Summary
Questo manoscritto descrive come valutare l'immunogenicità in vivo delle vescicole extracellulari derivate dalle cellule tumorali (EV) utilizzando la citometria a flusso. Gli EV derivati da tumori sottoposti a morte cellulare immunogenica indotta dal trattamento sembrano particolarmente rilevanti nell'immunosorveglianza tumorale. Questo protocollo esemplifica la valutazione dei veicoli elettrici immunostimolatori del tumore indotti da oxaliplatino, ma può essere adattato a varie impostazioni.
Abstract
La morte cellulare immunogenica dei tumori, causata dalla chemioterapia o dall'irradiazione, può innescare risposte delle cellule T specifiche del tumore rilasciando modelli molecolari associati al pericolo e inducendo la produzione di interferone di tipo I. Le immunoterapie, compresa l'inibizione del checkpoint, si basano principalmente su cellule T tumorali specifiche preesistenti per dispiegare un effetto terapeutico. Pertanto, approcci terapeutici sinergici che sfruttano la morte cellulare immunogenica come vaccino anti-cancro intrinseco possono migliorare la loro reattività. Tuttavia, lo spettro dei fattori immunogenici rilasciati dalle cellule sotto stress indotto dalla terapia rimane incompletamente caratterizzato, specialmente per quanto riguarda le vescicole extracellulari (EV). Gli EV, particelle membranose su scala nanometrica emesse praticamente da tutte le cellule, sono considerati per facilitare la comunicazione intercellulare e, nel cancro, hanno dimostrato di mediare il cross-priming contro gli antigeni tumorali. Per valutare l'effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati da tumori in varie condizioni, sono ricercati metodi adattabili, scalabili e validi. Pertanto, qui viene presentato un approccio relativamente semplice e robusto per valutare l'immunogenicità in vivo dei veicoli elettrici. Il protocollo si basa sull'analisi citometrica a flusso di cellule T spleniche dopo immunizzazione in vivo di topi con EV, isolati da saggi basati sulla precipitazione da colture di cellule tumorali in terapia o condizioni di stato stazionario. Ad esempio, questo lavoro mostra che l'esposizione all'oxaliplatino delle cellule di melanoma murino B16-OVA ha provocato il rilascio di EV immunogenici che possono mediare l'attivazione delle cellule T citotossiche reattive al tumore. Quindi, lo screening dei veicoli elettrici tramite immunizzazione in vivo e citometria a flusso identifica le condizioni in cui i veicoli elettrici immunogenici possono emergere. L'identificazione delle condizioni di rilascio di EV immunogenici fornisce un prerequisito essenziale per testare l'efficacia terapeutica dei veicoli elettrici contro il cancro ed esplorare i meccanismi molecolari sottostanti per svelare in definitiva nuove intuizioni sul ruolo dei veicoli elettrici nell'immunologia del cancro.
Introduction
Il sistema immunitario svolge un ruolo fondamentale nella lotta contro il cancro, sia quando incitato dall'inibizione del checkpoint immunitario sia per l'efficacia delle terapie convenzionali contro il cancro. Le cellule tumorali che soccombono a terapie genotossiche come gli agenti chemioterapici oxaliplatino e doxorubicina o il trattamento con radiazioni ionizzanti possono rilasciare antigeni e modelli molecolari associati al pericolo (DMP) che potenzialmente avviano una risposta immunitaria antitumorale adattativa1. I DAMP più importanti, nel contesto della morte cellulare immunogenica, includono segnali find-me come ATP chemiotattico, segnali eat-me come l'esposizione di calreticulina, che promuove l'assorbimento delle cellule tumorali da parte delle cellule che presentano l'antigene, e il rilascio di HMGB1, che attiva i recettori di riconoscimento del pattern, migliorando così la presentazione incrociata degli antigeni tumorali2. Inoltre, gli interferoni di tipo I (IFN-I), indotti tramite acidi nucleici immunogenici derivati dal tumore o altri stimoli, sono rilevati dalle cellule dendritiche, consentendo loro di innescare efficacemente cellule T citotossiche specifiche del tumore3,4. Clinicamente, le cellule T CD8+ attivate e proliferanti che si infiltrano nel tumore forniscono un fattore prognostico indipendente per una sopravvivenza prolungata in molti pazienti oncologici. Rilasciato da tali cellule T attivate, l'IFN-γ media effetti antiproliferativi diretti sulle cellule tumorali e guida la polarizzazione Th1 e la differenziazione citotossica delle cellule T, contribuendo così a un'efficace immunosorveglianza contro il cancro5,6. L'oxaliplatino è un induttore di morte cellulare immunogenico in buona fede, che media tale risposta immunitaria adattativa contro il cancro7. Tuttavia, la pletora di segnali immunogenici iniziali rilasciati dalle cellule tumorali sotto stress indotto dalla terapia rimane da svelare completamente. Nonostante i significativi progressi nell'immunoterapia del cancro, espandere i suoi benefici a una porzione più ampia di pazienti rimane una sfida. Una comprensione più dettagliata dei segnali immunogenici che avviano l'attivazione delle cellule T può guidare lo sviluppo di nuove terapie.
