Summary
نبلغ عن طريقة لإعادة البناء الميزوسكوبي لقلب الفأر بالكامل من خلال الجمع بين التطورات الجديدة في تحويل الأنسجة وتلطيخها مع تطوير مجهر ورقة ضوئية ممسوحة محوريا.
Abstract
يمكن أن تسبب كل من أمراض القلب الوراثية وغير الوراثية عمليات إعادة تشكيل شديدة في القلب. يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي ، مثل ترسب الكولاجين (التليف) والاختلال الخلوي ، على التوصيل الكهربائي ، وإدخال اختلالات كهروميكانيكية ، وفي النهاية تؤدي إلى عدم انتظام ضربات القلب. تستند النماذج التنبؤية الحالية لهذه التعديلات الوظيفية إلى معلومات هيكلية غير متكاملة ومنخفضة الدقة. يعد وضع هذا الإطار على ترتيب مختلف من حيث الحجم أمرا صعبا بسبب عدم فعالية طرق التصوير القياسية في إجراء تصوير عالي الدقة في الأنسجة الضخمة. في هذا العمل ، نصف إطارا منهجيا يسمح بتصوير قلوب الفئران بأكملها بدقة ميكرومترية. وقد تطلب تحقيق هذا الهدف جهدا تقنيا حيث تم الجمع بين التقدم في تحويل الأنسجة وطرق التصوير. أولا ، نصف بروتوكول CLARITY المحسن القادر على تحويل القلب السليم إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خالي من الدهون يسمح بشفافية عالية وتلطيخ عميق. بعد ذلك ، يتم وصف مجهر ورقة ضوئية مضان قادر على الحصول بسرعة على صور لمجال رؤية ميزوسكوبي (مقياس مم) بدقة مقياس ميكرون. بعد مشروع mesoSPIM ، يسمح المجهر المصمم بإعادة بناء قلب الفأر بالكامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد. نعتقد أن هذا الإطار المنهجي سيسمح بتوضيح تورط فوضى العمارة الخلوية في الاختلالات الكهربائية ويمهد الطريق لنموذج شامل يأخذ في الاعتبار كل من البيانات الوظيفية والهيكلية ، مما يتيح تحقيقا موحدا للأسباب الهيكلية التي تؤدي إلى تغييرات كهربائية وميكانيكية بعد إعادة تشكيل الأنسجة.
Introduction
يمكن أن تؤثر إعادة البناء الهيكلي المرتبطة بأمراض القلب على التوصيل الكهربائي وإدخال اختلالات كهروميكانيكية للجهاز 1,2. عادة ما تستخدم الأساليب الحالية المستخدمة للتنبؤ بالتغيرات الوظيفية التصوير بالرنين المغناطيسي و DT-MRI للحصول على إعادة بناء شاملة لترسب التليف وشجرة الأوعية الدموية وتوزيع الألياف للقلب ، ويتم استخدامها لنمذجة مسارات انتشار إمكانات العمل التفضيلي (APP) عبر العضو 3,4. يمكن أن توفر هذه الاستراتيجيات نظرة عامة جميلة على تنظيم القلب. ومع ذلك ، فإن دقتها المكانية غير كافية للتحقيق في تأثير إعادة البناء الهيكلي على وظيفة القلب على المستوى الخلوي.
إن وضع هذا الإطار في ترتيب مختلف من حيث الحجم ، حيث يمكن للخلايا المفردة أن تلعب أدوارا فردية في انتشار جهد الفعل ، يمثل تحديا. القيد الرئيسي هو عدم كفاءة طرق التصوير القياسية لأداء تصوير عالي الدقة (دقة ميكرومترية) في الأنسجة الضخمة (بحجم السنتيمتر). في الواقع ، تصوير الأنسجة البيولوجية في 3D بدقة عالية أمر معقد للغاية بسبب عتامة الأنسجة. الطريقة الأكثر شيوعا لإجراء إعادة بناء 3D في الأعضاء بأكملها هي إعداد أقسام رقيقة. ومع ذلك ، فإن التقسيم الدقيق والتجميع والتصوير يتطلب جهدا ووقتا كبيرين. النهج البديل الذي لا يتطلب قطع العينة هو توليد نسيج شفاف. خلال السنوات الأخيرة ، تم اقتراح عدة منهجيات لتوضيح الأنسجة5،6،7،8. تم تحقيق التحدي المتمثل في إنتاج أنسجة ضخمة وشفافة وموسومة بالفلورسنت مؤخرا من خلال تطوير مناهج تحويل الأنسجة الحقيقية (CLARITY9 ، SHIELD10). على وجه الخصوص ، تعتمد طريقة CLARITY على تحويل الأنسجة السليمة إلى شكل نانوي مسامي ، مهجن هيدروجيل ، خال من الدهون يمكن من منح شفافية عالية عن طريق الإزالة الانتقائية لطبقات الدهون الغشائية المزدوجة. والجدير بالذكر أن هذه الطريقة قد وجدت ناجحة أيضا في إعداد القلب11،12،13،14. ومع ذلك ، نظرا لأن القلب هش للغاية بحيث لا يكون مناسبا للمقاصة النشطة ، فيجب تطهيره باستخدام النهج السلبي ، والذي يتطلب وقتا طويلا لمنح الشفافية الكاملة.
