Summary
Desarrollamos un método reproducible para visualizar la internalización del trifosfato de adenosina fluorescente no hidrolizable (ATP), un sustituto de ATP, con alta resolución celular. Validamos nuestro método utilizando ensayos independientes in vitro e in vivo: líneas celulares tumorales humanas y ratones inmunodeficientes xenoinjertados con tejido tumoral humano.
Abstract
Se ha demostrado que el trifosfato de adenosina (ATP), incluido el ATP extracelular (eATP), desempeña un papel importante en varios aspectos de la tumorigénesis, como la resistencia a los medicamentos, la transición epitelial-mesenquimal (EMT) y la metástasis. La eATP intratumoral es de 10a 3 a 104 veces mayor en concentración que en los tejidos normales. Si bien eATP funciona como un mensajero para activar la señalización purinérgica para la inducción de EMT, también es internalizado por las células cancerosas a través de la macropinocitosis regulada al alza, un tipo específico de endocitosis, para realizar una amplia variedad de funciones biológicas. Estas funciones incluyen proporcionar energía a las reacciones bioquímicas que requieren ATP, donar grupos fosfato durante la transducción de señales y facilitar o acelerar la expresión génica como cofactor transcripcional. El ATP está fácilmente disponible, y su estudio en el cáncer y otros campos sin duda aumentará. Sin embargo, el estudio eATP se encuentra en una etapa temprana, y las preguntas no resueltas siguen sin respuesta antes de que las actividades importantes y versátiles desempeñadas por eATP y ATP intracelular internalizado puedan desentrañarse por completo.
Las contribuciones de los laboratorios de estos autores a estos primeros estudios de eATP incluyen imágenes microscópicas de ATP fluorescente no hidrolizable, junto con dextrans fluorescentes de alto y bajo peso molecular, que sirven como trazadores de macropinocitosis y endocitosis, así como varios inhibidores de endocitosis, para monitorear y caracterizar el proceso de internalización de eATP. Esta modalidad de imagen se aplicó a líneas celulares tumorales y a ratones inmunodeficientes, xenoinjertados con tumores de cáncer humano, para estudiar la internalización de eATP in vitro e in vivo. Este artículo describe estos protocolos in vitro e in vivo, con énfasis en la modificación y el ajuste fino de las condiciones del ensayo para que los ensayos de internalización eATP mediados por macropinocitosis / endocitosis se puedan realizar con éxito en diferentes sistemas.
Introduction
La absorción oportunista de nutrientes extracelulares intratumorales (es decir) ha sido nombrada recientemente un sello distintivo clave para el metabolismo del cáncer1. Uno de estos nutrientes importantes es el ATP, ya que la concentración de ieATP es 103 y 104 veces mayor que la que se encuentra en los tejidos normales, en el rango de varios cientos de μM a mM bajo2,3,4,5. Como molécula clave de energía y señalización, el ATP juega un papel central en el metabolismo celular en células cancerosas y sanas6,7,8. El ATP extracelular no solo está involucrado en el crecimiento de células cancerosas, sino que también promueve la resistencia a los medicamentos9. Recientemente se han identificado funciones previamente no reconocidas del ATP, como la actividad hidrotrópica, lo que implica la participación del ATP en enfermedades como el Alzheimer10. De hecho, parece que nuestra comprensión del ATP y sus funciones en las células cancerosas, las células sanas y otras células enfermas está lejos de ser completa. Sin embargo, debido a la inestabilidad del ATP y las altas tasas de renovación en las células, es técnicamente difícil monitorear el movimiento del ATP a través de la membrana celular y hacia la célula.
Para abordar este problema y satisfacer la necesidad de esta área de investigación, se desarrolló un método en el que se utilizó ATP fluorescente no hidrolizable (NHF-ATP)(Figura 1)como sustituto para visualizar la internalización del ATP y observar la localización espacial intracelular del ATP internalizado, tanto in vitro como in vivo11,12 . Se ha demostrado que el NHF-ATP sustituye al ATP endógeno para investigar el movimiento del ATP a través de las membranas celulares animales, tanto en líneas celulares cancerosas como en tejido tumoral humano xenoinjertado en ratones inmunodeficientes11,12. Además, la administración de inhibidores de la macropinocitosis a las células bloqueó la internalización de eATP, lo que sugiere que la absorción intracelular de eATP implica un mecanismo macropinocitótico9,11,12. Este protocolo permite el colabeling de base inmunocomprimida contra proteínas específicas de la célula y, por lo tanto, la identificación de qué tipo de célula internaliza el NHF-ATP. Utilizando xenoinjertos tumorales in vivo y microscopía de alta resolución, el NHF-ATP se puede visualizar espacialmente a través de la muestra de tejido e incluso dentro de una sola célula. Estos métodos también permiten el análisis cuantitativo, como el porcentaje de absorción celular, el número de vesículas macropinocitóticas y la cinética de internalización. Este artículo describe en detalle cómo el NHF-ATP, trabajando solo o junto con endocitosis-trazador fluorescente dextrans13,14,15,16, se puede utilizar en diferentes entornos experimentales para estudiar la internalización y localización intracelular de ATP, después de la internalización en las células.
Figura 1: Estructuras de ATP fluorescente no hidrolizable y tetrametilrodamina marcadas con dextrano fluorescente de alto peso molecular. (A) Estructura de NHF-ATP. (B) Representación esquemática de HMWFD. Abreviaturas: ATP = trifosfato de adenosina; NHF-ATP = ATP fluorescente no hidrolizable; TMR = tetrametilrodamina; HMWFD = dextrano fluorescente de alto peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Protocol
Todos los procedimientos reportados en este documento se realizaron de acuerdo con el IACUC de la Universidad de Ohio y con el NIH.
