Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen

Published: September 17, 2021 doi: 10.3791/62764
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

ERRATUM NOTICE

Summary

Detectie van gastheer-bacteriële pathogene interacties op basis van fenotypische therapietrouw met behulp van high-throughput fluorescentie labeling beeldvorming samen met geautomatiseerde statistische analysemethoden maakt een snelle evaluatie van potentiële bacteriële interacties met gastheercellen mogelijk.

Abstract

Identificatie van opkomende bacteriële pathogenen is van cruciaal belang voor de menselijke gezondheid en veiligheid. Bacteriële hechting aan gastheercellen is een essentiële stap in bacteriële infecties en vormt een kenmerk van potentiële bedreiging. Daarom kan het onderzoeken van de hechting van bacteriën aan gastheercellen worden gebruikt als onderdeel van bacteriële dreigingsanalyse. Een standaardmethode voor het opsommen van bacteriële hechting aan gastheercellen is om bacteriën samen met gastheercellen te incuberen, de aanhangende bacteriën te oogsten, de geoogste cellen op vaste media te plaatsen en vervolgens de resulterende kolonievormende eenheden (CFU) te tellen. Als alternatief kan bacteriële hechting aan gastheercellen worden geëvalueerd met behulp van immunofluorescentiemicroscopie-gebaseerde benaderingen. Conventionele strategieën voor het implementeren van deze benaderingen zijn echter tijdrovend en inefficiënt. Hier wordt een recent ontwikkelde geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie-gebaseerde beeldvormingsmethode beschreven. In combinatie met high-throughput beeldverwerking en statistische analyse maakt de methode een snelle kwantificering mogelijk van bacteriën die zich hechten aan gastheercellen. Twee bacteriesoorten, Gram-negatieve Pseudomonas aeruginosa en Gram-positieve Listeria monocytogenes en bijbehorende negatieve controles, werden getest om het protocol aan te tonen. De resultaten tonen aan dat deze aanpak snel en nauwkeurig aanhankelijke bacteriën opsomt en experimentele werklast en tijdlijnen aanzienlijk vermindert.

Introduction

Bacteriële hechting is een proces waarbij bacteriën zich hechten aan andere cellen of oppervlakken. Succesvolle vestiging van infectie door bacteriële pathogenen vereist adhesie aan gastheercellen, kolonisatie van weefsels en in sommige gevallen invasie van gastheercellen1,2,3. Opkomende infectieziekten vormen grote bedreigingen voor de volksgezondheid, zoals blijkt uit de recente COVID-19-pandemie4,5,6. Belangrijk is dat nieuwe of opkomende pathogenen mogelijk niet gemakkelijk worden onderscheiden met behulp van genomische benaderingen, vooral in gevallen waarin de ziekteverwekker is ontworpen om detectie te ontwijken of geen genomische handtekeningen bevat die het als pathogeen identificeren. Daarom kan de identificatie van potentiële pathogenen met behulp van methoden die kenmerken van pathogeniciteit direct beoordelen, zoals bacteriële hechting aan gastheercellen, een cruciale rol spelen bij de identificatie van pathogenen.

Bacteriële hechting aan gastheercellen wordt al tientallen jaren gebruikt om mechanismen van bacteriële pathogenese te evalueren1,7. Microscopische beeldvorming8,9 en de opsomming van bacteriële kolonievormende eenheid (CFU)10,11,12,13 door post-infectie plating zijn twee goed ontwikkelde laboratoriummethoden voor het testen van microbiële hechting en / of infectie van gastheercellen14. Gezien de micrometerschaalgrootte van bacteriële cellen, vereist de inventarisatie van de aanhangende bacteriële cellen over het algemeen het gebruik van geavanceerde microscopietechnieken met hoge vergroting, evenals beeldvormingsbenaderingen met hoge resolutie, waaronder elektronenmicroscopie, expansiemicroscopie (ExM)15,16en driedimensionale beeldvorming17 . Als alternatief kan de opsomming van bacteriën die gebonden zijn aan of geïnternaliseerd zijn in gastheercellen worden uitgevoerd door de verdunningsreeks van geoogste bacteriën op vaste agar te platen en de resulterende CFU's10,12,13te tellen . Deze methode is bewerkelijk en omvat veel handmatige stappen, wat problemen oplevert bij het vaststellen van een gestandaardiseerde of geautomatiseerde procedure die vereist is voor analyses met een hoge doorvoer18,19. Daarom zou de ontwikkeling van nieuwe methoden voor het evalueren van gastheercelaanhechting de huidige beperkingen in het veld aanpakken.