بالاقتران مع تقنيات التصوير المتقدمة مثل الفحص المجهري للصفائح الضوئية ، فإن CLARITY لديه القدرة على تصوير أنسجة القلب الضخمة 3D بدقة ميكرومترية. في الفحص المجهري للورقة الضوئية ، يتم إجراء إضاءة العينة باستخدام ورقة رقيقة من الضوء محصورة في المستوى البؤري لهدف الكشف. يتم جمع انبعاث التألق على طول محور عمودي على مستوى الإضاءة15. تشبه بنية الكشف الفحص المجهري واسع المجال ، مما يجعل الاستحواذ أسرع بكثير من مجاهر المسح بالليزر. يسمح نقل العينة عبر ورقة الضوء بالحصول على تصوير مقطعي كامل للعينات الكبيرة ، حتى عينات بحجم سنتيمتر. ومع ذلك ، نظرا للخصائص الجوهرية لحزمة Gaussian ، من الممكن الحصول على ورقة ضوئية رقيقة جدا (بترتيب بضعة ميكرونات) فقط لامتداد مكاني محدود ، مما يحد بشكل كبير من مجال الرؤية (FoV). في الآونة الأخيرة ، تم تقديم مخطط إثارة جديد للتغلب على هذا القيد وتطبيقه على تصوير الدماغ ، مما يسمح بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد بدقة16.
في هذه الورقة ، يتم تقديم نهج المقاصة السلبية ، مما يتيح تقليل كبير في توقيت المقاصة الذي يحتاجه بروتوكول CLARITY. يسمح الإطار المنهجي الموصوف هنا بإعادة بناء قلب فأر كامل بدقة ميكرومترية في مسح مقطعي واحد مع وقت اكتساب في حدود الدقائق.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع إجراءات وإجراءات التعامل مع الحيوانات وفقا للإرشادات الواردة في التوجيه 2010/63 / EU الصادر عن البرلمان الأوروبي بشأن حماية الحيوانات المستخدمة للأغراض العلمية وتتوافق مع مبادئ وأنظمة وزارة الصحة الإيطالية. تمت الموافقة على البروتوكول التجريبي من قبل وزارة الصحة الإيطالية (البروتوكول رقم 647/2015-PR). تم توفير جميع الحيوانات من قبل ENVIGO ، إيطاليا. لهذه التجارب ، تم استخدام 5 ذكور من الفئران C57BL / 6J من عمر 6 أشهر.
1. إعداد الحل
- تحضير 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.6) في غطاء كيميائي. قم بتخزين حصص 4٪ PFA في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
- تحضير محلول هيدروجيل: مزيج 4٪ أكريلاميد ، 0.05٪ مكرر أكريلاميد ، 0.25٪ بادئ AV-044 في 0.01 M PBS في غطاء كيميائي. الحفاظ على الكواشف والمحلول على الجليد أثناء التحضير بأكمله. قم بتخزين حصص الهيدروجيل في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
- تحضير محلول المقاصة: امزج 200 مللي متر من حمض البوريك ، 4٪ صوديوم دوديسيل سلفات (SDS) في ماء منزوع الأيونات ؛ درجة الحموضة 8.6 في غطاء كيميائي. قم بتخزين المحلول بين 21-37 درجة مئوية لتجنب هطول SDS.
- تحضير محلول Tyrode طازج في يوم التجربة: أضف 10 mM Glucose و 10 mM HEPES و 113 mM NaCl و 1.2 mM MgCl2 و 4.7 mM KCl ؛ معايرة إلى الرقم الهيدروجيني 7.4 باستخدام 1 M NaOH.
2. عزل القلب
- حقن 0.1 مل من 500 وحدة دولية من الهيبارين تحت الجلد قبل 30 دقيقة من إجراء عزل القلب.
- املأ حقنة سعة 30 مل وثلاثة أطباق بتري مقاس 6 سم بمحلول تيرود الطازج. اصنع صدعا صغيرا (بعمق 3-4 مم) على حدود أحد أطباق بتري وضعه تحت مجهر مجسم.
