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Immunology and Infection

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Der Nachweis von Wirt-Bakterien-Pathogen-Interaktionen basierend auf phänotypischer Adhärenz mittels Hochdurchsatz-Fluoreszenzmarkierungsbildgebung zusammen mit automatisierten statistischen Analysemethoden ermöglicht eine schnelle Bewertung potenzieller bakterieller Interaktionen mit Wirtszellen.

Abstract

Die Identifizierung neu auftretender bakterieller Krankheitserreger ist für die menschliche Gesundheit und Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Die bakterielle Adhärenz an wirtszellen ist ein wesentlicher Schritt bei bakteriellen Infektionen und stellt ein Kennzeichen potenzieller Bedrohung dar. Daher kann die Untersuchung der Adhärenz von Bakterien an Wirtszellen als Bestandteil der bakteriellen Bedrohungsbewertung verwendet werden. Eine Standardmethode zur Aufzählung der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen besteht darin, Bakterien mit Wirtszellen zu inkubieren, die adhärenten Bakterien zu ernten, die geernteten Zellen auf festen Medien zu plattieren und dann die resultierenden koloniebildenden Einheiten (CFU) zu zählen. Alternativ kann die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen mit Immunfluoreszenzmikroskopie-basierten Ansätzen bewertet werden. Herkömmliche Strategien zur Umsetzung dieser Ansätze sind jedoch zeitaufwendig und ineffizient. Hier wird ein kürzlich entwickeltes automatisiertes fluoreszenzmikroskopiebasiertes Bildgebungsverfahren beschrieben. In Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse ermöglicht die Methode eine schnelle Quantifizierung von Bakterien, die an Wirtszellen haften. Zwei Bakterienarten, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa und Gram-positive Listeria monocytogenes und entsprechende Negativkontrollen, wurden getestet, um das Protokoll zu demonstrieren. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Ansatz adhärente Bakterien schnell und genau aufzählt und experimentelle Arbeitsbelastungen und Zeitpläne signifikant reduziert.

Introduction

Bakterielle Adhäsion ist ein Prozess, bei dem sich Bakterien an andere Zellen oder Oberflächen anlagern. Die erfolgreiche Etablierung einer Infektion durch bakterielle Krankheitserreger erfordert die Adhäsion an Wirtszellen, die Besiedlung von Geweben und in einigen Fällen die Invasion von Wirtszellen1,2,3. Neu auftretende Infektionskrankheiten stellen eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar, wie die jüngste COVID-19-Pandemie4,5,6 zeigt. Wichtig ist, dass neue oder aufkommende Krankheitserreger mit genombasierten Ansätzen möglicherweise nicht ohne weiteres erkannt werden können, insbesondere in Fällen, in denen der Erreger so konstruiert wurde, dass er sich dem Nachweis entzieht oder keine genomischen Signaturen enthält, die ihn als pathogen identifizieren. Daher kann die Identifizierung potenzieller Krankheitserreger mit Methoden, die Kennzeichen der Pathogenität, wie die bakterielle Adhärenz an Wirtszellen, direkt bewerten, eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Krankheitserregern spielen.

Bakterielle Adhärenz an Wirtszellen wird seit Jahrzehnten verwendet, um Mechanismen der bakteriellen Pathogenese zu bewerten1,7. Die mikroskopische Bildgebung8,9 und die Aufzählung der bakteriellen koloniebildenden Einheit (KBE)10 , 11,12,13 durch Post-Infektionsplattierung sind zwei gut entwickelte Labormethoden zur Prüfung der mikrobiellen Adhärenz und/oder Infektion von Wirtszellen14. In Anbetracht der Mikrometerskala von Bakterienzellen erfordert die Zählung der adhärenten Bakterienzellen im Allgemeinen den Einsatz fortschrittlicher Mikroskopietechniken mit hoher Vergrößerung sowie hochauflösender Bildgebungsansätze, einschließlich Elektronenmikroskopie, Expansionsmikroskopie (ExM)15,16und dreidimensionale Bildgebung17 . Alternativ kann die Zählung von Bakterien, die an Wirtszellen gebunden oder internalisiert sind, durchgeführt werden, indem die Verdünnungsreihe der geernteten Bakterien auf festes Agar plattiert und die resultierenden CFUs10,12,13gezählt werden. Diese Methode ist mühsam und umfasst viele manuelle Schritte, was Schwierigkeiten bei der Etablierung eines standardisierten oder automatisierten Verfahrens mit sich bringt, das für Hochdurchsatzanalysen erforderlich ist18,19. Daher würde die Entwicklung neuer Methoden zur Bewertung der Wirtszellbindung die derzeitigen Einschränkungen in diesem Bereich angehen.