Een dergelijke methode wordt hier beschreven die gebruik maakt van geautomatiseerde high throughput microscopie, gecombineerd met high throughput beeldverwerking en statistische analyse. Om de aanpak aan te tonen, werden experimenten met verschillende bacteriële pathogenen uitgevoerd, waaronder Pseudomonas aeruginosa, een opportunistische Gram-negatieve bacteriële ziekteverwekker van mensen, dieren en planten14,20, waarvan vaak wordt vastgesteld dat het de luchtwegen koloniseert van patiënten met verminderde afweerfuncties van de gastheer. Deze aanpak optimaliseerde het microscopische beeldvormingsproces beschreven in eerdere studies14,20. De beeldvormingsdetectie werd vereenvoudigd door fluorescentie-gelabelde gastheercellen en bacteriën om de nabijheid ervan snel te volgen, wat de microscopiebelasting drastisch verminderde om beelden met een hoge resolutie te krijgen voor het onderscheiden van bacteriën. Bovendien verving de geautomatiseerde statistische analyse van beelden bij het tellen van gastheercellen en bacteriën het hands-on experiment van bacteriële CFU-plating om de verhouding van het aantal adherente bacteriën per gastheercel te schatten. Om de compatibiliteit van deze methode te bevestigen, zijn ook meerdere bacteriestammen en gastheerceltypen getest, zoals Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus en Klebsiella pneumoniae, evenals menselijke navelstrengas endotheelcellen (HUVECs), en de resultaten ondersteunen de diversiteit en effectiviteit van de methode.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. A549 celkweek

  1. Onderhoud de A549-cellijn in F-12K-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en incubeer bij 37 °C, 5% CO2.
  2. Verander het medium om de 3-4 dagen en passage bij 85% -95% confluency.
  3. Spoel de cellen kort met 1 x fosfaatgebuufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4, tenzij anders aangegeven) en behandel met 1 ml 0,25% trypsine-0,53 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) oplossing (onderdompeling van de cellaag) gedurende ongeveer 2 minuten bij 37 °C.
  4. Voeg extra 6 ml volledig groeimedium (F-12K medium + 10% FBS) toe om de protease-activiteit te stoppen. Plaats vervolgens de cellen in een steriele polystyreen T-75 weefselkweekkolf met een subcultivatieverhouding van 1: 3-1: 8. Het uiteindelijke volume van de cultuur is 12 ml.
  5. Zaai ongeveer 1 x 104 A549-cellen (celconcentratie: ~ 1 x 105 cellen / ml) op elke put van een 96-well plaat een dag voorafgaand aan de hechtingstests.