- ثبت قنية قطرها 1 مم على المحقنة وأدخلها في صدع طبق بتري. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء في المحقنة.
- املأ حقنة سعة 20 مل بنسبة 4٪ PFA واحتفظ بها في الغطاء الكيميائي. تحضير طبق بتري فارغ تحت غطاء محرك السيارة.
- تخدير الفأر بنسبة 3٪ إيزوفلوران / أكسجين بمعدل تدفق 1.0 لتر / دقيقة والتضحية به عن طريق خلع عنق الرحم وفقا لقواعد رعاية الحيوان المعمول بها.
- بعد التضحية ، قم بإزالة الفراء فوق الصدر وافتح الصدر للوصول الكامل إلى القلب.
- اعزل القلب ، واغمره في طبق بتري المملوء مسبقا ب 50 مل من محلول تيرودي. استخدم المقص الجراحي لقطع الشريان الأورطي مباشرة بالقرب من قوس الأبهر لكشف القلب.
- نقل القلب تحت المجهر مجسمة وإجراء القنية بعناية. لا تقم بإدخال القنية في عمق الشريان الأورطي (لا يزيد عن 2 مم) لتجنب تلف الأنسجة.
- استخدم مشبكا صغيرا وخياطة (مقاس 5/0) لتثبيت القلب في القنية.
- قم بتخلل القلب ب 30 مل من محلول Tyrode بضغط ثابت قدره 10 مل / دقيقة لإزالة الدم من الأوعية.
- افصل القنية عن المحقنة وضع القلب في طبق بتري المملوء بمحلول تيرودي. احرص على عدم وجود فقاعات هواء في القنية ؛ خلاف ذلك ، قم بإزالة فقاعات الهواء بشكل صحيح.
- قم بتوصيل المحقنة سعة 20 مل المملوءة ب 4٪ PFA البارد بالقنية وقم بتعكير القلب بنفس الضغط المستمر.
- احتضان القلب في 10 مل من 4٪ PFA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها (O / N). لتجنب تدهور الأنسجة ، قم بتنفيذ الخطوات 2.6-2.13 في أقصر وقت ممكن.
3. تطهير القلب
- في اليوم التالي ، اغسل القلب في 0.01 M PBS 3 مرات عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS + 0.01٪ أزيد الصوديوم (NaN3) عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. - احتضان القلب في 30 مل من محلول هيدروجيل في الهز (15 دورة في الدقيقة) عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام.
- قم بإزالة الغاز من العينة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مجفف ومضخة تفريغ ونظام أنبوب يربط المجفف بكل من المضخة وخط أنابيب النيتروجين.
- ضع العينة في المجفف وافتح القارورة ، مع الحفاظ على الغطاء عليها.
- أغلق المجفف وأزل الأكسجين من الأنبوب عن طريق فتح خط أنابيب النيتروجين.
- قم بتشغيل مضخة التفريغ لإزالة الأكسجين من المجفف لمدة 10 دقائق.
- قم بإيقاف تشغيل المضخة واستخدم مقبض المجفف لفتح خط أنابيب النيتروجين. بمجرد أن يصبح الضغط مساويا للضغط الجوي ، افتح المجفف بعناية وأغلق القارورة بسرعة.
- احتفظ بالقلب في محلول هيدروجيل مفرغ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في حالة راحة.
- عندما يتم بلمرة الهيدروجيل بشكل صحيح ويبدو هلاميا تماما ، قم بإزالة القلب منه بعناية وضعه في حامل العينة.
- أدخل حامل العينة مع القلب في إحدى غرف المقاصة وأغلقه بشكل صحيح لتجنب تسرب محلول المقاصة.
- قم بتشغيل الحمام المائي حيث يتم وضع حاوية محلول المقاصة والمضخة التمعجية لبدء إعادة تدوير محلول المقاصة.
- قم بتغيير محلول المقاصة في الحاوية مرة واحدة في الأسبوع لتسريع إجراء التوضيح.
4. تلطيخ الغشاء الخلوي
- بمجرد أن يظهر القلب واضحا تماما ، أخرجه من حامل العينة واغسله في 50 مل من برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 24 ساعة. اغسل مرة أخرى في 50 مل من PBS + 1٪ من Triton-X (PBS-T 1x) لمدة 24 ساعة.
- احتضان العينة في 0.01 مجم / مل من تراص جنين القمح (WGA) - Alexa Fluor 633 في 3 مل من PBS-T 1x في الهز (50 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 أيام.
- بعد الحضانة لمدة 7 أيام ، اغسل العينة في 50 مل من PBS-T 1x في درجة حرارة الغرفة في الاهتزاز لمدة 24 ساعة.