Eine solche Methode wird hier beschrieben, die automatisierte Hochdurchsatzmikroskopie in Kombination mit Hochdurchsatz-Bildverarbeitung und statistischer Analyse verwendet. Um den Ansatz zu demonstrieren, wurden Experimente mit mehreren bakteriellen Krankheitserregern durchgeführt, darunter Pseudomonas aeruginosa, ein opportunistischer gramnegativer bakterieller Erreger von Menschen, Tieren und Pflanzen14,20, der häufig die Atemwege von Patienten mit beeinträchtigten Wirtsabwehrfunktionen besiedelt. Dieser Ansatz optimierte den in früheren Studien14,20beschriebenen mikroskopischen Bildgebungsprozess. Der bildgebende Nachweis wurde durch fluoreszenzmarkierte Wirtszellen und Bakterien vereinfacht, um die Nähe von ihnen schnell zu verfolgen, was den Mikroskopieaufwand drastisch reduzierte, um hochauflösende Bilder zur Unterscheidung von Bakterien zu erhalten. Darüber hinaus ersetzte die automatisierte statistische Analyse von Bildern in zählenden Wirtszellen und Bakterien das praktische Experiment der bakteriellen CFU-Beschichtung, um das Verhältnis der adhärenten Bakterienzahlen pro Wirtszelle abzuschätzen. Um die Kompatibilität dieser Methode zu bestätigen, wurden auch mehrere Bakterienstämme und Wirtszelltypen wie Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Klebsiella pneumoniae sowie menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) getestet, und die Ergebnisse unterstützen die Vielfalt und Wirksamkeit der Methode.

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Protocol

1. A549 Zellkultur

  1. Halten Sie die A549-Zelllinie in F-12K-Medium, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), und inkubieren Sie bei 37 °C, 5%CO2.
  2. Wechseln Sie das Medium alle 3-4 Tage und passieren Sie es mit 85% -95% Konfluenz.
  3. Spülen Sie die Zellen kurz mit 1 x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4, sofern nicht anders angegeben) und behandeln Sie sie mit 1 ml 0,25% 0,53 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Lösung (Untertauchen der Zellschicht) für etwa 2 min bei 37 °C.
  4. Fügen Sie zusätzliche 6 ml komplettes Wachstumsmedium (F-12K-Medium + 10% FBS) hinzu, um die Proteaseaktivität zu stoppen. Anschließend werden die Zellen in einem sterilen Polystyrol-T-75-Gewebekulturkolben mit einem Subkultivationsverhältnis von 1:3-1:8 plattiert. Das endgültige Kulturvolumen beträgt 12 ml.
  5. Säen Sie etwa 1 x 104 A549-Zellen (Zellkonzentration: ~ 1 x 105 Zellen / ml) auf jede Vertiefung einer 96-Well-Platte einen Tag vor den Adhärenztests.

