Summary
Mikroplatemateranalysen tilbyr en økonomisk, høy gjennomstrømningsmetode for kvantifisering av flytende matforbruk i Drosophila. En 3D-trykt enhet forbinder en 96-brønns mikroplate der fluer er plassert til en 1536-brønns mikroplate hvorfra fluer bruker en fôringsløsning med sporstoff. Nedgangen i løsningsvolumet måles spektrofotometrisk.
Abstract
Kvantifisering av matinntaket i Drosophila brukes til å studere de genetiske og fysiologiske understøttelsene av forbruksrelaterte egenskaper, deres miljøfaktorer og de toksikologiske og farmakologiske effektene av mange stoffer. Få metoder som for tiden implementeres, er egnet til måling av høy gjennomstrømning. Microplate Feeder Assay (MFA) ble utviklet for å kvantifisere forbruket av flytende mat til individuelle fluer ved hjelp av absorbans. I denne analysen bruker fluer flytende mat medium fra utvalgte brønner av en 1536-brønns mikroplate. Ved å inkorporere et fortynnet sporstoff i det flytende matmediet og laste inn et kjent volum i hver brønn, reflekterer absorbansmålinger av brønnen som er oppnådd før og etter forbruk den resulterende volumendringen (dvs. forbruk av volum). For å muliggjøre høy gjennomstrømningsanalyse med denne metoden, ble en 3D-trykt kobling designet som gjør at fluer kan sorteres individuelt i 96-brønns mikroplater. Denne enheten orienterer nøyaktig 96- og 1536-brønns mikroplater for å gi hver fluetilgang til opptil 4 brønner til konsum, og muliggjør dermed kvantifisering av matpreferanser i tillegg til vanlig forbruk. Videre har enheten barrierestrimler som veksler mellom åpne og lukkede posisjoner for å tillate kontrollert inneslutning og frigjøring av en kolonne med prøver om gangen. Denne metoden muliggjør høye gjennomstrømningsmålinger av forbruk av vandige løsninger av mange fluer samtidig. Det har også potensial til å bli tilpasset andre insekter og å screene forbruk av næringsstoffer, giftstoffer eller legemidler.
Introduction
Drosophila melanogaster har sett bred bruk som en genetisk modellorganisme for å studere de biologiske understøttelsene av matinntak og egenskaper forbundet med forbruk1. Det anslås at 65% av menneskelige sykdomsfremkallende gener har funksjonelle homologer i fluer, med en betydelig andel av dem som uttrykkes i funksjonelt tilsvarende vev mellom fluer og mennesker2. Videre gjør D. melanogasters størrelse, kort intergenerasjonell tid, enkelt vedlikehold og genetisk tractability det til en attraktiv modell for studier på forbruk av næringsstoffer3,4 og toksikologiske og farmakologiske effekter av en rekke stoffer, inkludert insektmidler5, miljøgifter6, legemidler7og legemidler av misbruk8,9,10.
I mange tilfeller krever studiet av slike egenskaper presis kvantifisering av forbruket. Metoder for kvantifisering av forbruk er varierte og inkluderer CApillary FEeder (CAFE) analyse11, MAnual FEeding (MAFE) analyse12, Proboscis Extension Response (PER) analyse13, tracer fargestoffutvinning14,15, oligonukleotid tracer ekstraksjon16, og radio-isotope ekstraksjon5,17. Nyere innsats har fokusert på å forbedre gjennomstrømningen av disse analysene, som i Expresso-analysen18 eller det platebaserte Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) -systemet19. Til tross for deres nytte, kan disse analysene være kompliserte, kostbare eller arbeidskrevende, noe som hindrer bruken i studier med høy gjennomstrømning.
Figur 1: Komponenter i mikroplatemateranalysen (A) 3D-gjengivelse av den monterte mikroplatemateranalysen. Mikroplaten på 1536 brønner er orientert av den 3D-trykte koplingen slik at hver brønn på den nedre mikroplaten på 96 brønner har tilgang til fire brønner i den øvre mikroplaten på 1536 brønner. Tilgangen til brønnene kan styres ved å justere posisjonen til barrierestrimler som går gjennom koplingen. (B) En grafisk fremstilling av hver brønn i mikroplatemateranalysen. Forbruksløsninger beholdes i hver brønn ved hjelp av en tetningsfilm som har blitt perforert for å gi tilgang med fluen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over prosedyrene i mikroplatemateranalysen. Figuren viser et flytskjema som tilsvarer trinn 4.1-5.8 i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å overvinne disse hindringene, microplate feeder assay (MFA; Figur 1) ble utviklet. I denne analysen er fluer plassert individuelt i 96-brønns mikroplater. Hver mikroplate er koblet til en 1536-brønns mikroplate ved hjelp av en tilpasset, 3D-trykt enhet. Enheten orienterer nøyaktig de to platene slik at hver fly i sin respektive brønn på 96-brønnsplaten har tilgang til 4 brønner av 1536-brønns mikroplaten. Ved å bruke en bunnløs 1536-brønnsplate og tetningsfilmer, dispenseres løsninger i utvalgte brønner og perforeres med presise nåler med diameter på 0,25 mm for å gi tilgang til fluene. Kritisk, slik at forbruk direkte fra en mikroplate gir umiddelbare absorbansbaserte målinger ved hjelp av en mikroplateleser. Et fortynnet tracerfargestoff er innlemmet i forbruksmediet, og endringen i absorbans etter eksponering brukes til å bestemme volumet som forbrukes (figur 2 og figur 3). Siden væsken i hver brønn tilnærmer seg en kolonne med væske, vil volumetriske forskjeller manifestere seg som forskjeller i kolonnens høyde. (Figur 3A) I henhold til Øl-Lambert lov20:
hvor A er absorbansen, ε er molarabsorpsjonskoeffisienten for den dempende analytten, l er den optiske banelengden, og c er konsentrasjonen av den dempende analytten. Således, med konstant molar absorpsjonskoeffisient og konsentrasjon, skyldes endringer i absorbans utelukkende endringer i den optiske lysbanen, det vil si væskenivået i en gitt brønn. Ved å måle absorbans før og etter eksponering reflekterer den proporsjonale endringen i absorbans den proporsjonale volumendringen (figur 3B).
Figur 3: Absorbansbasert kvantifisering av brønnvolum. (A) Hendelseslys av kjent inngangsintensitet (I0) krysser hver brønn. Demping av lys ved ulike fyllvolumer gir forskjellige utgangsintensiteter (I), som viser en lineær sammenheng mellom volum og absorbans. (B) Empirisk måling av absorbans kontra volum. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Basert på volumendringen kan mengden av enhver inntatt forbindelse beregnes ut fra den kjente konsentrasjonen i fôringsløsningen. Delene som trengs for analysen er lave i kostnader og har en høy grad av gjenbrukbarhet, noe som reduserer de tilbakevendende kostnadene for analysen betydelig. Dermed tilbyr denne prosedyren en rimelig, høy gjennomstrømningsmetode for nøyaktig kvantifisering av forbruk.
Protocol
1. Klargjøring av sultplate
- Vei ut 1,5 g agarose i et 250 ml glassbeger.
- Tilsett 100 ml destillert H2O til begeret.
- Mikrobølgeovn periodisk til agarose er fullt smeltet.
MERK: Vær oppmerksom på begeret siden agarose er tilbøyelig til å koke over. - Hell smeltet agarose i et reagens trough og dispenser 80 μL smeltet agarose i hver brønn av en 96-brønns mikroplate ved hjelp av en flerkanals pipette. La platene herdes mens de er dekket ved romtemperatur. Kjøl ned rester av agarose i opptil en uke i en forseglet pose og smelt den på nytt for å lage flere plater.
2. Fly sortering og sult
- Forbered koblinger ved å sette inn barrierestrimler i barrierestripekanalene. Hvis barrierestrimlene er for løse, spoler du dem rundt fingeren for å gi dem krumning for å holde dem i kanalene.
- Fest koplingen til en sulteplate. Ikke bruk koplingen til å manipulere platen, da koplingen kan skli av. Kontroller at koplingene er riktig orientert (dvs. sørg for at det vinklede hjørnet av koplingen samsvarer med det vinklede hjørnet av mikroplaten).
- Under CO2 anestesi (Tabell over materialer), sortere 3-5-dagers gamle fluer. Last individuelle fluer etter kolonne inn i sultplaten.
MERK: Selv om fluer lastes i kolonne, anbefales det å distribuere grupper med prøver nedover rader på platen i stedet for ned kolonner (se figur 4 for eksempel plateoppsett). - Lukk hver kolonne mens den fylles ved å justere barrierelisten til lukket posisjon.
Figur 4: Representativ stivelsesplateoppsett. Diagrammet viser organiseringen av fordampningskontroller og mannlige og kvinnelige fluer i en 96-brønnsplate som brukes i denne studien. Alternative konfigurasjoner, inkludert vekslende rader med menn og kvinner med fordampningskontroller i rad A og H, kan også brukes. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Registrer prøveoppsettet forsiktig i mikroplaten. Når sultplaten er fylt, la fluene komme seg spontant etter å ha fjernet CO2 og sulte dem i 6 timer fra sin første bedøvelsestid.
3. Flytende matlaging
MERK: Gjør flytende mat fersk hver dag.
- Forbered en 10 mg/ml fargestoffoppløsning av FD&C Blue #1 i destillert H2O.
MERK: Dette kan oppbevares ved romtemperatur i opptil 6 måneder. - Forbered 10 ml flytende mat (4% sukrose, 1% gjærekstrakt, 40 μg / ml FD &C Blå #1) i et 15 ml konisk rør ved å oppløse 0,4 g sukrose og 0,1 g gjærekstrakt i 10 ml destillert H2O. Vortex røret til faste stoffer er helt oppløst. Tilsett 40 μL fargestoffoppløsning og inverter røret gjentatte ganger for å homogenisere løsningen.
- Overfør den flytende maten til en 10 ml sprøyte tippet med et 0,45 μm filter. Filtrer ~1,5 ml av oppløsningen om gangen i et 1,7 ml mikrosenterrør. Sett til side sprøyten som inneholder oppløsningen, og filtrer tilleggsløsningen etter behov under tilberedning av materplaten.
4. Klargjøring av materplate
MERK: Håndter materplatene forsiktig etter påfylling for å forhindre dannelse av bobler eller dråper i brønnen som kan påvirke absorbansavlesningene.
- Forbered en materplate ved å forsegle bunnen av en 1536-brønns mikroplate med en tetningsfilm. Bruk en tetnings padle for å feste seg til filmen grundig. Trim overflødig film av venstre og høyre kant med et barberblad.
- Dispenser 10 μL av den filtrerte flytende maten kolonnevis (se figur 5 for illustrasjon) i de aktuelle brønnene på mikroplaten på 1536 brønner. Dispenser i brønnen øverst til venstre for hver klynge med fire brønner (se figur 5 for illustrasjon).
Figur 5: Fyll rekkefølge og brønnplassering for 1536-brønns materplaten. Diagrammet illustrerer trinn 4.2 i protokollen. Piler viser i hvilken rekkefølge fôringsløsningen blir introdusert i materplaten en kolonne om gangen fra kolonne 1 til og med 12. Prøve B1 er forstørret for å vise et eksempel på plasseringen av fôringsløsninger for 1-valg og 2-valg analyser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Når alle brønnene er fylt, påfør en tetningsfilm på toppen av platen. Bruk en tetnings padle for å feste seg til filmen grundig. Trim overflødig film av venstre og høyre kant med et barberblad. Gjenta for ønsket antall plater.
- Sentrifuger platene på 200 x g i 10 s for å avgjøre væsken. Ikke la platen avkjøles, da dette kan føre til at kondens bygger seg opp i brønnene, og skjuler absorbansavlesninger.
5. Eksponering
- Når fluene er klare for forbruksanalysen, perforerer brønnene på toppen av platen med nålesondeverktøyet utstyrt med en nål med en diameter på 0,25 mm. Bruk samme rekkefølge for å perforere som ble brukt ved utlevering av løsningene. Snu platen og perforer brønnene på bunnen. Tørk av kanylen mellom løsninger for å forhindre krysskontaminering. Vær forsiktig så du ikke berører perforeringene, da dette transporterer løsningen fra brønnene.
- Les platens absorbans ved 630 nm uten lokk.
- Sett et innvendig lokk på den øverste tetningsfilmen for å sikre at kondensringene omkranser de perforerte brønnene. Plasser det utvendige lokket på platen.
- Plasser materplaten med forsiden opp på koplingen slik at styrene justerer de riktige hullene på materplaten og sultplaten. Pass på at koplingen og platene er riktig orientert (dvs. sørg for at det vinklede hjørnet på koplingen og platene stemmer overens). Pakk elastiske bånd rundt topp- og bunnplatene for å holde koplingen sammen. Kontroller justeringen og hullene mellom materplaten og koplingen.
- Når alle materplatene er lastet på koplingene, åpner du brønnene for platene ved å justere barrierestrimlene på koplingen. Plasser koplingen/plateenhetene i den sekundære beholderen. Hver sekundære beholder har plass til opptil seks samlinger.
- Plasser den nedre halvdelen av en pipetteboks som inneholder gjennomvåte papirhåndklær, i hver sekundære beholder for å gi fuktighet. Lukk lokket på sekundærbeholderne og overfør dem til et kontrollert miljø (25 °C, kontrollert fuktighet, 12 timers lys:mørke sykluser). La fluene konsumere i 22 timer.
- Etter 22 timers eksponering, sjekk hver plate for døde fluer og oppdater plateoppsettet tilsvarende. Etter at alle platene er sjekket, bedøv fluene masse ved å pumpe CO2 inne i sekundærbeholderen. Etter ~ 60 s, sørg for at alle fluene er immobilisert. Tamp forsiktig fluene inn i sultplaten og erstatt plastbarrierestrimlene. Fjern materplatene for lesing.
- Les platens absorbans på nytt ved 630 nm. Gjenta til alle platene er lest.
6. Dataanalyse
MERK: Analyse kan utføres med undersøkerens foretrukne programvarepakke.
- Utelat eventuelle fluer som døde under 22 timers eksponering.
- For hver brønn beregner du volumet som forbrukes som:
C - Forbrukt volum (μL)
V - Innledende brønnvolum (dvs. 10 μL)
ABS0 - Absorbans før eksponering
ABS1 - Absorbans etter eksponering
MERK: Forbruket betegnes som et positivt volum i beregningen. - For å gjøre rede for fordampning, trekk gjennomsnittlig fordampningsvolum fra flyforbruksverdier i respektive plater. For tovalgs-/preferansetesting justerer du hver brønn etter den respektive løsningen, for eksempel.
- Når du har justert for fordampning, slipper du eventuelle prøver med en forbruksverdi som er mindre enn null.
- For 2-valgs testing, beregn preferansen for hver brønn, samt:
P - Preferanseindeks (positiv retning indikerer preferanse)
FA - Volum av flytende mat som forbrukes som inneholder tilsetningsstoff (valg 2)
FN - Volum av normal flytende mat forbrukt (valg 1)
7. Mikroplate og kopling vaskeprotokoll.
MERK: Pass på at du skader bunnen av mikroplatene, da skade kan påvirke tetningen.
- Fjern filmene og etikettene fra mikroplatene på 1536 brønner. Skill koplingene og barrierestrimlene. Plasser barrierestrimlene i en forseglet beholder, for eksempel en flaske. Vask barrierestrimlene ved å riste kraftig i en rekke varmt vann fra springen, mildt vaskemiddeloppløsning, varmt vann fra springen og deretter destillert H2O.
- Skyll 1536-brønns mikroplater og koblinger under varmt vann fra springen. For mikroplater, kjør vann fra springen gjennom brønnene på hver mikroplate for å fjerne så mye løsning og rusk som mulig. Om nødvendig, bruk en pipettespiss for å løsne rusk; Ikke bruk metall- eller glassredskaper på platene.
- Dekk hver plate og kobling med en mild vaskemiddelløsning (f.eks. 1% v / v Aquet). For platene, skrubb overflatene med en hansket hånd. For koplingene, bruk en børste.
- Skyll hver plate grundig med vann fra springen, og skyll deretter med destillert H2O. Påse at brønnene skylles spesielt ut under vannstrømmen.
- La platene og koplingene lufttørke dekket ved romtemperatur. Oppbevars i en ren oppbevaringsbeholder til bruk.
MERK: Håndter aldri de 1536-brønns mikroplatene uten hansker. Restoljer fra huden kan hindre tetting, noe som fører til brønnlekkasje og fordampning.
Representative Results
For å finne ut om det finnes noen sammenhenger mellom brønnene på enkeltplater, ble fordampning kvantifisert for hver brønn (n = 96 brønner/plate for tre plater). Fordampning ble funnet å være -0,036 μL ± 0,003 μL (gjennomsnittlig ± SEM gjennom). (Figur 6A) Pearsons korrelasjoner ble beregnet for å evaluere trender mellom fordampning og brønnsteder. Korrelasjonskoeffisienten (Figur 6B,C) for fordampning kontra rader var -0,04 (p = 0,4949) og for fordampning vs kolonner var -0,23 (p = 0,0001). Grupper ble deretter fordelt mellom kolonner for å redusere de milde, men statistisk signifikante korrelasjonene på tvers av kolonner.
Figur 6: Fordampning i MFA. (A) Tetthetsfordeling av fordampningsendringer med gjennomsnittlig ± SD angitt av den stiplede linjen. Korrelasjoner mellom fordampning og rader (B) eller kolonner (C) med Pearson-korrelasjonskoeffisienten og p-verdien som angitt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å fastslå protokollens gyldighet ble forbruket kvantifisert for 3-5-dagers gamle Canton-S B-fluer (n = 36/sex/plate og n = 24 fordampningskontroller/plate for tre plater) (Figur 7). Fordampning blant kontrollbrønnene var signifikant forskjellig fra null (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; en prøve t-test vs null). To prøver ble utelatt (begge mannlige) fra datasettet, den ene på grunn av død under eksponeringen over natten og den andre på grunn av negativ forbruksverdi etter justering for fordampning. Dette ga en > 99% prøve oppbevaringsgrad.
Figur 7: Forbrukskvartifisering ved hjelp av MFA. (A) Forbruket ble visualisert ved hjelp av et tilpasset fremstilt glasskammer. Fluer ble observert drikking fra perforerte brønner og utvist blå abdominal farging etter inntak av farget løsning. Se også Tilleggsvideo S.1. (B) Forbruksverdier (gjennomsnitt ± SEM) blant fordampningskontroller, hannfluer og hunnfluer. Parvis post hoc t-test med ulik varians ble utført for statistiske sammenligninger, med signifikans angitt av stolper. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Deretter ble en ANOVA-modell (Analysis of Variance) konstruert som beskrevet av Y = μ + S + P + SxP + e, med Y som gruppegjennomsnitt, μ som det samlede gjennomsnittet, S som den faste effekten av sex, P som den faste effekten av plate, SxP som samspillet mellom sex og plate, og e som restvariabilitet. ANOVA viste ingen signifikant plate-til-plate variasjon (p = 0,671) eller kjønnsspesifikke interaksjoner med plater (p = 0,104) for forbruk, mens sex alene bidro betydelig til den observerte variasjonen i forbruk (p = 4,17 x 10-18). En post hoc t-testviste at menn konsumerte betydelig mindre enn kvinner (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17, to utvalg t-test med ulik varians).
For å demonstrere at analysen kan brukes til tovalgs preferanse kvantifisering, ble fluer gitt et valg mellom en 4% sukroseløsning med 1% gjærekstrakt og en 4% sukroseløsning supplert med 15% etanol og 1% gjærekstrakt. Både menn og kvinner viste overveldende preferanse for løsningen med etanol og gjærekstrakt med preferanseindekser på 0,974 ± 0,026 for menn og 0,876 ± 0,06 for kvinner (gjennomsnittlig ± SEM) (Figur 8).
Figur 8: Preferanse kvantifisering ved hjelp av MFA. Forbruk av 4% sukrose versus 4% sukrose supplert med 15% etanol og gjærekstrakt for mannlige og kvinnelige fluer (n = 33 for hvert kjønn). Mannlige fluer forbrukes mer av etanoloppløsningen enn kontrollsukroseløsningen (0,511 μL ± 0,029 μL versus 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; to-prøve t-test). Kvinnelige fluer konsumerte også mer etanolløsning enn kontrollsukroseløsningen (0,939 μL ± 0,044 μL versus 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; to-prøve t-test). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende video S.1: Videoen viser en fluefôring fra den perforerte brønnen og akkumulerer blå abdominal farging mens du inntar den fargede løsningen. Et stillbilde vises i figur 7A. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Tilleggsfil S.2: Mikroplatemateranalysekobling. Dette er en 3D-utskrivbar konstruksjon av koplingen som brukes i MFA. Trykkmateriale Nylon PA12 ble brukt til MFA. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S.3: Mikroplatemater analysebarriere stripe. Denne inneholder utformingen av plastbarrierestrimlene som brukes til å veksle eksponering av fluer til materplaten. En enkelt kobler kan bruke opptil tolv barrierestrimler. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsinstruksjonene for file S.4: Utpakkings- og fabrikasjonsinstruksjoner for mikroplatemateranalysen. Instruksjoner er inkludert for utpakking av koplingen og barrierestrimlene. Fabrikasjonsinstruksjoner er inkludert for det indre lokket, det ytre lokket og sekundærbeholderen som brukes til å begrense fordampning under eksponering. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil S.5:Kostnadssammenligning av Microplate Feeder Assay (MFA) og en 1-valg enkeltfly CApillary FEeder (CAFE) analyse. Testing av 72 fluer/sex for en enkelt linje ville kreve to sett med MFA-utstyr (koblinger + plater + barrierestrimler), mens CAFE bare trenger 1 kapillær for hvert kulturhette hetteglass. Til tross for den store forskjellen i innledende investeringer for MFA, vil den store forskjellen i tilbakevendende kostnader (henholdsvis $ 14.80 vs $ 46.08) tillate at forhåndskostnadene gjenopprettes etter å ha testet bare 4 linjer (break-even point). Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Studien beskriver en ny protokoll for kvantifisering av forbruket i Drosophila: Microplate Feeder Assay (MFA). I denne analysen forbruker fluer fra forseglede brønner av en 1536-brønns mikroplate gjennom kontrollerte perforeringer (Figur 1, Figur 2; Tilleggsvideo S.1). Siden flytende mat farges og leveres via mikroplate, kan målinger av den optiske absorbansen av maten oppnås ved hjelp av et mikroplatespektrofotometer (figur 3). På denne måten bestemmes forbruket ved å sammenligne absorbansen før og etter forbruk, og deretter bruke denne andelen til det kjente volumet som ble dispensert før forbruk. Dette ble verifisert empirisk ved å måle absorbansen av forskjellige volumer av det fargede mediet (Figur 3B).
For å utvikle denne analysen var det nødvendig med en enhet som kunne utnytte den absorbansbaserte kvantifiseringen av forbruket. Testing av fluer i et mikroplateformat er tiltalende fordi det utfyller mikroplaten som brukes til å dispensere mat og gir fleksibilitet i å velge mellom flere plateformater (f.eks. 6-, 12-, 48- eller 96-brønnsformater) ved å justere koblingsgeometrien. Et 96-brønns mikroplateformat ble valgt for å tillate individuell fluekultur.
Den 3D-trykte enheten (figur 1) orienterer nøyaktig 1536-brønns materplaten med 96-brønns kulturplaten, noe som gir hver fluetilgang til opptil 4 brønner av materplaten til konsum. Videre, for å gi tilstrekkelig tid til å distribuere fluer inn i boligplaten og for å kontrollere analyseinitiering, inkluderer enheten toggling barrierestrimler som inneholder fluene i sine respektive brønner og forhindrer brudd. Filene som trengs for å anskaffe eller endre disse delene er gitt (Tilleggsfiler S.2-S.3), samt de nødvendige fabrikasjonsinstruksjonene for de aktuelle stykkene (Tilleggsfil S.4).
MFA gir en enkel høy gjennomstrømningsmetode som utfyller mer forseggjorte metoder for å overvåke Drosophila fôringsatferd18,21,22. MFA tilbyr flere fordeler i forhold til andre metoder som brukes til å kvantifisere matinntaket. Gjennomstrømningen økes ved å kvantifisere forbruket ved hjelp av en plateleser. Dette eliminerer manuelle målinger og hindrer manuell dataregistrering. Data er også egnet til programmatisk utvinning og behandling. I tillegg øker den høyere gjennomstrømningen det mulige antallet biologiske repliker, spesielt sammenlignet med felles materdesign, noe som øker kraften betydelig for å oppdage små forskjeller i forbruk. Ved hjelp av MFA kan en enkelt eksperimenter kvantifisere forbruket eller preferansen til over 500 fluer per nattkjøring av analysen. Ved overlappende serier av analysen kan over 2000 fluer testes i løpet av en 5-dagers periode. Til slutt er det langsiktige kostnadsbesparelser på grunn av gjenbrukbarheten av mikroplater og koblinger (Supplementary File S.5). Ved hjelp av MFA kan den estimerte kostnaden per analyse være så lav som $ 14.80, med en $ 127.60 forhåndskostnad for utstyret. Ved hjelp av den klassiske CApillary FEeder (CAFE)-analysen, som krever kostbare presisjonsmikrokapillærer, er den estimerte kostnaden per analyse for et sammenlignbart antall replikeringer $ 46,08. Selv om det er en forhåndsinvestering i å anskaffe nødvendig utstyr, kan reduksjonen i tilbakevendende kostnader føre til betydelige besparelser, spesielt i tilfeller der gjentatt testing utføres.
Som med alle analyser har MFA visse begrensninger. Hovedsakelig krever det tilgang til et mikroplatespektrofotometer som er i stand til å lese 1536-brønns mikroplater. I tillegg gjør avhengigheten av absorberingsmålinger for kvantifisering metoden utsatt for optisk interferens. Dette manifesterer seg som negative forbruksverdier for et lite delsett av prøver som er testet. Næringsstoffer, legemidler, legemidler eller giftstoffer av interesse må også være vannløselige for å være kompatible med analysen.
Til tross for begrensningene tilbyr denne metoden en høy gjennomstrømningsmetode for kvantifisering av forbruksatferd i Drosophila. Videre kan koblingsenheten enkelt endres for å akseptere mange plateformater, slik at den kan imøtekomme en rekke insektarter.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) til TFCM og RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L.
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
- Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480 (2020).
- Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
- Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
- Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
- Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834 (2019).
- Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87 (2015).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776 (2020).
- Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