- احتضان العينة في 4٪ PFA لمدة 15 دقيقة ثم اغسلها 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
ملاحظة: بعد هذه الخطوة ، يمكن تخزين القلب في PBS + 0.01٪ NaN3 عند 4 درجات مئوية لعدة أشهر. - احتضان القلب بتركيزات متزايدة من 2,2′-Thiodiethanol (TDE) في 0.01 M PBS (20٪ و 47٪ TDE / PBS) لمدة 8 ساعات لكل منهما ، حتى التركيز النهائي 68٪ TDE في 0.01 M PBS لتوفير معامل الانكسار المطلوب (RI = 1.46). هذا هو وسيط مطابقة RI (RI-medium) للحصول على الصور16.
5. تركيب القلب واكتسابه
ملاحظة: يتم سرد جميع مكونات النظام البصري بالتفصيل في جدول المواد.
- املأ برفق حوالي 80٪ من الكوفيت الخارجي (الكوارتز ، 45 مم × 45 مم × 42.5 مم) باستخدام RI-medium.
ملاحظة: هنا ، من الممكن استخدام حلول مختلفة غير متطايرة تضمن مثيلا محصورا يبلغ 1.46. - املأ الكوفيت الداخلي برفق (الكوارتز ، 45 مم × 12.5 مم × 12.5 مم) بنفس وسيط RI.
- اغمر العينة داخل الكوفيت الداخلي. تسمح حضانة العينة الموصوفة أعلاه للعينة بالبقاء مستقرة داخل وسط RI دون الاحتفاظ بها.
- حرك العينة برفق إلى أسفل الكوفيت باستخدام ملاقط رفيعة ورتب القلب بمحوره الطولي الموازي للمحور الرئيسي للكوفيت لتقليل مسار ضوء الإثارة عبر الأنسجة أثناء المسح.
- ثبت القابس المخصص برفق فوق الكوفيت الداخلي بمسمارين.
- قم بتركيب العينة في مرحلة المجهر باستخدام المغناطيس.
- قم بترجمة مرحلة العينة الرأسية يدويا لغمر الكوفيت الداخلي في المرحلة الخارجية.
- قم بتشغيل مصدر ضوء الإثارة (الطول الموجي 638 نانومتر) ، مع ضبط طاقة منخفضة (في حدود 3 ميغاواط).
- حرك العينة باستخدام المترجم الآلي لإضاءة المستوى الداخلي للنسيج.
- قم بتشغيل برنامج التصوير (HCImageLive) واضبط مشغل الكاميرا على الوضع الخارجي (ورقة الضوء) لدفع مشغل الاستحواذ للكاميرا بواسطة البرنامج المخصص الذي يتحكم في الإعداد بأكمله.
- قم بتمكين الحفظ التلقائي في لوحة إعدادات المسح الضوئي وقم بتعيين مجلد الإخراج حيث يجب حفظ الصور.
- اضبط موضع العينة يدويا في المستوى XY باستخدام المترجمين الخطيين لنقل العينة إلى مركز FoV لمستشعر الكاميرا.
- حرك العينة على طول المحور Z باستخدام المترجم الخطي الميكانيكي لتحديد حدود القلب لإعادة البناء المقطعي.
- زيادة طاقة الليزر إلى ~ 20 ميغاواط ، جاهزة لجلسة التصوير.
- ابدأ الاكتساب المقطعي ، وانقر فوق الزر " ابدأ " في لوحة التسلسل الخاصة ببرنامج التصوير ، وفي نفس الوقت حرك العينة على طول المحور Z بسرعة ثابتة تبلغ 6 ميكرومتر / ثانية باستخدام المترجم الآلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يسمح إعداد المقاصة السلبية المطور بالحصول على قلب فأر بالغ تم تطهيره (ببعد من الطلب 10 مم × 6 مم × 6 مم) في حوالي 3 أشهر. يتم تثبيت جميع مكونات الإعداد كما هو موضح في الشكل 1. يسمح تدرج درجة الحرارة الضئيل بين كل غرفة مقاصة (بترتيب 3 درجات مئوية) بالحفاظ على درجة الحرارة في نطاق مناسب عبر جميع الغرف.
الشكل 1: رسم تخطيطي لإعداد المقاصة السلبية. يدور محلول المقاصة (بعد تصفيته) على التوالي من خلال غرف العينة بمساعدة المضخة التمعجية. تسمح صيانة حاوية المحلول في حمام مائي مضبوط على 50 درجة مئوية بأن تكون درجة حرارة المحلول بين 37-45 درجة مئوية داخل الغرف. صورة تم إنشاؤها باستخدام Biorender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يوضح الشكل 2 نتيجة عملية تطهير القلب بأكمله. كما ذكر بالفعل من قبل Costantini et al.16 ، فإن الجمع بين منهجية CLARITY مع TDE كوسيط RI لا يغير بشكل كبير الحجم النهائي للعينة ولا يؤدي إلى تشوه متباين الخواص للعينة.