2. Bacteriegroei en kleuring

  1. Voer al het bacteriële werk uit in een Bioveiligheidskast, Bioveiligheidsniveau 2 laboratorium.
  2. Ent alle bacterieculturen, waaronder P. aeruginosa (PAO1), Escherichia. coli, L. monocytogenes en B. subtilis, enz., uit de bevroren glycerolvoorraad en kweek ze in tryptische sojabouillon (TSB, 3 ml) in een schudincubator bij 37 °C die 's nachts bij 250 tpm wordt gehouden.
  3. Gebruik de volgende dag een verdunning van 1:100 van de nachtcultuur om een subcultuur te enten en kweek ze in TSB (1 ml) gedurende 3 uur tot de exponentiële fase, meet de OD bij 600 nm (OD600) om te bevestigen. Zorg ervoor dat de OD600 zich in het bereik van 0,4-0,6bevindt.
  4. Voorafgaand aan het uitvoeren van de bacterie-gastheertrouwtest, plaat seriële verdunningen van bacteriële suspensie op TSB-agar platen, incubateer ze 's nachts bij 37 °C, en stel vervolgens de bacteriële CFU's vast uit het aantal kolonies. Voor P. aeruginosakomt een OD600 van 1,0 overeen met 2 x 108 levensvatbare bacteriële cellen/ml, en voor L. monocytogeneskomt een OD600 van 1,0 overeen met 9 x 108 levensvatbare bacteriële cellen/ml.
  5. Oogst de bacterieculturen in de exponentiële fase door centrifugering bij 13.000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) en was ze vervolgens eenmaal met 1x PBS (1 ml). Resuspend de bacteriële pellets in 1 ml van 1x PBS en bepaal de concentraties door OD600 van bacteriële suspensies te meten. Bijvoorbeeld, P. aeruginosa met OD600 van 0,5 vertegenwoordigt een concentratie van 1 x 108 bacteriële cellen / ml.
  6. Kleur de bacteriële suspensie met behulp van een groene of een rode fluorescerende kleurstof bij RT gedurende 30 minuten met zachte rotatie in het donker. Voeg hiervoor 2 μL van de 500-voudige geconcentreerde bouillonkleurstof toe aan 1 ml bacteriële suspensie om de kleurstof 1-voudig te verdunnen. Om de kleurstof af te spoelen, centrifugeer je de gekleurde bacteriën gedurende 2 minuten bij 13.000 x g en reuspend je de pellet drie keer in 1 ml 1x PBS.
    OPMERKING: Als fluorescentie- (GFP-, RFP-, mCherry-, enz.) gelabelde bacteriën worden gebruikt in het experiment, sla dan deze bacteriële kleuringsstap over. GFP-gelabelde P. aeruginosa en rode fluorescerende kleurstof-gekleurde L. monocytogenes werden gebruikt in dit protocol.
  7. Verzamel de gekleurde bacteriële cellen of GFP-gelabelde bacteriën door centrifugering bij 13.000 x g gedurende 2 minuten. Resuspend in vers F-12K medium (1 ml) en meet de OD600 van elke cultuur. Verdun de culturen vervolgens tot de gewenste concentraties op basis van de multipliciteit van infectie (MOI) en gastheercelconcentratie. Het uiteindelijke volume dat in dit experiment wordt gebruikt, is 500 μL.
    OPMERKING: Als de gastheercelconcentratie geteld met Trypan Blue-kleuring bijvoorbeeld 1 x 105 cellen / ml is, is de gewenste concentratie van bacteriële cellen bij een MOI van 100 1 x 107 cellen / ml. Concentratie van P. aeruginosa op 0,5 OD600 is 1 x 108/ml. Om de gewenste concentratie te verkrijgen, verdunt u de P. aeruginosa-cultuur 10-voudig, voegt u 50 μL geresuspendeerde cultuur toe aan 450 μL vers F-12K-medium.