2. Bakterienwachstum und Färbung

  1. Führen Sie alle bakteriellen Arbeiten in einer Biosicherheitswerkbank, Biosafety Level 2 Labor, durch.
  2. Impfen Sie alle Bakterienkulturen, einschließlich P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes und B. subtilis usw., aus dem gefrorenen Glycerinbestand und züchten Sie sie in Trypto-Sojabrühe (TSB, 3 ml) in einem Schüttelbrutschrank bei 37 ° C über Nacht bei 250 U / min.
  3. Verwenden Sie am nächsten Tag eine 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur, um eine Subkultur zu impfen und sie in TSB (1 ml) für 3 h bis zur exponentiellen Phase zu züchten, messen Sie den OD bei 600 nm (OD600),um dies zu bestätigen. Stellen Sie sicher, dass sich der OD600 im Bereich von 0,4-0,6befindet.
  4. Vor der Durchführung des Bakterien-Wirt-Adhärenz-Assays platten sie serielle Verdünnungen der Bakteriensuspension auf TSB-Agarplatten, inkubieren sie über Nacht bei 37 °C und stellen dann die bakteriellen CFUs aus der Anzahl der Kolonien her. Für P. aeruginosaentspricht ein OD600 von 1,0 2 x 108 lebensfähigen Bakterienzellen/ml, und für L. monocytogenesentspricht ein OD600 von 1,0 9 x 108 lebensfähigen Bakterienzellen/ml.
  5. Ernten Sie die Bakterienkulturen in exponentieller Phase durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur (RT) und waschen Sie sie dann einmal mit 1x PBS (1 ml). Resuspendieren Sie die Bakterienpellets in 1 mL 1x PBS und bestimmen Sie die Konzentrationen durch Messung von OD600 von Bakteriensuspensionen. Zum Beispiel stellt P. aeruginosa mit OD600 von 0,5 eine Konzentration von 1 x 108 Bakterienzellen/ ml dar.
  6. Färben Sie die Bakteriensuspension entweder mit einem grünen oder einem roten Fluoreszenzfarbstoff bei RT für 30 minuten mit sanfter Rotation im Dunkeln. Dazu 2 μL des 500-fachen konzentrierten Brühfärfarbstoffs in 1 ml Bakteriensuspension geben, um den Farbstoff 1-fach zu verdünnen. Um den Färbefarbstoff abzuwaschen, zentrifugieren Sie die gefärbten Bakterien bei 13.000 x g für 2 min und resuspenieren Sie das Pellet dreimal in 1 ml 1x PBS.
    HINWEIS: Wenn fluoreszenz- (GFP-, RFP-, mCherry-, etc.) markierte Bakterien im Experiment verwendet werden, überspringen Sie diesen bakteriellen Färbeschritt. GFP-markierte P. aeruginosa und rot fluoreszierende Farbstoff-gefärbte L. monocytogenes wurden in diesem Protokoll verwendet.
  7. Sammeln Sie die gefärbten Bakterienzellen oder GFP-markierten Bakterien durch Zentrifugation bei 13.000 x g für 2 min. Resuspend in frischem F-12K Medium (1 ml) und messen Sie die OD600 jeder Kultur. Anschließend verdünnen Sie die Kulturen auf die gewünschten Konzentrationen basierend auf der Vielzahl der Infektionen (MOI) und der Wirtszellkonzentration. Das in diesem Experiment verwendete Endvolumen beträgt 500 μL.
    HINWEIS: Wenn beispielsweise die wirtszellkonzentration, die mit der Trypan Blue-Färbung gezählt wird, 1 x10 5 Zellen / ml beträgt, beträgt die gewünschte Konzentration von Bakterienzellen bei einem MOI von 100 1 x10 7 Zellen / ml. Die Konzentration von P. aeruginosa bei 0,5 OD600 beträgt 1 x 108/ml. Um die gewünschte Konzentration zu erhalten, verdünnen Sie die P. aeruginosa-Kultur 10-fach, fügen Sie 50 μL resuspendierte Kultur zu 450 μL frischem F-12K-Medium hinzu.