الشكل 2: صورة تمثيلية لقلب قبل (على اليسار) وبعد (على اليمين) بروتوكول CLARITY. تصبح القلوب شفافة تماما وكبيرة الحجم قليلا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
بمجرد تطهير القلب ، تم تلطيخ الأغشية الخلوية ب Alexa Fluor 633-conjugated WGA لإجراء إعادة بناء البنية الخلوية للعضو بأكمله. كان مجهر الورقة الضوئية الفلوري المصنوع خصيصا (الشكل 3) قادرا على ضمان دقة مقياس ميكرون ثلاثي الأبعاد عبر FoV بأكمله.
الشكل 3: ميزوسبيم. تقديم CAD لمجهر ورقة الضوء الفلوري المصنوع خصيصا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
بالنظر إلى الفتحة العددية (NA = 0.1) لبصريات الكشف ، يمكن تقدير وظيفة انتشار النقطة الشعاعية (XY) (PSF) للنظام بترتيب 4-5 ميكرومتر. من ناحية أخرى ، تنتج بصريات الإثارة ورقة ضوئية بحد أدنى للخصر يبلغ حوالي 6 ميكرومتر (نصف العرض الكامل كحد أقصى ، FWHM) تتباعد حتى 175 ميكرومتر عند حافة FoV (الشكل 4A-C). يضمن تزامن مصراع الكاميرا المتداول مع المسح المحوري لشعاع الليزر جمع إشارة الانبعاث فقط في جزء العينة المتحمس مع خصر ورقة الضوء ، مما ينتج عنه متوسط FWHM يبلغ حوالي 6.7 ميكرومتر على طول FoV بأكمله (الشكل 4B-D).
الشكل 4: توليد ورقة الضوء وتوصيفها . (أ) تركز ورقة ضوء الإثارة الناتجة عن مصدر ليزر يبلغ 638 نانومتر على مركز مجال الرؤية (FoV) ويتم الحصول عليها بحجم بكسل 3.25 ميكرومتر ووقت تعرض يبلغ 10 مللي ثانية. يتم تطبيع شدة الضوء والإبلاغ عنها باستخدام خريطة ملونة. يتم تقييم نصف العرض الكامل الأقصى (FWHM) لملف تعريف شدة الضوء في 15 موقعا مختلفا على طول FoV. النتائج موضحة في C. (B) صورة لورقة ضوء الإثارة الناتجة عن التزامن بين غالق الكاميرا المتداول الذي يعمل عند 1.92 هرتز وموضع شعاع الضوء المدفوع بالعدسة القابلة للضبط. يتم تقييم FWHM لملف تعريف شدة الضوء على طول FoV وتظهر النتائج في D. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
تم تقدير Z-PSF للمجهر أيضا من خلال إعادة بناء التصوير المقطعي للغلاف النانوي الفلوري (الشكل 5). يمكن تقدير FWHM البالغ 6.4 ميكرومتر من خلال الملاءمة ، بالاتفاق الجيد مع التقييم السابق.
الشكل 5: دالة انتشار النقطة في المحور Z. يتم تقدير وظيفة انتشار النقطة (PSF) للنظام البصري عن طريق تصوير الكرات النانوية الفلورية دون الميكرون (متحمسة بورقة ضوئية بطول موجي 638 نانومتر) بحجم بكسل 3.25 ميكرومتر × 3.25 ميكرومتر × 2.0 ميكرومتر. يتم تمثيل ملف تعريف كثافة PSF على طول المحور البصري (Z) كنقاط سوداء. تم تجهيز ملف تعريف PSF بوظيفة Gaussian مع μ = 18.6 ميكرومتر و σ = 2.7 ميكرومتر. FWHM من PSF المقدرة من قبل الملاءمة هو 6.4 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
نظرا للشفافية العالية للأنسجة ، كان من الممكن إضاءة القلب بالكامل دون تشويه كبير للورقة الضوئية الممسوحة محوريا بطول موجة إثارة يبلغ 638 نانومتر. تم جمع إشارة التألق بواسطة مستشعر sCMOS الذي يعمل عند 500 مللي ثانية من وقت التعرض ومعدل إطارات يبلغ 1.92 هرتز. واستنادا إلى القياس الكمي السابق، أجري الاكتساب المقطعي باستخدام سرعة مسح Z تبلغ 6 ميكرومتر/ثانية، وبافتراض معدل إطارات قدره 1.92 هرتز، تم الحصول على إطار واحد كل 3.12 ميكرومتر، مما أدى إلى زيادة أخذ عينات من النظام Z-PSF بنحو مرتين. يوضح الشكل 6 إطارين تمثيليين (على المستويين الإكليلي والمستعرض) لحجرة البطين الأيسر. تؤكد هذه النتيجة قدرة النظام على حل الأغشية الخلوية المفردة في ثلاثة أبعاد مع نسبة إشارة / ضوضاء كافية في العضو بأكمله (الشكل 6).
