Summary
我々は、組織形質転換と染色の新たな進歩と軸走査型ライトシート顕微鏡の開発を組み合わせることにより、マウス心臓全体のメゾスコピック再構成法を報告する。
Abstract
遺伝性および非遺伝性の両方の心臓病は、心臓に重度のリモデリングプロセスを引き起こす可能性があります。コラーゲン沈着(線維症)や細胞のずれなどの構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、電気機械的機能障害を引き起こし、最終的には不整脈を引き起こす可能性があります。これらの機能変化の現在の予測モデルは、統合されていない低解像度の構造情報に基づいています。このフレームワークを異なる桁数に配置することは、大規模な組織で高解像度イメージングを実行する際の標準的なイメージング方法の非効率性のために困難です。この研究では、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体をイメージングできる方法論的フレームワークについて説明します。この目標を達成するには、組織形質転換とイメージング方法の進歩を組み合わせた技術的努力が必要でした。まず、無傷の心臓をナノポーラスでヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリーの形態に変換できる最適化されたCLARITYプロトコルについて説明し、高い透明性と深い染色を可能にします。次に、ミクロンスケールの分解能でメゾスコピック視野(mmスケール)の画像を高速に取得できる蛍光光シート顕微鏡について説明する。mesoSPIMプロジェクトに続いて、考案された顕微鏡は、1回の断層撮影スキャンでマイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にします。この方法論的枠組みにより、電気機能障害における細胞構造の混乱の関与を明らかにし、機能データと構造データの両方を考慮した包括的なモデルへの道を開き、組織リモデリング後の電気的および機械的変化につながる構造的原因の統一的な調査が可能になると考えています。
Introduction
心疾患に関連する構造リモデリングは、電気伝導に影響を及ぼし、臓器の電気機械的機能障害を引き起こす可能性があります1,2。機能的変化を予測するために使用される現在のアプローチは、一般的にMRIおよびDT-MRIを使用して、心臓の線維症沈着、血管樹、および線維分布の全体的な再構成を取得し、それらは臓器を横切る優先活動電位伝播(APP)経路をモデル化するために使用されます3,4。これらの戦略は、心臓組織の美しい概要を提供することができます。しかし、それらの空間分解能は、細胞レベルでの心機能に対する構造リモデリングの影響を調べるには不十分です。
このフレームワークを、単一の細胞が活動電位の伝播において個々の役割を果たすことができる異なる桁に配置することは困難です。主な制限は、大規模な(センチメートルサイズの)組織で高解像度のイメージング(マイクロメートル分解能)を実行するための標準的なイメージング方法の非効率性です。実際、高解像度で3Dで生物学的組織をイメージングすることは、組織が不透明であるため非常に複雑です。臓器全体で3D再構成を実行するための最も一般的なアプローチは、薄い切片を準備することです。ただし、正確なセクショニング、組み立て、およびイメージングには、多大な労力と時間が必要です。サンプルを切断する必要のない別のアプローチは、透明な組織を生成することです。過去数年間、組織を透明化するためのいくつかの方法論が提案されてきた5、6、7、8。巨大で透明で蛍光標識された組織を製造するという課題は、真の組織形質転換アプローチ(CLARITY9、SHIELD10)を開発することによって最近達成されました。特に、CLARITY法は、無傷の組織をナノポーラスのヒドロゲルハイブリダイズした脂質フリー形態に変換することに基づいており、膜脂質二重層の選択的除去によって高い透明性を付与することができます。注目すべきことに、この方法は心臓調製物においても成功していることが見出されている11、12、13、14。ただし、心臓は脆弱すぎて能動的な清算には適さないため、受動的なアプローチを使用して清算する必要があり、完全な透明性を付与するには長い時間がかかります。