3. Bakterielle Adhärenz und Wirtszellfärbung

  1. Waschen Sie zuerst die ausgesäten A549-Zellmonoschichten dreimal mit warmen 1x PBS. Für jede Wäsche 100 μL 1x PBS in jede Vertiefung geben, dreimal vorsichtig auf und ab pipettieren, 1x PBS entsorgen oder nach Zugabe 10 s warten und dann saugen, um 1x PBS zu entfernen. Um die Kinetik der Bakterienassoziation zu bestimmen, überlagern Sie die Zellen mit 100 μL der gewünschten Konzentrationen der Bakteriensuspension mit verschiedenen MOIs (0, 1, 10 und 100). Drehen Sie die Bakterien bei 200 x g für 10 min herunter und inkubieren Sie die infizierten A549-Zellen bei 37 °C, 5%CO2 für weitere 1 h.
    HINWEIS: In diesem Experiment hatte jede Bedingung ein technisches Dreifaches.
  2. Entfernen Sie die ungebundenen Bakterien, indem Sie die Monoschichten fünfmal mit warmen 1x PBS wie oben beschrieben waschen. Fügen Sie 100 μL 4% Formaldehyd (in 1x PBS) in jede Vertiefung der 96-Well-Platten hinzu, um die Zellen zu fixieren. Lassen Sie die Platten 15 min auf Eis liegen und waschen Sie dann die Fixierlösung dreimal mit 1x PBS ab.
  3. Um die Kerne zu färben, fügen Sie 50 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) hinzu und inkubieren Sie sie für 10 min bei RT. Nach der Inkubation waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit 1x PBS. Bedecken Sie die infizierten A549-Zellen mit 100 μL 1x PBS, um ein Austrocknen zu vermeiden. Für den nächsten Schritt verfahren oder die Platte bei 4 °C bis zu 2 Tage im Dunkeln lagern.

4. Automatisierte Fluoreszenzbildgebung, -verarbeitung und -analyse

  1. Um die Datenintegrität zu erhalten, wählen Sie nach dem Zufallsprinzip und manuell fünf Positionen jeder Vertiefung aus, um die Bilder mit 20-facher Vergrößerung aufzunehmen. Erfassen Sie die fluoreszierenden Bilder von A549-Zellen und Bakterien unter DAPI- bzw. GFP-Kanälen. Verwenden Sie den PE-Cy5-Kanal für die Bakterien, die durch den roten Fluoreszenzfarbstoff gefärbt sind.
  2. Um eine bessere Auflösung zu erzielen, verarbeiten Sie alle Bilder für die Hintergrundverflachung und Dekonvolution. Stellen Sie die Parameter auf 68 μm Durchmesser der Walzkugel für die Glättung ein und messen Sie automatisch die Punktspreizungsfunktion (PSF) der Bilddekonvolution basierend auf dem Objektiv.
  3. Um alle qualifizierten Zellen und Bakterien zu zählen, messen Sie die Fluoreszenzintensität der Wirtszellen und Bakterien und legen Sie die schwächste Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien als Schwellenwerte für die Zellzahl fest. Zählen Sie alle Bakterien in der Nähe einer Wirtszelle innerhalb von 15 μm Entfernung als die adhärenten Bakterien, da der Durchmesser der A549-Zelle 10,59-14,93 μm21 beträgt.
    HINWEIS: Eine Standardeinstellung im Bildgebungssystem zählt selektiv die Wirtszellen mit Durchmessern von 5-100 μm und Bakterien mit einer Größe von 0,2-5 μm (Breite und Länge).
  4. Basierend auf den oben genannten manuellen Bildverarbeitungsergebnissen wenden Sie die Parameter Bildglättung, Dekonvolution, Objektgrößen, Abstand und Fluoreszenzintensitäten auf den Rest der automatisierten Bilder an. Berücksichtigen Sie nach der automatisierten Analyse kritische Messwerte wie die Gesamtzahl der Wirtszellen, die Zellgrößen und -formen, die Gesamtkeimzahl und die durchschnittliche Keimzahl pro Wirtszelle, die der wichtigste Indikator war, um die Bakterienadhärenz zu bestimmen.
  5. Datenexport und statistische Auswertung
    1. Exportieren Sie die analysierten Ergebnisse aus allen Bildern in eine Tabelle (z. B. 'xlsx'-Format). Das automatisierte System generiert zwei Sätze von Ergebnissen: 1) die durchschnittliche Anzahl der adhärenten Bakterien aus jedem Bild; 2) die informativen Daten jeder einzelnen Wirtszelle, wie die adhärente Bakterienzahl auf einer einzelnen Zelle, die Wirtsgröße und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von Wirtszellen und Bakterien, aus dem entsprechenden Bild.
    2. Berechnen Sie die mittlere Anzahl und Standardabweichung der adhärenten Bakterienzahlen aus allen Bildern, um den bakteriellen Adhärenzgrad im Vergleich zu Negativkontrollen darzustellen. Bei dieser Methode dienten E. coli und B. subtilis als Negativkontrollen beim Testen der gramnegativen bzw. grampositiven bakteriellen Adhärenz. Führen Sie Zwei-Wege-ANOVAs durch, um für drei unabhängige Experimente auf signifikante Unterschiede zwischen Datenpunkten in der gesamten Behandlung zu testen.