3. Bacteriële hechting en gastheer celkleuring

  1. Was eerst de gezaaide A549 cel monolagen drie keer met warme 1x PBS. Voeg voor elke wasbeurt 100 μL 1x PBS toe aan elke put, pipetteer drie keer voorzichtig op en neer, gooi 1x PBS weg of wacht 10 s na toevoeging en vacuüm om 1x PBS te verwijderen. Om de kinetiek van bacteriële associatie te bepalen, bedekt u de cellen met 100 μL gewenste concentraties bacteriële suspensie met verschillende MOIs (0, 1, 10 en 100). Spin de bacteriën gedurende 10 minuten bij 200 x g en incubeer de geïnfecteerde A549-cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende nog eens 1 uur.
    OPMERKING: In dit experiment had elke aandoening een technisch drievoudig kenmerk.
  2. Verwijder de ongebonden bacteriën door de monolagen vijf keer te wassen met warme 1x PBS zoals hierboven beschreven. Voeg 100 μL 4% formaldehyde (in 1x PBS) toe aan elke put van de 96-putplaten om de cellen te fixeren. Laat de platen 15 minuten op ijs staan en spoel vervolgens drie keer de fixatieoplossing af met 1x PBS.
  3. Om de kernen te bevlekken, voegt u 50 ng / ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe en incubeer het gedurende 10 minuten bij RT. Was de putjes na incubatie drie keer met 1x PBS. Bedek de geïnfecteerde A549-cellen met 100 μL 1x PBS om uitdroging te voorkomen. Verwerk voor de volgende stap of bewaar de plaat bij 4 °C gedurende maximaal 2 dagen in het donker.

4. Geautomatiseerde fluorescentie beeldvorming, verwerking en analyse

  1. Om de gegevensintegriteit te behouden, kiest u willekeurig en handmatig vijf locaties van elke put om de afbeeldingen vast te leggen met een vergroting van 20x. Leg de fluorescerende beelden van A549-cellen en bacteriën vast onder respectievelijk DAPI- en GFP-kanalen. Gebruik het PE-Cy5-kanaal voor de bacteriën gekleurd door de rode fluorescerende kleurstof.
  2. Voor een betere resolutie verwerkt u alle afbeeldingen voor achtergrondafvlakking en deconvolutie. Stel de parameters in als 68 μm diameter van de rollende bal voor het afvlakken en meet automatisch de puntspreidingsfunctie (PSF) van beelddeconvolutie op basis van het objectief.
  3. Om alle gekwalificeerde cellen en bacteriën te tellen, meet u de fluorescentie-intensiteit van de gastheercellen en bacteriën en stelt u de zwakste fluorescentie-intensiteit van gastheercellen en bacteriën in als de drempels voor het aantal cellen. Tel alle bacteriën in de buurt van een gastheercel binnen 15 μm afstand als de aanhangende bacteriën als de diameter van A549 cel is 10,59-14,93 μm21.
    OPMERKING: Een standaardinstelling in het beeldvormingssysteem telt selectief de gastheercellen met diameters variërend van 5-100 μm en bacteriën variërend van 0,2-5 μm groot (breedte en lengte).
  4. Pas op basis van de bovengenoemde handmatige beeldverwerkingsresultaten de parameters van beeldafvlakking, deconvolutie, objectgroottes, afstand en fluorescentie-intensiteiten toe op de rest van de geautomatiseerde afbeeldingen. Overweeg na de geautomatiseerde analyse kritische uitlezingen, zoals het totale aantal gastheercellen, celgroottes en -vormen, het totale aantal bacteriën en het gemiddelde aantal bacteriën per gastheercel, wat de belangrijkste indicator was, om de bacteriële hechting te bepalen.
  5. Gegevensexport en statistische analyse
    1. Exporteer de geanalyseerde resultaten van alle afbeeldingen naar een spreadsheet (bijvoorbeeld 'xlsx'-indeling). Het geautomatiseerde systeem genereert twee sets resultaten: 1) het gemiddelde aantal adherente bacteriën van elk beeld; 2) de informatieve gegevens van elke afzonderlijke gastheercel, zoals het aantal adherente bacteriën op een enkele cel, de grootte van de gastheer en de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van gastheercellen en bacteriën, uit het overeenkomstige beeld.
    2. Bereken het gemiddelde aantal en de standaarddeviatie van het aantal adherente bacteriën uit alle afbeeldingen om het bacteriële hechtingsniveau weer te geven in vergelijking met negatieve controles. In deze methode dienden E. coli en B. subtilis als negatieve controles bij het testen van respectievelijk Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriële therapietrouw. Voer tweerichtings-ANOVAs uit om te testen op significante variatie tussen gegevenspunten in de behandeling voor drie onafhankelijke experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om de op fluorescentiebeeldvorming gebaseerde bacteriële therapietrouwtest te ontwikkelen, werden P. aeruginosa-stam PAO1 en zijn tegenhanger met negatieve therapietrouw E. coli gebruikt om de effectiviteit van het protocol te testen, omdat de hechting van deze bacteriën aan A549-cellen was gemeld14,20,22. Ten eerste werden GFP-gelabelde P. aeruginosa (PAO1) en GFP-gelabelde E. coli geco-geïncubeerd met een menselijke vereeuwigde epitheelcellijn A549 bij verschillende MOI's, respectievelijk. De resultaten toonden aan dat PAO1 zich op een dosisafhankelijke manier aan A549-cellen hechtte (figuur 1A,B); in de tussentijd werd ook de hechting van E. coli bijna nul gecontroleerd (figuur 1A,B). Er werden 50 beelden vastgelegd en geanalyseerd bij elke MOI. Tweerichtings-ANOVAs werden uitgevoerd om de significante variaties van drie onafhankelijke experimenten te testen.