ライトシート顕微鏡などの高度なイメージング技術と組み合わせることで、CLARITYはマイクロメートルの解像度で3Dの巨大な心臓組織をイメージングする可能性があります。ライトシート顕微鏡では、サンプルの照明は、検出対物レンズの焦点面に閉じ込められた薄いシートの光で行われます。蛍光発光は、照明面15に垂直な軸に沿って収集される。検出アーキテクチャは広視野顕微鏡に似ており、レーザー走査型顕微鏡よりもはるかに高速に取得できます。ライトシートを通してサンプルを移動することで、センチメートルサイズまでの大きな標本の完全な断層撮影が可能になります。しかしながら、ガウシアンビームの本質的な性質のために、限られた空間拡張のためだけに非常に薄い(数ミクロンのオーダーの)ライトシートを得ることが可能であり、したがって視野(FoV)を大幅に制限する。最近、この制限を克服するために新しい励起スキームが導入され、脳イメージングに適用され、等方性分解能16の3D再構成が可能になりました。
この論文では、パッシブクリアリングアプローチを提示し、CLARITYプロトコルに必要なクリアリングタイミングを大幅に短縮できるようにします。ここで説明する方法論的枠組みは、分オーダーの取得時間を有する単一の断層撮影スキャンにおいて、マイクロメートル分解能でマウス心臓全体を再構築することを可能にする。
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Protocol
すべての動物の取り扱いと手順は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州議会の指令2010/63 / EUのガイドラインに従って実行され、イタリア保健省の原則と規制に準拠しました。実験プロトコルは、イタリア保健省によって承認されました(プロトコル番号647/2015-PR)。すべての動物はイタリアのENVIGOによって提供されました。これらの実験には、生後6か月の5匹の雄C57BL / 6Jマウスを使用しました。
1. 溶液調製
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH 7.6)でケミカルフードに調製します。4%PFAアリコートを-20°Cで数ヶ月間保管します。
- ヒドロゲル溶液の調製:4%アクリルアミド、0.05%ビスアクリルアミド、0.25%イニシエティオールAV-044を0.01 M PBSに化学フードで混合します。準備全体を通して試薬と溶液を氷上に保管してください。ヒドロゲルアリコートを-20°Cで数ヶ月間保存します。
- 清澄化溶液の調製:200 mMホウ酸、4%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を脱イオン水に混合します。化学フード内のpH 8.6。SDS沈殿を避けるために、溶液を21〜37°Cで保管してください。
- 実験当日に新鮮なタイロード溶液を調製する:10 mM グルコース、10 mM HEPES、113 mM NaCl、1.2 mM MgCl2、および4.7 mM KClを追加します。1 M NaOHを用いてpH 7.4に滴定する。
2.心臓の隔離
- 心臓隔離手順の30分前に0.1mLの500I.U.ヘパリンを皮下注射します。
- 30 mLシリンジと3つの6 cmペトリ皿に新しいタイロード溶液を入れます。ペトリ皿の1つの境界に小さな裂け目(深さ3〜4 mm)を作り、実体顕微鏡の下に置きます。
- 直径1mmのカニューレをシリンジに固定し、ペトリ皿の裂け目に挿入します。シリンジに気泡がないことを確認してください。
- 20 mLシリンジに4%PFAを満たし、ケミカルフードに入れます。フードの下に空のペトリ皿を用意します。
- マウスを3%イソフルラン/酸素で1.0 L / minの流速で麻酔し、施行されている動物福祉規則に従って頸部脱臼によって犠牲にします。
- 犠牲の後、胸の上の毛皮を取り除き、胸を開いて心臓に完全にアクセスできるようにします。
- 心臓を分離し、以前に50 mLのタイロード溶液で満たされたペトリ皿に浸します。外科用ハサミを使用して大動脈弓のすぐ近くの大動脈を切断し、心臓を露出させます。
- 実体顕微鏡下で心臓を移し、慎重にカニューレ挿入を行う。組織の損傷を避けるために、カニューレを大動脈の奥深く(2 mm以下)に挿入しないでください。
- 小さなクランプと縫合糸(サイズ5/0)を使用して、心臓をカニューレに固定します。
- 心臓に30 mLのタイロード溶液を10 mL / minの一定圧力で灌流し、血管から血液を取り除きます。
- カニューレをシリンジから取り外し、心臓をタイロード溶液で満たされたペトリ皿に入れます。カニューレに気泡が入らないように注意してください。それ以外の場合は、気泡を適切に除去してください。