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Representative Results

Zur Entwicklung des fluoreszenzbildgebenden bakteriellen Adhärenztests wurden P. aeruginosa Stamm PAO1 und sein Negativadhärenz-Gegenstück E. coli verwendet, um die Wirksamkeit des Protokolls zu testen, da die Adhärenz dieser Bakterien an A549-Zellen berichtet worden war14,20,22. Zuerst wurden GFP-markierte P. aeruginosa (PAO1) und GFP-markierte E. coli mit einer humanen immortalisierten Epithelzelllinie A549 an verschiedenen MOIs ko-inkubiert. Die Ergebnisse zeigten, dass PAO1 dosisabhängig an A549-Zellen haftete (Abbildung 1A,B); in der Zwischenzeit wurde auch die nahezu Nulladhärenz von E. coli nachgewiesen (Abbildung 1A,B). An jedem MOI wurden 50 Bilder aufgenommen und analysiert. Zwei-Wege-ANOVAs wurden durchgeführt, um die signifikanten Variationen von drei unabhängigen Experimenten zu testen.

Figure 1
Abbildung 1: Gramnegative Bakterien P. aeruginosa hafteten innerhalb von 1 h nach der Co-Inkubation an A549-Zellen. (A) Mikroskopische Aufnahmen für einen Überblick über die bakterielle Adhärenz, bei denen die Bilder mit 20-facher Vergrößerung aufgenommen wurden. PAO1 und die Negativadhärenzkontrolle E. coli hafteten bei der angegebenen Vielzahl von Infektionen (MOIs) an A549-Zellen. Bakterien wurden mit GFP-Fluoreszenz markiert. A549-Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (B) Quantifizierung der adhärenten Keimzahlen pro A549-Zelle. Für jeden getesteten Bakterienstamm (PAO1 und E. coli)in jedem MOI wurden bei jeder Erkrankung insgesamt 50 Bilder auf die Analyse angewendet. Die Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) von einem Vertreter von drei unabhängigen Experimenten. Die bidirektionale ANOVA-Statistikanalyse wurde durchgeführt. * S < 0,05, *** S < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ähnliche Ergebnisse wurden auch beobachtet, wenn grampositive Bakterien, L. monocytogens23,24 und seine Negativkontrolle B. subtilis, verwendet wurden ( Abbildung2A,B). Die Adhärenz an A549-Zellen war bei L. monocytogenes signifikant als bei B. subtilis (Abbildung 2A,B).