Figure 1
Figuur 1: Gram-negatieve bacteriële P. aeruginosa gehecht aan A549 cellen binnen 1 uur na co-incubatie. (A) Microscopische beelden voor een overzicht van bacteriële hechting waarbij de foto's zijn gemaakt met behulp van 20x vergroting. PAO1 en de negatieve-therapietrouwcontrole E. coli hechtten zich aan A549-cellen bij de aangegeven multipliciteit van infecties (MOI's). Bacteriën waren GFP-fluorescentie gelabeld. A549-celkernen werden gekleurd door DAPI. De schaalbalk is 50 μm. (B) Kwantificering van het aantal adherente bacteriën per A549-cel. Voor elke geteste bacteriestam (PAO1 en E. coli)in elke MOI werden in totaal 50 beelden toegepast op de analyse bij elke aandoening. Gegevens zijn gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van één vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. De tweerichtingsanalyse van ANOVA werd uitgevoerd. * p < 0,05, *** p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen wanneer Gram-positieve bacteriën, L. monocytogens23,24 en de negatieve controle B. subtilis, werden gebruikt ( Figuur2A,B). De hechting aan A549-cellen was significant in L. monocytogenes dan B. subtilis (Figuur 2A,B).

Figure 2
Figuur 2: Grampositieve bacteriële L. monocytogenes gehecht aan A549-cellen binnen 1 uur na co-incubatie. (A) Microscopische beelden voor een overzicht van L. monocytogenes, evenals de negatieve controle B. subtilis hechting aan A549 cellen bij verschillende MOIs. Bacteriën werden gekleurd met behulp van een rood-fluorescerende kleurstof. A549-celkernen werden gekleurd met DAPI. De schaalbalk is 50 μm. (B) Kwantificering van het aantal adherente bacteriën per A549-cel. Voor elke geteste bacteriestam (L. monocytogenes en B. subtilis) in elke MOI werden in totaal 50 beelden toegepast op de analyse bij elke aandoening. Gegevens zijn gemiddeld ± SD van een vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. De tweerichtingsanalyse van ANOVA werd uitgevoerd. ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een representatief beeld van gastheer-adherente P. aeruginosa segmentatie en tellingen wordt weergegeven in figuur 3 (Gele maskers: geselecteerde bacteriën, rode omtrek: enkele bacteriële telling). De instellingen voor zowel gastheer- als bacteriedoelen worden beschreven in de sectie Protocol.