1. Selección de ATP fluorescente no hidrolizable (NHF-ATP) y dextrans
- Seleccionar un NHF-ATP conjugado con fluoróforos(Figura 1A)y trazadores de endocitosis, dextrans fluorescentes de alto y bajo peso molecular (TMR-HMWFD y TMR-LMWFD)(Figura 1B),en función de las longitudes de onda de emisión preferidas (por ejemplo, sistema de imágenes equipado con filtros apropiados) y el proceso de endocitosis específico a estudiar.
2. Estudios de localización de ATP, in vitro (Figura 2)
Figura 2: Procedimiento in vitro para examinar la internalización del ATP. Representación esquemática del protocolo para visualizar la internalización de ATP extracelular en células cancerosas cultivadas mediante microscopía de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Cultivo celular y preparación de células
NOTA: Realizar cultivo celular en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos.- Prepare el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco, que contiene 10% (v/v) suero fetal bovino (FBS) y 1% (v/v) penicilina/estreptomicina (en adelante, DMEM/FBS), solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y 0,25% de tripsina/ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), en un baño de agua a 37 °C.
- Cultive células cancerosas humanas en DMEM/FBS en una placa de cultivo de tejidos de 100 mm. Mantenga las células en una incubadora a 37 °C con una atmósfera de 5% de CO2.
- Cuando las células alcanzan la confluencia, pase las células eliminando primero el medio de cultivo. A continuación, enjuague el plato con 5 ml de PBS estéril, retire el PBS y agregue 3 ml de tripsina al 0.25%. Incubar a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5% durante 5 min.
- Recupere el plato, luego agregue 6 ml de DMEM / FBS para detener la tripsinización. Transfiera las células en suspensión a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 800 × g durante 5 minutos para granular las células.
- Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y use 10 ml de DMEM / FBS para resuspendir el pellet celular mediante pipeteo.
- Cuente la densidad celular y la viabilidad utilizando un hemocitómetro. Utilice DMEM/FBS para diluir la suspensión celular a una densidad de ~7.5 × 104 células/ml.
- Preparación de fundas y células de siembra
- Lave las fundas de 12 mm con etanol al 70% y límpielas cuidadosamente con toallitas delicadas. Esterilizar las fundas y un par de fórceps mediante autoclave.
- En una campana de cultivo de tejidos, use fórceps para colocar un cubrehojas en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
NOTA: Más tarde, el coverslip, con celdas, se montará directamente en un portaobjetos de microscopio para obtener imágenes. - Dispensar 300 μL de la suspensión celular (células en DMEM/FBS), a una densidad de siembra de ~2,5 × 104 células por pozo, en la placa de 24 pocillos que contiene las fundas esterilizadas. Incubar en condiciones estériles a 37 °C con un flujo de CO2 del 5%.
- Inanición de células
- Veinticuatro horas después de la siembra, retire el DMEM / FBS de cada pozo. Agregue inmediatamente 300 μL de DMEM sin suero precalentado en cada pocillo para matar de hambre de suero a las células durante 15-18 h para inducir la absorción de nutrientes extracelulares.
NOTA: El período de inanición de 15-18 h es un parámetro crítico.
- Veinticuatro horas después de la siembra, retire el DMEM / FBS de cada pozo. Agregue inmediatamente 300 μL de DMEM sin suero precalentado en cada pocillo para matar de hambre de suero a las células durante 15-18 h para inducir la absorción de nutrientes extracelulares.
- Preparación de soluciones NHF-ATP y HMWFD/LMWFD
- Utilice una balanza analítica para pesar tmR-dextrano fluorescente de alto peso molecular (70 kDa) (TMR-HMWFD, 1 mg/mL), un trazador para visualizar macropinosomas, o NHF-ATP (10 μmol/L) en DMEM sin suero en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Coloque los tubos, protegidos de la luz, en un baño de agua a 37 °C durante 15 min.
- Centrifugadora a 12.000 × g durante 5 min a temperatura ambiente. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante transparente a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, dejando intacto cualquier gránulo o escombros para eliminar los cristales indisolubles.
- Agregue las soluciones del paso 2.4.1 a las células de cada pozo e incube las células durante 30 min a 37 °C.
NOTA: Si las soluciones HMWFD y NHF-ATP se van a mezclar para la coincubación con las células, prepare ambas soluciones a 2 veces las concentraciones finales. Las soluciones se mezclarán más tarde en una proporción de 1: 1 para lograr las concentraciones de trabajo precisas finales. Evite la luz ya que los reactivos son sensibles a la luz.
- Tratamiento de las células y fijación
- En una placa fresca de 24 pocillos, dispense 500 μL de PBS precalentado en cada uno de los cinco pozos.
- Después de la incubación celular, recoja cuidadosamente cada funda con fórceps. Enjuague cada funda sumergiéndola en 500 μL de PBS precalentado. Repita cinco veces usando los cinco pozos llenos de PBS.
NOTA: El lavado suave de las células en los labios es fundamental para el éxito de este experimento. - Después del lavado final de PBS, toque el cubrecolchas en una delicada toallita de tarea para absorber PBS adicional y transfiera el cubrecolchas inmediatamente a formaldehído frío (4 ° C) al 3.7%, precargado en una placa de 24 pocillos. Fije las celdas durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Mientras se fijan las células, el microscopio se desliza previamente con 70% de etanol. Retire los cubrehojas de los pocillos y móntelos en los portaobjetos, utilizando 5 μL de medio de montaje acuoso que contenga la tinción nuclear 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), por funda. Seque suavemente el exceso de PBS con una toalla de papel o una toallita delicada para tareas.
