Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء لبناء صفائف ألياف الكربون microelectrode للتسجيلات المزمنة والحادة في الفيزيولوجيا الكهربية في الجسم الحي في الماوس(Mus musculus)والنمس(موستيلا putorius furo) من مناطق الدماغ متعددة. كل خطوة، بعد شراء ألياف الكربون الخام لزرع صفيف microelectrode، ويرد وصف بالتفصيل، مع التركيز على بناء صفيف microelectrode.
Abstract
توفر صفائف الأقطاب الكهربائية متعددة القنوات نظرة ثاقبة على الدماغ العامل وتعمل على توضيح العمليات العصبية على مستوى الخلية الواحدة والدائرة. تطوير هذه الأدوات أمر بالغ الأهمية لفهم السلوكيات المعقدة والإدراك وللنهوض بالتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإنه لا يزال يشكل تحديا لتسجيل بكثافة من مجموعات الخلايا بشكل ثابت ومستمر على مدى فترات زمنية طويلة. تتميز العديد من الأقطاب الكهربائية الشائعة ، مثل tetrodes صفائف السيليكون ، بأقطار متقاطعة كبيرة تنتج تلفا عند الإدراج وتثير استجابات الأنسجة التفاعلية المزمنة المرتبطة بموت الخلايا العصبية ، مما يعوق تسجيل نشاط عصبي مستقر ومستمر. بالإضافة إلى ذلك، تظهر معظم حزم الأسلاك تباعد واسع بين القنوات، مما يمنع التسجيل المتزامن من عدد كبير من الخلايا المتجمعة في منطقة صغيرة. توفر صفائف الألياف الكربونية microelectrode الموصوفة في هذا البروتوكول حلا يمكن الوصول إليه لهذه المخاوف. توفر الدراسة طريقة مفصلة لتصنيع صفائف ألياف الكربون microelectrode التي يمكن استخدامها لكل من التسجيلات الحادة والمزمنة في الجسم الحي. الخصائص الفيزيائية لهذه الأقطاب الكهربائية جعلها مثالية للتسجيلات المستقرة والمستمرة على المدى الطويل في كثافات الخلايا العالية، مما يمكن الباحث من إجراء تسجيلات قوية لا لبس فيها من وحدات واحدة عبر أشهر.
Introduction
الأقطاب الكهربائية صفائف القطب هي أدوات قيمة لفهم كيفية معالجة الدماغ للمعلومات على مستوى الخلايا العصبية. في حين أن التسجيلات الكهربية كانت قابلة للتحقيق لأكثر من قرنينمن الزمان 1، فإنه لا يزال من غير الممكن قياس نشاط الدوائر العصبية بأكملها في القرار المكاني والزمني المطلوب لالتقاط ارتفاع الخلايا العصبية الفردية. على الرغم من أن الأساليب غير الغازية، مثل تخطيط الدماغ الكهربائي2،تضاريس الانبعاثات البوزيترونية3،والتصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي4 تسمح لقياسات الدماغ كله، فإنها لا يمكن تحقيق الدقة المكانية والزمنية اللازمة لحل نشاط الدوائر العصبية2،5. في المقابل، يمكن أن تحقق طرق التصوير مثل التصوير البصري باستخدام الأصباغ الحساسة للجهد أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا دقة مكانية أحادية الوحدة، ولكنها تطرح قضايا مثل الدقة الزمنية المنخفضة وضعف الانتقائية3و4و5و6. التسجيلات الكهربائية هي بديل قوي لهذه الأساليب. تسجيل الأقطاب الكهربائية توفير دقة زمنية لا مثيل لها والسماح للمستخدم لإجراء القياسات بدقة ارتفاع الوقت في أي منطقة من الدماغ7. بالإضافة إلى ذلك، صفائف متعددة الأقطاب المزروعة بشكل مزمن (MEAs) تمكن على نطاق واسع (عشرات إلى مئات الخلايا)، تسجيلات وحيدة الخلية في الحيوانات تتصرف على مدى فترة من الأيام إلى الأشهر8،9. ومع ذلك، المسابير السيليكون التي تسجل في كثافات أعلى لها بصمة كبيرة وهي الغازية للغاية، وصفائف مزروعة بشكل مزمن غالبا ما تولد استجابة التهاب، تغليف الأنسجة، والموت العصبي10،11،12،13.
وقد أدت القيود المفروضة على الأقطاب الكهربائية الموجودة في الابتكارات الأخيرة التي تسمح لتسجيلات مستقرة وعالية الدقة وطويلة الأجل. تتكون الأقطاب الكهربائية النموذجية من موصل معدني ، مثل التنغستن أو البلاتين إيريديوم ، أو تعتمد على السيليكون أو البوليمر. في حين أن صفائف الأسلاك الدقيقة القائمة على المعدن يمكنها الحفاظ على تسجيلات مستقرة طويلة الأجل ، إلا أن لها بصمة أكبر بكثير ، مع قطر سلك واحد يتراوح بين 10-200 ميكرومتر14. في المقابل، صفائف القطب القائم على السيليكون تسفر عن تسجيلات مع دقة المكانية عالية، ولكن نظرا لتصميمها جامدة نسبيا، فإنها عادة ما تكون غير قادرة على الحفاظ على إشارة وتسجيل من نفس الخلايا العصبية على مدى أشهر عديدة15. وقد أسفرت التطورات الأخيرة في صفائف السيليكون القائمة في الأقطاب الكهربائية التي يمكن أن تؤدي بشكل موثوق التسجيلات المزمنة، ولكن لا يمكن استخدام هذه الصفائف لتسجيل من مناطق الدماغ العميق في الحيوانات الكبيرة وتهدف للتسجيلات الخطية9. وقد أدى التقدم في صفائف البوليمر في زيادة المرونة وتسجيل الاستقرار من وحدات واحدة وتوفر إمكانية لتسجيلات عالية الكثافة في المستقبل القريب ولكن مع توافر محدود في الوقت الحاضر8،16،17. تسمح ألياف الكربون بالتسجيلات عالية الكثافة مع المواد الجاهزة الموضحة هنا.
وقد استخدمت ألياف الكربون تسجيل microelectrodes لعقود، مع أول أقطاب ألياف الكربون تتكون من ألياف الكربون واحد إدراجها في micropipette الزجاج. واستخدمت هذه microelectrodes لتسجيلات خارج الخلية وحدة واحدة، وعلى الرغم من أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء كانت مماثلة لأفضل التنغستن في الزجاج microelectrodes، كانت مفيدة نظرا لمرونتها، وانخفاض قيم المعاوقة، والبساطة لتصنيع18،19. تسارعت الجهود الرامية إلى تطوير صفائف أقطاب ألياف الكربون مؤخرا بسبب قدرات الاستشعار البيولوجي لألياف الكربون. بالإضافة إلى زيادة التوافق البيولوجي والتوصيلية الكهربائية الاستثنائية ، فإنها تتميز بمجموعة فريدة من الخصائص ، بما في ذلك مقاومة درجات الحرارة العالية ، والكثافة النسبية المنخفضة ، وقوة الشد العالية ، وتصلب الانحناء المنخفض ، وحساسية الكشف العالية ، ومنطقة صغيرة مقطعية10،12. كل هذه الخصائص قد حفزت على تطوير صفائف ألياف الكربون microelectrode (CFEAs) التي تسهل المزمنة, مستقرة, تسجيلات عالية الغلة من الخلايا العصبية واحدة. ويمكن الآن أن تكون وضعت هذه CFEAs باليد20،21 ( الشكل1) ، مما أسفر عن صفائف microelectrode التي يمكن أن تعقد الخلايا العصبية واحدة على مدى أشهر. وصف هنا هو عملية البناء للوصول لCFEAs التي تم تكييفها بطريقتين للتسجيلات الحادة والمزمنة من الخلايا العصبية الفردية في نوعين.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل جامعة برانديز أو لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة واشنطن. تم جمع البيانات المعروضة من أنثى نمس وفأر ذكر واحد.
1. إعداد ألياف الكربون والأدوات
- إعداد ألياف الكربون التجارية
- قطع شرائط 8 سم من حزمة الألياف بحجم الايبوكسي. وضع شرائط موازية في بوتقة وخبز في فرن في 400 درجة مئوية لمدة 6 ساعة لإزالة الايبوكسي من الألياف التجارية. ثم، تخزين الألياف المخبوزة في طبق بيتري القياسية أو أنبوب مخروطي.