Figure 3
Figuur 3: Voorbeeldbeelden van bacteriële segmentatie en tellen in het geautomatiseerde analyseproces. (A) Microscopische beelden van P. aeruginosa gehecht aan A549 bij een MOI van 100 zonder bacteriële segmentatie en telling. (B) Hetzelfde beeld na de statistische analyse van bacteriële segmentatie en telling. Gele maskers: geselecteerde bacteriën, rode omtrek: enkele bacterietelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resultaten van de geautomatiseerde analyses, met inbegrip van de grootte en gebieden van de gastheercellen, het aantal bacteriële en gastheercellen, alsmede de gemiddelde bacteriële tellingen per gastheercel, die de status van de gezondheid van de gastheercel, het hechtingsniveau van bacteriën en bacteriële cytotoxiciteit vertegenwoordigen, zijn vermeld in tabel 1 en tabel 2. Tabel 1 vertegenwoordigt de adherente bacterietellingen op een gemiddeld cellulair niveau van verschillende afbeeldingen, terwijl tabel 2 het aantal adherente bacteriën weergeeft dat op één afbeelding is geanalyseerd op een enkel A549 cellulair niveau. Deze representatieve beelden werden gemaakt van A549-cellen geïnfecteerd door PAO1 bij een MOI van 100. De geanalyseerde resultaten van de initiële afbeelding in figuur 3 werden weergegeven als afbeelding 1 in tabel 1 en tabel 2.

Tabel 1: Statistische analyseresultaten van 9 representatieve beelden op cellulair niveau. Klik hier om deze tabel te downloaden.

In elke afbeelding vertegenwoordigen het aantal gastheersom en bacteriële somvlekken respectievelijk de totale tellingen van gastheerkernen en de totale bacteriële tellingen die door het systeem worden herkend op basis van de hierboven beschreven parameters. Bovendien vertegenwoordigt de geautomatiseerde berekening van bacteriële vlekkenverhouding het gemiddelde aantal bacteriën per gastheercel, afgeleid van de bacteriesomvlekken / gastheersomtelling. Bovendien kunnen ook extra metingen worden opgenomen; de bacterie-aanhankelijke gastheertellingen illustreren bijvoorbeeld het universele of specifieke fenomeen van gastheer-bacterietrouw. Wanneer de bacterie-aanhankelijke gastheertellingen veel minder zijn dan het aantal hostsomen, is het gemiddelde aantal bacteriën per gastheer daarentegen relatief hoog, wat aangeeft dat een dergelijk therapietrouwfenotype een significante heterogeniteit heeft.

Tabel 2: Enkelvoudige cellulaire statistische analyse van een representatief beeld. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Enkelvoudige celanalyse biedt meer details over gastheercel- en bacteriële doelen in elk beeld, wat nuttiger is bij het verzamelen van andere bacteriële kenmerken en deze toe te passen op de geautomatiseerde computationele analyse om een krachtiger hulpmiddel te ontwikkelen bij het evalueren van de potentiële bacteriële pathogeniciteit, zoals een Machine Learning-model dat wordt bestudeerd. In dit protocol vertegenwoordigen gastheergrootte en -oppervlakte de diameters en gebieden van elke gekleurde gastheerkernen en vertegenwoordigt de fluorescentie-intensiteit van de gastheer de gemiddelde intensiteit van de gekleurde kernen. Bacteriële vlekkentelling en -gebied vertegenwoordigen de aanhankelijke bacteriële doelen voor elke gastheercel en hun totale gebieden. Bacteriële fluorescentie-intensiteit vertegenwoordigt de gemiddelde intensiteit van alle aanhankelijke bacteriën.