- 冷たい4%PFAで満たされた20mLシリンジをカニューレに取り付け、同じ一定の圧力で心臓に灌流します。
- 心臓を10 mLの4%PFAで4°Cで一晩インキュベートします(O / N)。組織の劣化を避けるために、可能な限り短い時間で手順2.6〜2.13を実行します。
3.ハートクリアリング
- 翌日、心臓を0.01 M PBSで4°Cで15分間3回洗浄します。
注:このステップの後、心臓はPBS + 0.01%アジ化ナトリウム(NaN3)に4°Cで数か月間保存できます。 - 心臓を30 mLのヒドロゲル溶液中で4°Cで3日間振とう(15 rpm)インキュベートします。
- 乾燥機、真空ポンプ、および乾燥機をポンプと窒素パイプラインの両方に接続するチューブシステムを使用して、室温でサンプルを脱気します。
- サンプルを乾燥機に入れ、バイアルを開き、キャップをかぶせたままにします。
- 乾燥機を閉じ、窒素パイプラインを開いてチューブから酸素を取り除きます。
- 真空ポンプをオンにして、乾燥機から酸素を10分間除去します。
- ポンプの電源を切り、乾燥機のノブを使用して窒素パイプラインを開きます。圧力が大気圧に等しくなったら、乾燥機を慎重に開き、バイアルをすばやく閉じます。
- 心臓を脱気したヒドロゲル溶液に37°Cで3時間安静に保ちます。
- ハイドロゲルが適切に重合され、完全にゼラチン状に見えたら、心臓を慎重に取り外してサンプルホルダーに入れます。
- 心臓付きのサンプルホルダーを透明化チャンバーの1つに挿入し、透明化溶液の漏れを防ぐために適切に閉じます。
- 透明化溶液容器が置かれている水浴と蠕動ポンプのスイッチを入れて、清澄溶液の再循環を開始します。
- 清澄化手順をスピードアップするために、週に一度容器内の清算液を交換してください。
4. 細胞膜染色
- 心臓が完全に透明になったら、サンプルホルダーから取り出し、50 mLのウォームアップPBSで24時間洗浄します。50 mLのPBS + 1%のトリトン-X(PBS-T 1x)で24時間再度洗浄します。
- サンプルを0.01 mg/mLの小麦胚芽凝集素(WGA)-Alexa Fluor 633を3 mLのPBS-T 1x中で室温で7日間振とう(50 rpm)インキュベートします。
- 7日間のインキュベーション後、50 mLのPBS-T 1xでサンプルを室温で24時間振とうしながら洗浄します。
- サンプルを4%PFA中で15分間インキュベートし、PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。
注:このステップの後、心臓はPBS + 0.01%NaN3に4°Cで数か月間保存できます。 - 心臓を0.01 M PBS(20%および47%TDE / PBS)中の2,2'-チオジエタノール(TDE)の濃度をそれぞれ8時間インキュベートし、0.01 M PBS中の68%TDEの最終濃度までインキュベートして、必要な屈折率(RI = 1.46)を提供します。画像16を取得するRIマッチング媒体(RI-medium)である。
5.心臓の取り付けと取得
注意: 光学系のすべてのコンポーネントは、 材料の表に詳細に記載されています。
- 外部キュベット(石英、45 mm×45 mm×42.5 mm)の約80%をRI培地で静かに満たします。
注:ここでは、1.46のRIを保証するさまざまな不揮発性ソリューションを使用できます。 - 内部キュベット(石英、45 mm×12.5 mm×12.5 mm)に同じRI培地をそっと充填します。
- サンプルを内部キュベット内に浸します。上記のサンプルインキュベーションにより、サンプルは保持されることなくRI培地内で安定な状態を保つことができます。
- 細いピンセットを使用してサンプルをキュベットの底にそっと移動し、縦軸がキュベットの主軸に平行になるように心臓を配置して、スキャン中の組織を横切る励起光路を最小限に抑えます。
- 2本のネジで内部キュベットの上に調整されたプラグをそっと固定します。
- 磁石を使用してサンプルを顕微鏡ステージに取り付けます。
- 垂直サンプルステージを手動で移動して、内部キュベットを外部キュベットに浸します。
- 励起光源(波長638nm)をオンにし、低電力(3mW程度)に設定します。
- 電動トランスレータを使用してサンプルを移動し、組織の内面を照らします。
- イメージングソフトウェア(HCImageLive)の電源を入れ、カメラのトリガーを外部(ライトシート)モードに設定して、セットアップ全体を制御するカスタムソフトウェアによってカメラの取得トリガーを駆動します。