Figure 2
Abbildung 2: Gram-positive bakterielle L. monocytogenes hafteten innerhalb von 1 h nach der Ko-Inkubation an A549-Zellen. (A) Mikroskopische Aufnahmen für einen Überblick über L. monocytogenes, sowie die Negativkontrolle B. subtilis Adhärenz an A549-Zellen an verschiedenen MOIs. Bakterien wurden mit einem rot fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. A549-Zellkerne wurden mit DAPI gefärbt. Der Maßstabsbalken beträgt 50 μm. (B) Quantifizierung der adhärenten Bakterienzahl pro A549-Zelle. Für jeden getesteten Bakterienstamm (L. monocytogenes und B. subtilis) in jedem MOI wurden insgesamt 50 Bilder für die Analyse bei jeder Erkrankung verwendet. Die Daten sind Mittelwerte ± SD von einem Vertreter von drei unabhängigen Experimenten. Die bidirektionale ANOVA-Statistikanalyse wurde durchgeführt. ** S. < 0,01, *** S. < 0,001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ein repräsentatives Bild der wirtsadhärenten P. aeruginosa Segmentierung und Zählungen ist in Abbildung 3 dargestellt (Gelbe Masken: ausgewählte Bakterien, roter Umriss: einzelne Keimzahl). Die Einstellungen für Wirts- und Bakterienziele werden im Abschnitt Protokoll beschrieben.

Figure 3
Abbildung 3: Beispielbilder der bakteriellen Segmentierung und Zählung im automatisierten Analyseprozess. (A) Mikroskopische Aufnahmen von P. aeruginosa hafteten an A549 bei einem MOI von 100 ohne bakterielle Segmentierung und Zählung. (B) Das gleiche Bild nach der statistischen Analyse der bakteriellen Segmentierung und Zählung. Gelbe Masken: ausgewählte Bakterien, roter Umriss: einzelne Keimzahl. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Ergebnisse der automatisierten Analysen, einschließlich der Wirtszellgrößen und -bereiche, der Bakterien- und Wirtszellzahl sowie der durchschnittlichen Keimzahlen pro Wirtszelle, die den Status der Wirtszellgesundheit, des Bakterienadhärenzniveaus und der bakteriellen Zytotoxizität darstellen, sind in Tabelle 1 und Tabelle 2aufgeführt. Tabelle 1 stellt die adhärenten Bakterienzahlen auf einer durchschnittlichen zellulären Ebene aus verschiedenen Bildern dar, während Tabelle 2 die adhärenten Bakterienzahlen darstellt, die auf einem Bild auf einer einzigen A549-Zellebene analysiert wurden. Diese repräsentativen Bilder wurden von A549-Zellen aufgenommen, die mit PAO1 bei einem MOI von 100 infiziert waren. Die analysierten Ergebnisse des Ausgangsbildes in Abbildung 3 wurden als Bild 1 in Tabelle 1 und Tabelle 2aufgeführt.

Tabelle 1: Statistische Analyseergebnisse von 9 repräsentativen Bildern auf zellulärer Ebene. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

In jedem Bild stellen die Wirtssummenzahl und die Bakteriensummenflecken die Gesamtzahl der Wirtskerne und die Gesamtkeimzahl dar, die vom System basierend auf den oben beschriebenen Parametern erkannt wird. Darüber hinaus stellt die automatisierte Berechnung des Verhältnisses von Bakterienflecken die durchschnittliche Keimzahl pro Wirtszelle dar, abgeleitet aus der Bakteriensummenpunkt/Wirtssumme. Darüber hinaus können auch zusätzliche Messwerte enthalten sein; Zum Beispiel veranschaulichen die Bakterien-adhärente Wirtszählungen das universelle oder spezifische Phänomen der Wirt-Bakterien-Adhärenz. Wenn die Bakterien-adhärenten Wirtszahlen viel geringer sind als die Wirtssummenzählung, ist im Gegensatz dazu die durchschnittliche Keimzahl pro Wirt relativ hoch, was bedeutet, dass ein solcher Adhärenz-Phänotyp eine signifikante Heterogenität aufweist.