ملاحظة: استخدمت الألياف التي يبلغ قطرها 7 ميكرومتر. وقد استخدمت مجموعات أخرى 4 ميكرومتر ألياف20،21. - إعداد أشرطة لعقد الألياف الفردية. استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد أو قاطع ليزر لإنشاء أشرطة الكاسيت وحامل الكاسيت المرتبط بها (انظر الشكل 2).
- تحميل الألياف على أشرطة الكاسيت. ابدأ بوضع قطعة من الشريط على الوجهين الطويلين من الكاسيت، مع محاذاة حافة الشريط مع الحافة الداخلية للكاسيت. فصل الألياف الفردية من حزمة المخبوزات ووضعها بالتوازي مع الجانب القصير من كاسيت، وحفظ 2-3 مم بين الألياف. تأكد من احتواء 20-30 ألياف على كل كاسيت. ختم الألياف في مكان عن طريق وضع شريط واضح على الشريط عصا مزدوجة. ضع أشرطة الفيديو المملوءة في حامل الكاسيت.
ملاحظة: بالنسبة لمنشئ متمرس، فإن ملء شريط كاسيت واحد من الألياف سيستغرق ~ 1 ساعة. بالنسبة للمنشئ المبتدئ ، من المرجح أن تستغرق هذه العملية ~ 1.5-3 ساعة. هناك عشرة أشرطة إلى مربع، واثنين من أصحاب كاسيت يمكن أن يصلح في غرفة ترسب باريلين. - معطف الألياف الفردية مع parylene C باستخدام غرفة ترسب فراغ التجارية. وهناك حاجة إلى تشغيل واحد للطلاء. قياس 2.3 غرام من الباريلين لكل شوط. اثنين من أصحاب كاسيت تناسب في الغرفة في وقت واحد. يستغرق إجراء الطلاء ~ 2 ساعة لكل شوط.
ملاحظة: يوفر قياس 2.3 غرام من الباريلين C 1 ميكرومتر تقريبا من الطلاء. يمكن تخزين الألياف المغلفة إلى أجل غير مسمى.
- قطع شرائط 8 سم من حزمة الألياف بحجم الايبوكسي. وضع شرائط موازية في بوتقة وخبز في فرن في 400 درجة مئوية لمدة 6 ساعة لإزالة الايبوكسي من الألياف التجارية. ثم، تخزين الألياف المخبوزة في طبق بيتري القياسية أو أنبوب مخروطي.
- إعداد أداة التلاعب بألياف الكربون
- التفاف قطعة صغيرة من فيلم لاصق مرن حول إبرة 30 G، وتشكيل نقطة حادة ولكن مرنة مع فيلم لاصق.
ملاحظة: التفاف طرف إبرة مع البارافيلم، وتمتد البارافيلم في القيام بذلك، يخلق تأثير لاصق خفيف يسمح للمستخدم لالتقاط والمناورة الألياف الفردية.
- التفاف قطعة صغيرة من فيلم لاصق مرن حول إبرة 30 G، وتشكيل نقطة حادة ولكن مرنة مع فيلم لاصق.
2. التصميم والتصنيع
- حدد تصميم الرقصة المناسبة اللازمة استنادا إلى مواصفات القطب الذي سيتم بناؤه. وسيستند ذلك إلى عدد القنوات اللازمة، إلى جانب أي إضافات في التصميم.
ملاحظة: تشير Jig إلى الكتلة المطبوعة ثلاثية الأبعاد التي توفر مرساة للأقطاب الكهربائية والاتصالات الكهربائية. - إنشاء أو تغيير التصميم المحدد للجيج باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD).
- استخدم شركة طباعة ثلاثية الأبعاد أو مختبر صانع المؤسسات لطباعة الرقصات باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد SLA عالية الدقة.
3. تجميع مجموعة الألياف الكربونية microelectrode (CFEA)
ملاحظة: هذه الخطوة يأخذ ~ 2 ساعة لمنشئ من ذوي الخبرة و ~ 6 ساعة لمنشئ مبتدئ. تنفيذ جميع خطوات التجمع CFEA والألياف تجميع الخطوات تحت المجهر ستيريو 10x. استكمال تجميع CFEA في بيئة مع الحد الأدنى من حركة الهواء، لأن هذا قد يزعج عملية البناء.
- اختيار الرقصة المناسبة اللازمة لبناء القطب المطلوب.
- باستخدام قطع الأسلاك المعدنية، وقطع قطعتين من سلك التنغستن من قطر 0.003 في (76.2 ميكرومتر)، حوالي 7 سم في الطول.
- تغذية كل سلك من خلال القناة المناسبة على نهاية موصل من الرقصة (GND و REF). تغذية ما يكفي من خلال حتى طرفي متساوية في الطول، ومن ثم تحريف لهم معا لتأمينها على الرقصة.
ملاحظة: للتصميم الحاد ذو ال 16 قناة، تأكد من أن السلك المعدني يناسب الحافة في الرقصة.- تطبيق الأشعة فوق البنفسجية الشفاء اسمنت الأسنان لتأمين السلك. تأكد من عدم الحصول على أي أسمنت الأسنان داخل القناة المفتوحة التي يتم تغذية السلك من خلال.
ملاحظة: يجب على المستخدم ارتداء الأشعة فوق البنفسجية لتصفية العين أثناء جميع الإجراءات المتعلقة بالأشعة فوق البنفسجية لمنع تلف العين المحتمل. تحتوي العديد من الصولجانات المعالجة للأشعة فوق البنفسجية على فلاتر عرض مدمجة. - باستخدام عصا علاج الأشعة فوق البنفسجية، علاج أسمنت الأسنان لمدة 20 s.
- تأمين الرقصة في قناع المجوهرات من قبل واحد من أذرع الرقصة. توجيه الرقصة بحيث يكون أحد الوجوه الجانبية موازيا للأرض.
- قم بتوجيه الرقصة والقناع تحت المجهر بحيث تكون نهاية الموصل والحوض وطرف القمع مرئية. توجيه الرقصة بحيث توجيه توجيه بعيدا عن المستخدم ونهاية الموصل هو التي تواجه نحو المستخدم.
- جمع أدوات ألياف الكربون وإبرة حادة 25 G.
- وضع كاسيت مع ألياف المغلفة parylene-C على ورقة بيضاء، الشريط الجانب حتى بحيث الألياف ليست مباشرة على الورق.
- استخدم إبرة 25 G لقطع ألياف كربون واحدة من الكاسيت. القيام بذلك عن طريق انزلاق غيض من الإبرة ضد كاسيت حيث الألياف التي سيتم إزالتها يخرج من.
- إذا بناء باستخدام نصف الألياف، وقطع نهاية واحدة من الألياف كما هو موضح أعلاه. توجيه الألياف بحيث يكون مستقيما، وباستخدام الإبرة، وقطع الألياف إلى النصف عن طريق قطع الألياف ضد ورقة. من أجل قطع النصف الآخر، الذي لا يزال متصلا كاسيت، عقد غيض الحرة من الألياف مع أداة ألياف الكربون التي تم إجراؤها سابقا، ومن ثم استخدام الإبرة لقطع الألياف لا تزال متصلة كاسيت كما هو موضح أعلاه.
- إذا بناء باستخدام الألياف الكاملة، وقطع نهاية واحدة من الألياف كما هو موضح أعلاه. استخدام أداة ألياف الكربون التي سبق إجراؤها وعقد نهاية الحرة من الألياف التي تم قطع فقط. باستخدام الإبرة، وقطع الطرف الآخر من الألياف بعيدا عن كاسيت.
- التقاط ألياف الكربون باستخدام أداة ألياف الكربون التي سبق إجراؤها. التقاط الألياف بحيث نهاية واحدة لديها حوالي 1 سم من طول الأداة.
- استخدام أداة ألياف الكربون مع الألياف المرفقة وتغذية نهاية أقصر من الألياف من خلال قطعة القمع من الحوض الأوسط من الرقصة. استخدام المجهر لتصور.