Un gruppo eterogeneo di strutture racchiuse in membrana, note come vescicole extracellulari (EV), sembrano servire come dispositivi di comunicazione intercellulare. Emessi praticamente da tutti i tipi di cellule, gli EV trasportano proteine funzionali, RNA, DNA e altre molecole a una cellula ricevente o possono alterare lo stato funzionale di una cellula semplicemente legandosi ai recettori sulla superficie cellulare. Il loro carico biologicamente attivo varia significativamente in base al tipo e allo stato funzionale della cellula generatrice8. Nell'immunologia del cancro, i veicoli elettrici rilasciati dalle cellule tumorali sono stati prevalentemente considerati come avversari dell'immunoterapia perché alla fine promuovono la crescita invasiva, preformano nicchie metastatiche9 e sopprimono la risposta immunitaria10. Al contrario, alcuni studi hanno dimostrato che gli EV possono trasferire antigeni tumorali alle cellule dendritiche per un'efficace presentazione incrociata11,12. I veicoli elettrici possono fornire acidi nucleici immunostimolatori se emergono sotto stress indotto dalla terapia, facilitando una risposta immunitaria antitumorale13,14. Il rilevamento di tali ligandi immunitari innati di RNA e DNA nel microambiente tumorale ha recentemente dimostrato di modulare significativamente la reattività al blocco del checkpoint15,16,17. Quindi, il ruolo immunogenico degli EV rilasciati dalle cellule tumorali sotto diverso stress indotto dalla terapia deve essere ulteriormente chiarito. Poiché i veicoli elettrici costituiscono un campo di ricerca giovane ma in crescita, la standardizzazione dei metodi è ancora in corso. Pertanto, la condivisione delle conoscenze è essenziale per migliorare la riproducibilità della ricerca sulle interazioni tra veicoli elettrici e immunologia del cancro. Con questo in mente, questo manoscritto descrive un semplice protocollo per valutare l'effetto immunogenico dei veicoli elettrici derivati dal tumore in vivo.
Questa valutazione viene eseguita generando EV derivati dal tumore, immunizzando i topi riceventi con quei veicoli elettrici e analizzando le cellule T spleniche tramite citometria a flusso. La generazione di veicoli elettrici viene eseguita idealmente seminando cellule tumorali murine in un terreno di coltura cellulare privo di EV per un alto grado di purezza. Le cellule vengono trattate con uno specifico stimolo di stress cellulare, come la chemioterapia, per confrontare l'effetto dei veicoli elettrici indotti dalla terapia con l'immunogenicità basale dei rispettivi VEICOLI elettrici derivati dal tumore. L'isolamento dei veicoli elettrici può essere eseguito con varie tecniche che dovrebbero essere selezionate in base all'applicabilità in vivo e alla disponibilità locale. Il seguente protocollo descrive un test basato sulla precipitazione con un kit commerciale per la purificazione dei veicoli elettrici. I topi sono immunizzati due volte con quei veicoli elettrici. Quattordici giorni dopo la prima iniezione, le cellule T vengono estratte dalla milza e analizzate per la produzione di IFN-γ tramite citometria a flusso per valutare una risposta immunitaria sistemica. Con questo, il potenziale degli EV derivati dal tumore, che emergono sotto diversi regimi terapeutici, per indurre risposte antitumorali delle cellule T viene valutato in modo relativamente semplice, rapido e con elevata validità13. Pertanto, questo metodo è adatto per uno screening immunologico di veicoli elettrici derivati da cellule tumorali in varie condizioni.