- [スキャン設定]パネルで[自動保存]を有効にし、画像を保存する必要がある出力フォルダーを設定します。
- リニアトランスレータを使用してXY平面内のサンプル位置を手動で調整し、サンプルをカメラセンサーのFoVの中心に移動します。
- リニア電動トランスレータを使用してサンプルをZ軸に沿って移動し、断層撮影再構成のための心臓の境界を特定します。
- レーザー出力を~20 mWに増やし、イメージングセッションの準備を整えます。
- 断層撮影を開始し、イメージングソフトウェアのシーケンスパネルにある開始ボタンをクリックすると同時に、電動トランスレータを使用してサンプルをZ軸に沿って6μm/sの等速で移動します。
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Representative Results
開発されたパッシブクリアリングセットアップにより、約3ヶ月でクリアされた成体マウスの心臓(オーダー10mm x 6mm x 6mm)を得ることができます。セットアップのすべてのコンポーネントは、 図 1 に示すようにマウントされます。各クリアリングチャンバー間の温度勾配はごくわずか(3°C程度)であるため、すべてのチャンバーで適切な範囲の温度を維持することができます。
図1:パッシブクリアリングセットアップの概略図。透明化溶液(ろ過後)は、蠕動ポンプの助けを借りてサンプルチャンバー内を連続して循環します。50°Cに設定された水浴中で溶液容器を維持することで、チャンバー内の溶液温度を37〜45°Cにすることができます。Biorender.com で作成された画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2は、心臓全体のクリアリングプロセスの結果を示しています。Costantiniらによってすでに報告されているように16、CLARITY法とRI培地としてのTDEの組み合わせは、サンプルの最終体積を大きく変化させたり、サンプルの異方性変形を引き起こしたりすることはありません。
図2:CLARITYプロトコルの前(左)と後(右)の心臓の代表的な画像。 ハートは完全に透明になり、少し特大になります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
心臓が透明になったら、細胞膜をAlexa Fluor 633結合WGAで染色し、臓器全体の細胞構造再建を行いました。カスタムメイドの蛍光ライトシート顕微鏡(図3)は、FoV全体で3Dミクロンスケールの分解能を確保することができました。
図3:メソスピム。 カスタムメイドの蛍光ライトシート顕微鏡のCADレンダリング。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
検出光学系の開口数(NA=0.1)を考慮すると、システムの半径方向(XY)点像分布関数(PSF)は4〜5μm程度で推定できます。一方、励起光学系は、FoVの端で最大175μmまで発散する最小ウエスト約6μm(全幅半値、FWHM)のライトシートを生成します(図4A-C)。カメラのローリングシャッターとレーザービームの軸方向スキャンの同期により、ライトシートの腰で励起されたサンプル部分でのみ発光信号を収集し、FoV全体に沿って平均約6.7μmの半値幅が得られました(図4B-D)。
図4:ライトシートの生成と特性評価。 (A)638nmのレーザー光源で生成した励起光シートを視野(FoV)の中心に集光し、画素サイズ3.25μm、露光時間10msで取得。光の強度は正規化され、カラーマップで報告されます。光強度プロファイルの全幅半値(FWHM)は、FoVに沿った15の異なる位置で評価されます。結果を Cに示す。(B)1.92Hzで動作するカメラローリングシャッターと同調可能レンズによって駆動される光ビーム位置との同期によって生成された励起光シートの画像。光強度プロファイルの半値幅をFoVに沿って評価し、結果を Dに示す。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
顕微鏡のZ-PSFも、蛍光ナノスフェアの断層再構成によって推定されました(図5)。6.4μmの半値幅は、以前の評価とよく一致して、適合によって推定できます。