- الاستمرار في تغذية الألياف من خلال قمع الرقصة حتى معظم طول الألياف من خلال (انظر الشكل 3A).
- تغذية الجزء الخلفي من الألياف من خلال قناة متاحة باستخدام أداة ألياف الكربون التي سبق إجراؤها. تغذية الألياف من خلال الظهر حتى حوالي 5 ملم من الألياف هو التمسك بها من الخلف. قطع إلى حجم إذا لزم الأمر (انظر الشكل 3B).
ملاحظة: لا تغذي الألياف في القنوات التي تحتوي على الأسلاك المعدنية.
- ملء ما تبقى من القنوات مع الألياف على جانب واحد من الرقصة، وفقا للتوجيهات المذكورة أعلاه.
ملاحظة: عند تغذية الألياف في القمع، تغذية نصف الألياف في كل قسم من القمع، مع النصف الأيمن من القنوات في القسم الأيمن والنصف الأيسر من القنوات في القسم الأيسر. عندما تكون الألياف على اتصال وثيق داخل القمع ، هناك احتكاك غير موات بين الألياف التي تؤدي إلى الألياف الموجودة إما سحبت فضفاضة أو مكسورة أثناء تغذية ألياف جديدة في الرقصة. يوفر هذا التقسيم إلى أربعة أقسام بعض الراحة ، حيث يتم الاحتفاظ بالألياف في حزم أصغر حتى خطوة لاحقة. - استخدام أخف وزنا عجلة شرارة القياسية وتمرير بسرعة اللهب على الألياف المكشوفة في نهاية الموصل. تأكد من إزالة عزل جميع الألياف في النهايات (انظر الشكل 3C).
ملاحظة: يجب أن يظهر الجزء من الألياف التي تعرضت للهب أن يكون أرق قليلا من بقية الألياف. - تغذية الألياف الملتهبة من خلال الرقصة بحيث جزء من الألياف المعرضة للهب هو الآن داخل القناة. تأكد من عدم وجود ألياف تخرج الجزء الخلفي من الرقصة (انظر الشكل 3D).
ملاحظة: استخدام أداة ألياف الكربون لفهم الألياف من داخل الحوض وتغذية الألياف الملتهبة من خلال الرقصة. لا تلمس جزء من الألياف المعرضة للهب، وهذا الجزء هو أكثر هشاشة. - تطبيق الأشعة فوق البنفسجية الشفاء أسمنت الأسنان إلى الألياف في حوض الرقصة. ملء الحوض بأكمله لتغطية فتحات القنوات وفتح القمع (انظر الشكل 3E).
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية وعلاج الاسمنت الأسنان لمدة 20 s. علاج لمدة 20 s إضافية إذا لم يتم الشفاء تماما الاسمنت الأسنان.
ملاحظة: تأكد من أن الاسمنت الأسنان لا يسافر داخل القنوات.
- استخدام الأشعة فوق البنفسجية وعلاج الاسمنت الأسنان لمدة 20 s. علاج لمدة 20 s إضافية إذا لم يتم الشفاء تماما الاسمنت الأسنان.
- إزالة الرقصة من فيس، والوجه أكثر من ذلك، وتأمين الرقصة في vise كما المضمون سابقا. تأكد من أن الجانب الذي يحتوي على الألياف هو الآن وجهه لأسفل.
- ملء في الجانب الفارغ من الرقصة مع ألياف الكربون تماما كما هو موضح أعلاه.
- مرة واحدة في جميع القنوات والألياف ، ويتم تأمين الألياف مع الاسمنت الأسنان ، وإزالة الرقصة من فيس وتوجيه الرقصة بحيث يتم توجيه القمع إلى أسفل. تأمين الرقصة في فيس بحيث نهاية الموصل يشير إلى أعلى.
- جمع حادة يميل 25 G إبرة, حقنة 1 مل, الفضة الطلاء موصل, القطن يميل التطبيقات, أرق الطلاء, مناديل الأنسجة, والموصل headstage المناسبة.
ملاحظة: تأكد من أن الطلاء موصل الفضة مختلطة بشكل جيد وهو حل متجانس. لا تدع الطلاء يجف. - رسم 0.3 مل من الطلاء الفضي في حقنة 1 مل، ومن ثم إرفاق إبرة حادة الرؤوس 25 G.
- أدخل الإبرة بعناية في قناة واحدة حتى يتوقف عن طريق أسمنت الأسنان. الاكتئاب ببطء حقنة أثناء إزالة الإبرة من القناة لملء القناة مع الطلاء (انظر الشكل 3E).
- مسح أي الطلاء قبالة الإبرة، ومن ثم الاستمرار في القناة التالية.
- ملء جميع القنوات مع الطلاء.
ملاحظة: قد يكون من الضروري تمرير إضافية إلى القنوات كما مجموعات الطلاء في القنوات لعدة دقائق الأولى.
- ملء جميع القنوات مع الطلاء.
- تراجع قضيب القطن يميل في أرق الطلاء، ومن ثم تنظيف قاعدة الرقصة من أي الطلاء على السطح. قد يكون من الضروري وجود عدد قليل من الملقطين ذات الرؤوس القطنية لهذا الغرض.
ملاحظة: قد تكون التطبيقات ذات الرؤوس القطنية غير المغمسة في أرق الطلاء مفيدة أيضا لتنظيف الرقصة. - أدخل موصل المرحلة الرأسية في الاتجاه الصحيح عن طريق محاذاة الدبابيس مع القنوات. تأكد من أن موصل headstage يجلس مستقيم مستقيم وتدفق إلى الرقصة قدر الإمكان (انظر الشكل 3F).
- السماح للجيج لعلاج لمدة 24 ساعة.
- تأمين موصل headstage إلى الرقصة باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الشفاء اسمنت الأسنان عن طريق تطبيق الاسمنت الأسنان على طول الحافة حيث موصل headstage يلتقي الرقصة. علاج الأشعة فوق البنفسجية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 s.
- تطبيق الأشعة فوق البنفسجية الشفاء اسمنت الأسنان لتأمين السلك. تأكد من عدم الحصول على أي أسمنت الأسنان داخل القناة المفتوحة التي يتم تغذية السلك من خلال.
4. حزمة الألياف التعبئة والتغليف
ملاحظة: يستغرق حوالي 30 دقيقة لتنفيذ هذه الخطوة. إكمال هذه الخطوة للأقطاب الكهربائية المستخدمة في نماذج الحيوانات مع طبقة سميكة من بيا ماتر. تعزيز حزمة الألياف لتقليل الانحناء. في إجراءات الماوس، قد لا تكون هذه الخطوة ضرورية.
- جمع حزمة من الألياف معا في رمح واحد باستخدام التوتر المياه. استخدام ماصة نقل لتشغيل قطرة من الماء من طرف القمع إلى طرف حزمة في حين يتم تأمين القطب تستقيم في قناع.
- ابدأ بتطبيق طبقة من أسمنت الأسنان سمكها حوالي 1.5 مم حول الحزمة عند طرف القمع. علاج الاسمنت الأسنان مع 20 ق من الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: للتسجيلات القشرية، لا حاجة إلى مزيد من التعبئة والتغليف. بالنسبة لمناطق الدماغ العميقة، قم بتأمين أنبوب إرشادي حول الحزمة. - بناء أنبوب دليل وإدراج حزمة في أنبوب دليل
- قياس وقطع الطول المطلوب من أنابيب البوليميد. تأكد من أن طول أنابيب البوليميد يترك 2 مم من نصائح ألياف الكربون مجانا. قياس وقطع قطعة من أنابيب معدنية 30 G 2 مم أقصر من أنابيب البوليميد. استخدام أداة دوارة لإزالة أي حواف حادة على أنابيب معدنية. أدخل أنابيب البوليميد داخل الأنابيب المعدنية.
- ضع القطب في قناع مع حزمة ألياف الكربون مشيرا إلى أعلى. تأمين أنابيب تجميعها إلى micromanipulator و, باستخدام المجهر, خفض بعناية على حزمة الألياف. تأمين الأنابيب إلى قاعدة الاسمنت الأسنان القائمة باستخدام طبقة إضافية من الاسمنت الأسنان. علاج الاسمنت الأسنان مع 20 ق من الأشعة فوق البنفسجية.