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Protocol
All'inizio degli esperimenti, i topi avevano almeno 6 settimane di età e sono stati mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. Il presente protocollo è conforme agli standard etici istituzionali e alle normative locali vigenti. Gli studi sugli animali sono stati approvati dall'agenzia di regolamentazione locale (Regierung von Oberbayern, Monaco di Baviera, Germania). Possibili pregiudizi legati al sesso non sono stati studiati in questi studi.
1. Generazione e isolamento di veicoli elettrici derivati da cellule tumorali dopo l'esposizione alla chemioterapia
- Cellule murine di melanoma B16 di coltura che esprimono ovoalbumina (B16-OVA) in DMEM (contenente 4 mM di L-glutammina e 4,5 g/L di D-glucosio) integrate con FCS (10% v/v), penicillina (100 unità/mL) e streptomicina (100 μg/mL) a 37 °C, fino a quando le cellule crescono costantemente e sono confluenti al 90% circa.
NOTA: Eseguire questa sezione del protocollo interamente in condizioni sterili utilizzando una cappa di coltura cellulare. Per l'analisi di altre entità tumorali, le linee cellulari che esprimono un antigene potente sono preferibili per valutare le risposte delle cellule T antigene-specifiche, in quanto consentono una specifica restimolazione dell'antigene ex vivo . - Per preparare i terreni di coltura cellulare necessari per la generazione di veicoli elettrici, esaurire i veicoli elettrici bovini all'interno di FCS mediante ultracentrifugazione a 100.000 x g per 24 ore a 4 °C, quindi scartare il pellet. In alternativa, scegli in anticipo una preparazione commerciale a basso contenuto di veicoli elettrici per animali.
- Raccogliere le cellule B16-OAV e lavarle due volte in PBS, quindi seminare ad una concentrazione di 400.000 cellule / ml in mezzi ev impoveriti.
NOTA: Adattare la concentrazione cellulare alla dinamica di crescita della linea cellulare in esame in modo che le cellule non crescano troppo. - Trattare le cellule B16-OAV aggiungendo 30 μg di oxaliplatino per mL e incubare per 24 ore a 37 °C. Lasciare le condizioni di controllo non trattate. Al primo utilizzo di una sostanza genotossica, titolare l'efficacia citotossica desiderata utilizzando saggi di vitalità cellulare come l'esclusione del tripano blu18.
NOTA: Questo test può anche valutare i veicoli elettrici generati in colture cellulari trattate con altre sostanze immunomodulanti o irradiazione ionizzante oltre ai chemioterapici.
ATTENZIONE: L'oxaliplatino provoca irritazione cutanea e oculare grave e può causare una reazione allergica cutanea e irritazione respiratoria. L'oxaliplatino è sospettato di causare il cancro. Come precauzione, utilizzare dispositivi di protezione individuale, inclusi guanti, occhiali, maschere e indumenti adeguati, puliti prima del riutilizzo. Evitare l'inalazione e lavarsi accuratamente le mani dopo la manipolazione. Evitare il rilascio nell'ambiente e smaltire l'oxaliplatino secondo le normative vigenti. Ottenere informazioni dettagliate dalla scheda di dati di sicurezza. - Raccogliere il surnatante di coltura cellulare. Centrifugare prima a 400 x g per 5 minuti a 4 °C, e poi a 2.000 x g per 30 minuti a 4 °C, scartando ogni volta il pellet. Infine, filtrare attraverso una membrana PVDF da 220 nm. Utilizzare un tubo nuovo per ogni passaggio per rimuovere eventuali detriti cellulari.