Tabelle 2: Einzelne zelluläre statistische Analyse eines repräsentativen Bildes. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Die singuläre Zellanalyse liefert in jedem Bild mehr Details über Wirtszellen und bakterielle Ziele, was nützlicher ist, wenn andere bakterielle Merkmale gesammelt und auf die automatisierte Computeranalyse angewendet werden, um ein leistungsfähigeres Werkzeug zur Bewertung der potenziellen bakteriellen Pathogenität zu entwickeln, wie ein Machine Learning-Modell, das untersucht wird. In diesem Protokoll stellen Wirtsgröße und -fläche die Durchmesser und Flächen jedes gefärbten Wirtskerns dar, und die Wirtsfluoreszenzintensität stellt die durchschnittliche Intensität der gefärbten Kerne dar. Die Anzahl der Bakterienflecken und die Fläche stellen die adhärenten bakteriellen Ziele für jede Wirtszelle und ihre Gesamtflächen dar. Die bakterielle Fluoreszenzintensität stellt die durchschnittliche Intensität aller adhärenten Bakterien dar.

Es ist nicht verwunderlich, dass einige virulente Bakterien nicht an A549 hafteten, während einige Bakterien mit hoher bakterieller Adhärenz nicht unbedingt mit pathogenität korrelieren. Ein anderer Wirtszelltyp, HUVECs, wurde ebenfalls getestet, um die Anwendung dieser Methode zu maximieren. Die Ergebnisse zeigten den effektiven Nachweis und die unterschiedlichen Adhärenzphänotypen von Bakterien (Abbildung 4). Verschiedene Wirtszellen könnten die Abschätzung potenzieller bakterieller Krankheitserreger erhöhen; zum Beispiel hafteten pathogene Serratia rubidaea und Streptococcus agalactiae an HUVEC, aber nicht an A549-Zellen(Abbildung 4). Darüber hinaus war das zytotoxische Enterohemorrhagikum E. coli (EHEC) weder A549 noch HUVEC entsprechend (Abbildung 4). Daher ist es wichtig sicherzustellen, dass die Methode für mehrere Wirtszelltypen geeignet ist, um auf die Spezifität von Wirt-Bakterien-Interaktionen zu reagieren. Sowohl A549- als auch HUVEC-Zellen wurden 1 h lang mit Bakterien bei einem MOI von 100 bei 37 °C ko-inkubiert.

Figure 4
Abbildung 4: Spezifität der bakteriellen Adhärenz an wirten A549- und HUVEC-Zellen. Die Bakterienstämme, einschließlich S. rubidaea, S. agalactiae, zytotoxische Enterohemorrhagische E. coli (EHEC), PAO1,P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP),E. coli, S. aureus und S. aureus ΔsaeR,wurden sowohl an A549- als auch an HUVEC-Zellen bei einem MOI von 100 für 1 h Co-Inkubation bei 37 °C, 5%CO2,getestet. Bakterien wurden mit einem rot fluoreszierenden Farbstoff angefärbt. Adhärente Bakterienzahlen wurden aus 45 Bildern/Bakterienstamm in drei unabhängigen Experimenten quantifiziert. Die Daten sind Mittelwerte ± SD von einem Vertreter von drei unabhängigen Experimenten. * P < 0.05, *** P < 0.001, **** S<0.0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Das Protokoll beschreibt einen automatisierten Ansatz zur Aufzählung der bakteriellen Bindung an Wirtszellen. Der beschriebene Ansatz hat mehrere attraktive Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden. Erstens ermöglicht dieser Ansatz die genaue Quantifizierung der Anzahl der mikrobiellen Pathogenzellen, die an einzelne Wirtszellen gebunden sind. Wichtig ist, dass diese Quantifizierung ohne die Notwendigkeit einer mühsamen Bakterienernte, seriellen Verdünnung, Beschichtung auf festen Medien und Bestimmung der CFUs10,11,12durchgeführt werden kann. Daher reduziert die beschriebene Technik den Gesamtaufwand, der zur Quantifizierung der bakteriellen Adhärenz erforderlich ist. Es sollte anerkannt werden, dass die Vorteile des vorgeschlagenen Ansatzes verstärkt werden, wenn versucht wird, Adhärenz-Phänotypen in groß angelegten Screening-Experimenten nachzuweisen, einschließlich der Identifizierung von Bakterien- oder Wirtsgenen in Mutanten- bzw. CRISPR-Bibliotheken, die diesen Prozess regulieren. Zweitens liefert die direkte Bewertung von Interaktionen zwischen Wirts- und Bakterienzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie Informationen zur Aufklärung von Mechanismen bakterieller Pathogenität, einschließlich Veränderungen im Überleben, der Morphologie oder Dynamik eines Wirts oder einer Bakterienzelle. Schließlich liefert die automatisierte statistische Analyse, die auf den in der Analyse gesammelten Bildern durchgeführt wird, nicht nur eine Gesamtquantifizierung der durchschnittlichen bakteriellen Assoziation mit Wirtszellen, sondern ermöglicht auch die Bewertung dynamischer Einzelzell-Wirt-Pathogen-Interaktionen.