ملاحظة: يمكن إيقاف عملية البناء مؤقتا هنا.
5. إعداد طرف القطب الكهربائي
ملاحظة: يستغرق حوالي 30 دقيقة لكل صفيف لتنفيذ هذه الخطوة.
- قطع الأقطاب الكهربائية إلى الطول المطلوب.
- استعدادا لقطع طرف القطب، كومة تلاحظ لزجة لبناء منصة ما يقرب من 1.5 مم عالية. قياس، من حافة المنصة، وطول القطب المطلوب ووضع علامة على هذه المسافة. وسوف تكون المنصة بمثابة دليل للقطع.
- خفض القطب إلى كوب من الماء deionized أو المقطر حتى يتم مغمورة تماما طرف القمع، تلميح أولا، وعقد طبيعية على السطح. جمع ألياف الكربون الفردية معا عن طريق إزالة القطب من الماء. التوتر السطحي سوف يجمع الحزمة (الحزم) معا. السماح للقطب للهواء الجاف لمدة 30 دقيقة.
- إرفاق شفرة المشرط رقم 10 بالمقبض. تجميد المشرط والقطب الكهربائي عن طريق وضعها في الثلاجة -18 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
- وضع القطب بحيث الألياف تكمن دافق على سطح الدليل (أعدت في الخطوة 5.1.1). قطع الألياف إلى الطول المطلوب مع مشرط، وذلك باستخدام حركة المتداول. أكمل هذه الخطوة بسرعة لضمان أن القطب والمشرط لا يزالان مجمدين (انظر الشكل 3G).
- حقن التيار الإيجابي للحد من مقاومة نصائح القطب.
- إرفاق القطب إلى اختبار مقاومة متعددة الإلكترود باستخدام محول المناسبة (انظر جدول المواد). طرف القطب السفلي ~ 2 مم في أنبوب الطرد المركزي الدقيق من المالحة العازلة 0.1 M الفوسفات (PBS). أدخل سلك التأريض في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- حقن التيار مع السعة والمدة المختارة.
ملاحظة: هذه الخطوة تهدف إلى تقليل قيم المعاوقة في طرف CFEA. في هذه الدراسة، تم إدخال المعلمات التالية في واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج الربط الكهربائي: الحالي: 0.100 ميكرومتر؛ 2.100 ميكرومتر؛ 2.100 ميكرومتر؛ 200 ميكرومتر؛ 0.100 ميكرومتر؛ 0.100 ميكرومتر؛ 0.100 ميكرومتر. المدة: 10 s; وقفة: 1 ق. ويمكن تكرار هذه العملية حسب الضرورة، في كل قناة، حتى تلبي مقاومات القطب القيم المطلوبة (انظر الشكل 4C). - مرة واحدة في القيم المعاوقة هي على النحو المطلوب، شطف الألياف في الماء deionized أو المقطر لتنظيف.
- لوحة كهربائية في حل الطلاء الذهب.
ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة قبل فترة وجيزة من الزرع (نفس اليوم).
تنبيه: بعض المواد الكيميائية المستخدمة في إعداد نصائح CFEA هي تآكل، بما في ذلك محلول طلاء الذهب. استشر SDS قبل الاستخدام وحدد التدابير الوقائية المناسبة التي يجب اتخاذها للتعامل مع الحل بأمان.
ملاحظة: لتوفير صلابة لحزمة الألياف، يمكن للمستخدم إنشاء حل الطلاء الذهب عن طريق أول solubilizing PEG8000 في الماء deionized أو المقطر في 1 ملغم / مل. ثم، والجمع بين 625 ميكرولتر solubilized PEG8000 و 375 ميكرولتر الذهب الطلاء الحل ودوامة الحل لمدة 10 ق لخلط. فإن PEG8000 تذوب بعد إدخال الألياف في الدماغ.- خفض طرف حزمة القطب ~ 2 ملم في أنبوب الطرد الدقيق من خليط الطلاء. أدخل سلك التأريض في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- تعيين المعلمات المناسبة للكهربائية. في هذه الدراسة، تم إدخال المعلمات التالية في واجهة المستخدم الرسومية لبرنامج الربط الكهربائي: الحالي: -0.05 ميكروA؛ المدة: 30 s; وقفة: 5 ق.
- شطف الألياف جيدا مع الماء deionized أو المقطر. في هذا الوقت، قم بقياس قيم المعاوقة مرة أخرى إذا رغبت في ذلك.
6. الإدراج في الدماغ: جراحة البقاء على قيد الحياة، الماوس (Mus musculus) وغير البقاء على قيد الحياة الجراحة، النمس (موستيلا putorius furo)
ملاحظة: يجب أن تتبع العمليات الجراحية البروتوكول القياسي امتثالا ل IACUC. للحصول على معلومات مفصلة انظر Ma et al.22 لبروتوكول جراحة البقاء على قيد الحياة وبوبوفيتش وآخرون23 لبروتوكول جراحة عدم البقاء على قيد الحياة. اتبع الإجراءات الجراحية العقيمة وفقا لإرشادات ASC لجراحة البقاء على قيد الحياة في أنواع القوارض. وتشمل هذه السيارات جميع الأدوات والمواد الجراحية في 135 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعلاج الجهاز ستيريوتاكسيك والمنطقة الجراحية مع الإيثانول 70٪. استخدم قفازات جراحية معقمة، وثوب يمكن التخلص منه، وقناع للوجه أثناء العملية.
- جراحة البقاء على قيد الحياة، الماوس (Musculus).
- تخدير الفئران مع 2.5٪ isoflurane في مربع التعريفي ل ~ 1 دقيقة، حتى يصل معدل التنفس 55-65 نفسا / دقيقة. ثم، إدارة 2.0٪ isoflurane من خلال مخروط الأنف للحفاظ على التخدير. تطبيق مرهم الطبيب البيطري على كلتا العينين لمنع تلف القرنية. إجراء قرصة إصبع القدم للتحقق من درجة التخدير المناسبة.
- بعد التحقق، اتبع إجراءات جراحة البقاء على قيد الحياة المفصلة في Ma et al.22. مراقبة معدل التنفس والحفاظ عليه في 60 نفسا / دقيقة. حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين يتم التحكم فيها حراريا. انظر الخطوات 6.3-6.5 (المفصلة أدناه) للحصول على تعليمات حول إعداد الجمجمة لاستئصال القحف، وتجميل الدروتومي، وزرع الأقطاب الكهربائية.
- بعد الجراحة، أعد الفئران إلى قفص الإنعاش، المجهز بمنصة تدفئة 37 درجة مئوية، معزولة عن الحيوانات الأخرى.
- تغطية الجروح الجراحية في مرهم المضادات الحيوية. مراقبة الحيوانات حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على شغل المؤخرة والسماح لهم بالتعافي لفترة 2-5 أيام. منزل لهم بشكل يؤنب ومراقبة باستمرار لعلامات العدوى أو عدم الراحة. إعطاء الحيوانات جرعة واحدة من البوبرينورفين 72 ساعة المستدامة الإفراج (0.5-1.0 ملغ / كغ) في يوم الجراحة كمسكن.
- جراحة عدم البقاء على قيد الحياة، النمس (موستيلا بوتوريوس فرو)
- تخدير النمس في البداية مع الكيتامين (20 ملغم / كجم ، i.m) ، ثم تهوية مع 1.0 ٪ - 2.0 ٪ isoflurane في خليط 2:1 من أكسيد النيتروز والأوكسجين من خلال قناع. إجراء قرصة إصبع القدم للتحقق من درجة التخدير المناسبة.
- بعد التحقق، اتبع إجراءات الجراحة غير البقاء على قيد الحياة مفصلة في بوبوفيتشوآخرون. إجراء فغر القصبة الهوائية وتهوية الحيوانات مع 1.0٪ -2.0٪ من ايزوفلوران في خليط 2:1 من أكسيد النيتروز والأوكسجين. تطبيق مرهم البيطري على كل من العينين لمنع تلف القرنية.
- حافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة تسخين يتم التحكم فيها حراريا. مراقبة معدل ضربات القلب، ومستويات ثاني أكسيد الكربونفي نهاية المد والجزر، ومعدل التنفس. الحفاظ على معدل التنفس ضمن النطاق الفسيولوجي المناسب (3.5٪ -4.0٪). انظر الخطوات 6.3-6.5 (المفصلة أدناه) للحصول على تعليمات حول إعداد الجمجمة لاستئصال القحف، وتجميل الدروتومي، وزرع الأقطاب الكهربائية.
- مراقبة تخطيط القلب للحيوان باستمرار لضمان التخدير الكافي وزيادة النسبة المئوية للisoflurane إذا كان تخطيط القلب يشير إلى أي محنة.
- عند الانتهاء من التجربة، قم بإعطاء 1 مل من الصوديوم البنتوباربيتال وحل الصوديوم فينيتوين للنمس ورصد حتى معدل ضربات القلب ونهاية المد والجزر CO2 التدابير 0.
- إعداد الجمجمة
- باستخدام 0.8 ملم حفر بور، حفر واحد 4 مم × 4 مم القحف في الموقع المطلوب لزرع. بالنسبة للفأر، حفر حفرة نتوء إضافية في موقع مضاد لإدراج المسمار الأرضي المقاوم للصدأ.
ملاحظة: لا تقم بإجراء عملية استئصال دوروتوي حتى يصبح القطب الكهربائي جاهزا للزرع. - إنشاء أرضية/مرجعية. في تجارب النمس الحادة، استخدم إبرة 18 G لاختراق الجلد وطبقة العضلات المحيطة بالجمجمة على جانب رأس الحيوان المقابل لاستئصال القحف. أدخل سلك نهاية القطب المرجعي Ag/Cl في طرف الإبرة، ثم اسحب الإبرة من العضلات/الجلد بحيث تجلس الكريات الآن بشكل آمن بين العضلة والجمجمة. في الماوس، التفاف السلك الأرض الفضة حول المسمار أسس الفولاذ المقاوم للصدأ. آمن مع أسمنت الأسنان المعالج للأشعة فوق البنفسجية.
- قم بتوصيل القطب إلى حامل القطب الكهربائي باستخدام شريط رفيع من شريط وضع العلامات وتأمين حامل القطب الكهربائي في المايكرومانيبولاتور. إرفاق السلك الأرضي إلى مصدر التأريض عبر مقطع التمساح. إرفاق السلك المرجعي إلى القطب المرجعي جزءا لا يتجزأ من عضلة الحيوان.
- باستخدام 0.8 ملم حفر بور، حفر واحد 4 مم × 4 مم القحف في الموقع المطلوب لزرع. بالنسبة للفأر، حفر حفرة نتوء إضافية في موقع مضاد لإدراج المسمار الأرضي المقاوم للصدأ.
- اختراق دوروتومي وبيا
- إزالة دورا من استئصال القحف باستخدام اختيار دورا.
- خلق ثقب صغير في بيا. للقيام بذلك، إدراج وسحب microelectrode المعدنية (الموصى بها في النمس). بدلا من ذلك، خفض الغدد المتعامدة CFEA إلى سطح الدماغ لتجنب أي الأوعية الدموية. مرة واحدة يتم تحديد هذا الموقع، ورفع القطب بلطف سطح الدماغ في هذا الموقع مع اختيار دورا، وسحب صعودا مع اختيار (الموصى بها في الماوس).
- زرع قطب كهربائي
- خفض طرف القطب إلى نفس الموقع، وفي وضع جيد، تبدأ في دفع القطب إلى الدماغ بمعدل ~ 2 ميكرومتر / ثانية. استخدم المجهر لضمان دخول القطب الكهربائي بسلاسة وعدم الانحناء.
ملاحظة: إذا لم يدخل القطب الكهربائي بسلاسة، ارفعه من الدماغ ثم قم بإعادة ضبط الزاوية. إذا استمر في الانحناء دون الدخول بسلاسة ، فعدل الموقع وكرر عملية سرقة سطح الدماغ لموقع الدخول الجديد. - إجراء عملية الزرع المزمنة والحادة باستخدام الخطوات التالية.
- للزرع المزمن: أسمنت القطب الكهربائي في مكان باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الشفاء أسمنت الأسنان.
- أغلق الشق باستخدام الغرز الجراحية 5-0 وبناء غطاء الرأس.
- لبناء غطاء الرأس إضافة أسمنت الأسنان إضافية حول موقع زرع. تأكد من تغطية أنف الرقصة.
- سحب الجلد صعودا وحول غطاء الرأس. خياطة الشق خلف غطاء الرأس مع 5-0 الغرز الجراحية.
- تطبيق كريم الليدوكائين ومرهم المضادات الحيوية.
- وقف التخدير واتباع إجراءات الاسترداد القياسية.
- للزرع الحاد: بعد خفض القطب الكهربائي والوصول إلى العمق المطلوب، انتظر 30 دقيقة على الأقل قبل البدء في التسجيل الكهربي للسماح للقطب بالاستقرار في مكانه.
- للزرع المزمن: أسمنت القطب الكهربائي في مكان باستخدام الأشعة فوق البنفسجية الشفاء أسمنت الأسنان.
- خفض طرف القطب إلى نفس الموقع، وفي وضع جيد، تبدأ في دفع القطب إلى الدماغ بمعدل ~ 2 ميكرومتر / ثانية. استخدم المجهر لضمان دخول القطب الكهربائي بسلاسة وعدم الانحناء.
Representative Results
ومع الانتهاء من هذا البروتوكول، سيكون من الممكن تسجيل تسجيلات مستقرة لنشاط التصاعد لوحدة واحدة. هذه الصفائف microelectrode قابلة للتخصيص في المواد، وعدد القنوات، ومحول headstage على أساس احتياجات الباحث. ألياف الطلاء الكهربائي في نتائج الذهب في انخفاض المعاوقات مناسبة للتسجيل (الشكل 4 والشكل 5). إذا كان المستخدم ينوي التسجيل بشكل مزمن ، يمكن إجراء القياسات بعد تعافي الحيوان من العملية الجراحية. وقد أدت الإجراءات المزمنة إلى تسجيلات مستقرة من وحدة واحدة لمدة 120 يوما على الأقل. يظهر تسجيل تمثيلي في الشكل 6، يوضح النشاط الكهربي المستقر من 64 قناة في القشرة الرجعية لفأر ذكر بالغ يتصرف بحرية. إذا كان المقصود إعداد حاد، يمكن أن تبدأ التسجيلات بعد فترة وجيزة من زرع (~ 30 دقيقة). وهذا سوف يتيح الوقت للقطب ليستقر في الدماغ. ويقدم الشكل 7 مثالا تمثيليا لتسجيل CFEA حاد من 16 قناة تم الحصول عليه من القشرة البصرية الأولية لنمس أنثى بالغة. تم إجراء فرز سبايك في الماوس والنمس مع برامج فرز المسامير (انظر جدول المواد).