Het is niet verwonderlijk dat sommige virulente bacteriën zich niet aan A549 hielden, terwijl sommige bacteriën met hoge niveaus van bacteriële hechting niet noodzakelijkerwijs correleren met pathogeniciteit. Een ander hostceltype, HUVECs, werd ook getest om de toepassing van deze methode te maximaliseren. De resultaten toonden de effectieve detectie en de verschillende therapietrouwfenotypen van bacteriën(figuur 4). Verschillende gastheercellen kunnen de schatting van potentiële bacteriële pathogenen verhogen; pathogene Serratia rubidaea en Streptococcus agalactiae waren bijvoorbeeld wel aan HUVEC-cellen gehecht, maar niet aan A549-cellen (figuur 4). Bovendien was de cytotoxische Enterohemorragische E. coli (EHEC) niet-hechtend aan A549 of HUVEC (figuur 4). Daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de methode geschikt is voor meerdere gastheerceltypen om te reageren op de specificiteit van gastheer-bacterie-interacties. Zowel A549- als HUVEC-cellen werden gedurende 1 uur samen geïncubeerd met bacteriën bij een MOI van 100 bij 37 °C.

Figure 4
Figuur 4: Specificiteit van bacteriële hechting aan gastheer A549- en HUVEC-cellen. De bacteriestammen, waaronder S. rubidaea, S. agalactiae, cytotoxische Enterohemorragische E. coli (EHEC), PAO1, P. aeruginosa ΔpilA (PAO-NP), E. coli, S. aureus en S. aureus ΔsaeR, werden getest op zowel A549- als HUVEC-cellen bij een MOI van 100 gedurende 1 uur co-incubatie bij 37 °C, 5% CO2. Bacteriën werden gekleurd met een rood-fluorescerende kleurstof. Adherente bacterietellingen werden gekwantificeerd uit 45 afbeeldingen / bacteriestam in drie onafhankelijke experimenten. Gegevens zijn gemiddeld ± SD van één vertegenwoordiger van drie onafhankelijke experimenten. * p < 0,05, *** p < 0,001, **** p<0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol beschrijft een geautomatiseerde aanpak voor het opsommen van bacteriële hechting aan gastheercellen. De beschreven aanpak heeft verschillende aantrekkelijke voordelen ten opzichte van conventionele methoden. Ten eerste maakt deze aanpak de nauwkeurige kwantificering mogelijk van het aantal microbiële pathogene cellen dat aan individuele gastheercellen is bevestigd. Belangrijk is dat deze kwantificering kan worden uitgevoerd zonder de noodzaak van moeizaam bacterieoogst, seriële verdunningen, plating op vaste media en bepaling van CFU's10,11,12. Als zodanig vermindert de beschreven techniek de totale werklast die nodig is om bacteriële therapietrouw te kwantificeren. Het moet worden gewaardeerd dat de voordelen van de voorgestelde aanpak worden versterkt bij het opsporen van therapietrouwfenotypen in grootschalige screeningsexperimenten, waaronder de identificatie van bacteriële of gastheergenen in respectievelijk mutant- of CRISPR-bibliotheken die dit proces reguleren. Ten tweede biedt de directe evaluatie van interacties tussen gastheer- en bacteriële cellen met behulp van fluorescentiemicroscopie informatie voor het ophelderen van mechanismen van bacteriële pathogeniciteit, waaronder veranderingen in de overleving van een gastheer of bacteriële cel, morfologie of dynamiek. Ten slotte biedt de geautomatiseerde statistische analyse die wordt uitgevoerd op beelden die in de analyse zijn verzameld, niet alleen een algemene kwantificering van de gemiddelde bacteriële associatie met gastheercellen, maar maakt het ook de evaluatie van dynamische, eencellige, gastheer-pathogeeninteracties mogelijk.