Trotz dieser Vorteile haben die beschriebenen Methoden einige wichtige Einschränkungen. Zunächst ist eine Fluoreszenzfärbung von Bakterien erforderlich, um ihre Adhärenz an wirtszellen aufzuzählen. Daher muss der fluoreszierende Färbefarbstoff Selektiv Bakterien färben als ihre Wirtszell-Gegenstücke. Darüber hinaus darf der Färbefarbstoff den Bindungsphänotyp der Bakterien, die ihn tragen, nicht verändern. Daher muss die Optimierung der bakteriellen Fluoreszenzfärbung (z.B. Konzentration, Färbedauer) im Vorfeld der Durchführung der beschriebenen Adhärenzstudien bestimmt werden. In diesem Protokoll hat die fluoreszierende Färbung von Bakterienstämmen wie P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli und B. subtilis für 30 min keinen Einfluss auf ihre Adhärenz an wirtszellen. Zweitens reicht aufgrund der Spezifität verschiedener Wirt-Bakterium-Interaktionen ein einzelner Wirtszelltyp möglicherweise nicht aus, um die bakterielle Bindung an Wirtszellen zu bewerten. Daher könnten mehrere Wirtszelltypen erforderlich sein, um ein vollständiges Verständnis des Ausmaßes zu erlangen, in dem eine bestimmte Mikrobe an wirtszelloberflächen haften kann. Drittens war die bakterielle Segmentierung nicht vollständig effizient, wenn Bakterien die Aggregation während der Co-Inkubation vorantreiben, z. B. S. aureus,oder wenn Bakterien Klumpen bei einem höheren MOI bildeten (>100), z. B. P. aeruginosa. In diesem Fall sollte eine höhere Vergrößerung angewendet werden, um die Bilder aufzunehmen, oder es sollten mehr Bilder in der Analyse verwendet werden, um den Effekt der Bakterienaggregation zu reduzieren.

Menschliche Lungenepithelzellen (A549) und HUVECs wurden in den Studien verwendet, um die Plastizität des Ansatzes in Bezug auf den Wirtszelltyp zu demonstrieren, und beide zeigten eine hohe Anfälligkeit für bakterielle Adhärenz. Die Verwendung von zwei Wirtszelltypen zeigte auch, dass die beschriebene Methode weit verbreitet angewendet werden kann, um adhärente Wirt-Bakterium-Interaktionen schnell zu charakterisieren.

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Disclosures

Alle Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Kaite Zlotkowski von Biotek Inc. für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Verteidigungsministerium unter der Vertragsnummer W911NF1920013 an PdF, die Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) und das Innenministerium unter der Vertragsnummer 140D6319C0029 an PdF unterstützt. Der Inhalt der Informationen spiegelt nicht unbedingt die Position oder die Politik der Regierung wider, und es sollte keine offizielle Billigung abgeleitet werden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

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Immunologie und Infektion Heft 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

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The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Automatisierter Hochdurchsatz-Nachweis der bakteriellen Adhärenz an Wirtszellen
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Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

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