図5:Z軸の点像分布関数。 光学系の点像分布関数(PSF)は、画素サイズ3.25 μm×3.25 μm×2.0 μmの蛍光サブミクロンスケールのナノスフェア(波長638 nmのライトシートで励起)を撮像することによって推定されます。 光軸(Z)に沿ったPSF強度プロファイルは黒い点で表されます。PSFプロファイルには、μ = 18.6 μm、σ = 2.7 μmのガウス関数が取り付けられています。フィットによって推定されたPSFの半値幅は6.4μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
組織の透明度が高いため、励起波長638nmで軸方向にスキャンされたライトシートの大きな歪みなしに心臓全体を照らすことができました。蛍光信号は、500msの露光時間と1.92Hzのフレームレートで動作するsCMOSセンサーによって収集されました。 以前の定量に基づいて、断層撮影は6 μm/sのZスキャン速度を使用して実行され、フレームレートを1.92 Hzと仮定すると、3.12 μmごとに1フレームが取得され、システムZ-PSFが約2倍オーバーサンプリングされました。左心室の2つの代表的なフレーム(冠状面上および横面上)を 図6に示す。この結果は、臓器全体で十分なシグナル/ノイズ比で3次元で単一の細胞膜を分解するシステムの可能性を裏付けています(図6)。
図6:マウスの心臓組織再建。清澄化した心臓をAlexa Fluor 633に結合させたWGAで染色し、波長638 nmのレーザー光源で励起しました。(A)冠状および(B)横方向の代表セクション。(C-D)組織変換は高い組織透明性を生み出し、壁の深さの小さな構造を解像することを可能にする。光学系は、マイクロメトリック構造を解像するのに十分な軸方向分解能を示します(パネル。(E)3D低解像度のハートレンダリング。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究では、マウスの心臓全体を高解像度でクリア、染色、および画像化するアプローチの成功を紹介しました。まず、組織形質転換プロトコル(CLARITY)を最適化して実行し、心臓組織への適用のためにわずかに変更しました。実際、心臓全体の3次元で効率的な再構成を得るためには、光散乱の現象を防ぐことが不可欠です。CLARITYの方法論により、透明度の高い無傷の心臓を得ることができますが、受動的に行うと長い潜伏時間(約5か月)が必要になります。脳に関しては、心臓組織は電界を利用する能動透明化には適していない。低電圧でも、電界は損傷や組織の破損につながります。ここでは、パッシブクリアリングアプローチが最適化され、約3か月で完全にクリアされた心臓が得られました。近位大動脈を通して心臓を単離およびカニューレした後、プロトコルのセクション3に記載されているようにCLARITY方法論を実行した。手順をスピードアップするために、自家製のパッシブクリアリングセットアップが配置され(図1)、組織クリアリングのタイミングが約40%短縮されました。セットアップは、透明化溶液用の容器、水浴、蠕動ポンプ、異なるサンプルホルダーを含むいくつかのチャンバー、各チャンバー用のカプセルフィルター、および溶液の再循環のためのチューブシステムで構成されています。ポンプは、容器から溶液を抽出して各チャンバーに連続して循環させ、そこでサンプルが透明化のために保持されます。チャンバーに入る前に、溶液はカプセルフィルターを通って流れ、透明化中に組織から洗い流された脂質をトラップします。透明化溶液の最適温度は37〜45°Cで、再循環中は溶液容器を50°Cの水浴に保つことでチャンバー内に維持されます。 手順中に週に一度、容器内の清算液を交換することをお勧めします。使用されるすべてのコンポーネントは、 材料表に詳細に記載されています。ここで紹介する最適化されたソリューションにより、標準的なパッシブクリアリング技術と比較して、受動的にクリアされたマウス心臓全体を大幅に短時間で取得できるため、臓器に損傷を与えることなく必要な実験時間を短縮できます。染色アプローチは、蛍光レクチン(WGA - Alexa Fluor 633)を使用して、細胞膜と内皮の均質な標識にも最適化されました。