Ondanks deze voordelen hebben de beschreven methoden enkele belangrijke beperkingen. Ten eerste is fluorescentiekleuring van bacteriën nodig om hun hechting aan gastheercellen op te sommen. De fluorescerende kleurstof moet dus selectief bacteriën kleuren dan hun tegenhangers in de gastheercel. Bovendien mag de kleurstof het aanhechtingsfenotype van de bacteriën die het dragen niet veranderen. Daarom moet de optimalisatie van bacteriële fluorescentiekleuring (bijv. Concentratie, kleuringsduur) worden bepaald voorafgaand aan het uitvoeren van de beschreven therapietrouwstudies. In dit protocol heeft fluorescerende kleuring van bacteriestammen, waaronder P. aeruginosa, L. monocytogenes, E. coli en B. subtilis gedurende 30 minuten, geen invloed op hun hechting aan gastheercellen. Ten tweede, vanwege de specificiteit van verschillende gastheer-bacterie interacties, is een enkel gastheerceltype mogelijk niet voldoende om bacteriële hechting aan gastheercellen te evalueren. Daarom kunnen meerdere gastheerceltypen nodig zijn om een volledig begrip te krijgen van de mate waarin een bepaalde microbe zich kan hechten aan gastheerceloppervlakken. Ten derde was bacteriële segmentatie niet volledig efficiënt wanneer bacteriën aggregatie voortstuwen tijdens de co-incubatie, bijvoorbeeld S. aureus, of wanneer bacteriën klonten vormden bij een hogere MOI (>100), bijvoorbeeld P. aeruginosa. In dit geval moet een hogere vergroting worden toegepast om de beelden vast te leggen, of moeten meer afbeeldingen worden gebruikt in de analyse om het effect van bacteriële aggregatie te verminderen.

Menselijke longepitheelcellen (A549) en HUVECs werden in de studies gebruikt om de plasticiteit van de aanpak met betrekking tot het gastheerceltype aan te tonen, en beide vertoonden een hoge mate van gevoeligheid voor bacteriële hechting. Het gebruik van twee gastheerceltypen toonde ook aan dat de beschreven methode op grote schaal kon worden toegepast om aanhankelijke gastheer-bacterie-interacties snel te karakteriseren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Acknowledgments

We zijn Dr. Kaite Zlotkowski van Biotek Inc. dankbaar voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie onder contractnummer W911NF1920013 aan PdF, het Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) en het ministerie van Binnenlandse Zaken onder contract nr. 140D6319C0029 aan PdF. De inhoud van de informatie weerspiegelt niet noodzakelijkerwijs het standpunt of het beleid van de regering en er mag geen officiële goedkeuring worden afgeleid.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS VWR 45001-130
4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher 62248 Host cell staining dye
96 well plate Corning 3882 Half area well, flat clear bottom
A549 cells ATCC  CCL 185 Mammalian cell line
BactoView Live Red Biotium 40101 Bacteria staning dye
Centrifuge Eppendorf 5810R
CFSE cell division tracker BioLegend 423801
Cytation 5  BioTek Cytation 5  Cell imaging multi-mode reader
E. coli Laboratory stock 
EGM bulletKit Lonza CC-3124 HUVEC cell culture medium
EHEC NIST collections
F-12k medium ATCC  302004 A549 cell culture medium
Fetal bovine serum Corning 35-016-CV
HUVEC Laboratory stock 
L. monocytogenes NIST collections
OD600 DiluPhotometer IMPLEN
P. aeruginosa Dr. Lori Burrows laboratory stock
P. aeruginosa ΔpilA Dr. Lori Burrows laboratory stock
S. agalactiae NIST collections
S. aureus BEI NR-46543
S. aureus ΔsaeR BEI NR-48164
S. rubidaea NIST collections
Typical soy broth Growcells MBPE-4040

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094 (2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928 (2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192 (2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110 (2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078 (2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240 (2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103 (2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173 (2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268 (2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350 (2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43 (2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259 (2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 02/08/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

Geautomatiseerde, high-throughput detectie van bacteriële hechting aan gastheercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik,… More

Yang, J., Qin, Q. M., Van Schaik, E., Samuel, J. E., de Figueiredo, P. Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells. J. Vis. Exp. (175), e62764, doi:10.3791/62764 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter