Summary
De microplate feeder assay biedt een economische, hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van vloeibare voedselconsumptie in Drosophila. Een 3D-geprint apparaat verbindt een 96-well microplaat waarin vliegen zijn gehuisvest met een 1536-well microplaat waaruit vliegen een voedingsoplossing met een tracerkleurstof consumeren. De volumedaling van de oplossing wordt spectrofotometrisch gemeten.
Abstract
Het kwantificeren van voedselinname in Drosophila wordt gebruikt om de genetische en fysiologische onderbouwing van consumptiegerelateerde eigenschappen, hun omgevingsfactoren en de toxicologische en farmacologische effecten van talrijke stoffen te bestuderen. Weinig methoden die momenteel worden geïmplementeerd, zijn vatbaar voor metingen met een hoge doorvoer. De Microplate Feeder Assay (MFA) is ontwikkeld voor het kwantificeren van de consumptie van vloeibaar voedsel voor individuele vliegen met behulp van absorptie. In deze test consumeren vliegen vloeibaar voedselmedium uit geselecteerde putten van een microplaat met 1536 putten. Door een verdunde tracerkleurstof in het vloeibare voedselmedium op te nemen en een bekend volume in elke put te laden, weerspiegelen absorptiemetingen van de put die voor en na consumptie zijn verkregen de resulterende volumeverandering (d.w.z. het verbruikte volume). Om met deze methode een analyse met hoge doorvoer mogelijk te maken, is een 3D-geprinte koppeling ontworpen waarmee vliegen individueel kunnen worden gesorteerd in microplaten met 96 putten. Dit apparaat oriënteert nauwkeurig 96- en 1536-well microplaten om elke vlieg toegang te geven tot maximaal 4 putten voor consumptie, waardoor kwantificering van voedselvoorkeuren naast regelmatige consumptie mogelijk is. Bovendien heeft het apparaat barrièrestrips die schakelen tussen open en gesloten posities om gecontroleerde insluiting en afgifte van een kolom monsters tegelijk mogelijk te maken. Deze methode maakt metingen met een hoge doorvoer van het verbruik van waterige oplossingen door vele vliegen tegelijkertijd mogelijk. Het heeft ook het potentieel om te worden aangepast aan andere insecten en om de consumptie van voedingsstoffen, toxines of geneesmiddelen te screenen.
Introduction
Drosophila melanogaster heeft op grote schaal gebruik gezien als een genetisch modelorganisme om de biologische onderbouwing van voedselinname en eigenschappen geassocieerd met consumptie te bestuderen1. Geschat wordt dat 65% van de menselijke ziekteverwekkende genen functionele homologen in vliegen hebben, waarvan een aanzienlijk deel wordt uitgedrukt in functioneel gelijkwaardige weefsels tussen vliegen en mensen2. Bovendien maken de grootte van D. melanogaster, de korte intergenerationele tijd, eenvoudig onderhoud en genetische tractie het een aantrekkelijk model voor studies over de consumptie van voedingsstoffen3,4 en toxicologische en farmacologische effecten van een verscheidenheid aan stoffen, waaronder insecticiden5, verontreinigendestoffen6,farmaceutische producten7en misbruikmiddelen8,9,10.
In veel gevallen vereist de studie van dergelijke eigenschappen een nauwkeurige kwantificering van de consumptie. Methoden voor het kwantificeren van consumptie zijn divers en omvatten de CApillary FEeder (CAFE) assay11, de MAnual FEeding (MAFE) assay12, Proboscis Extension Response (PER) assay13, tracer dye extraction14,15, oligonucleotide tracer extraction16, en radio-isotope extractie5,17. Recente inspanningen zijn gericht op het verbeteren van de doorvoer van deze assays, zoals in de Expresso assay18 of het plate-based Whole Animal Feeding FLat (WAFFL) systeem19. Ondanks hun nut kunnen deze testen ingewikkeld, duur of arbeidsintensief zijn, waardoor het gebruik ervan in studies met een hoge doorvoer wordt belemmerd.
Figuur 1: Componenten van de Microplate Feeder Assay. (A) 3D rendering van de geassembleerde microplate feeder assay. De 1536-well microplate is georiënteerd door de 3D-geprinte koppeling zodanig dat elke put van de onderste 96-well microplate toegang heeft tot vier putten van de bovenste 1536-well microplate. De toegang tot de putten kan worden geregeld door de positie van de barrièrestroken die door de koppeling zijn gegroefd aan te passen. (B) Een grafische weergave van elke put van de microplate feeder assay. Verbruiksoplossingen worden in elke put vastgehouden met behulp van een afdichtingsfolie die is geperforeerd om toegang door de vlieg mogelijk te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van de procedures in de Microplate Feeder Assay. De afbeelding toont een stroomdiagram dat overeenkomt met stap 4.1-5.8 van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om deze hindernissen te overwinnen, heeft de Microplate Feeder Assay (MFA; Figuur 1) werd ontwikkeld. In deze test worden vliegen individueel gehuisvest in microplaten met 96 putten. Elke microplaat is gekoppeld aan een 1536-well microplaat met behulp van een aangepast, 3D-geprint apparaat. Het apparaat oriënteert de twee platen nauwkeurig zodanig dat elke vlieg in zijn respectievelijke put van de 96-well plaat toegang heeft tot 4 putten van de 1536-well microplaat. Door gebruik te maken van een bodemloze plaat met 1536 putten en afdichtingsfolies worden oplossingen in geselecteerde putten gedoseerd en geperforeerd met naalden met een precieze diameter van 0,25 mm om toegang te bieden tot de vliegen. Het is van cruciaal belang dat het toestaan van verbruik rechtstreeks vanaf een microplaat onmiddellijke op absorptie gebaseerde metingen mogelijk maakt met behulp van een microplaatlezer. Een verdunde tracerkleurstof wordt in het consumptiemedium opgenomen en de verandering in absorptie na blootstelling wordt gebruikt om het verbruikte volume te bepalen(figuur 2 en figuur 3). Omdat de vloeistof in elke put een kolom vloeistof benadert, zullen volumetrische verschillen zich manifesteren als verschillen in de hoogte van de kolom. (Figuur 3A) Volgens de wet Beer-Lambert20:
waarbij A de absorptie is, ε de molaire absorptiecoëfficiënt voor de dempende analyt, l de optische padlengte en c de concentratie van de dempende analyt. Dus, met een constante molaire absorptiecoëfficiënt en concentratie, zijn veranderingen in absorptie uitsluitend te wijten aan veranderingen in het optische lichtpad, d.w.z. het vloeistofniveau binnen een bepaalde put. Door de absorptie voor en na blootstelling te meten, weerspiegelt de proportionele verandering in absorptie de proportionele verandering in volume(figuur 3B).
Figuur 3: Op absorptie gebaseerde kwantificering van het putvolume. (A) Invallend licht van bekende ingangsintensiteit (I0) doorkruist elke put. Demping van licht bij verschillende vulvolumes levert verschillende outputintensiteiten (I) op, die een lineaire relatie tussen volume en absorptie vertonen. (B) Empirische meting van absorptie versus volume. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Op basis van de volumeverandering kan de hoeveelheid van een ingenomen verbinding worden berekend op basis van de bekende concentratie in de voedingsoplossing. De onderdelen die nodig zijn voor de test zijn goedkoop en hebben een hoge mate van herbruikbaarheid, waardoor de terugkerende kosten van de test aanzienlijk worden verlaagd. Deze procedure biedt dus een betaalbare, hoge doorvoermethode om het verbruik nauwkeurig te kwantificeren.
Protocol
1. Voorbereiding van de verhongeringsplaat
- Weeg 1,5 g agarose af in een glazen bekerglas van 250 ml.
- Voeg 100 ml gedestilleerd H2O toe aan het bekerglas.
- Microgolf met tussenpozen totdat agarose volledig is gesmolten.
OPMERKING: Let op het bekerglas omdat de agarose gevoelig is voor overkoken. - Giet de gesmolten agarose in een reagenstrog en spuit 80 μL gesmolten agarose in elke put van een 96-well microplaat met behulp van een meerkanaalspipet. Laat platen uitharden terwijl ze bij kamertemperatuur worden afgedekt. Koel de overgebleven agarose tot een week in een afgesloten zak en smelt het opnieuw voor het maken van extra platen.
2. Vliegen sorteren en uithongeren
- Bereid koppelingen voor door barrièrestroken in de barrièrestrookkanalen te steken. Als barrièrestrips te los zijn, rol ze dan rond de vinger om ze kromming te geven om ze in de kanalen te houden.
- Bevestig de koppeling aan een verhongeringsplaat. Gebruik de koppeling niet om de plaat te manipuleren, omdat de koppeling eraf kan glijden. Zorg ervoor dat de koppelingen correct zijn georiënteerd (d.w.z. zorg ervoor dat de schuine hoek van de koppeling overeenkomt met de schuine hoek van de microplaat).
- Onder CO 2-anesthesie (Tabel van materialen), sorteer 3-5-dagen oude vliegen. Laad individuele vliegen per kolom in de hongerplaat.
OPMERKING: Hoewel vliegen per kolom worden geladen, wordt aanbevolen om groepen monsters over rijen van de plaat te verdelen in plaats van naar beneden kolommen (zie figuur 4 voor het voorbeeld van de plaatindeling). - Sluit elke kolom terwijl deze zich vult door de barrièrestrook aan te passen aan de gesloten positie.
Figuur 4: Representatieve indeling van de uithongeringsplaat. Het diagram toont de organisatie van verdampingscontroles en mannelijke en vrouwelijke vliegen in een 96-putplaat die in deze studie wordt gebruikt. Alternatieve configuraties, waaronder afwisselende rijen mannetjes en vrouwtjes met verdampingscontroles in rijen A en H, kunnen ook worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Noteer zorgvuldig de monsterlay-out in de microplaat. Zodra de hongerplaat is gevuld, laat u de vliegen spontaan herstellen na het verwijderen van de CO2 en verhonger ze gedurende 6 uur vanaf hun eerste verdovingstijd.
3. Vloeibare voedselbereiding
OPMERKING: Maak elke dag vloeibaar voedsel vers.
- Bereid een 10 mg / ml verfbouillonoplossing van FD & C Blue # 1 in gedestilleerde H2O.
OPMERKING: Dit kan maximaal 6 maanden bij kamertemperatuur worden bewaard. - Bereid 10 ml vloeibaar voedsel (4% sucrose, 1% gistextract, 40 μg / ml FD & C Blue # 1) in een conische buis van 15 ml door 0,4 g sucrose en 0,1 g gistextract op te lossen in 10 ml gedestilleerd H2O. Vortex de buis totdat de vaste stoffen volledig zijn opgelost. Voeg 40 μL verfvoorraadoplossing toe en keer de buis herhaaldelijk om om de oplossing te homogeniseren.
- Breng het vloeibare voedsel over in een spuit van 10 ml met een filter van 0,45 μm. Filter ~ 1,5 ml van de oplossing per keer in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Zet de spuit met de oplossing opzij en filtreer de extra oplossing indien nodig tijdens de bereiding van de aanvoerplaat.
4. Bereiding van de feederplaat
OPMERKING: Behandel de invoerplaten voorzichtig na het vullen om de vorming van bellen of druppels in de put te voorkomen die de absorptiemetingen kunnen beïnvloeden.
- Bereid een invoerplaat voor door de bodem van een microplaat met 1536 putten af te dichten met een afdichtfolie. Gebruik een afdichtingspeddel om de film grondig te hechten. Knip overtollige film van de linker- en rechterrand af met een scheermesje.
- Dispense 10 μL van het gefilterde vloeibare voedsel kolomgewijs (zie figuur 5 ter illustratie) in de juiste putten van de 1536-put microplaat. Steek in de linkerbovenhoek voor elk cluster van vier putten (zie figuur 5 ter illustratie).
Figuur 5: Vulvolgorde en putlocatie voor de 1536-put feederplaat. Het diagram illustreert stap 4.2 van het protocol. Pijlen geven de volgorde aan waarin de voedingsoplossing kolom voor kolom 1 in kolom 1 tot en met 12 in de invoerplaat wordt ingebracht. Monster B1 wordt uitvergroot om een voorbeeld te geven van de locatie van voedingsoplossingen voor 1-keuze en 2-keuze assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Zodra alle putten zijn gevuld, breng je een afdichtingsfolie aan op de bovenkant van de plaat. Gebruik een afdichtingspeddel om de film grondig te hechten. Knip overtollige film van de linker- en rechterrand af met een scheermesje. Herhaal dit voor het gewenste aantal platen.
- Centrifugeer de platen bij 200 x g gedurende 10 s om de vloeistof te laten bezinken. Laat de plaat niet koelen, omdat dit condensatie in de putten kan veroorzaken, waardoor absorptiemetingen worden verduisterd.
5. Blootstelling
- Zodra de vliegen klaar zijn voor de consumptietest, perforeert u de putten op het bovenoppervlak van de plaat met het naaldsondegereedschap uitgerust met een naald met een diameter van 0,25 mm. Gebruik dezelfde volgorde om te perforeren als werd gebruikt bij het doseren van de oplossingen. Draai de plaat om en perforeer de putjes aan de onderkant. Veeg de naald tussen de oplossingen af om kruisbesmetting te voorkomen. Pas op dat u de perforaties niet aanraakt, omdat dit de oplossing uit de putten afvoert.
- Lees de absorptie van de plaat bij 630 nm zonder deksel.
- Plaats een binnendeksel op de bovenste afdichtingsfolie om ervoor te zorgen dat de condensatieringen de geperforeerde putten omringen. Plaats het buitendeksel op de plaat.
- Plaats de invoerplaat met de voorkant naar boven op de koppeling, zodat de geleiders de juiste gaten van de invoerplaat en de uithongeringsplaat uitlijnen. Zorg ervoor dat de koppeling en platen correct zijn georiënteerd (d.w.z. zorg ervoor dat de schuine hoek van de koppeling en de platen overeenkomen). Wikkel elastiekjes rond de boven- en onderplaten om de koppeling bij elkaar te houden. Controleer op uitlijning en openingen tussen de invoerplaat en de koppeling.
- Zodra alle invoerplaten op de koppelingen zijn geladen, opent u de putten voor de platen door de barrièrestroken op de koppeling aan te passen. Plaats de koppeling/plaatassemblages in de secundaire container. Elke secundaire container biedt plaats aan maximaal zes assemblages.
- Plaats de onderste helft van een pipetdoos met geweekte papieren handdoeken in elke secundaire container om vocht te bieden. Sluit het deksel van de secundaire containers en breng ze over naar een gecontroleerde omgeving (25 °C, vochtigheid gecontroleerd, 12 uur licht:donker cycli). Laat de vliegen 22 uur consumeren.
- Controleer na de belichting van 22 uur elke plaat op dode vliegen en werk de lay-out van de plaat dienovereenkomstig bij. Nadat alle platen zijn gecontroleerd, verdooft u de vliegen massaal door CO2 in de secundaire container te pompen. Zorg er na ~ 60 s voor dat alle vliegen worden geïmmobiliseerd. Stamp de vliegen voorzichtig in de hongerplaat en vervang de plastic barrièrestrips. Verwijder de invoerplaten om af te lezen.
- Herlees de absorptie van de plaat bij 630 nm. Herhaal dit totdat alle platen zijn gelezen.
6. Data-analyse
OPMERKING: Analyse kan worden uitgevoerd met het voorkeurssoftwarepakket van de onderzoeker.
- Laat alle vliegen weg die stierven tijdens de 22 uur blootstelling.
- Bereken voor elke put het verbruikte volume als:
C - Verbruikt volume (μL)
V - Initieel putvolume (d.w.z. 10 μL)
ABS0 - Absorptie vóór blootstelling
ABS1 - Absorptie na blootstelling
OPMERKING: Verbruik wordt in de berekening aangeduid als een positief volume. - Om rekening te houden met verdamping, trekt u het gemiddelde verdampingsvolume af van de vliegverbruikswaarden binnen de respectieve platen. Voor 2-keuze/voorkeurstests past u elke put aan op de respectieve oplossing,bijv.past u "keuze 1" -putten aan met "keuze 1" in de verdampingsregelaars.
- Nadat u hebt gecorrigeerd voor verdamping, laat u alle monsters vallen met een verbruikswaarde van minder dan nul.
- Voor 2-keuze testen, bereken de voorkeur voor elke put als:
P - Voorkeursindex (positieve richting geeft voorkeur aan)
FA - Volume van vloeibaar voedsel geconsumeerd met additief (keuze 2)
FN - Volume van normaal vloeibaar voedsel geconsumeerd (keuze 1)
7. Microplaat en koppeling wasprotocol.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u schade aan de onderkant van de microplaten voorkomt, omdat schade de afdichting kan beïnvloeden.
- Verwijder de films en labels van de 1536-well microplaten. Scheid de koppelingen en barrièrestroken. Plaats de barrièrestrips in een afsluitbare container, zoals een fles. Was de barrièrestrips door krachtig te schudden in een reeks warm kraanwater, milde reinigingsoplossing, warm kraanwater en vervolgens gedestilleerd H2O.
- Spoel 1536-well microplaten en koppelingen af onder warm leidingwater. Voor microplaten, laat kraanwater door de putten van elke microplaat lopen om zoveel mogelijk oplossing en vuil te verwijderen. Gebruik indien nodig een pipetpunt om vuil los te maken; gebruik geen metalen of glazen gebruiksvoorwerpen op de borden.
- Bedek elke plaat en koppeling met een milde reinigingsoplossing (bijv. 1% v/v Aquet). Schrob voor de platen de oppervlakken met een gehandschoende hand. Gebruik voor de koppelingen een borstel.
- Spoel elke plaat grondig af met kraanwater en vervolgens met gedestilleerd H2O. Zorg ervoor dat de putten specifiek onder de waterstroom worden uitgespoeld.
- Laat de platen en koppelingen afgedekt bij kamertemperatuur aan de lucht drogen. Bewaren in een schone bewaarbak tot gebruik.
OPMERKING: Hanteer de 1536-well microplaten nooit zonder handschoenen. Resterende oliën uit de huid kunnen de afdichting belemmeren, wat leidt tot putlekkage en verdamping.
Representative Results
Om te bepalen of er correlaties bestaan tussen de putten van individuele platen, werd de verdamping gekwantificeerd voor elke put (n = 96 putten /plaat voor drie platen). De verdamping bleek -0,036 μL te zijn ± 0,003 μL (gemiddelde ± SEM). (Figuur 6A) Pearson-correlaties werden berekend om trends tussen verdamping en putlocaties te evalueren. De correlatiecoëfficiënt (Figuur 6B,C) voor verdamping versus rijen was -0,04 (p = 0,4949) en voor verdamping versus kolommen was -0,23 (p = 0,0001). Groepen werden vervolgens verdeeld over kolommen om de milde maar statistisch significante correlaties tussen kolommen te verminderen.
Figuur 6: Verdamping in de MFA. (A) Dichtheidsverdeling van verdampingsveranderingen met gemiddelde ± SD aangegeven door de stippellijn. Correlaties tussen verdamping en rijen (B) of kolommen (C) met de Pearson correlatiecoëfficiënt en p-waarde zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de geldigheid van het protocol vast te stellen, werd het verbruik gekwantificeerd voor 3-5 dagen oude Canton-S B-vliegen (n = 36/geslacht/plaat en n = 24 verdampingscontroles/plaat voor drie platen) (Figuur 7). De verdamping tussen de controleputten verschilde significant van nul (-0,030 μL ± 0,006 μL, p = 4,81 x 10-6; één monster t-test vs nul). Twee monsters werden weggelaten (beide mannelijk) uit de dataset, één als gevolg van overlijden tijdens de nachtelijke blootstelling en de andere als gevolg van negatieve consumptiewaarde na correctie voor verdamping. Dit leverde een > 99% sample retentie op.
Figuur 7: Kwantificering van het verbruik met behulp van de MFA. (A) Het verbruik werd gevisualiseerd met behulp van een op maat gemaakte glazen kamer. Vliegen werden waargenomen drinken uit geperforeerde putten en vertoonden blauwe abdominale kleuring na inname van de geverfde oplossing. Zie ook aanvullende video S.1. (B) Verbruikswaarden (gemiddelde ± SEM) bij verdampingscontroles, mannelijke vliegen en vrouwelijke vliegen. Paarsgewijze post hoc t-testmet ongelijke variantie werd uitgevoerd voor statistische vergelijkingen, waarbij de significantie werd aangegeven door staven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Vervolgens werd een Analysis of Variance (ANOVA) model geconstrueerd zoals beschreven door Y = μ + S + P + SxP + e, met Y als het groepsgemiddelde, μ als het totale gemiddelde, S als het vaste effect van geslacht, P als het vaste effect van plaat, SxP als de interactie tussen geslacht en plaat, en e als de residuele variabiliteit. ANOVA vertoonde geen significante plaat-tot-plaat variabiliteit (p = 0,671) of geslachtsspecifieke interacties met platen (p = 0,104) voor consumptie, terwijl geslacht alleen significant bijdroeg aan de waargenomen variatie in consumptie (p = 4,17 x 10-18). Een post hoc t-testtoonde aan dat mannetjes significant minder consumeerden dan vrouwen (0,500 μL ± 0,017 μL vs 0,811 μL ± 0,028 μL, p = 1,13 x 10-17, twee monster t-test met ongelijke variantie).
Om aan te tonen dat de test kan worden gebruikt voor tweekeuzevoorkeurkwantificering, kregen vliegen de keuze tussen een 4% sucrose-oplossing met 1% gistextract en een 4% sucrose-oplossing aangevuld met 15% ethanol en 1% gistextract. Zowel mannen als vrouwen vertoonden een overweldigende voorkeur voor de oplossing met ethanol en gistextract met voorkeursindices van 0,974 ± 0,026 voor mannen en 0,876 ± 0,06 voor vrouwen (gemiddelde ± SEM) (figuur 8).
Figuur 8: Voorkeurskwantificering met behulp van de MFA. Consumptie van 4% sucrose versus 4% sucrose aangevuld met 15% ethanol en gistextract voor mannelijke en vrouwelijke vliegen (n = 33 voor elk geslacht). Mannelijke vliegen consumeerden meer van de ethanoloplossing dan de controle sucrose-oplossing (0,511 μL ± 0,029 μL versus 0,00 μL ± 0,017 μL; p = 4,06e-10; twee-monster t-test). Vrouwelijke vliegen consumeerden ook meer ethanoloplossing dan de controle sucrose-oplossing (0,939 μL ± 0,044 μL versus 0,132 μL ± 0,044 μL; p = 7,38e-17; twee-monster t-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende video S.1: De video toont een vlieg die uit de geperforeerde put voedt en blauwe buikvlekken ophoopt tijdens het innemen van de geverfde oplossing. Een stilstaand beeld is weergegeven in figuur 7A. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand S.2: Microplate Feeder Assay Koppeling. Dit is een 3D-printbare constructie van de koppeling die in de MFA wordt gebruikt. Voor de MFA werd drukmateriaal Nylon PA12 gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand S.3: Microplate Feeder Assay Barrier Strip. Dit bevat het ontwerp van de plastic barrièrestrips die worden gebruikt om de blootstelling van vliegen aan de feederplaat te schakelen. Een enkele koppeling kan tot twaalf barrièrestrips gebruiken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand S.4: Uitpak- en fabricage-instructies voor de Microplate Feeder Assay. Instructies zijn inbegrepen voor het uitpakken van de koppeling en de barrièrestrips. Fabricage-instructies zijn inbegrepen voor het binnendeksel, het buitendeksel en de secundaire container die worden gebruikt om verdamping tijdens blootstelling te beperken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand S.5:Kostenvergelijking van de Microplate Feeder Assay (MFA) en een 1-choice single fly CApillary FEeder (CAFE) assay. Het testen van 72 vliegen / seks voor een enkele lijn zou twee sets MFA-apparatuur vereisen (koppelingen + platen + barrièrestrips), terwijl de CAFE slechts 1 capillair nodig zou hebben voor elke kweekflacon. Ondanks het grote verschil in initiële investering voor de MFA, zou het grote verschil in terugkerende kosten (respectievelijk $ 14,80 versus $ 46,08) het mogelijk maken om de initiële kosten terug te verdienen na het testen van slechts 4 regels (break-even punt). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De studie beschrijft een nieuw protocol voor het kwantificeren van de consumptie in Drosophila:de Microplate Feeder Assay (MFA). In deze test consumeren vliegen uit afgesloten putten van een microplaat met 1536 putten door perforaties van gecontroleerde grootte(figuur 1, figuur 2; Aanvullende video S.1). Aangezien vloeibaar voedsel wordt geverfd en via microplaat wordt geleverd, kunnen metingen van de optische absorptie van het voedsel worden verkregen met behulp van een microplaatspectrofotometer(figuur 3). Op deze manier wordt het verbruik bepaald door de absorptie voor en na consumptie te vergelijken en deze verhouding vervolgens toe te passen op het bekende volume dat vóór het verbruik is gestaan. Dit werd empirisch geverifieerd door de absorptie van verschillende volumes van het geverfde medium te meten (figuur 3B).
Om deze test te ontwikkelen, was een apparaat nodig dat gebruik kon maken van de op absorptie gebaseerde kwantificering van het verbruik. Het testen van vliegen in een microplaatformaat is aantrekkelijk omdat het een aanvulling vormt op de microplaat die wordt gebruikt om voedsel af te geven en flexibiliteit biedt bij het selecteren uit meerdere plaatformaten (bijv. 6-, 12-, 48- of 96-well-formaten) door de koppelingsgeometrie aan te passen. Er werd gekozen voor een 96-well microplate formaat om individuele vliegkweek mogelijk te maken.
Het 3D-geprinte apparaat (figuur 1) oriënteert de 1536-well feederplaat nauwkeurig met de 96-well kweekplaat, waardoor elke vlieg toegang heeft tot maximaal 4 putten van de feederplaat voor consumptie. Om voldoende tijd te bieden voor het verdelen van vliegen in de behuizingsplaat en om het initiëren van de test te controleren, omvat het apparaat bovendien het schakelen van barrièrestrips met de vliegen in hun respectieve putten en het voorkomen van inbreuken. De bestanden die nodig zijn om deze onderdelen aan te schaffen of te wijzigen worden verstrekt(Aanvullende bestanden S.2-S.3),evenals de nodige fabricage-instructies voor de relevante stukken(Aanvullend bestand S.4).
De MFA biedt een eenvoudige high throughput-methode die een aanvulling vormt op meer uitgebreide methoden om het voedingsgedrag van Drosophila te controleren18,21,22. De MFA biedt meerdere voordelen ten opzichte van andere methoden die worden gebruikt om de voedselinname te kwantificeren. De doorvoer wordt verhoogd door het verbruik te kwantificeren met behulp van een plaatlezer. Dit elimineert handmatige metingen en voorkomt handmatige gegevensinvoer. Gegevens zijn ook vatbaar voor programmatische extractie en verwerking. Bovendien verhoogt de hogere doorvoer het haalbare aantal biologische replicaties, vooral in vergelijking met gemeenschappelijke feederontwerpen, waardoor het vermogen om kleine verschillen in verbruik te detecteren aanzienlijk toeneemt. Met behulp van de MFA kan een enkele experimentator het verbruik of de voorkeur van meer dan 500 vliegen per nachtelijke run van de test kwantificeren. Door overlappende runs van de test kunnen meer dan 2.000 vliegen worden getest in een periode van 5 dagen. Ten slotte zijn er kostenbesparingen op lange termijn als gevolg van de herbruikbaarheid van microplaten en koppelingen(Supplementary File S.5). Met behulp van de MFA kunnen de geschatte kosten per test zo laag zijn als $ 14,80, met een kosten van $ 127,60 vooraf voor de apparatuur. Met behulp van de klassieke CApillary FEeder (CAFE) -test, die kostbare precisiemicrocapillairen vereist, zijn de geschatte kosten per test voor een vergelijkbaar aantal replicaties $ 46,08. Hoewel er dus vooraf wordt geïnvesteerd in de aanschaf van de benodigde apparatuur, kan de vermindering van terugkerende kosten leiden tot aanzienlijke besparingen, met name in gevallen waarin herhaalde tests worden uitgevoerd.
Zoals met alle assays, heeft de MFA bepaalde beperkingen. Het vereist voornamelijk toegang tot een microplaatspectrofotometer die in staat is om 1536-well microplaten te lezen. Bovendien maakt de afhankelijkheid van absorptiemetingen voor kwantificering de methode gevoelig voor optische interferentie. Dit manifesteert zich als negatieve verbruikswaarden voor een kleine subset van geteste monsters. Voedingsstoffen, geneesmiddelen, farmaceutische producten of toxines van belang moeten ook in water oplosbaar zijn om compatibel te zijn met de test.
Ondanks zijn beperkingen biedt deze methode een hoge doorvoermethode voor het kwantificeren van consumptiegedrag in Drosophila. Bovendien kan het koppelingsapparaat eenvoudig worden aangepast om veel plaatformaten te accepteren, waardoor het geschikt is voor een verscheidenheid aan insectensoorten.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute on Drug Abuse (U01 DA041613) aan TFCM en RRHA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm Diameter Needles | Rave Scientific | RS-MN-52-001012 | |
| 0.45 µm Syringe Filters | Olympus Plastics | 25-245 | |
| 10 mL Disposable Syringe | EXELINT | 26200 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Barrier Strips (Laser Cut) | Ponoko | - | Material: clear PETG, 0.5mm thickness; Supplementary File: |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Centrifuge Rotor A-4-62 with micro-titer plate buckets | Eppendorf | 22638041 | |
| FD&C Blue #1 | Spectrum Chemical Mfg Corp | FD110 | |
| Film Sealing Paddle | Fisher Scientific | 50-563-280 | |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | #59-114 and #59-119 | CO2 Anesthesia: The Flypads come in two sizes, either of which is appropriate |
| Microplate Coupler (3D Printed) | Shapeways | - | Material: Multi Jet Fusion nylon (MJF PA12); Supplementary File: |
| Microplate Lids | Greiner Bio-One | 656170 | |
| Molecular Devices SpectraMax iD5 | Molecular Devices | - | Any microplate reader with 1536-well resolution will do. |
| Needle Probe Holder | Rave Scientific | RS-MN-52-001000 | |
| Polyester Sealing Film | Excel Scientific, Inc. | 100-SEAL-PLT | |
| Polystyrene 96-well microplates | Greiner Bio-One | 655101 | |
| Polystyrene, Bottomless, 1536-well microplates | Greiner Bio-One | 783000 | Made to Order; allow for adequate lead time when purchasing. |
| Rubber Bands | |||
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Weather Stripping | 1/2" x 1/8" High Density Self Adhesive Neoprene Rubber | ||
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 |
References
- Wong, R., Piper, M. D. W., Wertheim, B., Partridge, L.
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
- Spitaler, U., et al. Yeast species affects feeding and fitness of Drosophila suzukii adults. Journal of Pest Science. 93 (4), 1295-1309 (2020).
- Wang, Q. P., et al. PGC1α controls sucrose taste sensitization in Drosophila. Cell Reports. 31 (1), 107480 (2020).
- Valtierra-de-Luis, D., et al. Quantification of dose-mortality responses in adult Diptera: Validation using Ceratitis capitata and Drosophila suzukii responses to spinosad. PLoS ONE. 14 (2), 1-11 (2019).
- Williams, M. J., et al. Exposure to bisphenol A affects lipid metabolism in Drosophila melanogaster. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 114 (5), 414-420 (2014).
- Jajoo, A., Donlon, C., Shnayder, S., Levin, M., McVey, M. Sertraline induces DNA damage and cellular toxicity in Drosophila that can be ameliorated by antioxidants. Scientific Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Fochler, S., et al. Genetics of alcohol consumption in Drosophila melanogaster. Genes, Brain and Behavior. 16 (7), 675-685 (2017).
- Highfill, C. A., Baker, B. M., Stevens, S. D., Anholt, R. R. H., Mackay, T. F. C. Genetics of cocaine and methamphetamine consumption and preference in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 15 (5), 1007834 (2019).
- Keebaugh, E. S., Park, J. H., Su, C., Yamada, R., Ja, W. W. Nutrition Influences caffeine-mediated sleep loss in Drosophila. Sleep. 40 (11), (2017).
- Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (20), 8253-8256 (2007).
- Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Molecular Brain. 8 (1), 87 (2015).
- Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (3), e193 (2007).
- Shell, B. C., et al. Measurement of solid food intake in Drosophila via consumption-excretion of a dye tracer. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Wu, Q., et al. Excreta quantification (EX-Q) for longitudinal measurements of food intake in Drosophila. iScience. 23 (1), 100776 (2020).
- Park, A., Tran, T., Atkinson, N. S. Monitoring food preference in Drosophila by oligonucleotide tagging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 9020-9025 (2018).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: Comparative analysis of current methodology. Nature Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste circuit that regulates ingestion by integrating food and hunger signals. Cell. 165 (3), 715-729 (2016).
- Jaime, M. D. L. A., et al. The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults. bioRxiv. , (2018).
- IUPAC. Compendium of Chemical Terminology (The "Gold Book"). , Blackwell Scientific Publications. Research Triangle Park, NC. (1997).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nature Communications. 5, 4560 (2014).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PLoS One. 9 (6), 101107 (2014).