NOTA: In questa fase, il surnatante contenente EV può essere conservato a 4 °C per un giorno prima di riprendere il protocollo. Tuttavia, si raccomanda vivamente di aderire al programma descritto con la purificazione immediata dei veicoli elettrici. - Miscelare 1 mL di surnatante con 0,5 mL di uno specifico reagente di isolamento degli esosomi disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) in un tubo da 1,5 mL a forma di V. Pipettare accuratamente su e giù o vortice per creare una soluzione omogenea. Incubare durante la notte a 4 °C.
- Centrifuga a 10.000 x g per 60 min a 4 °C. Scartare con attenzione il surnatante. Rimuovere le gocce rimanenti picchiettando il tubo da 1,5 ml a testa in giù su un tovagliolo di carta e aspirando attraverso una pipetta con una punta fine senza toccare il pellet EV nella parte inferiore.
- Rimuovere accuratamente tutti i fluidi per evitare la diluizione incontrollata del pellet EV. Inoltre, eseguire rapidamente queste attività per evitare che il pellet si secchi.
- Risospesciare i veicoli elettrici in PBS freddo tubando su e giù senza graffiare il pellet dalla parete del tubo con la punta. Ora, trasferisci le sospensioni passo dopo passo dal primo all'ultimo tubo per raggruppare i veicoli elettrici.
NOTA: utilizzare un volume di PBS uguale a 5 μL moltiplicato per il numero di tubi. 5 μL della sospensione finale contengono i veicoli elettrici isolati rilasciati da 400.000 cellule sotto chemioterapia o allo stato stazionario. - Preferibilmente, utilizzare direttamente i veicoli elettrici. Se ciò non è possibile, conservare le sospensioni EV a -80 °C in recipienti siliconati per un massimo di 28 giorni fino all'applicazione.
NOTA: I veicoli elettrici descritti qui e in diverse altre pubblicazioni non perdono la loro rispettiva funzione biologica se conservati a -80 °C per quel periodo di tempo19. - Quantificare e caratterizzare gli isolati EV secondo le linee guida MISEV201820.
NOTA: I possibili metodi di quantificazione includono l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA)21 e il rilevamento delle proteine legate alla membrana di EV22. I possibili approcci per caratterizzare ulteriormente i veicoli elettrici includono la microscopia elettronica23 e western blot20.
2. Immunizzazione dei topi con veicoli elettrici
- Pianificare l'esperimento in vivo con topi C57BL/6 (o altri topi singenici corrispondenti alla linea cellulare tumorale), compresi i gruppi di trattamento che ricevono EV derivati da cellule trattate, cellule non trattate e PBS (veicolo), rispettivamente.
NOTA: Preferibilmente, utilizzare topi all'età di 6-8 settimane per evitare che la senescenza fisiologica diminuisca la risposta immunitaria24. - Mescolare 5 μL di sospensione EV con PBS freddo da 55 μL per ciascun topo all'interno del rispettivo gruppo di trattamento per immunizzarlo con EV isolati da cellule B16-OAV 4,0 x 105 .
NOTA: questa quantità di veicoli elettrici corrisponde a circa 2 x 109 particelle misurate mediante analisi di tracciamento delle nanoparticelle (dati non mostrati). La proteina OAV miscelata con un adiuvante (ad esempio, LPS) può essere applicata come un potente controllo positivo al vaccino.- Riempire le siringhe (dimensione dell'ago 26-30 G) con 60 μL di EV o PBS diluiti, rispettivamente e mettere immediatamente su ghiaccio.
NOTA: Nel protocollo, la quantità di EV iniettati è normalizzata al numero di cellule tumorali che rilasciano EV per considerare sperimentalmente gli effetti sia qualitativi che quantitativi dell'oxaliplatino sulla biogenesi EV delle cellule tumorali. Per alcuni lettori, la normalizzazione a una concentrazione specifica di veicoli elettrici prodotti può adattarsi meglio alla loro configurazione sperimentale a seconda della loro domanda scientifica.
- Riempire le siringhe (dimensione dell'ago 26-30 G) con 60 μL di EV o PBS diluiti, rispettivamente e mettere immediatamente su ghiaccio.