الشكل 6: إعادة بناء أنسجة قلب الفأر. كان القلب الموضح ملطخا ب WGA مترافقا مع Alexa Fluor 633 ومثارا بواسطة مصدر ليزر بطول موجي يبلغ 638 نانومتر. أ: المقاطع الإكليلية، و(ب) الأجزاء التمثيلية المستعرضة. (جيم - دال) ينتج عن تحويل الأنسجة شفافية عالية للأنسجة ، مما يسمح بحل الهياكل الصغيرة في عمق الجدار. يظهر النظام البصري دقة محورية كافية لحل الهياكل الميكرومترية (لوحة. د). (ه) 3D عرض القلب منخفضة الدقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العمل ، تم تقديم نهج ناجح لمسح وصبغ وصورة قلب فأر كامل بدقة عالية. أولا ، تم تحسين بروتوكول تحويل الأنسجة (CLARITY) وتنفيذه ، وتم تعديله قليلا لتطبيقه على أنسجة القلب. في الواقع ، للحصول على إعادة بناء فعالة في 3D من القلب كله ، من الضروري منع ظاهرة تشتت الضوء. تسمح لنا منهجية CLARITY بالحصول على قلب سليم عالي الشفافية ، ولكنه يتطلب أوقات حضانة طويلة عند إجرائه بشكل سلبي (حوالي 5 أشهر). فيما يتعلق بالدماغ ، فإن أنسجة القلب ليست مناسبة للتطهير النشط ، والذي يستفيد من المجال الكهربائي. حتى في الفولتية المنخفضة ، يؤدي المجال الكهربائي إلى أضرار وكسر الأنسجة. هنا ، تم تحسين نهج المقاصة السلبية للحصول على قلب تم تطهيره تماما في حوالي 3 أشهر. بعد عزل القلب وإخراجه من خلال الشريان الأورطي القريب ، تم تنفيذ منهجية CLARITY كما هو موضح في القسم 3 من البروتوكول. لتسريع الإجراء ، تم ترتيب إعداد تطهير سلبي محلي الصنع (الشكل 1) ، مما أدى إلى تقليل توقيت إزالة الأنسجة بحوالي 40٪. يتكون الإعداد من حاوية لمحلول المقاصة ، وحمام مائي ، ومضخة تمعجية ، وعدة غرف تحتوي على حوامل عينات مختلفة ، ومرشحات كبسولة لكل غرفة ، ونظام أنابيب لإعادة تدوير المحلول. تقوم المضخة باستخراج المحلول وتعميمه من الحاوية على التوالي عبر كل غرفة ، حيث يتم الاحتفاظ بالعينات للتطهير. قبل دخول الغرف ، يتدفق المحلول عبر مرشح كبسولة لاحتجاز الدهون المتدفقة بعيدا عن الأنسجة أثناء المقاصة. يتم الحفاظ على درجة الحرارة المثلى لمحلول المقاصة ، بين 37-45 درجة مئوية ، داخل الغرف أثناء إعادة التدوير عن طريق الحفاظ على حاوية المحلول في حمام مائي عند 50 درجة مئوية. ينصح بتغيير محلول المقاصة في الحاوية مرة واحدة في الأسبوع أثناء الإجراء. يتم سرد جميع المكونات المستخدمة بالتفصيل في جدول المواد. يسمح لنا الحل الأمثل المقدم هنا بالحصول على قلب فأر كامل تم تطهيره بشكل سلبي في وقت أقصر بكثير فيما يتعلق بتقنية المقاصة السلبية القياسية ، وبالتالي تقليل الوقت التجريبي المطلوب دون الإضرار بالعضو. تم تحسين نهج التلوين أيضا لوضع العلامات المتجانسة للأغشية الخلوية والبطانة ، باستخدام ليكتين فلوري (WGA - Alexa Fluor 633).
