre de células.
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Disclosures
J.H. es cofundador de GenCirq Inc, que se centra en la terapéutica del cáncer. Está en el Consejo de Administración y tiene participación en GenCirq.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Zachary Sun y Richard Murray (Instituto de Tecnología de California) por proporcionar amablemente el plásmido P_araBAD-gamS, y a Kaeko Kamei (Instituto de Tecnología de Kyoto) por proporcionar amablemente una centrífuga de enfriamiento de alta velocidad. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud y del programa ARO MURI y fue apoyado en parte por la Iniciativa Líder para Jóvenes Investigadores Excelentes, MEXT, Japón.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
References
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