- Microscopía de fluorescencia y adquisición de imágenes
- De dos a 24 horas después de los pasos anteriores, capture imágenes de células e interiorice HMWFD y / o NHF-ATP utilizando un sistema de imágenes de epifluorescencia y un software de adquisición de datos.
NOTA: En esta subsección se describen los pasos para adquirir imágenes utilizando un microscopio Nikon NiU, equipado con capacidad de imagen de epifluorescencia, y el software Nikon NIS Elements. Sin embargo, se pueden utilizar otros sistemas de imágenes y software de adquisición comparables. Siga las instrucciones de funcionamiento del fabricante.- Coloque el portaobjetos en el escenario de un microscopio de epifluorescencia vertical en modo binocular. Acceda al programa de imágenes.
- Seleccione el objetivo 10x, ajuste el escenario para definir el enfoque y escanee la diapositiva de izquierda a derecha de manera serpenteante para identificar las regiones de interés.
NOTA: La identificación de las regiones de interés variará entre los tipos de células, con algunas líneas celulares / tipos de cáncer que exhiben diversos y distintos grados de absorción de TMR-HMWFD y / o NHF-ATP. - Seleccione el objetivo 40x y cambie del modo binocular al modo de captura de imágenes, utilizando el interruptor del microscopio.
- Haga clic en el icono Calidad en vivo en el programa de imágenes para ver y posteriormente adquirir imágenes.
- Con el panel OC de la barra de herramientas Anotaciones y mediciones, defina los parámetros de exposición para cada cubo de filtro o canal fluorescente.
NOTA: Seleccione el tiempo de exposición adecuado para cada canal, ya que las intensidades de la señal son diferentes. Por ejemplo, seleccione un tiempo de exposición de 200 ms para DAPI, 2 s para HMWFD y 4 s para NHF-ATP. Una vez que se determina el tiempo de exposición por canal, use esta configuración para todas las imágenes, por canal, con diferentes tratamientos o condiciones. - Una vez que se hayan establecido los ajustes de exposición para cada canal, utilice la barra de herramientas de adquisición multicanal para adquirir una imagen de 3 canales con los ajustes de exposición definidos.
NOTA: La adquisición de imágenes a través del modo de adquisición ND multicanal permite la captura automática de imágenes para cada canal del mismo campo de visión. El obturador se cierra automáticamente entre los cambios de torreta. - Alternativamente, adquiera imágenes multicanal manualmente alternando entre cubos de filtro, configurando el tiempo de exposición, cerrando / abriendo el obturador entre la adquisición de imágenes para cada canal y superponiendo cada imagen tomada para canales individuales.
NOTA: El modo de adquisición ND automatiza este proceso y proporciona imágenes combinadas. - Guarde la imagen como archivo .nd2 (el formato Nikon Elements guarda metadatos). Guarde los archivos TIF, incluida la imagen de canal combinada y las imágenes de canal individuales.
NOTA: Los archivos TIF se pueden utilizar con una selección más amplia de aplicaciones de software. - Utilice la función Recuento de objetos de la barra de herramientas Análisis para contar el número de celdas NHF-ATP-, TMR-HMWFD-, y/o TMR-LMWFD-positivas en un archivo de imagen .nd2 guardado.
- Exporte los datos a una hoja de cálculo a través del programa de análisis.
- De dos a 24 horas después de los pasos anteriores, capture imágenes de células e interiorice HMWFD y / o NHF-ATP utilizando un sistema de imágenes de epifluorescencia y un software de adquisición de datos.
- Cuantificación y análisis de datos
- Para cada condición ensayada, imagen de 50 a 100 células para la cuantificación. Utilizando el software de análisis de datos (software incluido en el sistema de imágenes de epifluorescencia u otro software), cuente y calcule el número medio de vesículas fluorescentes por célula.
- Utilizar métodos estadísticos apropiados para analizar los resultados cuantificados.
3. Internalización de ATP en tumores, ex vivo (Figura 3)
Figura 3: Procedimiento in vivo para examinar la internalización del ATP. Representación esquemática del protocolo para visualizar la internalización de ATP extracelular en xenoinjertos tumorales mediante criosecciona y microscopía de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Preparación de cultivos celulares para implantación
- Cultivar células cancerosas al 80% de confluencia a 37 °C en un matrazde 225 cm 2, utilizando DMEM suplementado con FBS, a una concentración final de 10% (v/v) y penicilina/estreptomicina al 1% (v/v).
- Lave las células dos veces con 10 ml de PBS. Pre-caliente 0.25% tripsina/EDTA a 37 °C. Añadir 8 ml de tripsina/EDTA e incubar a 37 °C durante 2 min.
- Una vez que las células comiencen a desprenderse de la parte inferior del matraz, use una pipeta serológica estéril de 10 ml para agregar 8 ml de DMEM / FBS. Aspirar dos veces para desalojar cualquier célula adherente. Utilice la pipeta para transferir las células desprendidas del matraz a un tubo cónico de 50 ml.
- Agregue 10 ml de DMEM/FBS utilizando una pipeta de 10 ml y recoja todas las celdas flotantes restantes en el mismo tubo cónico de 50 ml.
- Centrifugar la suspensión celular a 600 × g,4 °C durante 4 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 1 ml de PBS helado.
- Cuente la densidad celular usando un hemocitómetro. Mantenga la suspensión celular en hielo mientras cuenta.