تمت إعادة بناء البنية الخلوية للقلب من خلال تطوير mesoSPIM مخصص يكتسح المحوري ورقة الضوء عبر العينة (https://mesospim.org). تمكن مجهر الورقة الضوئية الفلوري المصنوع حسب الطلب (الشكل 3) من الحصول بسرعة على صور ل FoV الميزوسكوبي (بترتيب المليمترات) بدقة ميكرومترية. بهذه الطريقة ، يمكن حل خلايا عضلة القلب المفردة وتعيينها في إعادة بناء 3D للجهاز بأكمله. يضيء المجهر العينة التي تم تطهيرها بورقة ضوئية ، يتم إنشاؤها ديناميكيا عن طريق مسح شعاع ليزر عند 638 نانومتر باستخدام مرآة جلفانومترية. تميز كاميرا sCMOS ذراع الكشف في مخطط تكبير 2x مما يمكنها من الحصول على FoV بالكامل في مسح واحد. تم اختيار إشارة التألق عن طريق وضع مرشح تمرير طويل بعد الهدف. تم ضبط الكاميرا للعمل في وضع الغالق الدوار: في أي وقت ، تتم مزامنة خطوط بكسل الكاميرا النشطة (أي المعرضة للصورة) مع التحول داخل المستوى للنطاق البؤري للورقة الضوئية ، والتي يتم إجراؤها بواسطة عدسة قابلة للضبط كهربائيا. أدى هذا النهج إلى زيادة قدرة التقسيم البصري في FoV بالكامل من خلال الحصول فقط على الصور في أنحف جزء من ورقة الضوء المركزة. يختلف هذا الحل عن التكوينات التقليدية ، حيث يتضمن الاستحواذ النطاق الكامل للعمق البؤري للورقة الضوئية ، مما يمنع ذروة دقة التقسيم البصري في جزء كبير من FoV. تدعم مرحلة العينة المتكاملة cuvettes ، وبالتالي تحسين تحديد المواقع وتمكين الحركة المحورية للعينة أثناء عملية التصوير. بهذه الطريقة ، يمكن إعادة البناء المقطعي من خلال الحصول على أقسام داخلية متتالية. الصور التي تم الحصول عليها لها FoV ميزوسكوبي ودقة ميكرومترية ، في حين أن وقت الاستحواذ المطلوب لقلب الماوس كله هو ~ 15 دقيقة. تسمح المزامنة بين مصراع الكاميرا المتداول وشعاع ضوء الإثارة الذي يجتاح FoV بالحصول على مستوى الصورة بالكامل بدقة مكانية عالية (الشكل 4). وهذا يسمح بإعادة البناء المباشر للعينة في اكتساب مقطعي واحد ، دون الحاجة إلى الإزاحة الشعاعية للعينة والتصوير القائم على المداخن متعددة الجوار. والجدير بالذكر أن المجهر سمح بإعادة بناء العضو بأكمله بحوالي (10 مم × 6 مم × 6 مم) في جلسة تصوير واحدة ، مع حجم فوكسل قريب من الخواص ونسبة إشارة إلى خلفية كافية لحل الخلايا المفردة عبر العضو بأكمله بشكل محتمل.
يشار إلى أن البروتوكول المقترح يقدم بعض الخطوات الحاسمة التي يجب تنفيذها بعناية لتحقيق نتائج جيدة. على وجه الخصوص ، يمكن أن يكون قنية القلب من خلال الشريان الأورطي القريب صعبا للغاية ، ولكنه خطوة أساسية لغسل العضو وإصلاحه بشكل صحيح. Judd et al.17 ، أظهر كيفية تنفيذ هذه الخطوة بفعالية. علاوة على ذلك ، فإن إجراء التفريغ الذي يحتاجه بروتوكول CLARITY معقد للغاية أيضا ، ولكنه ضروري للحفاظ على الأنسجة. إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة بشكل صحيح ، فقد تواجه الأنسجة أضرارا وتفسخا أثناء الحضانة في محلول التطهير.
علاوة على ذلك ، على الرغم من أن سير العمل التجريبي المقدم مناسب لتحقيقات الفلورسنت الصغيرة ، إلا أن استخدام الكيمياء المناعية لا يوفر دائما كفاءة جيدة في التلوين بسبب الوزن الجزيئي العالي للأجسام المضادة. يتطلب كل بروتوكول تلطيخ مناعي تحسينا مناسبا ، وقد تم تصميم طرق مختلفة لتحسين تغلغل الأجسام المضادة ، على سبيل المثال ، توسيع الأنسجة18 و / أو الاختلافات في درجة الحموضة والقوة الأيونية19.