الشكل 1: تشريح 16- و 32 قناة من الألياف الكربونية microelectrode صفائف (CFEAs). (أ) التخطيطات من 32 قناة (أعلى) و 16 قناة (أسفل) CFEA من ثلاث وجهات نظر مختلفة. تتميز CFEA ذات ال 16 قناة بتصميم ممتد لأغراض المناولة. يتميز التصميم ذو ال 32 قناة بوجه مسطح يسمح بدمج هزتين ل CFEA من 64 قناة. كل من المخططات لها هياكل تعريف المسمى مع الأبعاد. يشير طرف الموصل إلى موقع الإدراج الموصل، وقنوات GND/REF تشير إلى مكان إدخال سلك التأريض. يشير حوض القمع إلى الموقع الذي تمر منه الألياف ليتم تراكبها مع أسمنت الأسنان المعالج بالأشعة فوق البنفسجية ، ويدل طرف القمع على الموقع من حيث تخرج الألياف من الرقصة. وينقسم طرف القمع إلى أرباع لتقليل الألياف التشبث معا وخلق الضرر. يتم سحب الألياف في وقت لاحق في حزمة واحدة مع استخدام أسمنت الأسنان. Jigs هي 3D المطبوعة باستخدام الطابعات الراتنج جيش تحرير السودان. يتم تكبير المخططات لإظهار التفاصيل. (ب) شيدت CFEA. يحتوي الرسم التخطيطي على هياكل تعريفية تم تسميتها. يمثل طرف الحزمة الزرقاء الجزء من ألياف الكربون التي تكتسب قياسات التسجيل. الرمادي داخل حوض القمع والمحيطة الموصل يدل على الأشعة فوق البنفسجية ضوء الشفاء الأسمنت الأسنان التي تحمل ألياف الكربون في مكان في حوض القمع ويضمن موصل إلى الرقصة. يمثل السلك الأرجواني سلك التأريض. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2:تحميل ألياف الكربون الخام في أشرطة طلاء باريلين C. (A) يتم تحميل ألياف الكربون على خراطيش مضافة مع شريطين من الشريط على الوجهين (الأزرق). يتم تحميل كل كاسيت مع ~ 25 الألياف. (ب) يتم تحميل كاسيت في حامل الليزر قطع (رمادي) استعدادا لطلاء باريلين C. كل منها يحمل عشرة أشرطة كاسيت. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3:صفيف الألياف الكربونية microelectrode (CFEA) حزمة البناء التخطيطي. (A) 16 الفردية، ألياف الكربون المغلفة (أسود) هي مترابطة من خلال الرقصة المطبوعة 3D 32 قناة (رمادي). (ب) يتم قطع نصائح ألياف الكربون مع مقص صغير، وترك الألياف الزائدة مساوية لارتفاع قاعدة الرقصة، وتمتد من قاعدة الرقصة. (ج)يتم تمرير أخف وزنا عجلة شرارة البلاستيك القياسية بسرعة على الألياف الزائدة لإزالة العزل C parylene. يظهر التخطيطي العلوي الأيمن إزالة الباريلين من 9 من الألياف ال 12. (د) يتم إعادة إدراج الألياف في الرقصة حتى نهاية الألياف هو دافق مع قاعدة. يظهر التخطيطي العلوي الأيمن إعادة إدخال 9 ألياف مع نصائح ألياف غير مخبولة (رمادية) داخل قاعدة الرقصة. ثم يتم قلب الرقصة وتتكرر الخطوات A-D لخيط القنوات ال 16 المقابلة. (ه) يتم تعبئة الرقصة مع أسمنت الأسنان لتأمين الألياف. يتم حقن الفضة المطبوعة في كل بئر من قاعدة الرقصة. (F) يتم إدخال موصل الذكور في قاعدة الرقصة. (G)CFEA والمشرط المجمدة في -20 درجة مئوية الفريزر. يتم قطع طرف الصفيف إلى الطول المطلوب ، تاركا 32 ليفا حتى. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تلميح العلاج والكهرباء. (أ) يتم وضع نصائح القطب لأول مرة في برنامج تلفزيوني 0.1 M, حيث يتم تمرير التيار من خلال كل قطب كهربائي. ثم يتم شطف النصائح ونقلها إلى محلول طلاء الذهب ، حيث يتم طلاءها بالتيار. (ب) تظهر صور SEM من ألياف الكربون المعدة محلول طلاء الذهب المركزة في الطرف. يمثل شريط المقياس 4 ميكرومتر (C) قيم المعاوقة من 168 قناة بعد القطع الأولي (أرجواني؛ 3.11 MΩ ± 0.42 MΩ، متوسط ± SE، n = 168 ليف)، حقن تيار إيجابي (وردي؛ 1.23 MΩ ± 0.36 MΩ، متوسط ± SE، n = 168 ليف)، واللدائن الكهربائية (البرتقالي؛ 0.19 MΩ ± 0.15 MΩ، متوسط ± SE، n = 168 ليف) تظهر انخفاض قيم المعاوقة بعد كل خطوة معالجة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:متوسط الذهب الصعق الكهربائي المدد تنتج صغيرة، وودائع مقربة على نصائح حزمة ألياف الكربون. نصائح ألياف الكربون في الصورة كلها من صفائف microelectrode مختلفة، مما يعكس فترات مختلفة من التيار حقن للحد من المعاوقة أو طلاء الذهب. صور تصور بالإضافة إلى ذلك طلاء باريلين C، الذي يعزل ألياف الكربون ويمنع أي الحصول على إشارة من موقع آخر غير نصائح من الألياف. (أ) مسح صورة المجهر الإلكتروني من نصائح ألياف الكربون بعد تجميد وجعل قطع واحد مع شفرة حلاقة. تمثل أشرطة المقياس 10 ميكرومتر (B) نفس A ولكن يتبعها بعد ذلك مع حقن التيار الإيجابي لمدة 10 s. (C) نفس B ولكن بعد ذلك مطلية بالذهب لمدة 5 s. (D)نفس B ولكن بعد ذلك مطلية بالذهب لمدة 15 ثانية (E)نفس B ولكن بعد ذلك مطلية بالذهب لمدة 30 ثانية (F) نفس B ولكن بعد ذلك مطلية بالذهب لمدة 120 ثانية. وجدنا أن اللدائن الكهربائية لمدة 30 ثانية في تيار -0.05 ميكرونا كان الأمثل للتسجيلات الكهربية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: التسجيلات المزمنة خارج الخلية في التصرف بحرية القشرة الرجعية الماوس مع صفائف ألياف الكربون microelectrode تظهر المستمرة, النشاط العصبي مستقرة. (A) تم تسجيل أحد عشر آثار الجهد بانديباس في وقت واحد. يتم رسم الآثار اللاحقة المسجلة من القناة الأولى (الصف العلوي) في B لإظهار المتانة عبر الزمن. الصفوف العشرة المتبقية إظهار تناسق جودة التسجيل وإظهار نشاط قوي عبر الصفيف. يمثل شريط المقياس إلى يسار كل تتبع إمكانية 200 ميكروفولت. (ب) بيانات من نفس الألياف كما هو الحال في أعلى أثر في A، وسعت لإظهار نشاط قوي عبر تسجيل مستمر لمدة 120 يوما. (ج)يكشف التجميع عن اكتشاف قوي لوحدة واحدة على مدى أشهر. تمثل الآثار متوسط الشكل الموجي لوحدة تمثيلية واحدة يمكن ملاحظتها باستمرار عبر 120 يوما ، يتم استخراجها من الألياف المرسومة في B في كل نقطة زمنية. (D) متوسط، غير تطبيع ارتفاع الطول الموجي من C مكدسة لإظهار الاتساق مع مرور الوقت. (ه)تسجيلات ألياف الكربون تثبت أرضية ضوضاء مستقرة على مدى عدة أشهر. الانحراف المعياري للضوضاء الكلمة (تتبع ناقص النشاط spiking) في باء يظهر أي تغيير تدريجي في الضوضاء. تمثل القضبان التلوث المتوسط. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. (F) رسم مقياس الماوس مع CFEA مزروع بشكل مزمن و headstage. (G) تتبع الجهد الخام (أعلى) 11 أشهر بعد زرع يظهر LFP قوية. يظهر تتبع الجهد الممر (السفلي) نشاطا عصبيا ثابتا. (H) متوسط الطول الموجي للخلايا العصبية المسجلة على الألياف من C، تحتها أول 1000 حالات نشاط التصاعد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: ألياف الكربون microelectrode صفيف (CFEA) تسجيلات من القشرة البصرية الأولية النمس. (أ) أشكال الموجات من ارتفاع فرز وحدات واحدة مسجلة من CFEA 16 قناة. كانت إمكانات العمل من الخلايا العصبية الفردية واضحة في كثير من الأحيان على قنوات متعددة باتساعات مختلفة قليلا. (ب) اتجاه ضبط منحنيات من الخلايا العصبية المختارة. تتوافق الألوان مع الوحدات المسجلة في A. تشير الأسهم إلى اتجاه حركة التحفيز. تشير أشرطة المقياس إلى معدل الاستجابة. تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط الاستجابة مع الخطأ القياسي. يمثل الخط الأفقي المتقطع معدل إطلاق الخلية التلقائي أثناء التعرض لشاشة فارغة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يصف هذا البروتوكول كل خطوة ضرورية لبناء CFEA وظيفية للاستخدام الحاد والمزمن على حد سواء. العملية الموصوفة قابلة للتخصيص لاحتياجات الباحث ، مما يجعلها خيارا متاحا وغير مكلف لمراقبة الخلايا العصبية الفردية على مدار أشهر. يوضح البروتوكول جدوى تسجيل كل من النشاط القوي لوحدة واحدة في غضون دقائق من الزرع في مخدر ، وعلى مدى أربعة أشهر في مستيقظ يتصرف ، مما يوضح إمكانات هذه CFEAs لدراسة التغيرات قصيرة الأجل وطويلة الأجل في الاستجابات العصبية.