心臓の細胞構造は、サンプル全体でライトシートを軸方向に掃引する専用のmesoSPIMを開発することによって再構築されました(https://mesospim.org)。特注の蛍光シート顕微鏡(図3)は、メゾスコピックFoV(ミリメートルオーダー)の画像をマイクロメートル分解能で迅速に取得することができました。このようにして、単一の心筋細胞を分解し、臓器全体の3D再構成にマッピングすることができます。顕微鏡は、ガルバノメトリックミラーを使用して638nmのレーザービームをスキャンすることによって動的に生成されたライトシートで透明化されたサンプルを照らします。sCMOSカメラは、2倍の倍率方式で検出アームの特性評価を行い、1回のスキャンでFoV全体を捕捉することができます。蛍光シグナルは、対物レンズの後にロングパスフィルターを配置することによって選択しました。カメラはローリングシャッターモードで動作するように設定されました:いつでも、アクティブなカメラピクセルの線(すなわち、画像に露出)は、電気的に調整可能なレンズによって実行されるライトシートの焦点帯域の面内シフトと同期しています。このアプローチは、集光されたライトシートの最も薄い部分の画像のみを取得することにより、FoV全体の光学セクショニング能力を最大化しました。このソリューションは、ライトシートの焦点深度の全範囲が取得に含まれる従来の構成とは異なり、FoVの大部分でピーク光学セクショニング分解能を防ぎます。統合されたサンプルステージはキュベットをサポートするため、位置決めが最適化され、イメージングプロセス中のサンプルの軸方向の動きが可能になります。このように、連続した内部切片を取得することにより断層再構成が可能です。得られた画像はメゾスコピックFoVとマイクロメートル分解能を持ち、マウスの心臓全体に必要な取得時間は~15分です。カメラのローリングシャッターとFoVを掃引する励起光ビームとの同期により、像面全体を高い空間分解能で取得できます(図4)。これにより、サンプルの半径方向の変位や複数の隣接スタックベースのイメージングを必要とせずに、1回の断層撮影でサンプルを直接再構築できます。特に、顕微鏡は、ほぼ等方性のボクセルサイズと、臓器全体の単一細胞を潜在的に分解するのに十分な信号対バックグラウンド比で、1回のイメージングセッションで約(10 mm x 6 mm x 6 mm)の臓器全体の再構成を可能にしました。
提案されたプロトコルが、良い結果を達成するために慎重に実行しなければならないいくつかの重要なステップを提示することは注目に値します。特に、近位大動脈を介した心臓のカニューレ挿入は非常に難しい場合がありますが、臓器を適切に洗浄して固定することは不可欠なステップです。Juddら17は、このステップを効果的に行う方法を示した。さらに、CLARITYプロトコルに必要な脱気手順も非常に複雑ですが、組織の保存には不可欠です。このステップが適切に実行されない場合、組織は透明化溶液でのインキュベーション中に損傷や腐敗に遭遇する可能性があります。
さらに、提示された実験ワークフローは小型の蛍光プローブに適しているが、免疫組織化学の使用は、抗体の分子量が高いため、染色において必ずしも良好な効率を提供するとは限らない。各免疫染色プロトコルには適切な最適化が必要であり、抗体の浸透を改善するために、組織拡張18 および/またはpHおよびイオン強度の変動19など、さまざまなアプローチが考案されています。
mesoSPIMのセットアップには、i)サンプル全体のライトシートの保存が組織の透明度に強く依存すること、ii)カメラセンサーの寸法がFoVを制限することの2つの主な制限もあります。心臓全体で完璧な屈折率マッチングを保証することは非常に困難であり、屈折率のわずかな変動は光散乱を引き起こし、画質の低下につながる可能性があります。この点で、両面照明方式を導入することができる。2つの励起アームは、試料の片側から反対側に照明を交互に行うことにより、最大に焦点を合わせた照明を備えた2つの異なる整列した動的ライトシートを生成できます。また、FoVは、非常に大きなセンサーを備えた新世代の高解像度裏面照射型sCMOSと、低視野歪みの高開口テレセントリックレンズを組み合わせることで改善できます。この実装により、同じ光学切片能力を維持しながら、より大きな臓器や拡張組織を再構築し、センチメートルサイズの透明なサンプルのミクロンスケールの3D画像を生成できます。
提示されたプロトコルは、臓器全体の信頼性の高い細胞構造再建を得るために、サンプル調製に依然として長い時間と高レベルの透明性を必要としますが、このアプローチの主な意義は、クリアリングプロトコルの改善と、マイクロメートル分解能で1回のスキャンでメゾスコピック再建を実行する機能にあります。将来的には、これらの進歩をマルチ染色プロトコルと組み合わせて、異なる生物学的構造を統合した全臓器再建を達成することができます。
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Disclosures