- Centrifugar la suspensión celular a 600 × g,4 °C durante 4 min. Retire el sobrenadante y suspenda las células en PBS helado de tal manera que la densidad celular se convierta en 5 × 106 células por 100 μL de PBS. Transfiera la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Inyección subcutánea de células cancerosas para el desarrollo de tumores de xenoinjerto
- Use una jeringa sin látex (1 ml) con una aguja deslizante de precisión (aguja de 27 G) para la inyección de células cancerosas.
- Transfiera la suspensión celular (5 × 106 en 100 μL de PBS) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Extraiga las células en la jeringa.
- Seleccione un sitio de inyección en el flanco de un ratón inmunodeficiente (desnudo) y limpie suavemente la piel con etanol al 75%. Limpie el exceso de etanol con una delicada limpieza de tareas.
- Para la inyección subcutánea, sostenga la aguja en un ángulo de aproximadamente 10 ° con respecto a la piel. Inserte la punta de la aguja, con el bisel hacia arriba, justo debajo de la piel, de modo que solo 1-2 mm de la aguja sea visible fuera de la piel. Dispense las células de la jeringa lentamente durante aproximadamente 10 s.
- Después de inyectar todo el volumen, continúe manteniendo la aguja en su lugar durante 3-5 s, luego retire la aguja y use un dedo para aplicar una presión suave pero firme en el sitio de inyección durante 3-5 segundos más para evitar fugas del contenido inyectado.
- Monitoree y mida el crecimiento tumoral usando pinzas vernier hasta que los tumores alcancen un volumen de 200-500 mm3.
- Preparación de soluciones HMWFD y NHF-ATP para ser utilizadas después de la resección tumoral
- Disolver 300 μL de 16 mg/ml de HMWFD en DMEM (medio de cultivo) sin suero, incubar en un baño de agua a 37 °C durante 30 min y centrifugar a 12.000 × g durante 5 min como se describió anteriormente. Transfiera la solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Añadir 40 μL de material análogo de NHF-ATP (1 mM) a 160 μL de DMEM sin suero para preparar una solución de NHF-ATP de 0,2 mM.
- Preparación de pozos experimentales
NOTA: Este diseño experimental ensayará la internalización intracelular de HMWFD + NHF-ATP, indicativa de captación por macropinosomas.- Preparar los pocillos de la siguiente manera: Pozo #1, Control: 200 μL de DMEM sin suero; Pozo #2, Control: 100 μL de 16 mg/mL LMWFD + 100 μL de DMEM libre de suero = 200 μL de 8 mg/mL LMWFD; Pozo #3, Control: 100 μL de 0.2 mM NHF-ATP + 100 μL de DMEM libre de suero = 200 μL de 0.1 mM NHF-ATP; Bueno #4; Experimental: 100 μL de 16 mg/mL HMWFD + 100 μL de 0,2 mM NHF-ATP = 200 μL de 0,1 mM NHF-ATP y 8 mg/mL HMWFD.
- Preparación de tejidos tumorales
- Eutanasiar al ratón por luxación cervical o según el protocolo aprobado por la IACUC.
- Use un bisturí de tamaño 10 para cortar los tumores aislados a un grosor de ~ 500-1,000 μm.
- Incubar las rebanadas tumorales en DMEM sin suero suplementado con 100 μM NHF-ATP y/o 8 mg/mL H/LMWFD en tubos de microcentrífuga durante 40 min a 37 °C con un flujo de CO2 al 5%.
NOTA: Después de la incubación, el metabolismo del tejido tumoral hace que el color del medio cambie. - Enjuague los tejidos en PBS precalentado a 37 °C (2 ml por cada enjuague en una placa de 24 pocillos).
- Transfiera el tejido a una nueva placa de 24 pocillos con PBS fresco precalentado, enjuague y repita cuatro veces con un suave agitación.
- Crio-incrustación (preparación de bloques de tejido congelado)
- Prepare las etiquetas de identificación para cada tumor que se va a cosechar. Cortar un trozo de cinta de laboratorio de 2 cm y doblar por la mitad, los lados adhesivos juntos, a lo largo. Use un rotulador para etiquetar la etiqueta, por ejemplo, con un número de identificación de ratón/tumor.
- Prepare moldes de incrustación colocando moldes de tejido de acero inoxidable directamente sobre hielo seco.
NOTA: El hielo seco puede causar congelación, quemaduras y asfixia. Use guantes aislados cuando manipule hielo seco. Use hielo seco en un área bien ventilada. No almacene hielo seco en un recipiente herméticamente sellado. En su lugar, guárdelo en un recipiente (como un enfriador de espuma de poliestireno) que permita que el gas escape. - Mientras el moho se enfría, coloque un pequeño charco de medio de congelación de tejido en una placa de cultivo de tejido de 10 mm. Asegúrese de que el volumen sea suficiente para sumergir el tejido tumoral que se va a cosechar.
- Use una cuchara perforada para recoger el tejido tumoral resecado y coloque inmediatamente el tejido en un medio de congelación, asegurándose de que el tejido esté sumergido. Usando la cuchara perforada, enrolle suavemente el tejido en el medio de congelación, asegurándose de que el medio esté bañando todas las superficies del tejido.
- Mueva cuidadosamente el tejido en el molde de incrustación que contiene el medio de congelación. Coloque la etiqueta de etiqueta correspondiente verticalmente en el medio de congelación / molde para congelar en su lugar. Asegúrese de que la etiqueta escrita sea visible fuera del medio.
- Cuando se complete la congelación (el medio de congelación se vuelve blanco opaco), retire el bloque de tejido del molde, colóquelo sobre hielo seco y repita para cada tumor. Guarde los bloques de tejido a -80 °C durante varios meses antes del procedimiento de crioseccionación.
- Preparación de portaobjetos de muestras de tejidos
- Para maximizar la posibilidad de encontrar células positivas para la internalización y tener regiones tisulares más representativas, recolecte criosecciones en serie a -18 a -20 ° C usando un criostato.
- Prechill herramientas de criostato (cuchilla, hoja de afeitar, placa antivuelco, soporte de mandril de tejido, pincel) y equilibran los bloques de tejido tumoral colocándolos en una cámara de criostato a -18 a -20 ° C. Ajuste el ángulo del soporte de la cuchilla a 5-10 °. Recorte cuidadosamente el bloque de tejido, según sea necesario, con una cuchilla de afeitar y móntelo en el soporte del mandril utilizando un medio de congelación de tejido como "pegamento".
- Bloquee el soporte del mandril en la posición vertical de la unidad de microtomo, que avanza a la distancia establecida (por ejemplo, 10 μm) con cada giro de la manivela. Coloque la placa estabilizadora para que descanse justo por encima de la altura de la cuchilla. Para evitar que el tejido se enrosque antes de avanzar el microtomo, deslice cuidadosamente el pulgar sobre el borde inferior del bloque de tejido.
- A medida que el microtomo avanza y la sección de tejido cae sobre la placa de metal, use un pincel para guiar la sección de tejido y desenrolle el tejido, si es necesario.
- Coloque el portaobjetos del microscopio sobre la sección de tejido sin tocarlo para que la sección se sienta atraída por el portaobjetos.
NOTA: Las cuchillas de criostato (de alto perfil, desechables) son extremadamente afiladas y pueden causar lesiones graves. Tenga cuidado al manipular cuchillas y operar el criostato. Use un protector de cuchillas, si está disponible. Se requiere una capacitación adecuada. - Cortar el tumor en secciones de 10 μm de grosor. Transfiera inmediatamente las secciones cortadas a un portaobjetos de microscopio de vidrio cargado positivamente.
NOTA: Para las secciones en serie, primero recoja una sección de 10 μm de espesor en la esquina superior izquierda de cada una de las ocho diapositivas cargadas positivamente. Avance el criostato a través de los siguientes 100-200 μm de tejido y deseche el tejido. Transfiera inmediatamente todas las secciones cortadas a portaobjetos de microscopio de vidrio. - A continuación, recoja otra sección de 10 μm de espesor, junto a la sección de tejido colocada previamente, para cada una de las ocho diapositivas. Repita este proceso de recolección en serie hasta que cada una de las ocho diapositivas contenga ocho secciones de tejido, cada una separada por 100-200 μm. Mantenga las secciones de tejido en la oscuridad para preservar la fluorescencia.
NOTA: Las secciones de tejido en las diapositivas se pueden almacenar en una caja de diapositivas a -80 ° C durante varios meses.
- Para maximizar la posibilidad de encontrar células positivas para la internalización y tener regiones tisulares más representativas, recolecte criosecciones en serie a -18 a -20 ° C usando un criostato.
- Fijación de portaobjetos de tejido
- PASO CRÍTICO: Fijar las secciones de tejido en etanol al 95% a -18 a -20 °C durante 5 min.
- Lave la sección fija durante 5 minutos con PBS a temperatura ambiente y luego monte las secciones tumorales fijas debajo de una cubierta de vidrio utilizando 10 μL de un medio de montaje acuoso con DAPI.
- De doce a 24 h después del montaje, examine las secciones tumorales fijas mediante microscopía de fluorescencia y adquiera imágenes, como se describe para las células cultivadas anteriormente.
- Microscopía de fluorescencia y adquisición de imágenes
- Identifique las regiones de interés y adquiera imágenes, como se describe en la sección 2.6.
- Cuantificación y análisis de datos
- Cuantificar las células y aplicar los análisis estadísticos adecuados, como en la sección 2.7.
4. Internalización de ATP en tumores, in vivo
- Preparar cultivos celulares para la implantación como se describe en la sección 3.1.
- Inyección subcutánea de células cancerosas para el desarrollo de tumores de xenoinjerto
- Generar tumores xenoinjertados como se describe en la sección 3.2.
- Inyección de ATP y/o dextrano en tumores de xenoinjerto
- Preparar las soluciones de tratamiento de DMEM (vehículo) o 8 mg/ml HMWFD o LMWFD, con o sin NHF-ATP (100 μM) en DMEM, como se describió anteriormente.
- Use una jeringa de 1 ml para recolectar 50 μL de una solución de tratamiento e inyecte la solución directamente en cada tumor de xenoinjerto. Repita el procedimiento para cuatro réplicas biológicas de cada tratamiento.
- Recolección de tejidos y crioincrustación
- Prepare las etiquetas de identificación para cada tumor que se va a cosechar. Cortar un trozo de cinta de laboratorio de 2 cm y doblar por la mitad, los lados adhesivos juntos, a lo largo. Use un rotulador para etiquetar la etiqueta, por ejemplo, con un número de identificación de ratón/tumor.
- Aproximadamente 5 minutos después de la inyección, sacrificar al ratón por luxación cervical o de acuerdo con el protocolo aprobado por la IACUC.
- Usando un bisturí de tamaño 10, haga una incisión adyacente al tumor y aproximadamente perpendicular a la dirección de la inyección con aguja. Use fórceps y tijeras quirúrgicas para resecar el tejido tumoral del tejido circundante.
- Divida el tumor en dos a cuatro piezas de 1 cm2, dependiendo del tamaño total del tumor.
- Preparar los moldes de incrustación e incrustar el tejido, tal y como se describe anteriormente en la sección 3.6. Asegúrese de que el tiempo de cosecha, desde la inyección intratumoral de dextrano hasta la crioincrustación, no sea más de 7-8 min.