- Inoculare EV o PBS per via sottocutanea nell'aspetto mediale della coscia dei topi e ripetere l'immunizzazione dopo 7 giorni. Quattordici giorni dopo il primo trattamento, sacrificare i topi, ad esempio, per lussazione cervicale per analizzare la risposta immunitaria.
NOTA: Possono essere utilizzate vie di iniezione sottocutanea alternative, secondo gli standard locali.
3. Analisi citometrica a flusso di cellule T spleniche
- Preparare e raffreddare RPMI completo (cRPMI), integrando RPMI-1640 con FCS (10% v / v), penicillina (100 unità / mL), streptomicina (100 μg / mL), L-glutammina (2 mM) e β-mercaptoetanolo (50 μM).
- Resecare la milza dalla cavità addominale aperta. Schiacciare la milza con un filtro cellulare inumidito da 100 μm e lo stantuffo di plastica di una siringa e lavare le cellule della milza in un tubo da 50 ml con 5-10 mL di cRPMI. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
NOTA: Mantenere le celle sul ghiaccio quando possibile. Per analizzare la risposta immunitaria locale piuttosto che splenica, resecare i linfonodi popliteali e inguinali drenanti, seguendo lo stesso protocollo. In questo caso, salta il passaggio successivo per la lisi degli eritrociti. - Per rimuovere gli eritrociti dalla sospensione cellulare, risospesciare il pellet con 2 ml di tampone di lisi dei globuli rossi (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, interrompere la reazione aggiungendo cRPMI. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.
- Per la semina, risospesere il pellet cellulare in cRPMI e contare le cellule per posizionare triplicati di 200.000 cellule con 200 μL cRPMI in ciascun pozzetto, utilizzando una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di U. Incubare per 48 ore a 37 °C.
NOTA: Per affrontare la specificità dell'antigene delle cellule T attivate, aggiungere 1 μg/mL di ovoalbumina solubile (o un altro antigene tumorale corrispondente alla linea cellulare in esame) o lasciare senza ulteriori stimoli, rispettivamente. L'aggiunta dell'epitopo peptidico immuno-dominante SIINFEKL, invece dell'ovoalbumina a lunghezza intera, consente un periodo di incubazione più breve. Oltre alla citometria a flusso, il siero dei topi e il surnatante di coltura cellulare dopo 48 ore di incubazione possono essere analizzati per varie citochine. - Dopo 48 ore, per migliorare la colorazione intracellulare di IFN-γ bloccando, tra l'altro, la secrezione mediata dal Golgi delle proteine, aggiungere Brefeldina A (5 ng / mL), PMA (20 ng / mL) e Ionomicina (1 μg / mL) alla coltura cellulare. Incubare per 4 ore a 37 °C.
- Prima di colorare i biomarcatori superficiali, trasferire gli splenociti su una piastra a 96 pozzetti con un fondo a forma di V e lavare due volte con PBS. Quindi, aggiungere anticorpi fluorescenti, compatibili con il citometro a flusso disponibile localmente, diretti contro biomarcatori di superficie, CD3, CD8 e CD4 (vedi Tabella dei materiali), diluiti 1:400, più un colorante di vitalità fissabile, diluito 1:1.000 in PBS. Risospendare gli splenociti pellettati nella soluzione colorante e incubare per 30 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce.
- Per la fissazione e la permeabilizzazione degli splenociti, lavare due volte in tampone FACS (PBS più 3% v / v FCS) e quindi risospesire in 100 μL di tampone di fissazione / permeabilizzazione (vedere Tabella dei materiali) per pozzetto. Incubare per 30 minuti a 4 °C, al riparo dalla luce.
- Per la colorazione dell'IFN-γ intracellulare, lavare gli splenociti nel tampone di fissazione/permeabilizzazione e risospesire con anticorpi fluorescenti contro l'IFN-γ, diluiti 1:200 nel tampone. Incubare per almeno 1 ora (fino ad un massimo di 12 h) a 4 °C, al riparo dalla luce.
- Prima di misurare i campioni mediante citometria a flusso, lavare gli splenociti due volte nel tampone di fissazione/permeabilizzazione e risospesirli nel tampone FACS. Analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche secondo la strategia di gating mostrata nella Figura 2.