وقد تم اختبار خطوات البروتوكول الموصوفة بدقة وتحسينها بمرور الوقت للتوصل إلى إجراء فعال يمكن إكماله بسرعة، بتكلفة هامشية منخفضة (< 100.00 دولار)، مع القدرة على تسجيل وحدات فردية لا لبس فيها، بكثافة وثبات على مدى أشهر. يمكن الانتهاء من خطوات البناء في أقل من يوم واحد، وسوف تنتج إشارات كهربية التي هي مماثلة لأي مجموعة تجارية رائدة. وCFEAs أيضا بصمة أصغر بكثير (حزمة من 16 قناة من الألياف وقطرها ~ 26 ميكرومتر) من صفائف تجارية مماثلة، وعدم توافقها البيولوجي يجعلها مناسبة للاستخدام على المدى الطويل13. الأهم من ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة والتعليمات التي يجب اتباعها من أجل إنتاج CFEA يعمل مع أداء مماثل.
نظرا لهشاشة ألياف الكربون ، يجب التعامل معها بأقصى قدر من العناية. التعامل معها مع ملقط حاد أو غيرها من الأدوات قد يؤدي إلى كسر الألياف. بالإضافة إلى ذلك، من المهم بناء CFEAs في الفضاء مع حركة الهواء محدودة بحيث الألياف لا تهب بعيدا. عندما المشتعلة الجزء الخلفي من الألياف، وأخف وزنا يحتاج فقط إلى أن تتحرك في حركة ذهابا وإيابا لفترة وجيزة جدا، لحوالي 1 ق. الخطوات التالية لإزالة العزل هذه حاسمة لبناء قطب كهربائي مع قنوات العمل. وينبغي تغذية نصائح ملتهبة في الرقصة دون أي اتصال إضافي. ثم، عند ملء الحوض مع أسمنت الأسنان، من المهم أن يتم تطبيق الاسمنت بعناية ويملأ تماما القنوات وحوض القمع، وإغلاق الفتحات دون ملء لهم. ثم ينبغي الشفاء تماما من الاسمنت الأسنان مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية قبل المتابعة. وبمجرد الانتهاء من ذلك، ينبغي حقن الطلاء الفضي في كل قناة حتى تملأ تماما ولكن لا تتسرب. هذه هي الخطوة الأكثر متغير في العملية. يمكن لأي تعبئة زائدة أن تنتج التحدث المتبادل بين القنوات، ويمكن أن يؤدي عدم كفاية التعبئة إلى فشل الاتصال. إذا لم تتمكن من حقن الطلاء الفضي باستخدام إبرة 25 G ، فمن المرجح أن الحل لزج للغاية ، وفي هذه الحالة ، يمكن إضافة كمية صغيرة من أرق الطلاء لإنشاء محلول أكثر مرونة. بمجرد تعبئة جميع القنوات ، وإدخال موصل headstage ، من المهم السماح للصفيف بالعلاج لمدة 24 ساعة قبل تأمين الموصل باستخدام أسمنت الأسنان. وجدنا أن الفشل في القيام بذلك خفض عدد القنوات المتصلة. تطبيق كمية سخية من الاسمنت الأسنان مهم أيضا بحيث موصل لا قطع عند التواصل مع نظام الحصول على إشارة. إذا أصبحت منفصلة، فمن الممكن محاولة إعادة الاتصال مع ملء المتكررة من القنوات مع الطلاء الفضي، ولكن يجب على المستخدم اختبار قيم المعاوقة من CFEA لتقييم عدد من القنوات المتصلة. السماح للأسمنت الأسنان لعلاج بين عشية وضحاها كما يعمل على منع مفرزة المحتملة.
إن قياس مقاومة القطب الكهربائي سيوفر تقديرا دقيقا للقنوات المتصلة. ويمكن القيام بذلك بعد غمر الأرض والأسلاك المرجعية ونصائح ألياف الكربون في برنامج تلفزيوني. لقد لاحظنا أن المعاوقة العالية (>15 MΩ) تدل على قناة مفتوحة وغير متصلة. قبل حقن التيار والكهرباء، يمكن أن يكون للقناة المتصلة مجموعة من قيم المعاوقة التي يجب أن تنخفض بشكل كبير مع هذه العملية. وبلغ متوسط عدد القنوات المتصلة (المعاوقة < 4 MΩ بعد الحقن الحالي) لكل قطب كهربائي من 16 قناة 12.96 ± 2.74 (متوسط ± SD؛ N = 48 أقطاب كهربائية). تم اختبار عدد من مرات الطلاء الكهربائي، وأنتجت 30 ق عزل إشارة متفوقة بين مواقع التسجيل (الشكل 5). في حين أنه ثبت جيدا أن PEDOT-pTS12و24و25و PEDOT-TFB21 توفر خيارات موثوقة لإعداد مواقع تسجيل ألياف الكربون ، وجدنا أن الطلاء بالذهب ، وهو طريقة مثبتة ويمكن الاعتماد عليها لأقطاب الطلاء الكهربائي للزرع المزمن27،28 ، وزيادة سهولة زرع ومنع نصائح القطب من تتجمع معا. في إنتاج قيم المعاوقة النهائية أقل من 0.2 MΩ في المتوسط ، تثبت هذه الطريقة أنها مماثلة للقيم التي تحققت باستخدام PEDOT-TFB21 و PEDOT-pTS26.
عند زرع صفيف microelectrode ، من المهم متابعة إدراج نصائح ألياف الكربون تحت المجهر بصريا. يجب أن يكون الإدراج الناجح واضحا ، مع عدم وجود ثني للألياف. إذا كانت الألياف ويبدو أن التواء، فمن غير المرجح أنها سوف تدخل بنجاح في الدماغ. في هذه الحالة، يجب تعديل زاوية المسبار لمحاولة ثانية. يمكن أن تستمر هذه العملية حتى يتم إدراج المسبار بنجاح. بمجرد أن يكون القطب في العمق المطلوب ، وجدنا أن الانتظار لمدة 30 دقيقة على الأقل سيسمح للمسبار بالاستقرار بالحصول على الإشارة المثلى (التسجيلات الحادة).