開示するものは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、助成金契約第952166号(REPAIR)に基づく欧州連合のホライズン2020研究およびイノベーションプログラム、FISRプログラムに基づくMUR、プロジェクトFISR2019_00320およびトスカーナ地域、バンドーリセルカ敬礼2018、PERCAREプロジェクトから資金提供を受けています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-2’ Thiodiethanol | Sigma-Aldrich | 166782 | |
| Acrylamide | Bio-Rad | 61-0140 | |
| AV-044 Initiator | Wako Chemicals | AVP5874 | |
| Bis-Acrylamide | Bio-Rad | 161-042 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Camera | Hamamatsu | Orca flash 4.0 v3 | |
| Camera software | Hamamatsu | HC Image | |
| Collimating lens | Thorlabs | AC254-050-A-ML | |
| Detection arm | Integrated optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Excitation lens | Nikon | 91863 | |
| Exteraìnal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-753 | |
| Fold mirrors | Thorlabs | BBE1-E02 | |
| Galvanometric mirror | Thorlabs | GVS211/M | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCImage Live | Hamamatsu | 4.6.1.19 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Internal quartz cuvette | Portmann Instruments | UQ-204 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Laser source | Integrated Optics | 0638L-15A-NI-PT-NF | |
| Long-pass filter | Thorlabs | FELH0650 | |
| Magnetic base | Thorlabs | KB25/M | |
| MgCl2 | Chem-Lab | CI-1316-0250 | |
| Motorized traslator | Physisk Instrument | M-122.2DD | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 59888 | |
| Objective | Thorlabs | TL2X-SAP | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Phosphate Buffer Solution | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Polycap AS | Whatman | 2606T | |
| Relay lens | Qioptiq | G063200000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Tube lens | Thorlabs | ACT508-200-A-ML | |
| Tunable lens | Optotune | EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C | |
| Vacuum pump | KNF Neuberger Inc | N86KT.18 | |
| Water bath | Memmert | WTB |
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