- In primo luogo, per rilevare singole cellule, cancellare FSC-H contro FSC-A. Quindi, per rilevare le cellule linfoidi, cancellare SSC contro FSC-A. Successivamente, selezionare le cellule CD3+, CD4-, CD8+ viventi e determinare il loro sottoinsieme produttore di IFN-γ per quantificare l'attivazione delle cellule T citotossiche nella milza.
NOTA: includere una colorazione di fluorescenza meno uno (FMO) con tutti i fluorocromi ad eccezione del fluorocromo mirato contro IFN-γ come controllo tecnico negativo.
- In primo luogo, per rilevare singole cellule, cancellare FSC-H contro FSC-A. Quindi, per rilevare le cellule linfoidi, cancellare SSC contro FSC-A. Successivamente, selezionare le cellule CD3+, CD4-, CD8+ viventi e determinare il loro sottoinsieme produttore di IFN-γ per quantificare l'attivazione delle cellule T citotossiche nella milza.
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Representative Results
Questo protocollo ha lo scopo di facilitare la valutazione diretta e facilmente riproducibile dell'immunogenicità dei veicoli elettrici derivati dal tumore. Con la presente, i topi vengono inoculati con EV derivati da colture in vitro di cellule tumorali che esprimono l'antigene modello di ovoalbumina di pollo (OVA). La successiva risposta immunitaria viene analizzata nelle cellule T spleniche tramite citometria a flusso.
La Figura 1 fornisce una panoramica dei passaggi pratici dell'intero protocollo. Poiché il lavoro si concentra sulla morte delle cellule immunogeniche, sulla presentazione incrociata e sull'immunità antitumorale indotta da EV, questo protocollo è limitato alla funzione delle cellule T citotossiche CD8 +. Come mostrato nella Figura 2, le cellule sono state chiuse come cellule singole, sottoinsieme di linfociti (per dimensione e granularità), cellule vitali (escluso un marcatore vitale / morto) e cellule T citotossiche CD3 + CD4- CD8 + . L'accumulo intracellulare di IFN-γ è stato valutato come marcatore surrogato per l'attivazione. Possibili marcatori aggiuntivi riguardanti la differenziazione e l'esaurimento delle cellule T sono discussi di seguito.
Utilizzando il metodo qui descritto, i topi sono stati immunizzati con EV derivati da cellule tumorali che esprimono OAV coltivate in condizioni di stress stazionario (non trattate) o genotossiche (trattate con oxaliplatino). Solo i topi iniettati con EV derivati da cellule tumorali in condizioni di stress genotossico hanno indotto una potente attivazione delle cellule T citotossiche della milza negli animali riceventi (Figura 3A). L'iniezione di veicoli elettrici derivati da tumori in condizioni di stato stazionario ha provocato l'attivazione di alcune cellule T, ma ciò non era significativamente diverso dall'attivazione delle cellule T nei topi iniettati con il veicolo PBS. Questi dati mostrano che sotto stress genotossico, le cellule tumorali possono rilasciare potenti EV immunogenici. La produzione di IFN-γ è stata particolarmente aumentata quando gli splenociti di animali trattati con EV tumorale sono stati retrostimolati ex vivo con l'OAV dell'antigene tumorale modello prima dell'analisi (Figura 3B). Questi dati suggeriscono che gli EV derivati dal tumore possono indurre risposte immunitarie specifiche dell'antigene tumorale. È interessante notare che la produzione di Γ IFN - anche se in misura molto minore - viene rilevata anche in assenza di ristimolazione antigene-specifica. Probabilmente, altri antigeni associati al melanoma, come l'antigene di differenziazione TRP225, possono essere presi di mira da una parte della risposta delle cellule T indotte da EV.