- Preparación de portaobjetos de muestras de tejidos
- Recoger las secciones de tumor en serie, como se describe en la sección 3.7.
- Fijación de portaobjetos de tejido
- Fijar el tejido, como se describe en la sección 3.8.
- Microscopía de fluorescencia y adquisición de imágenes
- Identifique las regiones de interés y adquiera imágenes, como se describe en la sección 2.6.
- Cuantificación y análisis de datos
- Cuantificar las células y aplicar los análisis estadísticos adecuados, tal como se describe en la sección 2.7.
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Representative Results
Estudio in vitro
La internalización intracelular de NHF-ATP se demostró mediante la co-localización de NHF-ATP con HMWFD o LMWFD (Figura 4). El éxito de este procedimiento se basa principalmente en el uso de concentraciones apropiadas de NHF-ATP y dextrans y en la determinación del tipo o tipos apropiados de dextrans (poli-lisina vs. neutro). Por ejemplo, para investigar la macropinocitosis, se eligió HMWFD ya que está internalizado solo por macropinosomas13,14,15,16. Alternativamente, si se estudian las endocitosis mediadas por clatrina y/o caveolas, entonces se debe seleccionar LMWFD porque los tamaños más pequeños de estos endosomas asociados a endocitosis solo les permiten engullir LMWFD14,15,16. Los dextrans fluorescentes también están disponibles en dos formas diferentes: poli-lisina dextrano y dextrano neutro. Estos dextrans generan diferente intensidad de fluorescencia y tinción de fondo; por lo tanto, sus aplicaciones recomendadas varían. Por ejemplo, el dextrano de polilisina produce una mayor intensidad de fluorescencia, pero también un fondo más alto. Los dextrans neutros generan suficiente intensidad de fluorescencia con una señal de fondo relativamente baja y son preferidos para experimentos con líneas celulares de cáncer. Utilizando este ensayo rentable, generamos un etiquetado fluorescente NHF-ATP de alta intensidad y alta señal a ruido, que coincidió con la intensidad de fluorescencia de dextrans sin confundir la fluorescencia de fondo.
Como la selección del agente de fijación y el procedimiento de fijación influyeron significativamente en el resultado del ensayo, las condiciones de fijación deben determinarse experimentalmente y seleccionarse para cada experimento específico (es decir, línea celular específica o tipo de tejido). El ATP extracelular no es necesario en el ensayo; de hecho, las altas concentraciones de eATP en la solución del ensayo pueden conducir a un aumento de los antecedentes. Es importante destacar que, después de la siembra celular, el marco de tiempo óptimo para la inanición sérica es de ~ 15-18 h. Si la inanición sérica es demasiado larga, la falta de nutrientes afectará la unión celular y conducirá a la pérdida de células en los siguientes pasos. Si la inanición sérica es demasiado corta, el ciclo celular no se detendrá adecuadamente y la tinción nuclear no será uniforme en todo el portaobjetos. Enjuagar el tejido unido a la cubierta en PBS caliente cinco veces es adecuado para eliminar las manchas de fondo. Es importante ser muy suave con los lavados de pañuelos desechables. Evite el enjuague excesivo, el enjuague en frío o el lavado forzado, ya que pueden dañar la morfología de las células.
Si bien se pueden usar líneas celulares de cáncer en este ensayo, diferentes líneas celulares pueden mostrar diferentes grados de internalización. Hemos demostrado que las líneas celulares de cáncer con mutaciones proto-oncogénicas KRAS son ventajosas para estudiar la internalización de NHF-ATP. Si bien las mutaciones KRAS no son necesarias para la internalización de eATP, las mutaciones KRAS se asocian con un aumento de la macropinocitosis in vitro13. Para estos experimentos, seleccionamos células de cáncer de pulmón A549, que albergan una mutación KRAS. De hecho, la macropinocitosis de eATP en células A549 se ha demostrado previamente utilizando un ensayo de internalización de ATP in vitro 13.
Estudio ex vivo
La Figura 5 muestra imágenes microscópicas de fluorescencia de la internalización de NHF-ATP en secciones de tejido tumoral. El éxito del estudio ex vivo depende en gran medida de la incubación adecuada de NHF-ATP con el tejido tumoral y el lavado exhaustivo posterior a la recolección de las secciones tumorales. Un tiempo de incubación más corto o más largo puede interrumpir la internalización. Determinar los tiempos de incubación, experimentalmente y por adelantado, para diferentes tumores. El enjuague inadecuado del tejido tumoral permite una alta tinción de fondo y, por lo tanto, una baja relación señal-ruido.
La selección del agente de fijación también es crítica. La fijación en metanol, formaldehído, acetona y etanol se puede probar individualmente y comparar para identificar el mejor agente de fijación para el sistema de estudio específico. Cabe destacar que las diapositivas montadas deben fotografiarse dentro de las 12-24 h, pero no más, para evitar que las moléculas fluorescentes internalizadas se liberen de las células y contribuyan a un alto fondo. Finalmente, para evitar el fenómeno del efecto de borde ,tinción intensa en los bordes de las secciones de tejido tumoral- es fundamental recolectar secciones de tejido uniformes antes de la incubación ex vivo.
Dada la heterogeneidad del tejido tumoral, es importante obtener secciones de tejido en todo el tumor. El método descrito de recolección de secciones tumorales seriadas, tomadas cada 100-200 μm de diferencia, garantiza que se puedan adquirir y analizar datos representativos de diferentes regiones del tumor. Por ejemplo, así como diferentes tipos de tumores pueden generar diferentes datos de internalización de ATP, las regiones intratumorales seleccionadas también pueden variar en la cinética y el mecanismo de internalización de ATP.