يقدم إعداد mesoSPIM أيضا قيدين رئيسيين: i) يعتمد الحفاظ على ورقة الضوء عبر العينة بشدة على شفافية الأنسجة ، و ii) يحد بعد مستشعر الكاميرا من FoV. يعد ضمان مطابقة معامل الانكسار المثالية داخل القلب بأكمله أمرا صعبا للغاية ، ويمكن أن تؤدي الاختلافات الصغيرة في معامل الانكسار إلى تشتت الضوء ، مما يؤدي إلى تدهور جودة الصورة. في هذا الصدد ، يمكن تقديم مخطط إضاءة ثنائي الجانب. يمكن لذراعي الإثارة توليد ورقتي إضاءة ديناميكيتين متميزتين ومحاذاة مع إضاءة مركزة إلى أقصى حد عن طريق تبديل الإضاءة من جانب إلى آخر من العينة. أيضا ، يمكن تحسين FoV باستخدام جيل جديد من sCMOS عالي الدقة بإضاءة خلفية مع مستشعرات كبيرة جدا مع عدسات ذات فتحة رقمية عالية مع تشويه مجال منخفض. سيسمح لنا هذا التنفيذ بإعادة بناء أعضاء أكبر أو أنسجة موسعة تحافظ على نفس قدرة القسم البصري وبالتالي إنتاج صور 3D على نطاق ميكرون لعينات تم تطهيرها بحجم سنتيمتر.
على الرغم من أن البروتوكول المقدم لا يزال يتطلب وقتا طويلا لإعداد العينات ومستوى عال من الشفافية للحصول على إعادة بناء بنية خلوية موثوقة للعضو بأكمله ، إلا أن الأهمية الرئيسية للنهج تكمن في تحسينات بروتوكول المقاصة والقدرة على إجراء إعادة بناء الميزوسكوبية في مسح واحد بدقة ميكرومترية. في المستقبل ، يمكن دمج هذه التطورات مع بروتوكول متعدد البقع لتحقيق إعادة بناء الأعضاء بالكامل التي تدمج الهياكل البيولوجية المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء للإفصاح.
Acknowledgments
تلقى هذا المشروع تمويلا من برنامج البحث والابتكار Horizon 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية المنحة رقم 952166 (REPAIR) ، MUR في إطار برنامج FISR ، مشروع FISR2019_00320 ومنطقة توسكانا ، باندو ريسركا تحية 2018 ، مشروع PERCARE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
References
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an International Forum on Cardiac Remodeling. Journal of the American College of Cardiology. 35, 569-582 (2000).
- Finocchiaro, G., et al. Arrhythmogenic potential of myocardial disarray in hypertrophic cardiomyopathy: genetic basis, functional consequences and relation to sudden cardiac death. EP Europace. 2, 1-11 (2021).
- Bishop, M. J., et al. Development of an anatomically detailed MRI-derived rabbit ventricular model and assessment of its impact on simulations of electrophysiological function. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 298 (2), 699-718 (2010).
- Bishop, M. J., Boyle, P. M., Plank, G., Welsh, D. G., Vigmond, E. J. Modelling the role of the coronary vasculature during external field stimulation. IEEE Transaction on Biomedical Engineering. 57, 2335-2345 (2010).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W.
- Silvestri, L., Costantini, I., Sacconi, L., Pavone, F. S. Clearing of fixed tissue: a review from a microscopist's perspective. Journal of Biomedical Optics. 21, 081205 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
- Park, Y. G., et al. Protection of tissue physicochemical properties using polyfunctional crosslinkers. Nature Biotechnology. 37, 73 (2019).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence microscopy for the study of the murine heart. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e57769 (2018).
- Olianti, C., et al. 3D imaging and morphometry of the heart capillary system in spontaneously hypertensive rats and normotensive controls. Scientific Reports. 10, 1-9 (2020).
- Pianca, N., et al. Cardiac sympathetic innervation network shapes the myocardium by locally controlling cardiomyocyte size through the cellular proteolytic machinery. The Journal of Physiology. 597, 3639-3656 (2019).
- Di Bona, A., Vita, V., Costantini, I., Zaglia, T. Towards a clearer view of sympathetic innervation of cardiac and skeletal muscles. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 154, 80-93 (2020).
- Voigt, F. F., et al. The mesoSPIM initiative - open-source light-sheet microscopes for imaging cleared tissue. Nature Methods. 16 (11), 1105-1108 (2019).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (114), e54012 (2016).
- Yi, F., et al. Microvessel prediction in H&E stained pathology images using fully convolutional neural networks. BMC Bioinformatics. 19 (1), 64 (2018).
- Susaki, E. A., et al. Versatile whole-organ/body staining and imaging based on electrolyte-gel properties of biological tissues. Nature Communications. 11 (1), 1982 (2020).