Figura 1: Panoramica pittografica del protocollo. (A) Procedura di isolamento dei veicoli elettrici generati in colture di cellule tumorali simili alla chemioterapia. (B) Programma per l'immunizzazione dei topi con veicoli elettrici. (C) Protocollo di colorazione per l'analisi citometrica a flusso di cellule T citotossiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Strategia di gating della citometria a flusso per analizzare l'attivazione delle cellule T citotossiche nella milza. I numeri rappresentano la percentuale della rispettiva popolazione madre. FSC-A: area di dispersione in avanti; FSC-H: altezza di dispersione in avanti; SSC: dispersione laterale; vivi/morti: marcatore di morte cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Gli EV derivati da cellule tumorali sotto stress genotossico possono indurre risposte delle cellule T antigene-specifiche negli animali riceventi. (A) I topi sono stati immunizzati con EV derivati da cellule tumorali coltivate in condizioni di stress stazionario (non trattate) o genotossiche (trattate con oxaliplatino). Le iniezioni del veicolo (PBS) sono state utilizzate come controllo negativo. È stata determinata la produzione di IFN-γ da parte di cellule T citotossiche nella milza dopo l'immunizzazione EV. Con questo, le sospensioni di cellule miliniche sono state ristimolate con ovalbumina ex vivo prima dell'analisi . (B) I topi sono stati trattati con EV derivati da cellule tumorali in condizioni di stress genotossico come descritto sopra. L'attivazione delle cellule T della milza è stata determinata dopo la ristimolazione ex vivo in presenza o assenza di ovoalbumina. Le barre raffigurano la media per gruppo e i baffi il suo errore standard. Il test di analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) con bonferroni posttest è stato utilizzato per confronti statistici multipli di un set di dati. Il livello di significatività è stato fissato a P < 0,05, P < 0,01 e P < 0,001 ed è indicato qui con asterischi (*, **e ***). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce una valutazione immunologica in vivo dei veicoli elettrici derivati da cellule di melanoma sotto stress indotto dalla chemioterapia, adattandosi ai veicoli elettrici emessi da vari tumori sotto vari trattamenti. L'immunizzazione dei topi con EV derivati da cellule B16-OAV trattate con oxaliplatino, ad esempio, espande le cellule T CD8+ produttrici di IFN γ nella milza, che sono ulteriormente stimolate dall'incubazione ex vivo con ovoalbumina, indicando una risposta immunitaria specifica del tumore. Pertanto, il rilevamento di veicoli elettrici immunogenici mediante screening attraverso questo protocollo facilita una comprensione più completa delle terapie convenzionali contro il cancro e consente un'indagine mirata sul ruolo dei veicoli elettrici nell'immunologia del cancro.
Da notare, gli esperimenti con i veicoli elettrici richiedono alcune considerazioni speciali. In questo protocollo, i veicoli elettrici sono semi-quantitativamente normalizzati al numero di cellule tumorali rilasciate entro 24 ore. Questo approccio riflette l'obiettivo di identificare una maggiore immunogenicità, indipendentemente dal fatto che emerga da alterazioni della qualità o della quantità dei veicoli elettrici rilasciati. Pertanto, i risultati riproducibili in vivo si basano sulla costante efficacia di isolamento dei veicoli elettrici. A tal fine, garantire che i pellet EV siano interamente e prontamente sospesi per evitare l'essiccazione è un passo critico.
Inoltre, i veicoli elettrici devono essere quantificati e caratterizzati, ad esempio, dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle e dalla macchia occidentale di transmembrana canonica, luminale e almeno un marcatore EV negativo20. Quantificare e caratterizzare i controlli dei veicoli elettrici per l'isolamento incostante e affrontare le differenze quantitative nei veicoli elettrici o nei sottoinsiemi di veicoli elettrici. Questo tipo di caratterizzazione EV costituisce una parte delle informazioni minime che devono essere riportate negli studi sulle vescicole extracellulari, secondo le linee guida della International Society of Extracellular Vesicles (ISEV). Tuttavia, vari metodi di caratterizzazione sono ugualmente legittimi e dovrebbero essere selezionati in base alla disponibilità locale e alla domanda di ricerca individuale. In particolare, la definizione del dosaggio di una sostanza di interesse o l'irradiazione ionizzante costituisce un altro passo critico del protocollo, che può richiedere una convalida sperimentale per raggiungere un livello adeguato di morte cellulare.