Estudio in vivo
La Figura 6 muestra la internalización de NHF-ATP en tumores inyectados (xenoinjertados). Un parámetro importante para un estudio in vivo exitoso y positivo fue la inyección de NHF-ATP y el tiempo entre la inyección y la eutanasia animal. Durante el procedimiento de inyección, coloque la aguja de inyección para que llegue a la mayor área del tumor como sea posible y mantenga la aguja intacta dentro del tumor durante 1 minuto para asegurarse de que el NHF-ATP permanezca dentro del tumor y no se filtre. El corto intervalo de tiempo entre la inyección y la eutanasia asegura que el NHF-ATP inyectado se transporte a las células tumorales, pero ese transporte no es demasiado largo, por lo que las células receptoras no metabolizarán y degradarán significativamente el NHF-ATP, lo que resulta en frotis intracelulares. Después de la eutanasia y la extirpación del tumor, documente el procedimiento de inyección para cada tumor, incluido el sitio de inyección y la dirección de la inyección. De esta manera, los tumores se pueden seccionar en orientaciones específicas y a lo largo de planos anatómicos específicos para que las secciones tumorales corran paralelas a la dirección de inyección, lo que lleva a la identificación de más células NHF-ATP-positivas.
Figura 4:Las células A549 internalizan NHF-ATP, que se co-localiza con HMWFD in vitro. Microscopía de fluorescencia de células A549 incubadas con 1 mg/mL HMWFD (panel izquierdo, rojo) y 10 μM NHF-ATP (panel medio, verde) durante 30 min. HMWFD y NHF-ATP co-localizan en macropinosomas (panel derecho, amarillo fusionado). Los recuadros muestran un alto aumento de las regiones en caja. Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: NHF-ATP = ATP fluorescente no hidrolizante; HMWFD = dextrano fluorescente de alto peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Las células A549 internalizan NHF-ATP junto con HMWFD ex vivo. Microscopía de fluorescencia de células tumorígenas A549 xenoinjertadas en ratones inmunodeficientes(Nu/J); La internalización de NHF-ATP se realizó ex vivo. Los tumores extirpados quirúrgicamente se incubaron(ex vivo)con 8 mg/ml de HMWFD (panel izquierdo, rojo) y 100 μM de NHF-ATP (panel medio, verde). La colocalización de HMWFD celular y NHF-ATP se muestra como una imagen combinada (panel derecho, amarillo). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: NHF-ATP = ATP fluorescente no hidrolizante; HMWFD = dextrano fluorescente de alto peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Las células A549 internalizan NHF-ATP junto con HMWFD in vivo. Microscopía de fluorescencia de células tumorígenas A549, xenoinjertadas en ratones inmunodeficientes(Nu/J); La internalización de NHF-ATP se realizó in vivo con 8 mg/ml de HMWFD y 100 μM de NHF-ATP inyectados directamente en tumores de ratones vivos. La colocalización de HMWFD celular y NHF-ATP se muestra como imágenes combinadas en A y B (paneles derechos, amarillo). Lasimágenes de alto aumento resaltan la internalización celular de NHF-ATP y HMWFD en tumores in vivo. Barras de escala = 20 μm. (B) Las imágenes de bajo aumento representan la internalización regional dentro de una sección de tejido tumoral. Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se desarrolló un método para el análisis espacial, temporal y cuantitativo de la internalización celular de ATP no hidrolizable. Este método es ampliamente aplicable para su uso en diversos sistemas biológicos, incluidos varios modelos tumorigénicos, para los cuales proporcionamos instrucción técnica y datos representativos. Para adquirir datos interpretables durante los estudios de internalización de ATP in vivo (sección 4 del protocolo), es fundamental limitar el tiempo experimental transcurrido desde la inyección intratumoral de dextrano hasta la crioincrustación. La fijación de portaobjetos de tejido-post-seccionamiento tumoral- es un paso necesario antes de la imagen microscópica de fluorescencia. Juntos, estos dos pasos críticos aseguran que las células tumorales retengan el ATP internalizado durante el proceso de obtención de imágenes. Otra consideración importante durante el análisis de la internalización de ATP es tener en cuenta la heterogeneidad de los tumores de xenoinjerto. Como la tumorigénesis procede de manera diferente entre los tipos de células cancerosas, puede ser necesario solucionar problemas de aspectos de este método para determinar las condiciones experimentales ideales para diferentes células cancerosas. Para garantizar una evaluación integral de la macropinocitosis de ATP en los tumores, es fundamental obtener imágenes de las secciones de tejido en todo el tumor, ya que puede haber una variación regional en términos de células residentes y su capacidad para internalizar eATP. De hecho, este método puede descubrir diferentes mecanismos de internalización de eATP entre células cancerosas / tumorales en estudios futuros.
Es importante tener en cuenta que el NHF-ATP solo puede reemplazar el ATP no conjugado o el ATP radiactivo para el estudio de internalización. No se puede utilizar para otros estudios, como estudios metabólicos, ya que el NHF-ATP se comportará y se metabolizará de manera diferente una vez que se libere de macropinosomas y / o endosomas dentro de las células. Tradicionalmente, la internalización del ATP se investigaba utilizando ATPradiactivo 17,18,19. Sin embargo, dada la inestabilidad de los ATP radiactivos, la radiactividad medible dentro de las células diana no es necesariamente ATP intacto. Debido a que el NHF-ATP no es hidrolizable y se puede visualizar microscópicamente, se recomienda su uso sobre el ATP radiactivo.