وتوفر العقود مقابل الفروقات الموصوفة، بالإضافة إلى صغر حجمها وتناواها البيولوجي، بديلا قويا وقابلا للتخصيص للصفائف التجارية نظرا لسهولة بنائها وانخفاض تكلفتها. أكبر تقييد ل CFEAs مفصلة في هذا البروتوكول هو قابليتها للتحجيم. نظرا للطبيعة اليدوية لبنائها ، قد لا يكون التوسع في التصاميم مع مئات مواقع التسجيل عملية. بالإضافة إلى ذلك، فإن التقدم في تصنيع صفيف microelectrode باستخدام تكنولوجيا النانو سيمكن التسجيلات السكانية على نطاق أوسع من الأساليب الموصوفة هنا. ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول يوفر إمكانية الوصول إلى CFEA للمختبرات المهتمة بالتصنيع على مقاعد البدلاء لأقطاب ألياف الكربون. لم نلاحظ أي فقدان للاستقرار أو انخفاض في قوة السعة الارتفاع على مدى فترة التجارب المزمنة لمدة 120 يوما، كما هو مبين من قبل قناة واحدة ممثل نموذجية من ملاحظاتنا على ذلك النطاق الزمني(الشكل 6A-ه). بالإضافة إلى ذلك، تظهر CFEAs القدرة على نشاط وحدة واحدة مستمرة، كما ظلت أربع وحدات واحدة ملحوظة بعد 11 شهرا من زرع في الماوس (الشكل 6G،H). ومن الممكن أيضا الحصول على مستقرة، تسجيلات وحدة واحدة بشكل حاد(الشكل 7)،والذي يقدم ميزة على العديد من الأقطاب التجارية الأخرى لدراسة الخلايا العصبية واحدة على مدى فترات زمنية قصيرة. وفي المستقبل، سيمكن تطوير هذه المسابير المرنة والمتوافقة بيولوجيا ذات الأقطار الدنيا من دراسة العمليات المعقدة. ستوفر هذه الأدوات فائدة كبيرة في تقدم التكنولوجيا العصبية ، بما في ذلك التطبيقات في واجهات الدماغ والآلة (BMIs) ، والتي تتطلب استقرار مستمر وطويل الأجل29.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن أي تضارب مالي في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر غريغ Guitchounts للتوجيه مع تصميم القطب والبناء وتيم غاردنر لفتح مختبره والمرافق لنا. نود أن نشكر كريستوس ميشاس على مساعدته في استخدام PDS في منشأة Bio-Interface و Technology الأساسية ونيل ريتر وجون سبيرياس وديفيد لاندسمان لمساعدتهم في تصميم الإصدارات المبكرة من الرقصة ذات ال 16 قناة. نود أن نشكر تيم كافانو على مساعدته في تصوير SEM في مركز أنظمة النانو في جامعة هارفارد في جامعة هارفارد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #10 scalpel blade | Fisher Scientific | 14-840-15 | Building tool |
| 16-channel CFEA Jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 16-channel Omnetics connector | Omnetics | A79014-001 | CFMA component |
| 25 G needle | Fisher Scientific | 14-840-84 | Building tool - sharp-tipped |
| 30 G needle | Fisher Scientific | 14-841-03 | Building tool |
| 31 G stainless steel 304 hypodermic round tubing | Small Parts Inc | B000FMYN38 | For guide tube |
| 32-channel CFEA jig | Realize Inc. | CFMA component | |
| 32-channel Omnetics connector | Omnetics | A79022-001 | CFMA component |
| 6 in cotton tip applicators | Fisher Scientific | 22-363-156 | Building tool |
| Acetone | Fisher Scientific | A16P4 | Building tool |
| AutoCad 3D printing software | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | Computer-aided design tool/ 3D modeling software | |
| BD disposable syringes | Fisher Scientific | 14-823-30 | 1 mL |
| Carbon fibers | Good Fellow USA | C 005725 | 7 μm epoxy sized |
| Cassettes and cassette holder | For coating fibers | ||
| Clear tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Deionized water | Electroplating component | ||
| Double-sided tape | Scotch | For coating raw fibers | |
| Flowable Dental Composite | Pentron | Flow-It ALC | CFMA component/ UV cured dental cement |
| Gold plating solution | Sifco ASC | 5355 | 10.0-20.0% glycerol, 1.0-5.0% ethylenediamine, 1.0-5.0% acetic acid (ethylenedinitrilo)tetra-, dipotassium salt, 5.0-10.0% butanoic acid, mercapto-monogold(1+) sodium salt, 1.0–5.0% potassium metabisulfite, 55.0-82.0% water |
| Jewelry clamp | Amazon | B00GRABH9K | Building tool |
| JRClust | Ferret spike sorting software | ||
| Lighter | BIC | LCP62DC | Building tool |
| Micromanipulator | Scientifica | PS-7000C | For guide tube |
| Microscissors | Fisher Scientific | 08-953-1B | Building tool |
| MountainSort | Mouse spike sorting software | ||
| NanoZ 16-channel adapter | Multi-channel systems | ADPT-nanoZ-NN-16 | Electroplating component |
| NanoZ 32-channel adapter | White Matter | NZA-OMN-32 rev A | Electroplating component |
| NanoZ multi-electrode impedance tester | White Matter | Electroplating component | |
| Parafilm | Fisher Stockroom | 13-374-10 | Semi-transparent, flexible film with adhesive properties |
| Parylene 'C' Dimer | Specialty Coating Systems | 980130-C-01LBE | For coating raw fibers |
| PEG 8000 | Fisher Scientific | 25322-68-3 | Electroplating component |
| Phosphate-buffered saline | Electroplating component | ||
| Polyimide tubing | MicroLumen | BRAUNI001 | For guide tube |
| Rotary tool | Dremel | 300124 | For guide tube |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | Building tool |
| Silver conductive coating | MG Chemicals | 842AR Super Shield | CFMA component |
| Stereo microscope with range 6.7:1 | Motic | SMZ-168 | Building tool |
| Sticky notes | Post-it | Building tool | |
| Tissue wipes | Kimtech Science | 34155 | Building tool |
| Tungsten wire | A-M Systems | 797550 | CFMA component |
| UV curing wand | Woodpecker | Building tool | |
| Vacuum deposition chamber | Specialty Coating Systems | Labcoter 2 (PDS 2010) |
References
- Galvani, L. De viribus electricitatis in motu musculari commentarius. , Academy of Sciences. Bologna. (1791).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature reviews. Neuroscience. 13 (6), 407-420 (2012).
- Ledochowitsch, P., et al. On the correspondence of electrical and optical physiology in in vivo population-scale two-photon calcium imaging. bioRxiv. , 800102 (2019).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Seymour, J. P., Wu, F., Wise, K. D., Yoon, E. State-of-the-art MEMS and microsystem tools for brain research. Microsystems and Nanoengineering. 3 (1), 16066 (2017).
- Kerr, J. N., Denk, W.
- Hong, G., Lieber, C. M. Novel electrode technologies for neural recordings. Nature reviews. Neuroscience. 20 (6), 330-345 (2019).
- Chung, J. E., et al. High-density, long-lasting, and multi-region electrophysiological recordings using polymer electrode arrays. Neuron. 101 (1), 21-31 (2019).
- Jun, J. J., et al. Fully integrated silicon probes for high-density recording of neural activity. Nature. 551 (7679), 232-236 (2017).
- Kozai, T. D., Jaquins-Gerstl, A. S., Vazquez, A. L., Michael, A. C., Cui, X. T. Brain tissue responses to neural implants impact signal sensitivity and intervention strategies. ACS Chemical Neuroscience. 6 (1), 48-67 (2015).
- Polikov, V. S., Tresco, P. A., Reichert, W. M. Response of brain tissue to chronically implanted neural electrodes. Journal of Neuroscience Methods. 148 (1), 1-18 (2005).
- Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
- Chen, R., Canales, A., Anikeeva, P. Neural recording and modulation technologies. Nature Reviews Materials. 2 (2), 16093 (2017).
- Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
- Subbaroyan, J., Martin, D. C., Kipke, D. R. A finite-element model of the mechanical effects of implantable microelectrodes in the cerebral cortex. Journal of Neural Engineering. 2 (4), 103-113 (2005).
- Park, S., et al. One-step optogenetics with multifunctional flexible polymer fibers. Nature Neuroscience. 20 (4), 612-619 (2017).
- Guo, Y., et al. Polymer composite with carbon nanofibers aligned during thermal drawing as a microelectrode for chronic neural interfaces. ACS Nano. 11 (7), 6574-6585 (2017).
- Armstrong-James, M., Millar, J.
- Garris, P. A., Ciolkowski, E. L., Pastore, P., Wightman, R. M. Efflux of dopamine from the synaptic cleft in the nucleus accumbens of the rat brain. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 14 (10), 6084-6093 (1994).
- Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
- Guitchounts, G., Cox, D. 64-channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
- Ma, Z., Turrigiano, G. G., Wessel, R., Hengen, K. B. Cortical circuit dynamics are homeostatically tuned to criticality in vivo. Neuron. 104 (4), 655-664 (2019).
- Popovic, M., et al. Development of cross-orientation suppression and size tuning and the role of experience. Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society of Neuroscience. 38 (11), 2656-2670 (2018).
- Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
- Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
- Patel, P. R., et al. Insertion of linear 8.4 µm diameter 16 channel carbon fiber electrode arrays for single unit recordings. Journal of Neural Engineering. 12 (4), 046009 (2015).
- Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives. Sensors and Actuators. A, Physical. 156 (2), 388-393 (2009).
- Vafaiee, M., Vossoughi, M., Mohammadpour, R., Sasanpour, P. Gold-plated electrode with high scratch strength for electrophysiological recordings. Scientific Reports. 9 (1), 2985 (2019).
- Lebedev, M. A., Nicolelis, M. A. Brain-machine interfaces: From basic science to neuroprostheses and neurorehabilitation. Physiological Reviews. 97 (2), 767-837 (2017).