In generale, deve essere presa in considerazione la potenziale contaminazione dei veicoli elettrici isolati con la sostanza di trattamento, le proteine solubili e le lipoproteine. Una strategia in questo senso consiste nel riprodurre l'esperimento con tecniche complementari di isolamento EV che lo stesso tipo di contaminazione20 potrebbe non compromettere. L'immunoaffinità, ad esempio, isola i veicoli elettrici con una resa inferiore ma una specificità superiore rispetto ai metodi puramente basati sulle precipitazioni e può fornire un controllo appropriato a tale riguardo26. Un approccio alternativo consiste nel confrontare i veicoli elettrici derivati da cellule selvatiche con isolamenti da cellule geneticamente modificate con una specifica delezione di geni coinvolti nella biogenesi dei veicoli elettrici o distribuire sostanze che riducono l'emissione di veicoli elettrici20.
I risultati ottenuti da questo protocollo dovrebbero essere integrati da una caratterizzazione più completa della risposta immunitaria mediata dall'EV. Soprattutto la classificazione delle cellule T CD8 + in cellule di memoria effettrici ed effettrici, attraverso CD4427, così come le cellule di memoria antigene-naïve e centrale, attraverso CD62L28, può trasmettere una visione più profonda. Inoltre, l'analisi delle cellule T helper, delle cellule T regolatorie e delle cellule NK può essere di interesse. Per testare l'efficacia antitumorale dei veicoli elettrici, i topi possono essere sfidati con le cellule tumorali corrispondenti dopo aver ricevuto l'immunizzazione EV o trattati con EV contro un cancro prestabilito, adattando così le linee guida per il rilevamento della morte delle cellule immunogeniche2,29 a questo derivato tumorale privo di cellule. Tuttavia, le conclusioni di tutte queste configurazioni sperimentali sono limitate dal fatto che le cellule tumorali in una capsula di Petri generano potenzialmente EV funzionalmente diversi rispetto alle cellule tumorali incorporate in un microambiente tumorale dinamico30 che spesso sopprime l'immunità anti-cancro. Pertanto, la valutazione dei veicoli elettrici derivati da cocolture tumorali / fibroblasti o tessuto tumorale ex vivo può riflettere meglio la situazione reale. In un prossimo passo traslazionale verso la realtà clinica, i veicoli elettrici dal materiale del paziente possono essere analizzati per l'immunogenicità prima e durante la terapia per valutare la loro usabilità come biomarcatori.
Poiché i veicoli elettrici derivati dal cancro sono stati recentemente trovati per modulare il sistema immunitario in determinate circostanze, il viaggio di esplorazione del loro potenziale clinico è appena iniziato31. Per un'analisi approfondita dei meccanismi immunitari cooptati dai veicoli elettrici immunogenici, strumenti utili comprendono la microscopia a fluorescenza che visualizza l'assorbimento di EV da parte di cellule specifiche, il dispiegamento di topi con carenze genetiche per specifiche vie immunitarie e metodi di screening per alterazioni molecolari nel contenuto di EV. In definitiva, l'identificazione di veicoli elettrici immunogenici derivati da tumori, con metodi di screening descritti nel presente documento, consentirà una migliore comprensione dei meccanismi alla base dell'immunità mediata da EV e quindi costituisce un passo cruciale verso lo sfruttamento del loro potenziale contro il cancro.
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Disclosures
Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 e Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (a H.P.), un Mechtild Harf Research Grant dalla DKMS Foundation for Giving Life (a H.P.) un Young Investigator Award dalla Melanoma Research Alliance (a S.H.), una borsa di studio della Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (a F.S.), un Seed Fund dell'Università Tecnica di Monaco (a S.H.) e una borsa di ricerca della Wilhelm Sander Foundation (2021.041.1, a S.H.). H. P. è supportato dall'EMBO Young Investigator Program.
CONTRIBUTI DELL'AUTORE:
F.S., H.P. e S.H. hanno progettato la ricerca, analizzato e interpretato i risultati. F.S. e S.H. scrissero il manoscritto. H.P. e S.H. hanno guidato lo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
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