El procedimiento descrito en este documento es simple de realizar, rápido y rentable. Si un sistema de imágenes está equipado con capacidad de video en aplicaciones futuras, entonces el proceso dinámico de internalización de ATP se puede visualizar en tiempo real, revelando información sobre la cinética macropinocitótica y el tráfico de tejidos específicos. Este procedimiento se ha utilizado con éxito en otras líneas celulares de cáncer como las células H129912,células no cancerosas como las células NL-2012y células neuronales, sin modificaciones o modificaciones menores (datos no mostrados). Como el ATP está íntimamente involucrado en el efecto Warburg en el metabolismo del cáncer6,7,8,20,21,22,en la diabetes23,24,25y otras enfermedades que involucran el metabolismo energético, y como eATP puede desempeñar un papel importante en esas enfermedades, es probable que el procedimiento descrito tenga amplias aplicaciones.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Acknowledgments
La crioseccionación se realizó in situ en el Núcleo de Histopatología de la Universidad de Ohio. Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de puesta en marcha (Ohio University College of Arts & Sciences) a C Nielsen; Concesión de los NIH R15 CA242177-01 y concesión de RSAC a X Chen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A549 cells, human lung epithelial, carcinoma | National Cancer Institute | n/a | Less expensive source |
| Acetone | Fisher Scientific | S25904 | |
| Aluminum foil, Reynolds | Grainger | 6CHG6 | |
| Aqueous Mounting Medium, ProLong Gold Anti-fade Reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| ATP analog | Jena Biosciences | NK-101 | |
| Autoclave, sterilizer | Grainger | 33ZZ40 | |
| Blades, cryostat, high profile | C. L. Sturkey, Inc. | DT554550 | |
| Calipers, vernier | Grainger | 4KU77 | |
| Cell medium, Ham's Nutrient Mixture F12, serum-free | Millipore Sigma | 51651C-1000ML | |
| Centrifuge, refrigerated with swinging bucket rotor | Eppendorf | 5810R | |
| Chloroform | Acros Organics | 423555000 | |
| Conical tube, 15 mL | VWR | 21008-216 | |
| Conical tube, 50 mL | VWR | 21008-242 | |
| Coverslips, glass, 12 mm | Corning | 2975-245 | |
| Cryostat, Leica CM1950 | Leica Biosystems | CM1950 | |
| Delicate task wipe, Kim Wipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Dextran, Lysine fixable, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1818 | MW = 70,000, Tetramethylrhodamine |
| Dextran, Neutral, High Molecular Weight (HMW) | Invitrogen | D1819 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), serum-free | Fisher Scientific | 11885076 | |
| Dry ice | Local delivery | Custom order | |
| Epifluorescent imaging system, Nikon NiU and Nikon NIS Elements acquisition software | Nikon | Custom order | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 | |
| Forceps, Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Forceps, Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Gloves (small, medium, large) | Microflex | N191, N192, N193 | |
| Gloves, MAPA Temp-Ice 700 Thermal (for handling dry ice) | Fisher Scientific | 19-046-563 | |
| Hemocytometer | Daigger | EF16034F EA | |
| Incubator, cell culture | Eppendorf | Galaxy 170 S | |
| Labelling tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| Marking pen, Sharpie (ultra-fine) | Staples | 642736 | |
| Mice, immunodeficient (Nu/J) | Jackson Laboratory | 2019 | |
| Microcentrifuge, accuSpin Micro17 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Microcentrifgue tubes, Eppendorf tubes (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | |
| Microscope slide box | Fisher Scientific | 50-751-4983 | |
| Needle, 27 gauge | Becton-Dickinson | 752 0071 | |
| Paintbrush | Grainger | 39AL12 | |
| Paper towels | Staples | 33550 | |
| Paraformaldehyde | Acros Organics | 416785000 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Perforated spoon, 15 mm diameter, 135 mm length | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-6162 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP3991 | |
| Pipet tips (10 μL) | Fisher Scientific | 02-707-438 | |
| Pipet tips (200 μL) | Fisher Scientific | 02-707-411 | |
| Pipet tips (1000 μL) | Fisher Scientific | 02-707-403 | |
| Pipets, serological (10 mL) | VWR | 89130-910 | |
| Pippetor, Gilson P2 | Daigger | EF9930A | |
| Pipettor Starter Kit, Gilson (2-10 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL) | Daigger | EF9931A | |
| Platform shaker - orbital, benchtop | Cole-Parmer | EW-51710-23 | |
| Positively-charged microscope slides, Superfrost | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Scalpel, size 10, Surgical Design, Inc. | Fisher Scientific | 22-079-707 | |
| Scissors, surgical - sharp, curved | Fine Science Tools | 14005-12 | |
| Software for image analysis, Nikon Elements | Nikon | Custom order | |
| Software for image analysis, ImageJ (FIJI) | National Institutes of Health | n/a | Download online (free) |
| Specimen disc 30 mm (chuck holder), cryostat accessory | Leica Biosystems | 14047740044 | |
| Staining tray, 245 mm BioAssay Dish | Corning | 431111 | |
| Syringe, 1 cc | Becton-Dickinson | 309623 | |
| Tape, laboratory, 19 mm width | Fisher Scientific | 15-901-5R | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tissue culture dish, 100 x 15 mm diameter | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Tissue culture flask, 225 cm2 | ThermoFisher | 159933 | |
| Tissue culture plate, 24-well | Becton-Dickinson | 353226 | |
| Tissue embedding mold, stainless steel | Tissue Tek | 4161 | |
| Tissue Freezing Medium, Optimal Cutting Temperature (OCT) | Fisher Scientific | 4585 | |
| Trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), 0.25% | Gibco | 25200072 | |
| Water bath, Precision GP 2S | ThermoFisher | TSGP2S |
References
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